WO1998044344A9

WO1998044344A9 -

Info

Publication number: WO1998044344A9
Authority: WO
Publication date: 1999-03-11

Description

明細書液体クロマトグラフィ及ぴカラム充) a剤

技術分野

本発明は液体クロマトグラフィ装置に係り、特に被測定試料を濃縮処理する濃縮用カラムを具備する液体クロマトグラフィ装置、及び被測定試料を濃縮処理して行う分析方法に関する。従来の技術

液体クロマトグラフィ装置は化学物質を分離 ·定量する化学分析手段として広く使われている。特に、内径が 1〜 2 m mのセミミクロカラムを使った液体クロマトグラフィ装置は高感度、高分解能および高精度な分析結果を提供できる利点を有しており、活発な研究がなされている。

そして、このセミミクロ力ラムあるいは汎用力ラムにおいて長さの短いもの（例えば内径 4 m m、長さ 1 O m mあるいは 2 0 m m ) を所謂分離用のカラムではなく、被測定試料濃縮処理用の濃縮力ラムとして用いる技術が最近注目されている。

この濃縮カラムは通常、分離用カラムとは別に液体クロマトグラフィ装置に内設され、分離用カラムにより被測定試料の分離が行われる前に用いられる。そして、測定対象となる物質以外の不純物たる物質を測定系外に取り除き、試料溶液中に被測定物を濃縮する。この濃縮用カラムの内部には被測定試料の特性に対応する特性のカラム充塡剤が充塡されており、試料溶液はこのカラム充塡剤により濃縮処理が行われる。

よって、分離カラムでの被測定試料の分離は試料溶液中に濃縮された被測定試料を用いて行うことが可能となり、その分離性能は格段に向上する。このような目的の濃縮用カラムに充墳剤容量の小さいセミミクロカラムを用いることは、濃縮用カラムにおける濃縮の効果を一段と高め、同時に用いられる分離カラムにおいて更に優れた分離特性を示すこととなる。

しかし、被測定試料は通常、非常に多種多様な不純物を含んでおり、濃縮用カラムにおける濃縮の効果を低下させるような場合があ例えば、液体クロマトグラフィ装置を血清等の各種物質の混合試料の分離，分析に用いた場合、生体成分である血清等はタンパク質成分を多量に含んでいるために、このタンパク質成分がカラム充填剤に吸着してしまい濃縮作用が低下してしまう。

このため、従来ではカラム充填剤による濃縮作用の低下を防止するために、ひいては分離カラムでの高い分離能を確保するために、予め試料より夕ンパク質を除去する前処理を行うほかなかった。

しかるに、このような前処理操作は多大の時間と労力を要し、かつ分析精度を低下させるという問題を有している。そこで、近年これらの除夕ンパク操作を行うことなく装置内に直接夕ンパク質成分含有試料を注入し、この注入されたタンパク質成分含有試料を濃縮しうるカラム充塡剤が提供されるようになってきている。

これらの改良されたカラム充塡剤は、多孔性ガラスゃシリ力ゲルを担体とし、その細孔内表面に特性の異なる物質を設けた構成とされている。そして、このカラム充塡剤を用いれば、血清中のタンパク質は巨大分子なので細孔内に入らず、且つ親水性の外表面（孔外面）に吸着されることなくカラムを素通りし、比較的小さな薬物等の分子は疎水性の内表面（孔内面）に吸着することとなる。

このようなカラム充墳剤の具体例としては、特開昭 6 0 - 5 6 2 5 6号公報に記載されたものが挙げられる。このカラム充塡剤では、ォク夕デシルシリル（O D S ) 基を化学結合させたシリカの外表面に夕ンパク質をコートしている。このコート用タンパク質はゥシ血清アルブミン等よりなり、該夕ンパク質を O D S結合シリ力に吸着 •変性させることによりカラム充塡剤を得ている。

