JP2510302B2 - 生体液中アミン類の測定法 - Google Patents
生体液中アミン類の測定法Info
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- JP2510302B2 JP2510302B2 JP1300362A JP30036289A JP2510302B2 JP 2510302 B2 JP2510302 B2 JP 2510302B2 JP 1300362 A JP1300362 A JP 1300362A JP 30036289 A JP30036289 A JP 30036289A JP 2510302 B2 JP2510302 B2 JP 2510302B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は蛋白成分を含有する生体液中のアミン類の分
析方法、さらに詳しくは、逆相系の液体クラマトグラフ
ィー法により血漿、血清などに含有される生体アミン類
を、混在している蛋白成分、疎水性成分の妨害を受ける
ことなく精度よく測定する方法に関する。
析方法、さらに詳しくは、逆相系の液体クラマトグラフ
ィー法により血漿、血清などに含有される生体アミン類
を、混在している蛋白成分、疎水性成分の妨害を受ける
ことなく精度よく測定する方法に関する。
血清、髄液等に含まれるカテコールアミン類、ヒスタ
ミン、セロトニン等のインドールアミン類をはじめとす
る生体アミン類を液体クロマトグラフィー法、特に高速
液体クロマトグラフィー法によって測定し病理学的な研
究や診断に利用することが広く行われている。これらの
生体液試料中には一般にアルブミン等の蛋白成分が含ま
れているため、これらの蛋白成分の影響により分析精度
や分析カラム機能が低下したり、該分析カラムの寿命が
短くなったりする。そのため、生体アミンの測定におい
ては、予め過塩素酸処理などの除蛋白操作により蛋白成
分を除いた試料を用いるのが普通である。しかし、この
ような方法では除蛋白操作に何段階もの操作を必要と
し、かつ長時間を要するため被測定物質の損失や分解が
生じる。さらに、上記除蛋白操作は煩雑であるうえ被測
定物質の回収率が悪く、再現性に乏しい。
ミン、セロトニン等のインドールアミン類をはじめとす
る生体アミン類を液体クロマトグラフィー法、特に高速
液体クロマトグラフィー法によって測定し病理学的な研
究や診断に利用することが広く行われている。これらの
生体液試料中には一般にアルブミン等の蛋白成分が含ま
れているため、これらの蛋白成分の影響により分析精度
や分析カラム機能が低下したり、該分析カラムの寿命が
短くなったりする。そのため、生体アミンの測定におい
ては、予め過塩素酸処理などの除蛋白操作により蛋白成
分を除いた試料を用いるのが普通である。しかし、この
ような方法では除蛋白操作に何段階もの操作を必要と
し、かつ長時間を要するため被測定物質の損失や分解が
生じる。さらに、上記除蛋白操作は煩雑であるうえ被測
定物質の回収率が悪く、再現性に乏しい。
これに対して、特願昭58−223061号公報には蛋白成分
及び非蛋白性の被測定物質を含む試料液を除蛋白カラム
に通して非蛋白質成分のみを吸着させ蛋白成分を通過除
去した後吸着した非蛋白成分を溶出させてこれを分析カ
ラムに導く方法が開示されている。この方法によれば、
上記除蛋白操作を必要とせず試料中の被測定物質が直接
測定されるため短時間で再現性のよい測定がなされる。
及び非蛋白性の被測定物質を含む試料液を除蛋白カラム
に通して非蛋白質成分のみを吸着させ蛋白成分を通過除
去した後吸着した非蛋白成分を溶出させてこれを分析カ
ラムに導く方法が開示されている。この方法によれば、
上記除蛋白操作を必要とせず試料中の被測定物質が直接
測定されるため短時間で再現性のよい測定がなされる。
しかし、上記公報に開示された方法を改良し蛋白非吸
着性弱陽イオン交換樹脂を充填した除蛋白カラムを用い
