JPS63163277A - カテコ−ルアミンの分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はカテコールアミンの分析方法、さらに詳しくは
、試料中のカテコールアミンを逆相系の液体クロマトグ
ラフィー法により、混在している蛋白成分の妨害をうけ
ることなく精度よ（分析する方法に関する。

（従来の技術） アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン。

セロトニンなどのカテコールアミンを液体クロマトグラ
フィー法、特に高速液体クロマトグラフィー法によって
分析し、病理学的な研究や診断に利用することが広く行
われている。血清などの生体試料中には一般にアルブミ
ンなどの蛋白成分が含まれているため、この蛋白成分の
影響により１分析精度や分析カラム機能が低下したり、
該分析カラムの寿命が短くなったりする。そのため、あ
らかじめ過塩素酸処理などの除蛋白操作により蛋白成分
を除いた試料を用いるのが普通である。しかし、このよ
うな方法では除蛋白操作に何段階もの操作を必要としか
つ長時間を要するため、被測定物質の損失や分解が生じ
る。さらに上記除蛋白操作は、熟練した技術を必要とす
るうえ、測定者間あるいは測定時のバラツキが大きい。

このように。

従来の除蛋白操作は繁雑であるうえ被測定物質の回収率
が悪く、再現性に乏しい。

これに対して、特開昭５８−２２３０６１号公報には。

蛋白成分および非蛋白性の被測定物質を含む試料液を除
蛋白刃ラムに通して非蛋白成分のみを吸着させ蛋白成分
を通過除去したのち、吸着した非蛋白成分を溶離させて
これを分析カラムに導く方法が開示されている。この方
法によれば、上記除蛋白操作を必要とせず、試料中の被
測定物質が直接測定されるため短時間で再現性のよい測
定がなされる。しかし、カテコールアミンの分析に上記
公報に開示された方法を採用しても、カテコールアミン
は極性が高いため上記逆相系の充填剤とは疎水性相互作
用することなく　（つまり、充填剤に吸着されずに）蛋
白成分とともにカラム外へ除去される。

カテコールアミンを選択的に吸着しうるカラムとしては
１例えば、特開昭６１−８８１４８号公報にアルミナゲ
ルを充填した除蛋白刃ラムが、そして特開昭５８−２２
３０６３号公報にホウ酸ゲルを充填した除蛋白刃ラムが
開示されている。しかし、カテコールアミン類はいずれ
も中性〜アルカリ性領域においては極めて不安定である
ため、上記除蛋白刃ラムを通過する間に分解が起こり、
高精度の分析がなされ得ない。さらに、アルミナゲルや
ホウ酸ゲルの再生に煩雑な操作を必要とする欠点もある
。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは、試料中のカテコールアミンを
、混在する蛋白成分の影響を受けることなく精度良く分
析する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、除蛋白カラムを備えた逆相系の高
速液体クロマトグラフィーによりカテコールアミンを変
性もしくは分解させることなく、かつ簡単な操作で分析
する方法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明のカテコールアミンの分析方法は、（ａ）カテコ
ールアミンおよび蛋白成分を含有する試料溶液に陰性電
荷物質を添加し、該カテコールアミンと該陰性電荷物質
とのイオン対を形成させる工程。

（ｂ）該イオン対を含む試料溶液を除蛋白刃ラムに供給
し該カラムに該イオン対を吸着させるとともに蛋白成分
を吸着させることなく該カラムを通過させることにより
蛍白成分を除く工程、（Ｃ）該除蛋白刃ラムに溶離液を
供給し該カラムの充填剤に吸着されている該イオン対を
脱着させる工程、および（ｄｌ脱着した該イオン対を分
析カラムに轟いてこれを分析する工程を包含し、そのこ
とにより上記目的が達成される。

本発明でいうカテコールアミンとは、アドレナリン、ノ
ルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンなど、一般に
カテコールアミン類と総称される化合物およびその誘導
体をさしていう。