しかしながら、上述したカラム充塡剤の内、タンパク質をコートし O D Sシリカ充塡剤では、使用が長期に渡ると吸着 ·変性した夕ンパク質が溶離を起こすことがあり、また高分離効率のカラムが得られない等、耐久性や分離能の点で問題を残している。

このような問題点を改良するため、特開昭 6 1 - 6 5 1 5 9号公報及び特開平 1 — 1 2 3 1 4 5号公報に記載されたように、

①多孔質担体の内表面及び外表面に疎水性基を導入する。

②それ自信が巨大分子であり、シリ力等の細孔内に侵入できない酵素を用いて外表面の疎水性基だけを切断する。

③その後、外表面に親水性基を導入する。

ことにより、カラム充塡剤を得る方法も開発されている。

具体的には、特開昭 6 1 - 6 5 1 5 9号公報記載の方法では、グリセリルプロピル基を導入した多孔性シリ力を出発原料とし、これにカルボ二ルジィミダツールを介してォリゴぺプチドを結合させ、夕ンパク質加水分解酵素であるカルボキシぺプチターゼ Aを用いて加水分解を行うことにより外表面のフ二ルァラニン側鎖を切断している。その結果、カラム充塡剤の内表面には疎水性リガンドとしてグリシルーフェニルァラニルフヱ二ルーァラニンが残り、外表面には親水性のグリシル一グリセリルプロピル基となる。

一方、特開平 1 一 1 2 3 1 4 5号公報に記載の方法は、アミノブ口ピル基を導入した多孔性シリカを出発原料として、トリエチルァミン存在下、ォクタノイルクロリドを反応させ、ァミド結合を介して疎水性基を導入し、次にポリミキシン · アシラーゼにより外表面のァシル基を加水分解し、外表面のァミノ基をグリシドールとの反応を行うことにより親水基とする方法である。

しかるに、液体クロマトグラフィ装置に配設される濃縮用カラムのカラム充填剤として特開昭 6 1 - 6 5 1 5 9号公報或いは特開平 1 - 1 2 3 1 4 5号公報に開示されたものを用いると、各公報に開示されたカラム充塡剤は酵素反応を利用しているため、カラム充塡剤の製造構成が複雑化すると共に得られたカラム充塡剤の特性にバラツキが生じやすいという問題点があった。

また、従来の液体クロマトグラフィ装置では、濃縮用カラムの内容積が 2 . 0 ミリリットル以上と大きい容積を有していたため、供給された試料溶液が却って濃縮用カラム内で希釈されてしまい、検出精度が低下してしまうという基本的な問題点もあった。この問題点は、特に注入される試料量が少ない場合には検出精度に大きく影響を与えてしまう。

そして、これらの公知例によって明らかにされたカラム充塡剤は取り除くべき物質、ここでの例においてはタンパク質であるが、この夕ンパク質を取り除くことにその特徴を有している。つまり、夕ンパク質に対応するため、その表面を親水性若しくは疎水性に制御しているが、このような制御は本来測定すべき被測定試料に対し従来技術以上の分離効果をカラム充塡剤が示すために付与されたものではない。

被測定試料に対応する特性は、従来どおりの充塡剤の疎水表面であり、その濃縮処理の対象としうる被測定試料、特に被測定物質の範囲も本質的には従来のものと変わらないことになる。

すなわち、上記公知例はその濃縮の対象としうる被測定試料を非極性又は低極性の物質に限られ、上記の例に従えば、血清等の各種物質の混合試料である生体試料の分離，分析に用いた場合、生体試料中に含有され当然に測定の対象となりうるイオン性の物質に対してその効果的な濃縮処理を行うことができない。

本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、濃縮用カラムとして比較的得ることが容易でかつ濃縮効率の良好なものを用いると共に濃縮用カラムの内容積を小さくすることにより、上記の問題点を解決した液体クロマトグラフィ装置を提供することを目的とする _c また、本発明の別の目的は、濃縮用カラムの充塡剤又は濃縮用力ラムの充塡剤及び分離用カラム充塡剤としてカチオン交換機能を有した充塡剤を用い、被測定試料中のカチオン性物質に対し高い分離能を示す液体クロマトグラフィ装置及び分析方法を提供することにめる。発明の開示

