JPH02141658A - 生化学成分の分析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は液体クロマトグラフを用いた生化学成分の分析
方法及び装置に係り、特に、試料の除蛋白等の前処理を
自動化するのに好適な生化学成分の分析法とそのための
装置に関する。

〔従来の技術〕

従来、液体クロマトグラフィーによる生化学成分の分析
では、試料は蛋白質を含む場所が多く、しかも、目的成
分の存在が微量であるため、除蛋白処理や、高感度検出
が可能な誘導体を生成させる誘導体化処理が行なわれて
いる。自動化された除蛋白処理には、特開昭５８−２２
３０６１号に記載のように特定の条件では蛋白質な吸着
しないが目的成分は吸着する充填剤を充填した除蛋白刃
ラムを通して行う方法が挙げられる。また、誘導体化処
理としては自動化を目的として、分離カラムで分離され
た成分に誘導体化試薬を作用させるポストラベル法やア
ナリテイ力ル　バイオケミストリー１３３巻（１９８６
）第２８頁から第３３頁において論じられている固相で
の反応を利用するプレラベル法がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記、従来技術は、除蛋白処理と誘導体化処理を個別に
行なわなければならず、これらの過程で目的成分の希釈
が起こること、前処理を含めた分析時間が長大になるこ
と、誘導体化試薬と目的成分の混合が不充分なため分析
精度が低下するなどの問題があった。また、自動化の点
でも問題があった。

本発明の目的は前処理過程で生ずる目的成分の希釈を抑
制し、前処理操作を含めたトータルの分析時間の短縮が
可能な高感度で高精度の生化学分析方法及び装置を提供
することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は以下に述べるようにして達成される。

すなわち、イオン結合、水素結合、電荷移動型結合のう
ちのどれか１つの相互作用（第１の相互作用）を支配的
に持つ充填剤を充填した吸着カラムに血清等の試料を導
入して目的成分及びこれに類似の性質の成分だけを吸着
する工程、目的成分と選択的に反応し、かつ、その生成
物と吸着カラム内充填剤とが第１の相互作用以外の相互
作用ｉ（第２の相互作用）を生じるような誘導体化試薬
を導入し反応させる工程、吸着カラムにｐ）Ｉ、有機溶
媒濃度、塩濃度等を調整した再生液を導入し、第１の相
互作用で吸着されている目的成分と類似の性質を持つ共
存成分を脱着する工程、吸着カラムにｐＨ１有機溶媒濃
度、塩濃度等を調整した溶離液を導入し、第２の相互作
用で吸着されている目的成分を脱着する工程、脱着され
た目的線分の混合物を分離カラムに導き、それぞれの成
分に単離し、検出する工程からなる方法及び装置である
。

〔作用〕

この発明による生化学分析方法の特徴のひとつは、あら
かじめ初期化しである吸着カラムに試料を流通させ、目
的成分を吸着カラム中の吸着剤と第１の相互作用を利用
して保持し、この状態で、目的成分との反応生成物が吸
着剤に対して第２の相互作用を生じさせる誘導体化試薬
を作用させることである。これにより、目的成分は吸着
剤表面に保持され、ここを通過する過剰の誘導体化試薬
と反応するようになるので、液相による反応よりも時間
が短縮できる。また、反応後には目的成分と誘導体化試
薬との反応生成物は吸着剤と第２の相互作用により吸着
されることになるので、第１の相互作用により吸着され
ている成分だけを脱着する再生液を吸着カラムに導いて
、試料中の共存成分及び未反応成分等を洗浄することが
できる。

さらに、分離カラムに用いる充填剤は、目的成分と誘導
体化試薬との反応生成物に対して第２の相互作用を持ち
、かつ、この強度が吸着剤の相互作用よりも大きいもの
を使用するので、吸着カラムから溶出した目的成分の誘
導体は分離カラムヘッドでいったん濃縮された後、展開
されることになる。それ故、吸着カラムから脱着される
際に生じる目的成分の希釈はほとんど無視できる。