本発明方法に用いられる陰性電荷物質の種類は特に制限
されないが８通常、アルキル基、芳香族基またはアルキ
ル芳香族基を有するスルホン酸；アルキル基、芳香族基
またはアルキル芳香族基を有するスルホン酸塩；アルキ
ル基、芳香族基またはアルキル芳香族基を有する硫酸；
およびアルキル基、芳香族基またはアルキル芳香族基を
有する硫酸塩でなる化合物の群のうちの少なくとも一種
が利用される。例えば、ベンゼンスルホン酸すトリウム
、１−ドデカンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナ
トリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなど
が好適に利用される。上記各化合物のアルキル基は、そ
の炭素数が１２以下であることが好ましい。アルキル基
の炭素数が１３を越えると疎水性が高くなるため、この
物質が添加される試料溶液や除蛋白液（緩衝液などを主
成分とし有機溶媒をほとんど含有しない）に溶解しない
。

本発明方法は９例えば、第１図（Ａ）および（Ｂ）に示
す装置により具体化される。この装置は、接続端Ａ−Ｆ
を有する六方バルブ４に、除蛋白カラム５が接続端Ｂ−
Ｅを介して接続されている。除蛋白液収容槽ｌｌ中の除
蛋白液ｌが定流量ポンプ２によって試料導入装置３およ
び接続端Ａ−Ｂを経て除蛋白刃ラム５に送られ、そこか
ら接続端Ｅ。

Ｆを通り系外に排出される。除蛋白カラム５に充填され
る充填剤は、一定の条件１例えば水あるいはある特定の
ｐＨの緩衝液中では非蛋白成分を吸着し、蛋白成分を吸
着しない。そして他の条件９例えば上記と異なったｐ）
ｌの緩衝液や有機溶媒を含有する緩衝液中では、カラム
に吸着した上記非蛋白成分を溶離する性質を有する。非
蛋白成分の吸着性は、後述の分析カラム８に充填される
充填剤よりも低く設定される。除蛋白カラム５の充填剤
としては、ａ常の逆相クロマトグラフィー用の充填剤９
特に親水性の高い充填剤が用いられる。例えば、水酸基
、カルボキシル基、エーテル基などの親水性の基をその
表面に有する高分子系ゲルが用いられる。その素材とし
ては２例えばテトラメチロールメタントリアクリレート
やｎ−エチレングリコールジメタクリレート（ｎは２〜
４）の単独重合体、もしくはこれらと他の単量体との共
重合体でなる粒子が挙げられる。特に懸濁重合によって
得られる粒径１０〜２０μｍ程度の微粒子を用いること
が好ましい。

試料としては９例えばカテコールアミンを含む血清試料
が用いられる。除蛋白液としては、水や各種緩衝液が使
用され得、特に水もしくは有機溶媒を含有しない低濃度
緩衝液が好適である。を機溶媒が含有されると試料中の
蛋白成分が凝集して沈澱を生じるおそれがある。

上記試料は、試料導入装置３より系内に導入される。こ
のとき、上記陰性電荷物質が、あらかじめ試料および／
または除蛋白液に加えられる。その量は含有されるカテ
コールアミンに対して過剰量で存在することが必要であ
り２例えば除蛋白液中に１０〜８００μｇ／ｄの割合で
含有される。、−〇陰性電荷物質は、試料中のカテコー
ルアミン（解離して陽性電荷を有する）と結合してイオ
ン対を形成する。そのためカテコールアミンの極性は低
下する。さらに上記陰性電荷物質はアルキル基や芳香族
基を有するため、形成されたイオン対は疎水性の度合が
高（なる。このようなイオン対を含む試料溶液は、定流
量ポンプ２により除蛋白液とともに移送されて除蛋白カ
ラム５に達する。イオン対を形成したカテコールアミン
は、上記のように疎水性が高くなっているため、除蛋白
刃ラム５の充填剤に吸着する。陰性電荷物質分子の疎水
部分が大きいほど１例えば、アルキル鎖が長いおよび／
または芳香環を含有する程、該イオン対の除蛋白カラム
５に対する吸着性の度合は高くなる。試料中の蛋白成分
は吸着されずカラム５を通過し、六方バルブ４の接続端
Ｅ−Ｆを経て系外に排出される。