請求項 1記載の発明は、液体クロマトグラフィ装置において、ポンプにより供給される溶媒に混在する被測定試料を分離する分離用カラムと、

該ポンプと該分離用カラムとの間に配設され、該ポンプから該溶媒を供給されると共に試料注入配管より該被測定試料を供給され、該被測定試料を該溶媒と共に該分離用カラムに供給する流路制御手段と、

該分離用カラムで分離された該被測定試料が供給されると共に、供給された該被測定試料を分析処理する検出手段と、

該被測定試料を格納した複数の容器を担持する試料保持機構と、前記複数の容器の一つから該被測定試料を選択的に採取してこれを該流路制御手段に供給する試料注入手段と、

該流路制御手段と該分離用カラムとの間に設けられ、該溶媒と共に供給される該被測定試料を濃縮処理する濃縮用カラムと

を設けており、

該濃縮用カラムの内容量を 2 . 0 ミリリットル未満とすると共に, 該濃縮用カラム内に、 S i - R - X ( Rはスぺーサ一部分、 Xはスルホン基）結合、及び S i一 R ' ( R ' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなるカラム充塡剤を充塡してなる構成

としたことを特徴とする。

請求項 2記載の発明は、請求項 1記載の液体クロマトグラフィ装置において、

前記カラム充塡剤における親水性基 R ' を、水酸基を有する親水性基としたことを特徴とする。

請求項 3記載の発明は、請求項 1又は請求項 2記載の液体クロマトグラフィ装置において、

前記カラム充塡剤におけるスぺーサ一部分 Rを、炭素数 1〜 4 0 の炭化水素残基又は該炭化水素残基の構成炭素原子の一部を酸素原子若しくは窒素原子で置換した置換基としたことを特徴とする。請求項 4記載の発明は、請求項 1乃至請求項 3の何れか一項記載の液体クロマトグラフィ装置において、

前記濃縮用カラム内に充塡された充塡剤を構成する多孔性担体はシリ力ゲルであることを特徴とする。

請求項 5記載の発明は、請求項 1乃至請求項 4の何れか一項記載の液体クロマトグラフィ装置において、

前記分離用カラムは、内容量が 2 . 0 ミリリットル未満であり、充塡剤としてカチオン交換機能を有したイオン交換用充填剤を充塡されたカチオン交換カラムであることを特徴とする。

請求項 6記載の発明は、分析方法において、

使用されるカラム本体の内容量が 2 . 0 ミリリットル未満であるとともに、

該カラム本体に充塡する充塡剤に、 S i - R - X ( Rはスぺーサ一部分、 Xはスルホン基）結合、及び S i一 R ' ( R ' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなるカラム充塡剤を用いている、

供給された被測定試料の濃縮を行うために設けられた濃縮用カラムに、

溶剤に混在された被測定試料を供給して、該被測定試料を濃縮し- 濃縮された被測定試料を、溶剤に混在する被測定試料を分離する分離用カラムに供給して分離し、分離された被測定試料を、供給された被測定試料を分析処理する検出手段に供給て分析処理することを特徴とする。

請求項 7記載の発明は、分析方法において、

移動相たる溶剤や被測定試料の流路を制御して溶剤の供給や溶剤と被測定試料の混合を担う流路制御装置に、該溶剤をポンプにより供給すると共に、該流路制御装置に接続され試料の該流路制御装置への供給を担う試料注入配管より被測定試料を該流路制御装置に供給して被測定試料を該溶剤に混在させ、