以上に述べた手段は分離カラムでの濃縮、展開以外はい
ずれも吸着カラム内で行うものであるため、血清等の生
体試料中の除蛋白や誘導体化処理がカラムスイッチング
等の操作で簡単に自動化できる。

〔実施例〕

以下１本発明の一実施例を第１図により説明する。

第１図において１は調整液であり、予備濃縮カラム９に
充填された充填剤に目的成分が吸着されるように液性が
コントロールされる。２は目的成分の誘導体化試薬を含
む溶液、３は予備濃縮カラムに吸着された蛋白質等を除
去する再生液である。

４ａ〜４ｃは予備濃縮カラムに吸着された成分を脱着し
、分離カラム１１において各成分ごとに分離するための
溶離液である。調整液１、誘導体化試薬２及び再生液３
には、それぞれ独立したピストン型の低圧ポンプ５ａ〜
、５　ｃが設けられる。低圧ポンプ５ａは調整液１ある
いはオートサンプラ８上の試料８５、内標準物質８６及
び洗浄液８７を選択して吸引できるように切換弁６を介
して配管１５に接続される。低圧ポンプ５８〜５Ｃから
の３本の配管はマニホールド１４ａで１本にまとめられ
、流路切換え弁１ｏに接続される。なお、マニホールド
１４ａと低圧ポンプ５８〜５０間の配管には図示しない
逆止弁が設けられる。一方、溶離液４ａ〜４ｃからの配
管も電磁弁１７ａ〜１７ｃ及びマニホールド１４ｂを介
して高圧ポンプ７に接続される。流路切換え弁１０には
、調整液１、誘導体化試薬２及び再生液３の前処理用溶
液、４ａ〜４ｃの溶離液、予備濃縮カラム９、分離カラ
ム１１が配管１５を介して接続される。分離カラム１１
の出口には検出器１２が配管で接続され、検出器１２に
はデータプロセッサー１３が信号コード１６で接続され
ている。

オートサンプラ８は試料８５等を積載するサンプルラッ
ク８４．試料８５内標準物質８６．洗浄液８７を選択的
に吸引するためにノズル８２を移動するＸＹファーム１
、吸引した試料８５等を流路に注入するための注入ボー
ト８３で構成される。

次に本発明による装置の動作について説明する。

ピストン型の低圧ポンプ５ａと調整液１が連結されるよ
うに切換え弁６を切換え、調整液１を一定量吸引し、吐
出する。この時、流路切換え弁１ｏを実線で示す流路に
し、ノズル８２を下方に移動して注入ボート８３と嵌合
させると、調整液１は予備濃縮カラム９を通過して系外
に排出される。この過程で予備濃縮カラムは初期化され
る。

この後、ＸＹファーム１を移動してノズル８２をサンプ
ルラック８４上の試料８５に移動し、切換弁６を試料側
に切換えて低圧ポンプ５ａで一定量を吸引し、ノズル８
２を移動して注入ボート８３と嵌合させて吐出する。こ
の時試料８５は調整液１と同様に予備濃縮カラム９を通
過して系外に排出される。また、この過程で試料８５中
に含まれる目的成分等は予備濃縮カラム９に吸着される
。

切換弁６を調整液側に切換え、調整液１を低圧ポンプ５
ａで吸引、吐出し、流路及び予備濃縮カラム９内に残存
する試料成分を系外に排出する。この段階では、試料中
の目的成分は調整液１で初期化された予備濃縮カラム９
内の吸着剤と特定の相互作用（第１の相互作用）により
吸着されている。