他方、溶離液槽６１中の溶離液６は定流量ポンプ７によ
り、接続端りおよびＣを経由して液体クロマトグラフィ
ーの分析カラム８へ送られる。次いで第１図（Ｂ）に示
すように、六方パルプ４を切り換えて接続端りを已に接
続すると、定流量ポンプ７により？８離液槽６１中の溶
離液６が接続端りおよびＥを経て除蛋白刃ラム５に供給
される。熔雅液がカラム５を通過することにより、吸着
されたイオン対が溶離され（脱着し）、溶離液と共に接
続端ＢおよびＣを経て分析カラム８に達する。カテコー
ルアミンを含む上記イオン対は分析カラム８で分剤され
１分析カラム８以降に設けられた図外の適宜な検出器に
より検出される。分析カラム８に充填される充填剤は除
蛋白刃ラム５に用いられる充填剤よりも吸着性の高いも
のが使用される。

このような吸着性の高い充填剤を用いることにより除蛋
白カラムに吸着されていたイオン対を溶離液によって完
全に脱着させ、これをそのまま分析カラムに流しここで
被測定物質を精度よく分離することができる。上記検出
器としては、　ＵＶ検出器。

螢光検出器、電気化学検出器などが好適に用いられる。

（作用） 本発明方法では、陽性電荷物質であるカテコールアミン
に対し陰性電荷を有する物質を添加することによりイオ
ン対が形成され、カテコールアミンの極性が低くなる。

さらに上記陰性電荷物質が有するアルキル基や芳香族基
のため、該イオン対は疎水性の度合が高くなる。そのた
め、逆相系のクロマトグラフィー用ゲルの充填された除
蛋白刃ラムに吸着することが可能となる。このように陽
電荷性のカテコールアミンが通常の非イオン性の非蛋白
成分と同様の性質を有するようになるため。

除蛋白刃ラムにおいて蛋白成分と効果的に分離される。

蛋白成分の除去されたカテコールアミンは。

通常の高速液体クロマトグラフィーにおける方法と同様
に分析カラム８で分離され、測定される。

このような方法においては、アルミナゲルやホウ酸ゲル
を使用しないため、カテコールアミンが変性もしくは分
解することがない。そのため、カテコールアミンが損失
を受けずに精度よく短時間のうちに再現性よく測定され
る。イオン対脱着後の除蛋白カラムは、除蛋白液を流す
ことにより再生されるため、カラムの再生に煩雑な操作
を必要としない。そのため１本法は、血清、尿など蛋白
成分が含有される試料中のカテコールアミンの一般的な
測定方法として多方面で利用され得る。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

大庭桝工 （八）除蛋白刃ラム充填剤ゲルの調製：４重量％のポリ
ビニルアルコール チレングリコールジメタクリレート４０ｇ，テトラメチ
ロールメタントリアクリレート１０ｇ，メタクリル酸５
０ｇ，　　トルエン４０ｇおよびヘンシイルバーオキサ
イド１，５ｇを加えた。４００ｒｐｍで攪拌しながら８
０℃で１０時間反応させた後，熱水およびアセトンで洗
浄し，粒子径２０〜３０μｍの高分子球状多孔体を得た
。

（Ｂ）カテコールアミンの測定：第１図に示す測定装置
を用い血清中のノルアドレナリンおよびアドレナリンの
測定を行った。除蛋白刃ラム５としては（八）項で得ら
れた充填剤ゲルを内径４酊，長さ１５０Ｒのステンレス
製カラムに充填したものを（［した。分析カラム８とし
ては．　ＯＤＳ系の逆相クロマトグラフィー用の市販の
カラム（バツクドカラムＡＭ−３１２　；山村化学社製
；カラムサイズ内径５ｍｍ，長さ１５０鰭）を用いた。

除蛋白液としてはラウリル硫酸ナトリウムを２ｍｍｏｌ
／／！の割合で含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　
３．０）を、そして溶離液６としては，　０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ　３．０）とア七ト二トリルとの混合液
（容量比９０　：　１０）を使用した。