該ポンプの溶剤供給圧力に従い該溶剤に混在された被測定試料を、被測定試料を濃縮処理するために設けられた、充塡剤を充塡してなる濃縮用カラムに供給し、

該濃縮用カラムにより該被測定試料を濃縮し、

濃縮された被測定試料を該ポンプの溶剤供給圧力に従い、溶剤に混在する被測定試料を分離する分離用カラムに供給し、

該分離用カラムにより該濃縮された被測定試料分離し、

分離された被測定試料を該ポンプの溶剤供給圧力に従い、供給された被測定試料を分析処理する検出手段に供給し、

該検出手段により該分離された被測定試料を分析処理する分析方法であって、

該濃縮用カラムの内容量を 2 . 0 ミリリットル未満とすると共に、該濃縮用カラム内の充塡剤に、 S i—R— X ( Rはスぺーサ一部分、 Xはスルホン基）結合、及び S i 一 R ' ( R ' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなる力ラム充塡剤を用いたことを特徴とする。

請求項 8記載の発明は、請求項 7記載の分析方法において、前記分離カラムに、内容量が 2 . 0 ミリリットル未満であって、充塡剤としてカチオン交換機能を有したイオン交換用充塡剤を充填されたカチオン交換カラムを用いることを特徴とする。

請求項 9記載の発明は、分析方法において、カチオン性の化合物を含む生体試料に請求項 7又は請求項 8の何れか記載の分析方法を施して、該生体試料中の該カチオン性物質を分析することを特徴とする。

請求項 1 0記載の発明は、分析方法において、

カチオン性の化合物とタンパク質を含む生体試料に請求項 7又は請求項 8の何れか記載の分析方法を施して、該生体試料中の該カチオン性物質を分析することを特徴とする。

請求項 1 1記載の発明は、分析方法において、

被測定試料は血漿又は血清又は尿又は唾液又は生体組織から採取された生体組織構成物であり、

該測定試料中に請求項 7又は請求項 8の何れか記載の分析方法を施して、該測定試料中のカチオン性物質を分析することを特徴とす 0

請求項 1 2記載の発明は、カラム充塡剤において、

S i 一 R— X ( Rはスぺーサ一部分、 Xはスルホン基）結合、及ぴ S i— R ' ( R ' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなることを特徴とする。

請求項 1 3記載の発明は、請求項 1 2記載のカラム充塡剤において、

前記 S i— R ' 結合における親水性基 R ' が、水酸基を有する親水性基であることを特徴とする。

請求項 1 4記載の発明は、請求項 1 2又は請求項 1 3記載のカラム充塡剤において、

前記 S i 一 R— X結合におけるスぺーサ一部分 Rを、炭素数 1〜 4 0の炭化水素残基又は該炭化水素残基の構成炭素原子の一部を酸素原子若しくは窒素原子で置換した置換基としたことを特徴とする ο

請求項 1 5記載の発明は、請求項 1 2乃至請求項 1 4記載のうち何れか一項記載のカラム充塡剤において、前記充塡剤を構成する多孔性担体はシリカゲルであることを特徴とする。

請求項 1及び請求項 2及び請求項 3記載の発明によれば、液体ク口マトグラフィ装置において、濃縮用カラムの内容量を 2 . 0 ミリリットル未満としておりその内容積は小さいため、注入される被測定試料量が少なくても希釈作用は発生せず、よって確実に濃縮処理を行うことができるため検出精度を向上させることができる。

また、濃縮用カラム内に充塡されるカラム充塡剤は、 S i 一 R— X ( Rはスぺーサ一部分、 Xはスルホン基）結合、及び S i 一 R ' ( R ' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなり、この構成のカラム充塡剤はその外表面の一部が親水性であるために、例えば生体試料に対して用いられた場合、生体試料の含有するタンパク質等が吸着されることはなく、また安定でしかも分離能に優れているため、濃縮処理を確実に行うことができる。更に、反応に酵素等を用いていないため、再現性に優れた充塡剤が得られ、これによつても安定した濃縮処理を実現できる。そして、スぺーサ一部分 Rの先端にはスルホン基が結合して設けられており、該スルホン基がカチオンに対し強いイオン的な相互作用を示すことから、該カラム充塡剤はカチオン交換機能を有することが可能となり、カチオン性化合物を選択的に濃縮することができ