次に、低圧ポンプ５ｂで誘導体化試薬２を吸引、送液、
する。この時、流路切換弁１０は実線に示す流路になっ
ているので誘導体化試薬２は予備濃縮カラム９を通過し
、系外に排出されるが、誘導体化試薬２の組成、目的成
分との接触時間等をコントロールすることにより吸着剤
に吸着された目的成分と誘導体化試薬がカップリングす
る。この際に誘導体化試薬として環状化合物を使用し、
予備濃縮カラムに、例えばポリマー系充填剤を使用する
と生成した誘導体は第１の相互作用以外にπ電子に基づ
く電荷移動型の相互作用（第２の相互作用）をも併せ持
つようになり、誘導体化試薬の種類あるいはその時の溶
液によっては、第２の相互作用の方が第１のそれよりも
支配的になるように制御が可能である。目的成分と誘導
体化試薬とのカップリング反応が終了した時点で、低圧
ポンプ５ａで調整液１を送液し、予備濃縮カラム中に存
在している過剰の誘導体化試薬２及び分解生成物等を洗
い出す。この後、低圧ポンプ５ｃを用いて再生液３を予
備濃縮カラム９に送液するが、この時の再生液３は、吸
着剤に第１の相互作用が吸着されている成分は脱着でき
るけれども第２の相互作用で吸着されている成分は脱着
しないように液性がコントロールされる。これにより、
目的成分の誘導体は第２の相互作用でそのまま予備濃縮
カラム９内に残るが、目的成分と同じような物理的、化
学的な性質を持ち、吸着剤と第１の相互作用で吸着して
いる蛋白質等の妨害成分は除去することができる。以上
のようにして予備濃縮カラム９内をクリーンアップした
ら、流路切換え弁１０を点線の流路になるように回転す
る。この状態になると、高圧ポンプ７から送液されてく
る溶離液４ａ〜４ｃは流路切換え弁１０及び予備濃縮カ
ラム９を経由して分離カラム１１に流入する。溶離液４
ａ〜４ｃは、予備濃縮カラム９内の吸着剤と第２の相互
作用で吸着されている目的成分の誘導体を脱着し、さら
に、分離カラム１１で目的成分の誘導体混合物を単一成
分に分離できるようにコントロールされる０本実施例で
は、溶離液を４ａ〜４ｃの３種類としたが、分離が容易
な混合物では単一溶離液を用いても良いし、複雑な混合
物では電磁弁１７ａ〜１７ｃの開閉を制御してグラジェ
ント溶離法としても良い。分離カラム１１には通常、分
析に使用される５〜１０Ｇ程度のカラムを使用するため
、１ｍΩ／ｗｉｎ程度で溶離液を送液すると圧力は５０
ｋｇｆ／−以上になるが、高圧ポンプ７は通常の分析に
用いられるものが使用できる。分離カラム１１で単離さ
れた成分は検出器１２で検出され、濃度に応じた出力信
号は信号コード１６を介してデータプロセサー１３に伝
達される。

本実施例によれば次のような効果がある。

（１）予備濃縮カラム、分離カラム、サンプル及び前処
理用溶液及び溶離液が１つの流路切換弁に接続できるの
で、サンプルインジェクターに使用される高圧流路切換
え弁が不要となり、構成が簡便となる。したがって安心
して無人運転ができる。

（２）試料と調整液、誘導体化試薬及び再生液の前処理
用溶液はそれぞれ独立したポンプで送液されるため、流
路中の溶液の置換に要する時間が短かくしてすむことに
より分析時間が短縮できる。

（３）前処理用溶液は小型の予備濃縮カラムにしか流れ
ない構成であるため、これらの送液手段はピストン型の
低圧ポンプが使用できる。したがって、高価な高圧ポン
プを使用する必要がない。

