JP3444900B2 - 液体クロマトグラフィ及びカラム充填剤 - Google Patents

液体クロマトグラフィ及びカラム充填剤

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JP3444900B2 JP54142698A JP54142698A JP3444900B2 JP 3444900 B2 JP3444900 B2 JP 3444900B2 JP 54142698 A JP54142698 A JP 54142698A JP 54142698 A JP54142698 A JP 54142698A JP 3444900 B2 JP3444900 B2 JP 3444900B2
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綾 大久保
裕 大津
道広 山口
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は液体クロマトグラフィ装置に係り、特に被測
定試料を濃縮処理する濃縮用カラムを具備する液体クロ
マトグラフィ装置、及び被測定試料を濃縮処理して行う
分析方法に関する。
従来の技術 液体クロマトグラフィ装置は化学物質を分離・定量す
る化学分析手段として広く使われている。特に、内径が
１〜2mmのセミミクロカラムを使った液体クロマトグラ
フィ装置は高感度、高分解能および高精度な分析結果を
提供できる利点を有しており、活発な研究がなされてい
る。
そして、このセミミクロカラムあるいは汎用カラムに
おいて長さの短いもの（例えば内径4mm、長さ10mmある
いは20mm）を所謂分離用のカラムではなく、被測定試料
濃縮処理用の濃縮カラムとして用いる技術が最近注目さ
れている。
この濃縮カラムは通常、分離用カラムとは別に液体ク
ロマトグラフィ装置に内設され、分離用カラムにより被
測定試料の分離が行われる前に用いられる。そして、測
定対象となる物質以外の不純物たる物質を測定系外に取
り除き、試料溶液中に被測定物を濃縮する。
この濃縮用カラムの内部には被測定試料の特性に対応
する特性のカラム充填剤が充填されており、試料溶液は
このカラム充填剤により濃縮処理が行われる。
よって、分離カラムでの被測定試料の分離は試料溶液
中に濃縮された被測定試料を用いて行うことが可能とな
り、その分離性能は格段に向上する。
このような目的の濃縮用カラムに充填剤容量の小さい
セミミクロカラムを用いることは、濃縮用カラムにおけ
る濃縮の効果を一段と高め、同時に用いられる分離カラ
ムにおいて更に優れた分離特性を示すこととなる。
しかし、被測定試料は通常、非常に多種多様な不純物
を含んでおり、濃縮用カラムにおける濃縮の効果を低下
させるような場合がある。
例えば、液体クロマトグラフィ装置を血清等の各種物
質の混合試料の分離，分析に用いた場合、生体成分であ
る血清等はタンパク質成分を多量に含んでいるために、
このタンパク質成分がカラム充填剤に吸着してしまい濃
縮作用が低下してしまう。
このため、従来ではカラム充填剤による濃縮作用の低
下を防止するために、ひいては分離カラムでの高い分離
能を確保するために、予め試料よりタンパク質を除去す
る前処理を行うほかなかった。
しかるに、このような前処理操作は多大の時間と労力
を要し、かつ分析精度を低下させるという問題を有して
いる。そこで、近年これらの除タンパク操作を行うこと
なく装置内に直接タンパク質成分含有試料を注入し、こ
の注入されたタンパク質成分含有試料を濃縮しうるカラ
ム充填剤が提供されるようになってきている。
これらの改良されたカラム充填剤は、多孔性ガラスや
シリカゲルを担体とし、その細孔内表面に特性の異なる
物質を設けた構成とされている。そして、このカラム充
填剤を用いれば、血清中のタンパク質は巨大分子なので
細孔内に入らず、且つ親水性の外表面（孔外面）に吸着
されることなくカラムを素通りし、比較的小さな薬物等
の分子は疎水性の内表面（孔内面）に吸着することとな
る。
このようなカラム充填剤の具体例としては、特開昭60
−56256号公報に記載されたものが挙げられる。このカ
ラム充填剤では、オクタデシルシリル（ODS）基を化学
結合させたシリカの外表面にタンパク質をコートしてい
る。このコート用タンパク質はウシ血清アルブミン等よ
りなり、該タンパク質をODS結合シリカに吸着・変性さ
せることによりカラム充填剤を得ている。
しかしながら、上述したカラム充填剤の内、タンパク
質をコートしODSシリカ充填剤では、使用が長期に渡る
と吸着・変性したタンパク質が溶離を起こすことがあ
り、また高分離効率のカラムが得られない等、耐久性や
分離能の点で問題を残している。
このような問題点を改良するため、特開昭61−65159
号公報及び特開平１−123145号公報に記載されたよう
に、 多孔質担体の内表面及び外表面に疎水性基を導入す
る。
それ自信が巨大分子であり、シリカ等の細孔内に侵入
できない酵素を用いて外表面の疎水性基だけを切断す
る。
その後、外表面に親水性基を導入する。
ことにより、カラム充填剤を得る方法も開発されてい
る。
具体的には、特開昭61−65159号公報記載の方法で
は、グリセリルプロピル基を導入した多孔性シリカを出
発原料とし、これにカルボニルジイミダソールを介して
オリゴペプチドを結合させ、タンパク質加水分解酵素で
あるカルボキシペプチターゼＡを用いて加水分解を行う
ことにより外表面のフェニルアラニン側鎖を切断してい
る。その結果、カラム充填剤の内表面には疎水性リガン
ドとしてグリシル−フェニルアラニルフェニル−アラニ
ンが残り、外表面には親水性のグリシル−グリセリルプ
ロピル基となる。
一方、特開平１−123145号公報に記載の方法は、アミ
ノプロピル基を導入した多孔性シリカを出発原料とし
て、トリエチルアミン存在下、オクタノイルクロリドを
反応させ、アミド結合を介して疎水性基を導入し、次に
ポリミキシン・アシラーゼにより外表面のアシル基を加
水分解し、外表面のアミノ基をグリシドールとの反応を
行うことにより親水基とする方法である。
しかるに、液体クロマトグラフィ装置に配設される濃
縮用カラムのカラム充填剤として特開昭61−65159号公
報或いは特開平１−123145号公報に開示されたものを用
いると、各公報に開示されたカラム充填剤は酵素反応を
利用しているため、カラム充填剤の製造構成が複雑化す
ると共に得られたカラム充填剤の特性にバラツキが生じ
やすいという問題点があった。
また、従来の液体クロマトグラフィ装置では、濃縮用
カラムの内容積が2.0ミリリットル以上と大きい容積を
有していたため、供給された試料溶液が却って濃縮用カ