^> o

よって、カチオン性の被測定化合物に対し優れた分離能を示す液体クロマトグラフィ装置を提供できる。

請求項 4記載の発明によれば、濃縮用カラム内に充塡されるカラム充塡剤を構成する多孔性担体に、使用時の移動相たる溶剤による膨潤等の問題の無い高い信頼性を有するシリカゲルを使用することができる。

よって、カチオン性の被測定化合物に対し優れた分離能を示すとともに高い信頼性を有する液体クロマトグラフィ装置を提供できる。請求項 5記載の発明によれば、被測定試料の特性であるカチオン性に従い被測定試料の濃縮を行った後、更にそのカチオン性を利用して被測定試料の分離を行うことが可能となる。

よって、カチオン性の被測定化合物に対し非常に優れた分離能を示す液体クロマトグラフィ装置を提供できる。

請求項 6及び請求項 7記載の発明によれば、被測定試料の分析における被測定試料の濃縮に用いる濃縮用カラムの内容量を 2 . 0 ミリリットル未満としておりその内容積は小さいため、注入される被測定試料量が少なくても希釈作用は発生せず、よって確実に濃縮処理を行うことができるため検出精度を向上させることができる。

また、濃縮用カラム内に充塡されるカラム充填剤は、 S i 一 R— X ( Rはスぺーサ一部分、 Xはスルホン基）結合、及び S i— R ' ( R ' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなり、この構成のカラム充塡剤はその外表面の一部が親水性であるために、例えば生体試料に対して用いられた場合、生体試料の含有するタンパク質等が吸着されることはなく、また安定でしかも分離能に優れているため、濃縮処理を確実に行うことができる。更に、反応に酵素等を用いていないため、再現性に優れた充塡剤が得られ、これによつても安定した濃縮処理を実現できる。そして、スぺ一サ一部分 Rの先端にはスルホン基が結合して設けられており、該スルホン基がカチオンに対し強いイオン的な相互作用を示すことから、該カラム充塡剤はカチオン交換機能を有することが可能となり、カチオン性化合物を選択的に濃縮することができる o

よって、カチオン性の被測定化合物に対して、高い分離能を有した分離を行う分析が可能となる。

請求項 8記載の発明によれば、被測定試料の特性であるカチオン性に従い被測定試料の濃縮を行った後、更にそのカチオン性を利用して被測定試料の分離を行うことが可能となる。よって、カチオン性の被測定化合物に対して、非常に優れた分離能を有した分離を行う分析が可能となる。

請求項 9及び請求項 1 0及び請求項 1 1記載の発明によれば、被測定試料である生体試料に含有されるカチオン性の化合物を、該化合物の特性であるカチオン性に従い選択的に濃縮することができる。更にそのカチオン性を利用して被測定試料の分離を行うことが可能となる。

よって、生体試料、特に含有するカチオン性の被測定化合物を測定対象とした場合に、測定対象に対して、非常に優れた分離能を有した分離を行う分析が可能となる。

請求項 1 2及び請求項 1 3及び請求項 1 4記載の発明によれば、カラム充塡剤は S i 一 R— X結合を有して、スぺ一サ一部分 Rの先端にはスルホン基が結合して設けられており、該スルホン基がカチオンに対し強いイオン的な相互作用を示すことから、該カラム充塡剤はカチオン交換機能を有することが可能となり、カチオン性化合物を選択的に保持、ひいては濃縮することができる。

よって、カチオン性の被測定化合物に対して、高い濃縮性能を有したカラム充塡剤を提供することが可能となる。

更に、該カラム充塡剤は S i— R ' 結合を有することにより、その外表面の一部が親水性であるため、例えば生体試料に対して用いられた場合、生体試料の含有するタンパク質等が吸着されることはなく、また安定でしかも分離能に優れているため、濃縮処理を確実に行うことができる。