た方法を採用した場合、除蛋白効果は良好であるが、血
清などの生体液試料中に疎水性の強い物質が共存してい
る場合、その物質は生体アミン類と共に上記除蛋白カラ
ム充填剤に吸着され、さらに溶離液により両物質とも上
記除蛋白カラムから脱着後、分析カラムに導かれる。本
発明で言う疎水性物質とは生体中で生合成されるコレス
テロール類、胆汁酸類、プロゲステロン、アンドロステ
ロン、エストロジェン等のステロイドホルモン類、ビリ
ルビン等があり、また、生体外から供給される脂溶性ビ
タミン類や脂溶性薬物等が挙げられる。通常、被測定物
質より疎水性（親油性）が強い物質は逆相クロマトグラ
フィー用充填剤に対して被測定物質より吸着し易い。従
って、被測定物質より疎水性の強い物質は被測定物質に
比較してより長い溶出時間を要する。このように、従来
の除蛋白カラム法では試料中に被測定物質より疎水性が
強い物質が共存している場合、被測定物質よりも疎水性
が強い物質も除蛋白カラムに吸着し脱着後、分析カラム
に導入されるため被測定物質単体を測定する場合よりも
長く測定時間を要し、さらには、被測定物質のピークと
疎水性物質のピークが重なる場合、被測定物質の定量性
が損なわれるという欠点がある。
着性弱陽イオン交換樹脂を充填した除蛋白カラムを用い
た方法を採用した場合、除蛋白効果は良好であるが、血
清などの生体液試料中に疎水性の強い物質が共存してい
る場合、その物質は生体アミン類と共に上記除蛋白カラ
ム充填剤に吸着され、さらに溶離液により両物質とも上
記除蛋白カラムから脱着後、分析カラムに導かれる。本
発明で言う疎水性物質とは生体中で生合成されるコレス
テロール類、胆汁酸類、プロゲステロン、アンドロステ
ロン、エストロジェン等のステロイドホルモン類、ビリ
ルビン等があり、また、生体外から供給される脂溶性ビ
タミン類や脂溶性薬物等が挙げられる。通常、被測定物
質より疎水性（親油性）が強い物質は逆相クロマトグラ
フィー用充填剤に対して被測定物質より吸着し易い。従
って、被測定物質より疎水性の強い物質は被測定物質に
比較してより長い溶出時間を要する。このように、従来
の除蛋白カラム法では試料中に被測定物質より疎水性が
強い物質が共存している場合、被測定物質よりも疎水性
が強い物質も除蛋白カラムに吸着し脱着後、分析カラム
に導入されるため被測定物質単体を測定する場合よりも
長く測定時間を要し、さらには、被測定物質のピークと
疎水性物質のピークが重なる場合、被測定物質の定量性
が損なわれるという欠点がある。
本発明は上記欠点を解決するものであり、その目的と
するところは、生体アミン類及び蛋白質を含む生体液試
料中の該アミン類を煩雑な除蛋白操作を行うことなく、
さらには、夾雑物の影響が少ない条件で短時間に測定す
る方法を提供することにある。
するところは、生体アミン類及び蛋白質を含む生体液試
料中の該アミン類を煩雑な除蛋白操作を行うことなく、
さらには、夾雑物の影響が少ない条件で短時間に測定す
る方法を提供することにある。
本発明の生体液中アミン類の測定法は、アミン類を含
む生体液試料を前処理移動相と共に該アミン類及び蛋白
質を吸着しない逆相クロマトグラフィー用充填剤充填の
第１除蛋白カラムに導入し疎水性物質を吸着させると共
に該アミン類及び蛋白質を吸着させることなく該第１除
蛋白カラムを通過させる工程、b.該第１除蛋白カラム通
過液を弱陽イオン交換樹脂充填の第２除蛋白カラムに導
入し該アミン類を吸着させると共に蛋白質を吸着させる
ことなく該第２除蛋白カラムを通過させることにより蛋
白質を除去する工程、c.該第２除蛋白カラムに溶離液を
供給し該第２除蛋白カラム充填剤に吸着されている該ア
ミン類を脱着させる工程、d.脱着した該アミン類を分析
カラムに導いてこれを分析する工程、を包含し、そのこ
とにより上記目的が達成される。
む生体液試料を前処理移動相と共に該アミン類及び蛋白
質を吸着しない逆相クロマトグラフィー用充填剤充填の
第１除蛋白カラムに導入し疎水性物質を吸着させると共