ラム内で希釈されてしまい、検出精度が低下してしまう
という基本的な問題点もあった。この問題点は、特に注
入される試料量が少ない場合には検出精度に大きく影響
を与えてしまう。
そして、これらの公知例によって明らかにされたカラ
ム充填剤は取り除くべき物質、ここでの例においてはタ
ンパク質であるが、このタンパク質を取り除くことにそ
の特徴を有している。つまり、タンパク質に対応するた
め、その表面を親水性若しくは疎水性に制御している
が、このような制御は本来測定すべき被測定試料に対し
従来技術以上の分離効果をカラム充填剤が示すために付
与されたものではない。
被測定試料に対応する特性は、従来どおりの充填剤の
疎水表面であり、その濃縮処理の対象としうる被測定試
料、特に被測定物質の範囲も本質的には従来のものと変
わらないことになる。
すなわち、上記公知例はその濃縮の対象としうる被測
定試料を非極性又は低極性の物質に限られ、上記の例に
従えば、血清等の各種物質の混合試料である生体試料の
分離，分析に用いた場合、生体試料中に含有され当然に
測定の対象となりうるイオン性の物質に対してその効果
的な濃縮処理を行うことができない。
本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、濃縮
用カラムとして比較的得ることが容易でかつ濃縮効率の
良好なものを用いると共に濃縮用カラムの内容積を小さ
くすることにより、上記の問題点を解決した液体クロマ
トグラフィ装置を提供することを目的とする。
また、本発明の別の目的は、濃縮用カラムの充填剤又
は濃縮用カラムの充填剤及び分離用カラム充填剤として
カチオン交換機能を有した充填剤を用い、被測定試料中
のカチオン性物質に対し高い分離能を示す液体クロマト
グラフィ装置及び分析方法を提供することにある。
発明の開示 請求項１記載の発明は、液体クロマトグラフィ装置に
おいて、 ポンプにより供給される溶媒に混在する被測定試料を
分離する分離用カラムと、 該ポンプと該分離用カラムとの間に配設され、該ポン
プから該溶媒を供給されると共に試料注入配管より該被
測定試料を供給され、該被測定試料を該溶媒と共に該分
離用カラムに供給する流路制御手段と、 該分離用カラムで分離された該被測定試料が供給され
ると共に、供給された該被測定試料を分析処理する検出
手段と、 該被測定試料を格納した複数の容器を担持する試料保
持機構と、 前記複数の容器の一つから該被測定試料を選択的に採
取してこれを該流路制御手段に供給する試料注入手段
と、 該流路制御手段と該分離用カラムとの間に設けられ、
該溶媒と共に供給される該被測定試料を濃縮処理する濃
縮用カラムと を設けており、 該濃縮用カラムの内容量を2.0ミリリットル未満とす
ると共に、 該濃縮用カラム内に、Si−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部
分、Ｘはスルホン基）結合、及びSi−R'（R'は親水性
基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔
性担体よりなるカラム充填剤を充填してなる構成 としたことを特徴とする。
請求項２記載の発明は、請求項１記載の液体クロマト
グラフィ装置において、 前記カラム充填剤における親水性基R'を、水酸基を有
する親水性基としたことを特徴とする。
請求項３記載の発明は、請求項１又は請求項２記載の
液体クロマトグラフィ装置において、 前記カラム充填剤におけるスペーサー部分Ｒを、炭素
数１〜40の炭化水素残基又は該炭化水素残基の構成炭素
原子の一部を酸素原子若しくは窒素原子で置換した置換
基としたことを特徴とする。
請求項４記載の発明は、請求項１乃至請求項３の何れ
か一項記載の液体クロマトグラフィ装置において、 前記濃縮用カラム内に充填された充填剤を構成する多
孔性担体はシリカゲルであることを特徴とする。
請求項５記載の発明は、請求項１乃至請求項４の何れ
か一項記載の液体クロマトグラフィ装置において、 前記分離用カラムは、内容量が2.0ミリリットル未満
であり、 充填剤としてカチオン交換機能を有したイオン交換用
充填剤を充填されたカチオン交換カラムであることを特
徴とする。
請求項６記載の発明は、分析方法において、 使用されるカラム本体の内容量が2.0ミリリットル未
満であるとともに、 該カラム本体に充填する充填剤に、Si−Ｒ−Ｘ（Ｒは
スペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合、及びSi−R'
（R'は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被
覆された多孔性担体よりなるカラム充填剤を用いてい
る、 供給された被測定試料の濃縮を行うために設けられた
濃縮用カラムに、 溶剤に混在された被測定試料を供給して、該被測定試
料を濃縮し、 濃縮された被測定試料を、溶剤に混在する被測定試料
を分離する分離用カラムに供給して分離し、 分離された被測定試料を、供給された被測定試料を分
析処理する検出手段に供給て分析処理することを特徴と
する。
請求項７記載の発明は、分析方法において、 移動相たる溶剤や被測定試料の流路を制御して溶剤の
供給や溶剤と被測定試料の混合を担う流路制御装置に、
該溶剤をポンプにより供給すると共に、該流路制御装置
に接続され試料の該流路制御装置への供給を担う試料注
入配管より被測定試料を該流路制御装置に供給して被測
定試料を該溶剤に混在させ、 該ポンプの溶剤供給圧力に従い該溶剤に混在された被
測定試料を、被測定試料を濃縮処理するために設けられ
た、充填剤を充填してなる濃縮用カラムに供給し、 該濃縮用カラムにより該被測定試料を濃縮し、 濃縮された被測定試料を該ポンプの溶剤供給圧力に従
い、溶剤に混在する被測定試料を分離する分離用カラム
に供給し、 該分離用カラムにより該濃縮された被測定試料分離
し、 分離された被測定試料を該ポンプの溶剤供給圧力に従
い、供給された被測定試料を分析処理する検出手段に供
給し、 該検出手段により該分離された被測定試料を分析処理
する分析方法であって、 該濃縮用カラムの内容量を2.0ミリリットル未満とす
ると共に、 該濃縮用カラム内の充填剤に、Si−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペ
ーサー部分、Ｘはスルホン基）結合、及びSi−R'（R'は
親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆され
た多孔性担体よりなるカラム充填剤を用いたことを特徴
とする。
請求項８記載の発明は、請求項７記載の分析方法にお