以上より、生体試料等、タンパク質物質を含むようなカチオン性の非測定化合物に対しても、安定的に高い濃縮性能を有したカラム充塡剤を提供することが可能となる。

請求項 1 5記載の発明によれば、濃縮用カラム内に充墳される力ラム充塡剤を構成する多孔性担体に、使用時の移動相たる溶剤による膨潤等の問題の無い高い信頼性を有するシリ力ゲルを使用することができる。

よって、カチオン性の被測定化合物に対し優れた保持性能、ひいては濃縮性能を示すとともに高い信頼性を有する力ラム充塡剤を提供できる。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の第 1実施例である液体クロマトグラフィ装置の概略構成図である。

第 2図は、本発明の第 1実施例である液体クロマトグラフィ装置の動作を説明するための概略構成図である。

第 3図は、本発明の第 1実施例である液体クロマトグラフィ装置の動作を説明するための概略構成図である。

第 4図は、本発明の第 2実施例である液体クロマトグラフィ装置の概略構成図である。

第 5図は、本発明にかかる一実施例であるカラム充塡剤のカチォン性物質に対する保持特性を示すクロマトグラムである。

第 6図は、本発明にかかる実施例である充塡剤が濃縮可能なカチオン性物質の例を示す図である。

第 7図は、本発明にかかる実施例である充塡剤を使用した場合の移動相中の塩濃度の変化による保持の調整を示すグラフである。第 8図は、本発明の効果を説明するためのクロマトグラムを示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の実施例について図面と共に説明する。

図 1乃至図 3は、本発明の第 1実施例である液体クロマトグラフィ装置の概略構成図である。

本実施例に係る液体クロマトグラフィ装置は、複数の試料容器 2

1 aを形成された試料保持部 2 1を有し、各試料容器 2 1 aには被測定試料が保持される。この各々の試料容器 2 1 aは典型的には約 2 5 0 1 の容量を有している。また、試料注入管 2 2はロボット 2 2 aにより移動自在に保持されており、ロボット 2 2 aの動作により試料注入管 2 2が位置に移動され、続いて下降動作することにより試料注入管 2 2は複数ある試料容器 2 1 aの内、選択された 3の試料容器 2 1 aに挿入される。続いて、シリンジ 1 5の操作を操作することにより、被測定試料は試料注入管 2 2内に吸入させる。

また、図中 1 4で示すのは六方弁として構成される第 1の切り換えバルブ 1 4であり、この第 1の切り換えバルブ 1 4には本発明の要部となる濃縮用カラム 3 0及び試料注入管 2 2の先端を受け入れる端部 1 4 Xが接続されている。

濃縮用カラム 3 0は、その内容積が 2 . 0 ミリリットル未満と比較的小型のカラムであり、後述するカラム充塡剤が充塡されている < この濃縮用カラム 3 0において供給された被測定試料は濃縮されるため、後述する分離用カラム 1 6及び検出器 1 7には濃縮された被測定試料が供給されることとなり、検査精度の向上を図ることができる。

また、端部 1 4 Xは被測定試料の注入口となる部位であり、試料注入管 2 2内に採取された被測定試料は、試料注入管 2 2を端部 1 4 X内に挿入し再びシリンジ 1 5を操作することにより端部 1 4 X 内に注入される。

この際、試料注入管 2 2はロボット 2 2. aにより端部 1 4 xに対応した位置 P ₂ に水平移動され、続いて鉛直方向に移動することにより端部 1 4 X内に挿入される。また、試料注入管 2 2から注入された試料溶液は、第 1の切り換えバルブ 1 4が図 1及び図 2に示される状態の時に濃縮用カラム 3 0内に供給され、濃縮処理が行われる構成となっている。

また、本実施例に係る液体クロマトグラフィ装置では、検出器 1 7の試料出口に六方弁として構成される第 2の切り換えバルブ 2 3 が接続されている。この第 2の切り換えバルブ 2 3は、分離用カラム 1 6で分離され検出器 1 7で検出された後排出される被分離試料を、前記廃液溜め 1 8と前記試料注入管 2 2のいずれか一方に選択的に供給する機能を奏する。図 1及び図 3に示す状態では、検出器 1 7から排出される被分離試料は矢印で示すように廃液溜め 1 8に送れる。