（４）誘導体化反応を、予備濃縮カラム内の吸着剤に目
的成分が吸着されたままの状態で行うため、目的成分の
誘導体化試薬による希釈がなくなり、高感度検出ができ
る。

実施例２ 第１図実施例に示す構成の装置を用しと、血清中のカテ
コールアミンを分析する場合について述べる。本実施例
における各要素の詳細は以下の通りである。

調整液１； ０．０１ｍｏＱ／１２　　リン酸バッファ、ｐＨ５，８
誘導体化試薬２；　（特開昭６０−２０５２６２号準拠
）■１，２−ジフェニルエチレンジアミン　０．１ｍｏ
Ｑ／Ｑ■フェリシアン化カリウム　１０ＩＩｌｏＱ／Ｑ
■アセトニトリル ■；■；■：　１　：　１　：　０．５の混合溶液再生
液３； 塩化ナトリウム　０　、５　ｍｏｌ／　Ｑ溶離液４ アセトニトリル、５／エタノール、２／水、（０，０１
ｍｏｆｆ／Ｑ　リン酸バッファ（ｐＨ７，０）と０．１
ｍｏｆｆ／Ｑドデシル硫酸ナトリウム含有）。

なお、本実施例では単一溶離法を使用した。

低圧ポンプ５： 自作品、ハミルトンガスタイトシリンジ（１００５ＴＬ
Ｌ型１０ｍΩ）をパルスモータ−で駆動、切換え弁６、
オートサンプラ付属品 高圧ポンプ７、 日立　Ｌ６０００　　ダブルプランジャー形オートサン
プラ８； ギルソンモデル２３１−４０１ 予備濃縮カラム９： 陽イオン交換樹脂　ＭＣＩＣＱＫ３０Ｓ４ｍｍＩＤＸＸ
１０ｍｍ 流路切換え弁１０： レオダイン６０００ アクチュエータ駆動装置付 分離カラム１１： 日立ゲル　＃３０５７ ４ｍ＋１．Ｄ、ＸＸ１５０ｍｍ 検出器１２： 日立　Ｆ−１０００、Ｅｘ　　３４５ｎｍ、Ｅｍ４８５
ｎｍ操作手順は次のようにした。流路切換え弁１０を実
線で示す流路にしておき調整液１を１　ｍ　１１　／ｗ
ｉｎ予備濃縮カラム９に送液して初期化を行う、また、
同時に溶離液４ａを高圧ポンプで送液（０、１ｍ　ｎ　
／ｗｉｎ　）する、ノズル８２を移動して血清８５　２
００μしを吸引する。この時、試料のバンドが拡散しな
いように試料の両端に気泡を挿入する方法が取られるが
、本実施例では予備濃縮カラム９で濃縮するために、こ
のような操作は不要である。吸引された試料は調整液１
と共に予備濃縮カラム９に注入される（第３図（ａ）参
照）。予備濃縮カラム内の吸着剤は負に、血清中のカテ
コールアミン類は正に荷電するため、両者の間に静電力
による相互作用（第１の相互作用）が発生し、吸着が起
こる。一方、血清中に存在する妨害成分であるアルブミ
ンは負に荷電しているため吸着されずに系外に排出され
るが、グロブリンは等電点が広範囲に分布している混合
成分であるため大部分はカテコールアミン類と同様に第
１の相互作用で吸着される（第３図（ｂ）参照）。

カテコールアミン類が予備濃縮カラム１に吸着されてい
る状態で低圧ポンプ５ｂで誘導体化試薬を０．１ｍＭ／
＋＊ｉｎで送液し、予備真綿カラム９内のカテコールア
ミン類に５分間作用させ誘導体を生成させる（第３図（
ｃ）参照）。この後、低圧ポンプ５ｃで再生液３を１ｍ
ＱｙへＬｎで２分間送液した。また、はぼ同時に高圧ポ
ンプ７の流量を１ｍＱ／ｍｉｎに上げた。この時、カテ
コールアミン類は誘導体化試薬である１、２−ジフェニ
ルエチレンジアミンとカップリングしているため、予備
濃縮カラム９内の吸着剤を電荷移動型の相互作用（第２
の相互作用）でも吸着されているので、再生液３として
使用した０、５ｍｏＱ／Ｑ　塩化ナトリウムでは脱着さ
れないが、第１の相互作用である静電力で吸着されてい
るグロブリン等はＮａ＋イオンに交換されて予備濃縮カ
ラム９から排出される（第３図（ｄ）参照）、ここで、
流路切換え弁１０を実線で示す流路から破線で示す流路
へと切換えると、溶離液４ａは予備濃縮カラム９に流入
する。この溶離液には約６０％の有機溶媒が含まれてい
るため第２の相互作用で吸着されている目的成分の誘導
体は脱着される（第３図（ｅ）参照）脱着された目的成
分の誘導体は溶離液４ｃとともに分離カラム１１内に流
入し、ここで、単一の成分ごと分離される。さらに、こ
れらの成分は検出器１２に達し、検出される。