いて、 前記分離カラムに、内容量が2.0ミリリットル未満で
あって、充填剤としてカチオン交換機能を有したイオン
交換用充填剤を充填されたカチオン交換カラムを用いる
ことを特徴とする。
請求項９記載の発明は、分析方法において、 カチオン性の化合物を含む生体試料に請求項７又は請
求項８の何れか記載の分析方法を施して、該生体試料中
の該カチオン性物質を分析することを特徴とする。
請求項10記載の発明は、分析方法において、 カチオン性の化合物とタンパク質を含む生体試料に請
求項７又は請求項８の何れか記載の分析方法を施して、
該生体試料中の該カチオン性物質を分析することを特徴
とする。
請求項11記載の発明は、分析方法において、 被測定試料は血漿又は血清又は尿又は唾液又は生体組
織から採取された生体組織構成物であり、 該測定試料中に請求項７又は請求項８の何れか記載の
分析方法を施して、該測定試料中のカチオン性物質を分
析することを特徴とする。
請求項12記載の発明は、カラム充填剤において、 Si−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）
結合、及びSi−R'（R'は親水性基）結合を有するシリコ
ーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなることを特
徴とする。
請求項13記載の発明は、請求項12記載のカラム充填剤
において、 前記Si−R'結合における親水性基R'が、水酸基を有す
る親水性基であることを特徴とする。
請求項14記載の発明は、請求項12又は請求項13記載の
カラム充填剤において、 前記Si−Ｒ−Ｘ結合におけるスペーサー部分Ｒを、炭
素数１〜40の炭化水素残基又は該炭化水素残基の構成炭
素原子の一部を酸素原子若しくは窒素原子で置換した置
換基としたことを特徴とする。
請求項15記載の発明は、請求項12乃至請求項14記載の
うち何れか一項記載のカラム充填剤において、 前記充填剤を構成する多孔性担体はシリカゲルである
ことを特徴とする。
請求項１及び請求項２及び請求項３記載の発明によれ
ば、液体クロマトグラフィ装置において、濃縮用カラム
の内容量を2.0ミリリットル未満としておりその内容積
は小さいため、注入される被測定試料量が少なくても希
釈作用は発生せず、よって確実に濃縮処理を行うことが
できるため検出精度を向上させることができる。
また、濃縮用カラム内に充填されるカラム充填剤は、
Si−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）結
合、及びSi−R'（R'は親水性基）結合を有するシリコー
ンポリマーで被覆された多孔性担体よりなり、この構成
のカラム充填剤はその外表面の一部が親水性であるため
に、例えば生体試料に対して用いられた場合、生体試料
の含有するタンパク質等が吸着されることはなく、また
安定でしかも分離能に優れているため、濃縮処理を確実
に行うことができる。更に、反応に酵素等を用いていな
いため、再現性に優れた充填剤が得られ、これによって
も安定した濃縮処理を実現できる。
そして、スペーサー部分Ｒの先端にはスルホン基が結
合して設けられており、該スルホン基がカチオンに対し
強いイオン的な相互作用を示すことから、該カラム充填
剤はカチオン交換機能を有することが可能となり、カチ
オン性化合物を選択的に濃縮することができる。
よって、カチオン性の被測定化合物に対し優れた分離
能を示す液体クロマトグラフィ装置を提供できる。
請求項４記載の発明によれば、濃縮用カラム内に充填
されるカラム充填剤を構成する多孔性担体に、使用時の
移動相たる溶剤による膨潤等の問題の無い高い信頼性を
有するシリカゲルを使用することができる。
よって、カチオン性の被測定化合物に対し優れた分離
能を示すとともに高い信頼性を有する液体クロマトグラ
フィ装置を提供できる。
請求項５記載の発明によれば、被測定試料の特性であ
るカチオン性に従い被測定試料の濃縮を行った後、更に
そのカチオン性を利用して被測定試料の分離を行うこと
が可能となる。
よって、カチオン性の被測定化合物に対し非常に優れ
た分離能を示す液体クロマトグラフィ装置を提供でき
る。
請求項６及び請求項７記載の発明によれば、被測定試
料の分析における被測定試料の濃縮に用いる濃縮用カラ
ムの内容量を2.0ミリリットル未満としておりその内容
積は小さいため、注入される被測定試料量が少なくても
希釈作用は発生せず、よって確実に濃縮処理を行うこと
ができるため検出精度を向上させることができる。
また、濃縮用カラム内に充填されるカラム充填剤は、
Si−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）結
合、及びSi−R'（R'は親水性基）結合を有するシリコー
ンポリマーで被覆された多孔性担体よりなり、この構成
のカラム充填剤はその外表面の一部が親水性であるため
に、例えば生体試料に対して用いられた場合、生体試料
の含有するタンパク質等が吸着されることはなく、また
安定でしかも分離能に優れているため、濃縮処理を確実
に行うことができる。更に、反応に酵素等を用いていな
いため、再現性に優れた充填剤が得られ、これによって
も安定した濃縮処理を実現できる。
そして、スペーサー部分Ｒの先端にはスルホン基が結
合して設けられており、該スルホン基がカチオンに対し
強いイオン的な相互作用を示すことから、該カラム充填
剤はカチオン交換機能を有することが可能となり、カチ
オン性化合物を選択的に濃縮することができる。
よって、カチオン性の被測定化合物に対して、高い分
離能を有した分離を行う分析が可能となる。
請求項８記載の発明によれば、被測定試料の特性であ
るカチオン性に従い被測定試料の濃度を行った後、更に
そのカチオン性を利用して被測定試料の分離を行うこと
が可能となる。
よって、カチオン性の被測定化合物に対して、非常に
優れた分離能を有した分離を行う分析が可能となる。
請求項９及び請求項10及び請求項11記載の発明によれ
ば、被測定試料である生体試料に含有されるカチオン性
の化合物を、該化合物の特性であるカチオン性に従い選
択的に濃縮することができる。
更にそのカチオン性を利用して被測定試料の分離を行
うことが可能となる。
よって、生体試料、特に含有するカチオン性の被測定
化合物を測定対象とした場合に、測定対象に対して、非
常に優れた分離能を有した分離を行う分析が可能とな
る。
請求項12及び請求項13及び請求項14記載の発明によれ
ば、カラム充填剤はSi−Ｒ−Ｘ結合を有して、スペーサ
ー部分Ｒの先端にはスルホン基が結合して設けられてお
り、該スルホン基がカチオンに対し強いイオン的な相互