一方、被分離試料を試料注入管 2 2に給送する場合には、図 2に示されるように、試料はシリンジ 1 5に設けられた継手 1 5 a中に形成された流路 1 5 bを通って試料注入管 2 2に供給される。流路 1 5 bは、シリンジ 1 5から供給された試料であろうとも、また弁 2 3から供給された試料であろうとも、いずれも前記試料注入管 2 2に送られるように T字型に形成されている。

更に、図示の装置には、分離用カラム 1 6およびこれに協働する配管系を洗浄する洗浄液を保持する容器 2 4が設けられ、洗浄液は容器 2 4からポンプ 2 5を経て第 2の切り換えバルブ 2 3に供給される。図 1及び図 3に示す状態では、洗浄液は継手 1 5 aを経て試料注入管 2 2に送られこれを洗浄する。試料注入管 2 2を洗浄する場合には、ロボット 2 2 aは針 2 2を位置 P , や P ₂ とは異なった廃液回収位置（図示せず）に移動させる。

図 2は、図 1の装置において第 2の切り換えバルブ 2 3が回動した状態を示している。図示の状態では、検出器 1 7から排出される被分離試料は矢印に沿って弁 2 3を通過し、継手 1 5 a中の流路 1 5 bを経て針 2 2に送られる。一方、容器 2 4からの洗浄液は第 2 の切り換えバルブ 2 3において阻止される。その結果、ロボット 2 2 aにより、試料注入管 2 2を試料保持部 2 1上の適当な試料容器 2 1 aに対応する位置に移動させることにより、検出器 1 7から排出された被分離試料を試料容器 2 1 a中に回収することが可能になる o 特にカラムの内径が 1 . 0〜2 . 0 m mのセミミクロカラムをク口マトグラフ分離用カラム 1 6 として使う場合、溶媒の全流量が高々 5 0〜 2 0 0 I Zm i nと非常に小さいため、溶媒による試料の希釈に伴う被分離試料の体積の増大は問題にならず、数百 1 の容量の試料容器 2 1 aで十分に被分離試料を回収することができ o

また、図 3は第 1の切り換えバルブ 1 4が回動した状態を示している。図示の状態では、端部 1 4 Xから濃縮用カラム 3 0の上端供給口への被測定試料の供給は阻止され、その代わりに濃縮用カラム 3 0の上端供給口にはポンプ 1 1 により溶媒が供給される状態となる。また、濃縮用カラム 3 0の下端排出口は分離用カラム 1 6に接続された状態となる。よって、濃縮用カラム 3 0で濃縮された被測定試料は分離用カラム 1 6に供給され、分離用カラム 1 6により分離された被測定試料は続いて検出器 1 7に供給され、所定の分析処理が行われる。

図 4は、発明の第 2実施例である液体クロマトグラフィ装置を示している。

本実施例に係る液体クロマトグラフィ装置は、オートサンプラー 4 1 と六方弁として構成される 6バルブ—スイッチングバルブ（以下、スイッチングバルブという） 4 2 との間に一次分離を行う濃縮用カラム 4 0が配設されている。

この濃縮用カラム 4 0は、その内容積が 2 . 0 ミリリツトル未満とされたカラムであり、第 1実施例の液体クロマトグラフィ装置に配設されている濃縮用カラム 3 0 と同様に、後述するカラム充塡剤が充塡されている。この濃縮用カラム 4 0においてオートサンプラー 4 1から供給された被測定試料は濃縮されるため、後述する分離用カラム 4 3及び検出器 4 4には濃縮された被測定試料が供給されることとなり、検査精度の向上を図ることができる。