第２図は実施例２で述べた操作手順を示したタイムチャ
ートである。分析スタートから約１０分間は試料の前処
理工程で、低圧ポンプ５ａ〜５ｃはシリーズにそれぞれ
の溶液を送液する。高圧ポンプ７は分析スタート後約８
分間は０．１ｍＱ／ｌｌｌ１ｎで溶離液を流して分離カ
ラム１１のコンディショニングを行い、分離・検出の２
分前から定常の流量で送液するようにしている。また、
流路切換え弁１０は分析スタート後１０分で第１図の点
線で示す流路に切換わり数分後には実線流路に戻してい
る。これは、予備濃縮カラム１１に吸着されている成分
の脱着が終った時点ですぐに同カラムの初期化を並行し
て行い、分析時間の短縮を図っているためである。

第４図において（ａ）は本発明による実施例２の生化学
分析法の流れを示したものである。血清や尿等の検体は
被験者からサンプリングされてオートサンプラー上にセ
ットされ（工程１）、オ−トサンプラーの機能を利用し
て内標準物質の添加、混合（工程２）、予備濃縮とアル
ブミン除去（工程３）、吸着剤に吸着されているカラコ
ールアミンと誘導体化試薬とのカップリング（工程４）
、グロブリン等の蛋白質の除去（工程５）、液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）による分離検出（工程６）で
構成される。第４図には比較のために、ジャーナル　オ
ブ　クロマトグラフィー２１８　（１９８１年）第６３
１頁から第６３７頁（Ｊ、ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　２
１　Ｂ（１９８１）Ｐ　Ｐ　６３１〜６３７）に記載の
方法に準拠した従来例を（ｂ）に示した。従来例は工程
２までは本発明の実施例（ａ）と同様であるが、ＨＰＬ
Ｃによる分離（工程５）を行った後でカテコールアミン
類を蛍光体に変換するための各種試薬と混合（工程６）
して検出するようになっている。特に、従来例の工程６
では０．２ｍｏＱ／ｗｉｎのカラム溶出液に４種類の試
薬をそれぞれ加え、合計でｌ　ｍ　Ｑ　／ｍｉｓになる
ようにしている。

第５図は、本発明による実施例の方法で得られたクロマ
トグラムである。試料には管理血清にカテコールアミン
（ノルエピネフリン、ＮＥ、エピネフリンｌＥｔ　ドー
パミン、ＤＡ）が５０Ｐｇ１ｍＱになるように添加した
ものを用いた。チャートスピード：　２０　ｍｎ／　ｍ
ｉｎ　、蛍光モニタの感度は×１０である。ここで、ピ
ーク１，２，３．４はそれぞれ、ＮＥ、Ｅ、ＤＡ及びＤ
Ａを示している。

本実施例によれば次の効果がある。

（１）除蛋白、誘導体化を予備濃縮カラム中で、オンラ
インで行うため前処理操作の高速化、自動化ができる。

（２）プレラベル法であるため従来法よりもＳ／Ｎが改
善される。

（３）目的成分の解離基に環状化合物をカップリングし
てイオン性の支配力を弱めるため分離カラムとして逆相
系が使用できる。従って分離の高速化が可能となる。

実施例３ 試料として、Ｅ９０ｐｇ／ｍＱ、ＮＥ３４０ｐｇ／ｍＡ
、ＤＡ５０ρｇ／ｍｆｌと正常血液中の濃度に近いモデ
ル血清を用い、分析の再現性を調べた。条件はすべて実
施例２と同様である。この結果を第１表に示す。なお、
この表には第４図（ｂ）に示した従来例で得られた得も
比較のために示しある。