作用を示すことから、該カラム充填剤はカチオン交換機
能を有することが可能となり、カチオン性化合物を選択
的に保持、ひいては濃縮することができる。
よって、カチオン性の被測定化合物に対して、高い濃
縮性能を有したカラム充填剤を提供することが可能とな
る。
更に、該カラム充填剤はSi−R'結合を有することによ
り、その外表面の一部が親水性であるため、例えば生体
試料に対して用いられた場合、生体試料の含有するタン
パク質等が吸着されることはなく、また安定でしかも分
離能に優れているため、濃縮処理を確実に行うことがで
きる。
以上より、生体試料等、タンパク質物質を含むような
カチオン性の非測定化合物に対しても、安定的に高い濃
縮性能を有したカラム充填剤を提供することが可能とな
る。
請求項15記載の発明によれば、濃縮用カラム内に充填
されるカラム充填剤を構成する多孔性担体に、使用時の
移動相たる溶剤による膨潤等の問題の無い高い信頼性を
有するシリカゲルを使用することができる。
よって、カチオン性の被測定化合物に対し優れた保持
性能、ひいては濃縮性能を示すとともに高い信頼性を有
するカラム充填剤を提供できる。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明の第１実施例である液体クロマトグ
ラフィ装置の概略構成図である。
第２図は、本発明の第１実施例である液体クロマトグ
ラフィ装置の動作を説明するための概略構成図である。
第３図は、本発明の第１実施例である液体クロマトグ
ラフィ装置の動作を説明するための概略構成図である。
第４図は、本発明の第２実施例である液体クロマトグ
ラフィ装置の概略構成図である。
第５図は、本発明にかかる一実施例であるカラム充填
剤のカチオン性物質に対する保持特性を示すクロマトグ
ラムである。
第６図は、本発明にかかる実施例である充填剤が濃縮
可能なカチオン性物質の例を示す図である。
第７図は、本発明にかかる実施例である充填剤を使用
した場合の移動相中の塩濃度の変化による保持の調整を
示すグラフである。
第８図は、本発明の効果を説明するためのクロマトグ
ラムを示す図である。
発明を実施するための最良の形態 本発明の実施例について図面と共に説明する。
図１乃至図３は、本発明の第１実施例である液体クロ
マトグラフィ装置の概略構成図である。
本実施例に係る液体クロマトグラフィ装置は、複数の
試料容器21aを形成された試料保持部21を有し、各試料
容器21aには被測定試料が保持される。この各々の試料
容器21aは典型的には約250μｌの容量を有している。ま
た、試料注入管22はロボット22aにより移動自在に保持
されており、ロボット22aの動作により試料注入管22が
位置P1に移動され、続いて下降動作することにより試料
注入管22は複数ある試料容器21aの内、選択された一つ
の試料容器21aに挿入される。続いて、シリンジ15の操
作を操作することにより、被測定試料は試料注入管22内
に吸入させる。
また、図中14で示すのは六方弁として構成される第１
の切り換えバルブ14であり、この第１の切り換えバルブ
14には本発明の要部となる濃縮用カラム30及び試料注入
管22の先端を受け入れる端部14xが接続されている。
濃縮用カラム30は、その内容積が2.0ミリリットル未
満と比較的小型のカラムであり、後述するカラム充填剤
が充填されている。この濃縮用カラム30において供給さ
れた被測定試料は濃縮されるため、後述する分離用カラ
ム16及び検出器17には濃縮された被測定試料が供給され
ることとなり、検査精度の向上を図ることができる。
また、端部14xは被測定試料の注入口となる部位であ
り、試料注入管22内に採取された被測定試料は、試料注
入管22を端部14x内に挿入し再びシリンジ15を操作する
ことにより端部14x内に注入される。
この際、試料注入管22はロボット22aにより端部14xに
対応した位置P2に水平移動され、続いて鉛直方向に移動
することにより端部14x内に挿入される。また、試料注
入管22から注入された試料溶液は、第１の切り換えバル
ブ14が図１及び図２に示される状態の時に濃縮用カラム
30内に供給され、濃縮処理が行われる構成となってい
る。
また、本実施例に係る液体クロマトグラフィ装置で
は、検出器17の試料出口に六方弁として構成される第２
の切り換えバルブ23が接続されている。この第２の切り
換えバルブ23は、分離用カラム16で分離され検出器17で
検出された後排出される被分離試料を、前記廃液溜め18
と前記試料注入管22のいずれか一方に選択的に供給する
機能を奏する。図１及び図３に示す状態では、検出器17
から排出される被分離試料は矢印で示すように廃液溜め
18に送られる。
一方、被分離試料を試料注入管22に給送する場合に
は、図２に示されるように、試料はシリンジ15に設けら
れた継手15a中に形成された流路15bを通って試料注入管
22に供給される。流路15bは、シリンジ15から供給され
た試料であろうとも、また弁23から供給された試料であ
ろうとも、いずれも前記試料注入管22に送られるように
Ｔ字型に形成されている。
更に、図示の装置には、分離用カラム16およびこれに
協働する配管系を洗浄する洗浄液を保持する容器24が設
けられ、洗浄液は容器24からポンプ25を経て第２の切り
換えバルブ23に供給される。図１及び図３に示す状態で
は、洗浄液は継手15aを経て試料注入管22に送られこれ
を洗浄する。試料注入管22を洗浄する場合には、ロボッ
ト22aは針22を位置P1やP2とは異なった廃液回収位置
（図示せず）に移動させる。
図２は、図１の装置において第２の切り換えバルブ23
が回動した状態を示している。図示の状態では、検出器
17から排出される被分離試料は矢印に沿って弁23を通過
し、継手15a中の流路15bを経て針22に送られる。一方、
容器24からの洗浄液は第２の切り換えバルブ23において
阻止される。その結果、ロボット22aにより、試料注入
管22を試料保持部21上の適当な試料容器21aに対応する
位置に移動させることにより、検出器17から排出された
被分離試料を試料容器21a中に回収することが可能にな
る。
特にカラムの内径が1.0〜2.0mmのセミミクロカラムを
クロマトグラフ分離用カラム16として使う場合、溶媒の
全流量が高々50〜200μl/minと非常に小さいため、溶媒
による試料の希釈に伴う被分離試料の体積の増大は問題
にならず、数百μｌの容量の試料容器21aで十分に被分
離試料を回収することができる。
また、図３は第１の切り換えバルブ14が回動した状態
を示している。図示の状態では、端部14xから濃縮用カ
ラム30の上端供給口への被測定試料の供給は阻止され、