に該アミン類及び蛋白質を吸着させることなく該第１除
蛋白カラムを通過させる工程、b.該第１除蛋白カラム通
過液を弱陽イオン交換樹脂充填の第２除蛋白カラムに導
入し該アミン類を吸着させると共に蛋白質を吸着させる
ことなく該第２除蛋白カラムを通過させることにより蛋
白質を除去する工程、c.該第２除蛋白カラムに溶離液を
供給し該第２除蛋白カラム充填剤に吸着されている該ア
ミン類を脱着させる工程、d.脱着した該アミン類を分析
カラムに導いてこれを分析する工程、を包含し、そのこ
とにより上記目的が達成される。
本発明により測定しうる生体アミン類としてはカテコ
ールアミン類、インドールアミン類、ポリアミン類、ヒ
スタミン類が挙げられる。これらは主に生体成分として
血液中や髄液中あるいは尿中に存在する物質である。
ールアミン類、インドールアミン類、ポリアミン類、ヒ
スタミン類が挙げられる。これらは主に生体成分として
血液中や髄液中あるいは尿中に存在する物質である。
本発明の方法は例えば第１図（Ａ）及び（Ｂ）に示す
装置により具体化される。この装置は接続端Ａ〜Ｆを有
する六方バルブ４に、第２除蛋白カラム５が接続端B,E
を介して接続されている。また、第１除蛋白カラム10が
六方バルブ接続端Ａ及び試料導入装置３の間に接続され
ている。除蛋白液収容槽11中の除蛋白液１が定流量ポン
プ２によって試料導入装置３及び第１除蛋白カラム10さ
らに接続端A,Bを経て第２除蛋白カラム５に送られ、そ
こから接続端E,Fを通り系外に排出される。第１除蛋白
カラム10に充填される充填剤は、一定の条件、例えば水
あるいはある特定のpH緩衝液中では親油成分を吸着しア
ミン類及び蛋白成分は吸着しない。第１除蛋白カラム10
の充填剤としては通常の逆相クロマトグラフィー用の充
填剤、特に親水性の高い充填剤が用いられる。例えば、
水酸基、エーテル基等の親水性の基をその表面に有する
高分子系ゲルが用いられる。その素材としては、例えば
テトラメチロールメタントリアクリレートやｎ−エチレ
ングリコールジメタクリレート（ｎは２〜４）の単独重
合体、もしくはこれらと他の単量体との共重合体でなる
粒子が挙げられる。特に懸濁重合によって得られる粒径
20〜30μｍ程度の微粒子を用いることが望ましい。ま
た、第２除蛋白カラム５に充填される充填剤は、一定の
条件、例えば水あるいは特定のpHの緩衝液中ではアミン
類を吸着し蛋白成分を吸着しない。そして他の条件、例
えば上記とは異なるpHや塩濃度の緩衝液中ではカラムに
吸着した上記アミン類を溶離する性質を有する。第２除
蛋白カラム５の充填剤としては、通常の陽イオン交換樹
脂、特にカルボキシル基をその表面に有し、親水性の高
い弱陽イオン交換樹脂を用いるのが好ましい。その素材
としては、例えばスチレンとジビニルベンゼンの共重合
体にカルボキシル基をその表面に導入した高分子系ゲル
でなる粒子が挙げられる。特に、懸濁重合によって得ら
れる粒径20〜30μｍ程度の微粒子を用いることが好まし
い。試料としては、例えば、上記生体アミン類を含む除
蛋白処理の行われていない血清試料が用いられる。除蛋
白液としては水や各緩衝液が使用され得、特に、水もし
くは弱アルカリ性の低濃度緩衝液が好適である。
装置により具体化される。この装置は接続端Ａ〜Ｆを有
する六方バルブ４に、第２除蛋白カラム５が接続端B,E
を介して接続されている。また、第１除蛋白カラム10が
六方バルブ接続端Ａ及び試料導入装置３の間に接続され
ている。除蛋白液収容槽11中の除蛋白液１が定流量ポン
プ２によって試料導入装置３及び第１除蛋白カラム10さ
らに接続端A,Bを経て第２除蛋白カラム５に送られ、そ
こから接続端E,Fを通り系外に排出される。第１除蛋白
カラム10に充填される充填剤は、一定の条件、例えば水
あるいはある特定のpH緩衝液中では親油成分を吸着しア
ミン類及び蛋白成分は吸着しない。第１除蛋白カラム10
の充填剤としては通常の逆相クロマトグラフィー用の充
填剤、特に親水性の高い充填剤が用いられる。例えば、