本実施例の値は予備濃縮カラムによる前処理操作に起因
する変動も含んだものである。この表より、本実施例は
前処理操作を自動化した結果従来例よりも測定精度が高
いことが明らかである。

第　　１　　表 で、高感度分析が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による分析装置のフローを示す図、第２
図は第１図装置を用いてカテコールアミンを分析する場
合のタイムチャート、第３図は前処理工程を示す概念図
、第４図は本発明による実施例と従来例の分析の流れを
示す図、第５図は第１図、第２図実施例で示した装置及
び方法で得られたクロマトグラムを示す図である。 ５・・・低圧ポンプ、７・・・高圧ポンプ、８・・・オ
ートサンプラー、９・・・予備濃縮カラム、１０・・・
流路切換え弁、１１・・・分離カラム、１２・・・検出
器、１３・・・データプロセッサー ［発明の効果］ 本発明によれば、除蛋白及び誘導体化等の前処理操作を
予備濃縮カラム内でできるので、前処理操作の自動化、
高速化、高精度化が達成できる。 また、前処理用溶液による試料の希釈がないの第 因 第 図 第２区 第４図 第５図 間 ６分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、吸着剤を充填した予備濃縮カラムに調整液を流して
   カラムの初期化を行う工程、上記カラムに血清等の生体
   液試料を付して調整液とともに通過させ試料中の目的成
   分をある特定の相互作用（第１の相互作用）を利用して
   吸着する工程、吸着された目的成分と選択的に反応し、
   かつ、この反応生成物と吸着剤との間に第１の相互作用
   より支配的な新たな相互作用（第２の相互作用）を生じ
   せしめる誘導体化試薬をカラムに導入する工程、吸着剤
   に第１の相互作用により吸着されている成分だけを脱着
   する再生液をカラムに導入する工程、吸着剤に第２の相
   互作用で吸着されている目的成分と誘導体化試薬との反
   応生成物（誘導体）を脱着する脱着液をカラムに導入す
   る工程、脱着された誘導体を分離、検出する工程からな
   ることを特徴とする生化学成分の分析方法。 ２、第１の相互作用がイオン結合、水素結合、電荷移動
   型結合のうちのいずれか１つから選択され、第２の相互
   作用が上記した相互作用のうち、第１の相互作用として
   選択した以外の相互作用、あるいは、立体的一化学的作
   用及び第１の相互作用に上げたものの複合型であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の生化学成分の
   分析方法。 ３、溶離液、分離カラム、送液ポンプ、検出器で構成さ
   れる液体クロマトグラフに基づく分析装置において、少
   なくとも１台の高圧送液ポンプと６方流路切換弁を有し
   、試料、調整液、誘導体化試薬及び再生液の前処理用溶
   液等はそれぞれ独立した送液手段に接続され、高圧送液
   ポンプには溶離液が接続され、さらに、上記流路切換え
   弁に、（イ）サンプル及び前処理用溶液と（ロ）予備濃
   縮カラムと（ハ）溶離液と（ニ）分離カラムとがそれぞ
   れ配管を介して接続される構成であることを特徴とする
   生化学成分の分析装置。 ４、分離カラムに使用する充填剤の分離モードは目的成
   分と誘導体化試薬との反応生成物と予備濃縮カラム中の
   吸着剤とに生じた第２の相互作用と同じであり、かつ、
   目的成分と誘導体化試薬との反応生成物に対する作用が
   吸着剤よりも強いものであることを特徴とする特許請求
   の範囲第３項記載の生化学成分の分析装置。