まず、第１図（八）に示すように，定流量ポンプ２によ
り除蛋白液１を０．６ｄ／分の割合で六方バルブ４の接
続端Ａ−Ｂを経て除蛋白カラム５に流しながら，試料導
入装置３から試料血清２０μｌを注入した。この試料は
，正常人男子血清中に標品のノルアドレナリン１．５μ
ｇおよびアドレナリン１、５μｇ・が添加されたもので
ある。試料注入８分後に．六方バルブ４を切り換え第１
図（Ｂ）に示すように接続した。ポンプ７により．溶離
液槽６１中から溶離液６を１．０ｍ１１分の割合で六方
バルブ接続端Ｄ　−　Ｅ，除蛋白刃ラム５そして六方バ
ルブ接続端Ｂ−Ｃを経て液体クロマトグラフの分析カラ
ム８へ通した。上記溶離液の流通により被測定物質を含
むイオン対は？＠離し，分析カラムにより分離されて，
検出器（図外）により検出される。検出器としては．吸
光度計（ＵＶＩＤＥＣ　１００−Ｖｌ　　；日本分光社
製）を用い，　２８０鰭ｍにおける吸光強度の測定を行
った。得られたクロマトグラムを第２図（八）に示す。

第２図（八）においてノルアドレナリンのピークａおよ
びアドレナリンのピークｂが確認される。ノルアドレナ
リンおよびアドレナリンの回収率は．それぞれ９８％以
上であった。

上較五上 ラウリル硫酸ナトリウムを含有しない除蛋白液を用いた
こと以外は実施例１と同様である。得られたクロマトグ
ラムを第２図（Ｂ）に示す。第２図（Ｂ）において、ノ
ルアドレナリンおよびアドレナリンのピークは確認され
ない。

去施血叉 ラウリル硫酸ナトリウムの代わりに１−ドデカンスルホ
ン酸ナトリウムを用いたこと以外は実施例１と同様であ
る。得られたクロマトグラムを第３図に示す。第３図に
おいて、ノルアドレナリンＣおよびアドレナリンｄのピ
ークが確認される。

ノルアドレナリンおよびアドレナリンの回収率は。

それぞれ９９％以上であった。

（発明の効果） 本発明方法によれば、このように、蛋白成分が共存する
試料（血清、尿など）において、カテコールアミンが、
該蛋白成分の影響を受けることなく高精度で測定される
。従来、高速液体クロマトグラフィーを利用して精度よ
く測定することの困難であったカテコールアミンを正確
に分析することが可能となったため１本法により各種診
断や病理研究が効果的になされ得る。

４、ヌ　の　゛なコ゛口 第１図（Ａ）および（Ｂ）は本発明方法の実施に用いら
れる測定装置の一例を示す接続図；第２図（Ａ）および
第３図は本発明の実施例で得られたクロマトグラム；第
２図（Ｂ）は１本発明方法とは異なる除蛋白液を用いた
例における第２図（Ａ）に対応するクロマトグラムであ
る。

１・・・除蛋白液、３・・・試料導入装置、４・・・六
方バルブ、５・・・除蛋白刃ラム、６・・・溶離液、８
・・・分析カラム。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）カテコールアミンおよび蛋白成分を含有する
   試料溶液に陰性電荷物質を添加し、該カテコールアミン
   と該陰性電荷物質とのイオン対を形成させる工程、 （ｂ）該イオン対を含む試料溶液を除蛋白カラムに供給
   し該カラムに該イオン対を吸着させるとともに蛋白成分
   を吸着させることなく該カラムを通過させることにより
   蛋白成分を除く工程、（ｃ）該除蛋白カラムに溶離液を
   供給し該カラムの充填剤に吸着されている該イオン対を
   脱着させる工程、および （ｄ）脱着した該イオン対を分析カラムに導いてこれを
   分析する工程、 を包含するカテコールアミンの分析方法。 ２、前記陰性電荷物質が、アルキル基、芳香族基または
   アルキル芳香族基を有するスルホン酸；アルキル基、芳
   香族基またはアルキル芳香族基を有するスルホン酸塩；
   アルキル基、芳香族基またはアルキル芳香族基を有する
   硫酸；およびアルキル基、芳香族基またはアルキル芳香
   族基を有する硫酸塩でなる化合物のうちの少なくとも一
   種である特許請求の範囲第１項に記載の分析方法。