水酸基、エーテル基等の親水性の基をその表面に有する
高分子系ゲルが用いられる。その素材としては、例えば
テトラメチロールメタントリアクリレートやｎ−エチレ
ングリコールジメタクリレート（ｎは２〜４）の単独重
合体、もしくはこれらと他の単量体との共重合体でなる
粒子が挙げられる。特に懸濁重合によって得られる粒径
20〜30μｍ程度の微粒子を用いることが望ましい。ま
た、第２除蛋白カラム５に充填される充填剤は、一定の
条件、例えば水あるいは特定のpHの緩衝液中ではアミン
類を吸着し蛋白成分を吸着しない。そして他の条件、例
えば上記とは異なるpHや塩濃度の緩衝液中ではカラムに
吸着した上記アミン類を溶離する性質を有する。第２除
蛋白カラム５の充填剤としては、通常の陽イオン交換樹
脂、特にカルボキシル基をその表面に有し、親水性の高
い弱陽イオン交換樹脂を用いるのが好ましい。その素材
としては、例えばスチレンとジビニルベンゼンの共重合
体にカルボキシル基をその表面に導入した高分子系ゲル
でなる粒子が挙げられる。特に、懸濁重合によって得ら
れる粒径20〜30μｍ程度の微粒子を用いることが好まし
い。試料としては、例えば、上記生体アミン類を含む除
蛋白処理の行われていない血清試料が用いられる。除蛋
白液としては水や各緩衝液が使用され得、特に、水もし
くは弱アルカリ性の低濃度緩衝液が好適である。
上記試料は試料導入装置３により系内に導入され、定
流量ポンプ２より除蛋白液と共に移送されて第１除蛋白
カラム10に達する。上記試料中の疎水性物質は第１除蛋
白カラム10の充填剤に吸着する。試料中のアミン類及び
蛋白成分は吸着されずに第１除蛋白カラム10を通過し六
方バルブ４の接続端A,Bを経て第２除蛋白カラム５に導
かれる。第２除蛋白カラム５の充填剤表面のカルボキシ
ル基は除蛋白液により十分解離して陰性に荷電してお
り、試料中の陽性に荷電しているアミン類と特異的にイ
オン結合を形成することによりアミン類がカラム充填剤
に吸着される。一方、試料中の蛋白成分は吸着されず第
２蛋白カラムを通過し、六方バルブ４の接続端E,Fを経
て系外に排出される。
流量ポンプ２より除蛋白液と共に移送されて第１除蛋白
カラム10に達する。上記試料中の疎水性物質は第１除蛋
白カラム10の充填剤に吸着する。試料中のアミン類及び
蛋白成分は吸着されずに第１除蛋白カラム10を通過し六
方バルブ４の接続端A,Bを経て第２除蛋白カラム５に導
かれる。第２除蛋白カラム５の充填剤表面のカルボキシ
ル基は除蛋白液により十分解離して陰性に荷電してお
り、試料中の陽性に荷電しているアミン類と特異的にイ
オン結合を形成することによりアミン類がカラム充填剤
に吸着される。一方、試料中の蛋白成分は吸着されず第
２蛋白カラムを通過し、六方バルブ４の接続端E,Fを経
て系外に排出される。
他方、溶離液槽61中の溶離液６は定流量ポンプ７によ
り接続端Ｄ及びＣを経由して液体クロマトグラフィーの
分析カラム８へ送られる。ついで第１図（Ｂ）に示すよ
うに、六方バルブ４を切り換えて接続端ＤをＥに接続す
ると、定流量ポンプ７により溶離液槽61の溶離液６が接
続端Ｄ及びＥを経て第２除蛋白カラム５に供給される。
溶離液がカラム５を通過することにより、吸着されてい
たアミン類が溶離され（脱着し）、溶離液と共に接続端
Ｂ及びＣを経て分析カラム８に達する。アミン類は分析
カラム８で分離され、分析カラム８以降に設けられた図
外の適切な検出器により検出される。分析カラム８に充
填される充填剤は第１及び第２除蛋白カラムに用いられ
ている充填剤よりも吸着性の高いものが使用される。こ
のような吸着性の高い充填剤を用いることにより第２除
蛋白カラムに吸着されていたアミン類を溶離液によって
完全に脱着させ、これをそのまま分析カラムに流しここ
でアミン類を精度よく分離し分析することができる。分
析カラム８に充填される吸着性の高い充填剤としては、
ポリマー系担体あるいはシリカ系担体にオクタデシル
基、オクチル基、スルホプロピル基等を化学結合させた