その代わりに濃縮用カラム30の上端供給口にはポンプ11
により溶媒が供給される状態となる。また、濃縮用カラ
ム30の下端排出口は分離用カラム16に接続された状態と
なる。よって、濃縮用カラム30で濃縮された被測定試料
は分離用カラム16に供給され、分離用カラム16により分
離された被測定試料は続いて検出器17に供給され、所定
の分析処理が行われる。
図４は、発明の第２実施例である液体クロマトグラフ
ィ装置を示している。
本実施例に係る液体クロマトグラフィ装置は、オート
サンプラー41と六方弁として構成される６バルブ−スイ
ッチングバルブ（以下、スイッチングバルブという）42
との間に一次分離を行う濃縮用カラム40が配設されてい
る。
この濃縮用カラム40は、その内容積が2.0ミリリット
ル未満とされたカラムであり、第１実施例の液体クロマ
トグラフィ装置に配設されている濃縮用カラム30と同様
に、後述するカラム充填剤が充填されている。この濃縮
用カラム40においてオートサンプラー41から供給された
被測定試料は濃縮されるため、後述する分離用カラム43
及び検出器44には濃縮された被測定試料が供給されるこ
ととなり、検査精度の向上を図ることができる。
また、第１実施例で説明した切り換えバルブ14,シリ
ンジ15,試料注入管22及びこれらの構成要素と共に機能
する他の構成要素は、オートサンプラー41内に組み込ま
れた構成となっている。更に、ポンプ45A及びポンプ45B
は、スイッチングバルブ42と協働して被測定試料を濃縮
用カラム40,分離用カラム43及び検出器44に供給する被
測定試料供給システムを構成する。
図４に示される構成によれば、被測定試料はポンプＡ
により供給される溶媒（移動相Ａ）と共に、オートサン
プラー41から濃縮用カラム40に送られ濃縮処理が行われ
る。そして、濃縮用カラム40において濃縮された被測定
試料は、ポンプ45Bにより供給される溶媒（移動相Ｂ）
と共に分離処理を行うために分離用カラム43に供給され
る。この際、移動相Ａと移動相Ｂの切り換えは、先に述
べたスイッチングバルブ42により行われる。
搬送された被測定試料は分離用カラム43において分離
され、検出器44において被測定試料に対して所定の分析
処理が行われる。また、上記構成とされた液体クロマト
グラフィ装置は、分析処理の制御を行うためにコンピュ
ーターにより構成されるコントローラー46を具備してい
る。このコントローラー46は、オートサンプラー41,ス
イッチングバルブ42,及びポンプ45A,45Bの駆動制御を行
う。
尚、上記した２カラムシステムを採用した液体クロマ
トグラフィ装置は、従来の分析装置に対して被測定試料
に対する処理を排除できる点で有利であり、このシステ
ムはサンプルトリートメントフーリーシステムとして一
般に用いられている。
続いて、コントローラー46の制御処理により実施され
るスイッチングバルブ42の切り換え動作について説明す
る。スイッチングバルブ42はコントローラー46の制御処
理により、液体クロマトグラフィ装置内に形成される被
測定試料の流路を第１の状態と第２の状態とに切り換え
処理を行う。
スイッチングバルブ42が第１の状態となっている時、
ポンプ45Aの発生するポンプ圧によりオートサンプラー4
1から移動相Ａと共に圧送される被測定試料は、濃縮用
カラム40を通過した後にスイッチングバルブ42に供給さ
れ、更に被測定試料は図中実線で示されるラインに沿っ
て図示されない廃液貯蔵槽に向け進んでゆく。この際、
被測定試料に含まれる分析対象となる物質のみが濃縮用
カラム40に捕獲され濃縮処理される。また、同時に移動
相Ｂもポンプ45Bの発生するポンプ圧によりスイッチン
グバルブ10に供給され、図４に実線で示すラインに沿っ
て分離用カラム43及に向け流れる構成となっている。
一方、コントローラー46の制御処理によりスイッチン
グバルブ42が第２の状態となると、濃縮用カラム40にお
いて濃縮された被測定試料は、分析を行うために図４に
破線で示すラインに沿って流れ分離用カラム43に供給さ
れる。一方、ポンプ45Bから供給される移動相Ｂは、図
中破線で示されるラインに沿って図示しない廃液貯蔵槽
に流出される構成となっている。
ここで、濃縮用カラム30,40に充填される充填剤につ
いて以下説明する。本実施例においては、濃縮用カラム
30,40に充填される充填剤として、Si−Ｒ−Ｘ（Ｒはス
ペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合、及びSi−R'（R'
は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆さ
れた多孔性担体よりなるカラム充填剤を使用している。
この構成のカラム充填剤を使用することにより、例えば
タンパク質成分を含有する血清等を被測定試料として用
いた場合におけるタンパク質の分離能を高めることがで
き、よって濃縮処理を確実かつ安定して行うことが可能
となる。以下、本実施例で用いるカラム充填剤の具体的
構成について説明する。
本実施例において用いられる多孔性担体としては、例
えば液体クロマトグラフィー用の担体として一般に使用
されている任意の粉体であるシリカゲル、アルミナ、ガ
ラスビーズ（例えばポーラスガラス）、ゼオライト、ヒ
ドロキシアパタイト又はグラファイト等を使用すること
ができる。また、複合粉体、例えばポリアミド、アクリ
ル樹脂、又はポリビニルアルコール等の合成樹脂の表面
に、微細な無機粉体、例えばシリカゲル、二酸化チタン
又はヒドロキシアパタイトを被覆処理した粉体も使用す
ることができる。
また、多孔性担体の平均粒径は２〜200μｍで、比表
面積200〜300m2/g、40〜120Åの細孔を有するものが好
適である。特に好適な多孔性担体としては、60〜80Åの
細孔を持ち、比表面積が400〜600m2/gで粒径３〜50μｍ
の球形あるいは破砕型のシリカゲルである。
本発明において使用されるSi−Ｈ基を有するシリコー
ン化合物は、下記一般式Ｉ （R1HSiO）ａ（R2R3SiO）ｂ（R4R5R6SiO1/2）ｃ （式
Ｉ） （式Ｉ中R1,R2及びR3は相互に独立に水素原子である
か又はハロゲン原子の少なくとも１個で置換されている
ことのある炭素数１〜10の炭化水素基であるが、R1,R2,
R3が同時に水素原子であることはない。また、R4,R5,R6
は相互に独立に水素原子であるか又はハロゲン原子に少
なくとも一個で置換されていることのある炭素数１〜10
の炭化水素基である。ａは０又は１以上の整数であり、
ｂは０又は１以上の整数であり、ｃは０又は２である
が、但しｃが０である場合にはａとｂとの和が３以上の