ものが好ましい。例えば、TSK gel SCX〔東ソー
（株）〕、Asahipak ODP〔旭化成工業（株）〕、LICROS
ORB RP−18,LICROSORB RP−８〔メルク社〕、YMC Pack
ODS、YMC Pack C8〔（株）YMC〕が挙げられる。
り接続端Ｄ及びＣを経由して液体クロマトグラフィーの
分析カラム８へ送られる。ついで第１図（Ｂ）に示すよ
うに、六方バルブ４を切り換えて接続端ＤをＥに接続す
ると、定流量ポンプ７により溶離液槽61の溶離液６が接
続端Ｄ及びＥを経て第２除蛋白カラム５に供給される。
溶離液がカラム５を通過することにより、吸着されてい
たアミン類が溶離され（脱着し）、溶離液と共に接続端
Ｂ及びＣを経て分析カラム８に達する。アミン類は分析
カラム８で分離され、分析カラム８以降に設けられた図
外の適切な検出器により検出される。分析カラム８に充
填される充填剤は第１及び第２除蛋白カラムに用いられ
ている充填剤よりも吸着性の高いものが使用される。こ
のような吸着性の高い充填剤を用いることにより第２除
蛋白カラムに吸着されていたアミン類を溶離液によって
完全に脱着させ、これをそのまま分析カラムに流しここ
でアミン類を精度よく分離し分析することができる。分
析カラム８に充填される吸着性の高い充填剤としては、
ポリマー系担体あるいはシリカ系担体にオクタデシル
基、オクチル基、スルホプロピル基等を化学結合させた
ものが好ましい。例えば、TSK gel SCX〔東ソー
（株）〕、Asahipak ODP〔旭化成工業（株）〕、LICROS
ORB RP−18,LICROSORB RP−８〔メルク社〕、YMC Pack
ODS、YMC Pack C8〔（株）YMC〕が挙げられる。
本発明では、生体液試料中の疎水性物質は逆相系のク
ロマトグラフィー用ゲルが充填された第１除蛋白カラム
に吸着除去され、さらに弱陽イオン交換樹脂が充填され
た第２除蛋白カラムでアミン類のみがイオン結合を形成
して吸着されるため蛋白成分とも効果的に分離される。
疎水性物質が予め第１除蛋白カラムで除去されているた
め分析カラム８に導入されるのはアミン類のみであり夾
雑ピークの少ない条件で、かつ、従来より短時間で測定
可能となる。蛋白成分及び疎水性物質の除去されたアミ
ン類は通常の高速液体クロマトグラフィーにおける方法
と同様に分析カラム８で分離され測定される。このよう
に疎水性妨害物質が共存する生体液中アミン類の一般的
な測定方法として多方面で利用され得る。
ロマトグラフィー用ゲルが充填された第１除蛋白カラム
に吸着除去され、さらに弱陽イオン交換樹脂が充填され
た第２除蛋白カラムでアミン類のみがイオン結合を形成
して吸着されるため蛋白成分とも効果的に分離される。
疎水性物質が予め第１除蛋白カラムで除去されているた
め分析カラム８に導入されるのはアミン類のみであり夾
雑ピークの少ない条件で、かつ、従来より短時間で測定
可能となる。蛋白成分及び疎水性物質の除去されたアミ
ン類は通常の高速液体クロマトグラフィーにおける方法
と同様に分析カラム８で分離され測定される。このよう
に疎水性妨害物質が共存する生体液中アミン類の一般的
な測定方法として多方面で利用され得る。
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する
が、これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するも
のではない。
が、これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するも
のではない。
実施例１ （Ａ） 第１除蛋白カラム充填剤ゲルの調製 ４重量％のポリビニルアルコール水溶液400mlにテト
ラエチレングリコールジケタクリレート40g、テトラメ
チロールメタントリアクリレート10g、トルエン40g、及
び過酸化ベンゾイル1.5gを加えた。400rpmで撹拌しなが