整数であるものとする）の少なくとも一種である。
上記式Ｉのシリコーン化合物は２種の群からなる。第
１の群は、前記式Ｉにおいてｃ＝０の場合に相当し、下
記一般式II （R1HSiO）ａ（R2R3SiO）ｂ （式II） （式II中R1,R2,R3、ａ及びｂは前記と同じ意味である
が、好ましくはR1,R2及びR3が相互に独立にハロゲン原
子に少なくとも一個で置換されていることのある炭素数
１〜10の炭化水素基であり、ａとｂとの和が３以上であ
る）で表わされた環状シリコーン化合物である。
この化合物の代表例を挙げれば以下の通りである。
上記の式III及び式IVで示される化合物は、それぞれ
単独で又はそれらの混合物の形で使用することができ
る。
上記式III及び式IVの各式において、ｎ（又はａ＋
ｂ）は好ましくは３〜７である。ｎの値が小さくなるの
に従ってその沸点が低下するので、蒸発して担体上に吸
着する量が多くなる。特に３量体及び４量体は、その立
体性質上、重合しやすいので特に適している。
前記式IIの環状シリコーン化合物の具体例としては、
ジハイドロジェンヘキサメチルシクロテトラシロキサ
ン、トリハイドロジェンベンタメチルシクロテトラシロ
キサン、テトラハイドロジェンテトラメチルシクロテト
ラシロキサン、ジハイドロジェンオクタメチルシクロペ
ンタシロキサン、トリハイドロジェンヘプタメチルシク
ロペンタシロキサン、テトラハイドロジェンヘキサメチ
ルシクロペンタンシロキサン、及びペンタハイドロジェ
ンペンタメチルシクロペンタシロキサン等を挙げること
ができる。
前記式Ｉのシリコーン化合物の第二の群は、前記式Ｉ
において、ｃ＝２の場合に相当し、下記一般式Ｖ （R1HSiO）ａ（R2R3SiO）ｂ（R4R5SiO1/2）ｃ （式Ｖ） （式Ｖ中R1,R2,R3,R4,R5,R6、ａ及びｂは前記と同じ
意味であり、ｃは２であるが、好ましくはR1〜R6が相互
に独立にハロゲン原子の少なくとも１個で置換されてい
ることのある炭素数１〜10炭化水素基である）で表わさ
れるシリコーン化合物である。この化合物の代表例とし
ては、下記一般式VI で表わされる化合物を挙げることができる。
上記式Ｖの直鎖状シリコーン化合物の具体例として
は、1,1,1,2,3,4,4,4−オクタメチルテトラシロキサ
ン、1,1,1,2,3,4,5,5,5−ノナメチルペンタシロキサ
ン、及び1,1,1,2,3,4,5,6,6,6−デカメチルヘキサシロ
キサン等を挙げることができる。前記一般式Ｉで表わさ
れるシリコーン化合物は、気相状態又は液相状態で前記
多孔性担体と接触させる。
スルホン基を有するスペーサー部分 担体表面を被覆したシリコーンポリマー中には、スル
ホン基を有するスペーサ部分がある。その構造として
は、例えば一般式 （Si）−R8−Ｘ （式VII） （式中、R8は、炭素数１〜40の直鎖状或いは分枝構造
を有するアルキル基若しくは該アルキル基の対応する構
成炭素原子の一部を酸素原子或いは窒素原子で置換して
なる酸素原子或いは窒素原子を含有する置換基、炭素数
４〜８のシクロアルキル基或いはシクロアルケニル基若
しくは該シクロアルキル基或いは該シクロアルケニル基
の対応する構成炭素原子の一部を酸素原子或いは窒素原
子で置換してなる酸素原子或いは窒素原子を含有する置
換基、又は炭素数１〜20のアルキル基で置換されている
ことのあるアリール基若しくは該アリール基の対応する
構成炭素原子の一部を酸素原子或いは窒素原子で置換し
てなる酸素原子或いは窒素原子を含有する置換基、又は
主鎖構造中にベンゼン環構造或いはシクロアルカン構造
を有する炭素数１〜40のアルキル基若しくは該アルキル
基の対応する構成炭素原子の一部を酸素原子或いは窒素
原子で置換してなる酸素原子或いは窒素原子を含有する
置換基であり、Ｘはスルホン基である）で表わされる。
親水性基 本実施例にかかる液体クロマトグラフィ用充填剤は、
上記のようにして得たシリコーンポリマー被覆担体の表
面に−Si−R'（R'は親水性基）を有する。親水性基R'と
しては、その内部に水酸基を有するものが望ましく、例
えば次の式VIIIに示すテトラオール構造を有した置換基
等が用いられる。
また、このテトラオール構造をポリオール構造とした
置換基も同様に用いることができる。
以上のようにして得た充填剤は、シリカゲルをシリコ
ーンポリマーで被覆しているため、シリカゲル上のシラ
ノール基の影響が出現しにくく、塩基性物質の吸着がほ
とんど見られない。
図５は、本発明にかかる一実施例であるカラム充填剤
のカチオン性物質に対する保持特性を示すクロマトグラ
ムである。
使用したカラム充填剤は、Si−Ｒ−Ｘ（Ｒはその構造
が下式IXのように示されるスペーサー部分であり、Ｘは
スルホン基）結合、及びSi−R'（R'は水酸基）結合を有
するシリコーンポリマーで被覆されたシリカゲルよりな
る。
尚、シリカゲルには約60Åの細孔を有し、平均粒径５
μｍの球形シリカゲル粉体を使用した。
かかるカラム充填剤の製造については、特開平８−26
2004号公報に記載された方法に従い、更に所定の化学反
応方法を適宜使用して行なった。
この本発明にかかる一実施例であるカラム充填剤を内
径2.0mm、長さ10mmのカラムに充填し、カチオン性物質
としてカテコールアミンを含む被測定試料（濃度が100p
pmとなるようにカテコールアミンを血清に添加したも
の）をそれに導入し、得られるクロマトグラムからカテ
コールアミンの溶出状況を調べ、そのカチオン性物質に
対する保持性能を調べた。
以下に分離条件を示す。
移動相:10μＭ EDTA−2Na, 25mM リン酸緩衝液（pH＝6.9） 流速:100μL/分 分離温度（カラム温度）:35℃ 検出方法:UV検出（254nm） そして、比較例として、従来技術である充填剤（表面
にフェニル基を備えたもの）を充填した市販のカラムを
使用して、同様の分離条件で同じ試料の保持性能を調べ
た。
図５（Ａ）は本発明にかかる一実施例であるカラム充
填剤を使用した場合のクロマトグラムを示し、図５
（Ｂ）には比較例のカラム充填剤を使用した場合のクロ
マトグラムを示す。
図５（Ａ）に示すように、本実施例のカラム充填剤を
使用した場合、カテコールアミン（ノルエピネフリン
（NE），エピネフリン（Ｅ）及びドーパミン（Ｄ））
は、血清中のタンパク質が保持されずボイドボリューム
付近に溶出した後、カラム内に保持され溶出される。
しかし、比較例では、血清中のタンパク質及び溶剤等
々と共にカテコールアミンは素早くカラムから溶出して
しまって、カラム内で保持されず、クロマトグラムは分
離状態のカテコールアミンのピークを示さない。
以上より、本発明にかかる一実施例であるカラム充填
剤が血清中のタンパク質は保持せず、カテコールアミン
等のカチオン性物質を効率よく保持、ひいては濃縮する
ことが明らかとなった。
尚、本発明にかかる実施例である充填剤は、カテコー
ルアミンのみではなく、図６に示す多様なカチオン性物
質を保持、濃縮できる。
このとき、移動相中の塩濃度を変化させることによ
り、その保持を調整することも可能である。
図７は本発明にかかる実施例である充填剤を使用した
場合の移動相中の塩濃度の変化による保持の調整を示す
グラフである。このとき、グラフの縦軸は保持比の対数
であり、横軸は塩の濃度（mM）である。
分離条件を以下に示す。
カラムのサイズ:2.0mm×10mm 分離温度:35℃ 移動相：リン酸緩衝液（pH＝6.9） リン酸緩衝液中の塩濃度:5,10,25,50及び100mM 流速:0.1ml/分 検出法:UV検出 試料：各カチオン性物質が100ppmの濃度である溶液 試料注入量:2μｌ 図７に示されるように、本発明にかかる実施例である
充填剤は、多様なカチオン性物質に対して、多様な塩濃
度の移動相を使用し、保持の調整を行なうことができ
る。
次に、本実施例にかかる充填剤を用いて血清等の生体
成分中の薬物や代謝物、特にカチオン性の化合物を既に
説明した本発明の液体クロマトグラフィ装置を用いて定
量する場合、繁雑な前処理なしに生体成分を直接注入し
ても十分な分析が可能である。
図８は、上記したカラム充填剤を濃縮用カラム30,40
に充填して分析処理を行った実験例を示している。図８
（Ａ）は従来のカラム充填剤を濃縮用カラム30,40に充
填して分析処理を行った実験例を示しており、また図８
（Ｂ）は上記した本実施例に係るカラム充填剤を濃縮用
カラム30,40に充填して分析処理を行った実験例を示し
ている。
図８（Ａ）の従来のカラム充填剤を濃縮用カラム30,4
0に充填して分析処理を行った実験例においては、分離
カラムについても従来のカラム充填剤を充填したものを
用いた。そして、移動相たる溶剤は図中のピークS,T,U
で示される目的化合物の分離が最も良くなるように選択
がなされて、濃縮用にはpH6.0の5mMりん酸緩衝液／アセ
トニトリル（＝98/2）溶液が用いられ、分離用にはpH2.
3の5mMの１−オクタンスルホン酸ナトリウムを含む50mM
りん酸緩衝液／アセトニトリル（＝94/6）溶液が用いら
れ、その流速は0.1ml/分とされた。
分離状況の検出には電気化学検出器を用いた。
被測定試料はヒト尿とし、如何なる前処理もせずに10
μｌを用いた。
次に、図８（Ｂ）は上記した本実施例に係るカラム充
填剤を濃縮用カラム30,40に充填して分析処理を行った
実験例においては、分離カラムに内径2.0mm長さ150mmの
強カチオン交換カラムを用いた。
そして、移動相たる溶剤は図中のピークS,T,Uで示さ
れる目的化合物の分離が最も良くなるように選択がなさ
れて、濃縮用にはpH5.5の10mMりん酸緩衝液が用いら
れ、分離用にはpH3.0の100mMりん酸緩衝液が用いられ、
その流速は0.2ml/分とされた。
分離状況の検出には電気化学検出器を用いた。
被測定試料はヒト尿とし、如何なる前処理もせずに10
μｌを用いた。
結果は、図８に示すクロマトグラム中の分析目的物の
ピークS,T,Uの分離状況によって判断される。
同図から明らかなように、従来用いていたカラム充填
剤を用いた場合においては、目的化合物のピークS,T,U
は何れも不要な化合物ピークと重なって現れており、十
分な分離がなされたとは言えない。
それに比べて、上記した本実施例に係るカラム充填剤
を用いて分析処理を行った実験例の方は、分析目的物の
ピークS,T,Uは何れも単独かつ急峻に現れており、十分
な分離がなされたことがわかる。
これは、本実施例に係るカラム充填剤がその外表面に
有するスルホン基を有した置換基の効果などにより、安
定した濃縮処理、特にカチオン性の分析目的物に対して
高い濃縮効果を実現でき、その結果、装置の被測定試料
の分離能力が高いため、良好な分析結果となって現れた
ものと考えられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山口 道広 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株式会社資生堂第１リサーチセンター内 (56)参考文献 特開 平８−50120（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−262004（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−65159（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 30/48 G01N 30/08

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ポンプ（11,45A）により供給される溶媒に
    混在する被測定試料を分離する分離用カラム（16,43）
    と、 該ポンプ（11,45A）と該分離用カラム（16,43）との間
    に配設され、該ポンプから該溶媒を供給されると共に試
    料注入配管（22,41）より該被測定試料を供給され、該
    被測定試料を該溶媒と共に該分離用カラム（16,43）に
    供給する流路制御手段（14,42）と、 該分離用カラム（16,43）で分離された該被測定試料が
    供給されると共に、供給された該被測定試料を分析処理
    する検出手段（17,44）と、 該被測定試料を格納した複数の容器（21a）を担持する
    試料保持機構（21,41）と、 前記複数の容器（21a）の一つから該被測定試料を選択
    的に採取してこれを該流路制御手段（14,42）に供給す
    る試料注入手段（22,41）と、 該流路制御手段（14,42）と該分離用カラム（16,43）と
    の間に設けられ、該溶媒と共に供給される該被測定試料
    を濃縮処理する濃縮用カラム（30,40）と を設けており、 該濃縮用カラム（30,40）の内容量を2.0ミリリットル未
    満とすると共に、 該濃縮用カラム（30,40）内に、Si−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペ
    ーサー部分、Ｘはスルホン基）結合、及びSi−R'（R'は
    親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆され
    た多孔性担体よりなるカラム充填剤を充填してなる構成
    としたことを特徴とする液体クロマトグラフィ装置。