ら80℃で10時間反応させた後、熱水及びアセトンで洗浄
し、粒子径20〜30μｍの高分子球状多孔体を得た。
ラエチレングリコールジケタクリレート40g、テトラメ
チロールメタントリアクリレート10g、トルエン40g、及
び過酸化ベンゾイル1.5gを加えた。400rpmで撹拌しなが
ら80℃で10時間反応させた後、熱水及びアセトンで洗浄
し、粒子径20〜30μｍの高分子球状多孔体を得た。
（Ｂ） 第２除蛋白カラム充填剤ゲルの調製 ４重量％のポリビニルアルコール水溶液500mlにジビ
ニルベゼン30g、スチレン10g、メタクリル酸30g、トル
エン50g、及びベンゾイル1.5gを加えた。400rpmで撹拌
しながら80℃で10時間反応させた後、熱水及びアセトン
で洗浄し、粒子径20〜30μｍの高分子球状多孔体を得
た。
ニルベゼン30g、スチレン10g、メタクリル酸30g、トル
エン50g、及びベンゾイル1.5gを加えた。400rpmで撹拌
しながら80℃で10時間反応させた後、熱水及びアセトン
で洗浄し、粒子径20〜30μｍの高分子球状多孔体を得
た。
（Ｃ） 生体アミンの測定 第１図に示す測定装置を用いて血漿中のノルアドレナ
リン、アドレナリン、ドーパミンの測定を行った。第１
除蛋白カラム10としては（Ａ）項で得られた充填剤ゲル
を内径4mm、長さ20mmのステンレス製カラムに充填した
ものを使用した。また、第２除蛋白カラム５としては
（Ｂ）項で得られた充填剤ゲルを内径4mm、長さ20mmの
ステンレス製カラムに充填したものを使用した。分析カ
ラム８としては、ODS系の逆相クロマトグラフィー用の
市販のカラム（パックドカラムＡ−303;山村化学社製；
カラムサイズ内径4.6mm、長さ250mm）を用いた。除蛋白
液としてはエタノールと10mMリン酸緩衝液（pH8.3）の
混合液（容量比8/92）を、そして溶離液６としては、5m
Mペンタンスルホン酸ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝
液（pH3.0）とメタノールとの混合液（容量比85/15）を
使用した。
リン、アドレナリン、ドーパミンの測定を行った。第１
除蛋白カラム10としては（Ａ）項で得られた充填剤ゲル
を内径4mm、長さ20mmのステンレス製カラムに充填した
ものを使用した。また、第２除蛋白カラム５としては
（Ｂ）項で得られた充填剤ゲルを内径4mm、長さ20mmの
ステンレス製カラムに充填したものを使用した。分析カ
ラム８としては、ODS系の逆相クロマトグラフィー用の
市販のカラム（パックドカラムＡ−303;山村化学社製；
カラムサイズ内径4.6mm、長さ250mm）を用いた。除蛋白
液としてはエタノールと10mMリン酸緩衝液（pH8.3）の
混合液（容量比8/92）を、そして溶離液６としては、5m
Mペンタンスルホン酸ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝
液（pH3.0）とメタノールとの混合液（容量比85/15）を
使用した。
まず、第１図（Ａ）に示すように、定流量ポンプ２に
より除蛋白液１を0.6ml/分の割合で第１除蛋白カラム1
0、さらに六方バルブ４の接続端A,Bを経て第２除蛋白カ
ラム５に流しながら、試料導入装置３から試料血漿500
μを注入した。この試料は、正常人男子血漿である。
試料注入８分後に六方バルブ４を切り換え第１図（Ｂ）
に示すように接続した。ポンプ７により、溶離液槽61中
から溶離液６を1.0ml/分の割合で六方バルブの接続端D,
E、第２除蛋白カラム５そして六方バルブの接続端B,Cを
経て液体クロマトグラフの分析カラム８へ通した。上記
溶離液の流通により被測定物質が溶離し分析カラムによ
り分離されて検出器（図外）により検出された。検出器
としては、電気化学検出器（M460:Waters社製）を用
い、印可電圧650mVで測定を行った。得られたクロマト
グラムを第２図（Ａ）に示す。第２図（Ａ）においてノ