  2. 【請求項２】請求項１記載の液体クロマトグラフィ装置
    において、 前記カラム充填剤における親水性基R'を、水酸基を有す
    る親水性基としたことを特徴とする液体クロマトグラフ
    ィ装置。
  3. 【請求項３】請求項１又は請求項２記載の液体クロマト
    グラフィ装置において、 前記カラム充填剤におけるスペーサー部分Ｒ、炭素数１
    〜40の炭化水素残基又は該炭化水素残基の構成炭素原子
    の一部を酸素原子若しくは窒素原子で置換した置換基と
    したことを特徴とする液体クロマトグラフィ装置。
  4. 【請求項４】請求項１乃至請求項３の何れか一項記載の
    液体クロマトグラフィ装置において、 前記濃縮用カラム（30,40）内に充填された充填剤を構
    成する多孔性担体はシリカゲルであることを特徴とする
    液体クロマトグラフィ装置。
  5. 【請求項５】請求項１乃至請求項４の何れか一項記載の
    液体クロマトグラフィ装置において、 前記分離用カラム（16,43）は、内容量が2.0ミリリット
    ル未満であり、 充填剤としてカチオン交換機能を有したイオン交換用充
    填剤を充填されたカチオン交換カラムであることを特徴
    とする液体クロマトグラフィ装置。
  6. 【請求項６】使用されるカラム本体の内容量が2.0ミリ
    リットル未満であるとともに、 該カラム本体に充填する充填剤に、Si−Ｒ−Ｘ（Ｒはス
    ペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合、及びSi−R'（R'
    は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆さ
    れた多孔性担体よりなるカラム充填剤を用いている、供
    給された被測定試料の濃縮を行うために設けられた濃縮
    用カラム（30,40）に、 溶剤に混在された被測定試料を供給して、該被測定試料
    を濃縮し、濃縮された被測定試料を、溶剤に混在する被
    測定試料を分離する分離用カラム（16,43）に供給して
    分離し、 分離された被測定試料を、供給された被測定試料を分析
    処理する検出手段（17、44）に供給て分析処理すること
    を特徴とする分析方法。
  7. 【請求項７】移動相たる溶剤や被測定試料の流路を制御
    して溶剤の供給や溶剤と被測定試料の混合を担う流路制
    御装置（14,42）に、該溶剤をポンプ（11,45A）により
    供給すると共に、該流路制御装置（14,42）に接続され
    試料の該流路制御装置（14,42）への供給を担う試料注
    入配管（22,41）より被測定試料を該流路制御装置（14,
    42）に供給して被測定試料を該溶剤に混在させ、 該ポンプ（11,45A）の溶剤供給圧力に従い該溶剤に混在
    された被測定試料を、被測定試料を濃縮処理するために
    設けられた、充填剤を充填してなる濃縮用カラム（30,4
    0）に供給し、 該濃縮用カラム（30,40）により該被測定試料を濃縮
    し、 濃縮された被測定試料を該ポンプ（11,45A）の溶剤供給
    圧力に従い、溶剤に混在する被測定試料を分離する分離
    用カラム（16,43）に供給し、 該分離用カラム（16,43）により該濃縮された被測定試
    料分離し、 分離された被測定試料を該ポンプ（11,45A）の溶剤供給
    圧力に従い、供給された被測定試料を分析処理する検出
    手段（17、44）に供給し、 該検出手段（17、44）により該分離された被測定試料を
    分析処理する分析方法であって、 該濃縮用カラム（30,40）の内容量を2.0ミリリットル未
    満とすると共に、 該濃縮用カラム（30,40）内の充填剤に、Si−Ｒ−Ｘ
    （Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合、及びSi
    −R'（R'は親水性基）結合を有するシリコーンポリマー
    で被覆された多孔性担体よりなるカラム充填剤を用いた
    ことを特徴とする分析方法。
  8. 【請求項８】請求項７記載の分析方法において、 前記分離カラム（16,43）に、内容量が2.0ミリリットル
    未満であって、充填剤としてカチオン交換機能を有した
    イオン交換用充填剤を充填されたカチオン交換カラムを
    用いることを特徴とする分析方法。
  9. 【請求項９】カチオン性の化合物を含む生体試料に請求
    項７又は請求項８の何れか記載の分析方法を施して、該
    生体試料中の該カチオン性物質を分析することを特徴と
    する分析方法。
  10. 【請求項１０】カチオン性の化合物とタンパク質を含む
    生体試料に請求項７又は請求項８の何れか記載の分析方
    法を施して、該生体試料中の該カチオン性物質を分析す
    ることを特徴とする分析方法。
  11. 【請求項１１】被測定試料は血漿又は血清又は尿又は唾
    液又は生体組織から採取された生体組織構成物であり、 該測定試料中に請求項７又は請求項８の何れか記載の分
    析方法を施して、該測定試料中のカチオン性物質を分析
    することを特徴とする分析方法。
  12. 【請求項１２】Si−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘは
    スルホン基）結合、及びSi−R'（R'は親水性基）結合を
    有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体より
    なることを特徴とするカラム充填剤。
  13. 【請求項１３】請求項12記載のカラム充填剤において、 前記Si−R'結合における親水性基R'が、水酸基を有する
    親水性基であることを特徴とするカラム充填剤。
  14. 【請求項１４】請求項12又は請求項13記載のカラム充填
    剤において、 前記Si−Ｒ−Ｘ結合におけるスペーサー部分Ｒを、炭素
    数１〜40の炭化水素残基又は該炭化水素残基の構成炭素
    原子の一部を酸素原子若しくは窒素原子で置換した置換
    基としたことを特徴とするカラム充填剤。
  15. 【請求項１５】請求項12乃至請求項14記載のうち何れか
    一項記載のカラム充填剤において、 前記充填剤を構成する多孔性担体はシリカゲルであるこ
    とを特徴とするカラム充填剤。
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