ルアドレナリンのピークａ及びアドレナリンのピーク
ｂ、ドーパミンのピークｃが確認される。
より除蛋白液１を0.6ml/分の割合で第１除蛋白カラム1
0、さらに六方バルブ４の接続端A,Bを経て第２除蛋白カ
ラム５に流しながら、試料導入装置３から試料血漿500
μを注入した。この試料は、正常人男子血漿である。
試料注入８分後に六方バルブ４を切り換え第１図（Ｂ）
に示すように接続した。ポンプ７により、溶離液槽61中
から溶離液６を1.0ml/分の割合で六方バルブの接続端D,
E、第２除蛋白カラム５そして六方バルブの接続端B,Cを
経て液体クロマトグラフの分析カラム８へ通した。上記
溶離液の流通により被測定物質が溶離し分析カラムによ
り分離されて検出器（図外）により検出された。検出器
としては、電気化学検出器（M460:Waters社製）を用
い、印可電圧650mVで測定を行った。得られたクロマト
グラムを第２図（Ａ）に示す。第２図（Ａ）においてノ
ルアドレナリンのピークａ及びアドレナリンのピーク
ｂ、ドーパミンのピークｃが確認される。
比較例１ 第１除蛋白カラム10を使用しないこと以外は実施例１
と同様である。得られたクロマトグラムを第２図（Ｂ）
に示す。第２図（Ｂ）においてノルアドレナリン、アド
レナリン及びドーパミンのピーク以外に夾雑ピークｄが
確認される。
と同様である。得られたクロマトグラムを第２図（Ｂ）
に示す。第２図（Ｂ）においてノルアドレナリン、アド
レナリン及びドーパミンのピーク以外に夾雑ピークｄが
確認される。
実施例２ 試料として正常男子尿を用い、溶離液として5mMペン
タンスルホン酸ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH
3.0）とメタノールの混合液（容量比80/20）を用いたこ
と以外は実施例１と同様である。得られたクロマトグラ
ムを第３図（Ａ）に示す。第３図（Ａ）においてセロト
ニンのピークｅが確認される。
タンスルホン酸ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH
3.0）とメタノールの混合液（容量比80/20）を用いたこ
と以外は実施例１と同様である。得られたクロマトグラ
ムを第３図（Ａ）に示す。第３図（Ａ）においてセロト
ニンのピークｅが確認される。
比較例２ 第１除蛋白カラム10を使用しないこと以外は実施例２
と同様である。得られたクロマトグラムを第３図（Ｂ）
に示す。第３図（Ｂ）において、セロトニンのピーク以
外に夾雑ピークf,gが確認される。
と同様である。得られたクロマトグラムを第３図（Ｂ）
に示す。第３図（Ｂ）において、セロトニンのピーク以
外に夾雑ピークf,gが確認される。
本発明によれば、蛋白成分が共存する試料（血漿、血
清、尿）において、被測定物質が、該蛋白成分及び疎水
性夾雑成分の影響を受けることなく高精度で、かつ短時
間に測定される。従って、本法により各種診断や病理研
究が効果的になされ得る。
清、尿）において、被測定物質が、該蛋白成分及び疎水
性夾雑成分の影響を受けることなく高精度で、かつ短時
間に測定される。従って、本法により各種診断や病理研
究が効果的になされ得る。
第１図（Ａ）及び（Ｂ）は本発明方法の実施に用いられ
る測定装置の一例を示す接続図、第２図（Ａ）及び第３
図（Ａ）は本発明の実施例で得られたクロマトグラム、
第２図（Ｂ）及び第３図（Ｂ）は第１除蛋白カラムを使
用しない例における第２図（Ａ）及び第３図（Ａ）に対
応するクロマトグラムである。 1:除蛋白液、2:定流量ポンプ、3:試料導入装置、4:六方
バルブ、5:第２除蛋白カラム、6:溶離液、7:定流量ポン
プ、8:分析カラム、10:第１除蛋白カラム、11:除蛋白液
収容槽、61:溶離液槽
る測定装置の一例を示す接続図、第２図（Ａ）及び第３
図（Ａ）は本発明の実施例で得られたクロマトグラム、
第２図（Ｂ）及び第３図（Ｂ）は第１除蛋白カラムを使
用しない例における第２図（Ａ）及び第３図（Ａ）に対
応するクロマトグラムである。 1:除蛋白液、2:定流量ポンプ、3:試料導入装置、4:六方
バルブ、5:第２除蛋白カラム、6:溶離液、7:定流量ポン
プ、8:分析カラム、10:第１除蛋白カラム、11:除蛋白液
収容槽、61:溶離液槽
Claims (1)
- 【請求項１】アミン類を含む生体液試料を高速液体クロ
マトグラフィーで測定するにあたり、a.該試料を前処理
移動相と共に該アミン類及び蛋白質を吸着しない逆相ク
ロマトグラフィー用充填剤充填の第１除蛋白カラムに導
入し疎水性物質を吸着させると共に該アミン類及び蛋白
質を吸着させることなく該第１除蛋白カラムを通過させ
る工程、b.該第１除蛋白カラム通過液を弱陽イオン交換
樹脂充填の第２除蛋白カラムに導入し該アミン類を吸着
させると共に蛋白質を吸着させることなく該第２除蛋白
カラムを通過させることにより蛋白質を除去する工程、
c.該第２除蛋白カラムに溶離液を供給し該第２除蛋白カ
ラム充填剤に吸着されている該アミン類を脱着させる工
程、d.脱着した該アミン類を分析カラムに導いてこれを
分析する工程、を包含する生体液中アミン類の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1300362A JP2510302B2 (ja) | 1989-11-17 | 1989-11-17 | 生体液中アミン類の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1300362A JP2510302B2 (ja) | 1989-11-17 | 1989-11-17 | 生体液中アミン類の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03160365A JPH03160365A (ja) | 1991-07-10 |
| JP2510302B2 true JP2510302B2 (ja) | 1996-06-26 |
Family
ID=17883868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1300362A Expired - Fee Related JP2510302B2 (ja) | 1989-11-17 | 1989-11-17 | 生体液中アミン類の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2510302B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010527452A (ja) * | 2007-05-15 | 2010-08-12 | ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン | 血漿メタネフリンを検出するための装置および方法 |
| JP5471287B2 (ja) * | 2009-10-21 | 2014-04-16 | 東ソー株式会社 | セロトニンの測定方法 |
| JP5662182B2 (ja) * | 2010-02-08 | 2015-01-28 | 地方独立行政法人神奈川県立病院機構 | 生体試料中のアミンの測定方法およびその方法を用いる患者のスクリーニング方法 |
| JP5267491B2 (ja) * | 2010-03-15 | 2013-08-21 | 三菱化学株式会社 | 糖鎖分離方法、検体分析方法、液体クロマトグラフィー装置、並びに糖鎖分析方法及び糖鎖分析装置 |
-
1989
- 1989-11-17 JP JP1300362A patent/JP2510302B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03160365A (ja) | 1991-07-10 |
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