また、第 1実施例で説明した切り換えバルブ 1 4 , シリンジ 1 5 , 試料注入管 2 2及びこれらの構成要素と共に機能する他の構成要素は、オートサンプラー 4 1内に組み込まれた構成となっている。更に、ポンプ 4 5 A及びポンプ 4 5 Bは、スイッチングバルブ 4 2 と協働して被測定試料を濃縮用カラム 4 0 , 分離用カラム 4 3及び検出器 4 4に供給する被測定試料供給システムを構成する。

図 4に示される構成によれば、被測定試料はポンプ Aにより供給される溶媒（移動相 A ) と共に、オートサンプラー 4 1から濃縮用カラム 4 0に送られ濃縮処理が行われる。そして、濃縮用カラム 4 0において濃縮された被測定試料は、ポンプ 4 5 Bにより供給される溶媒（移動相 B ) と共に分離処理を行うために分離用カラム 4 3 に供給される。この際、移動相 Aと移動相 Bの切り換えは、先に述ベたスィツチングバルブ 4 2により行われる。

搬送された被測定試料は分離用カラム 4 3において分離され、検出器 4 4において被測定試料に対して所定の分析処理が行われる。また、上記構成とされた液体クロマトグラフィ装置は、分析処理の制御を行うためにコンピュータ一により構成されるコントローラ一 4 6を具備している。このコントローラ一 4 6は、オートサンプラー 4 1 , スイッチングバルブ 4 2 , 及びポンプ 4 5 A , 4 5 Bの駆動制御を行う。

尚、上記した 2カラムシステムを採用した液体クロマトグラフィ装置は、従来の分析装置に対して被測定試料に対する処理を排除できる点で有利であり、このシステムはサンプルトリートメントフーリーシステムとして一般に用いられている。

続いて、コントローラ一 4 6の制御処理により実施されるスィッチングバルブ 4 2の切り換え動作について説明する。スィツチングバルブ 4 2はコントローラー 4 6の制御処理により、液体クロマトグラフィ装置内に形成される被測定試料の流路を第 1 の状態と第 2 の状態とに切り換え処理を行う。

スィツチングバルブ 4 2が第 1の状態となっている時、ポンプ 4 5 Aの発生するポンプ圧によりォ一トサンプラー 4 1から移動相 A と共に圧送される被測定試料は、濃縮用カラム 4 0を通過した後にスイッチングバルブ 4 2に供給され、更に被測定試料は図中実線で示されるラインに沿って図示されない廃液貯蔵槽に向け進んでゆく < この際、被測定試料に含まれる分析対象となる物質のみが濃縮用力ラム 4 0に捕獲され濃縮処理される。また、同時に移動相 Bもボンプ 4 5 Bの発生するポンプ圧によりスイッチングバルブ 1 0に供給され、図 4に実線で示すラインに沿って分離用カラム 4 3及に向け流れる構成となっている。

—方、コントローラ一 4 6の制御処理によりスィッチングバルブ 4 2が第 2の状態となると、濃縮用カラム 4 0において濃縮された被測定試料は、分析を行うために図 4に破線で示すラインに沿って流れ分離用カラム 4 3に供給される。一方、ポンプ 4 5 Bから供給される移動相 Bは、図中破線で示されるラインに沿って図示しない廃液貯蔵槽に流出される構成となっている。

ここで、濃縮用カラム 3 0 , 4 0に充填される充塡剤について以下説明する。本実施例においては、濃縮用カラム 3 0， 4 0に充塡される充塡剤として、 S i — R— X ( Rはスぺ一サ一部分、 Xはスルホン基）結合、及び S i — R ' ( R ' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなるカラム充塡剤を使用している。この構成のカラム充塡剤を使用することにより、例えばタンパク質成分を含有する血清等を被測定試料として用いた場合におけるタンパク質の分離能を高めることができ、よって濃縮処理を確実かつ安定して行うことが可能となる。以下、本実施例で用いるカラム充塡剤の具体的構成について説明する。

本実施例において用いられる多孔性担体としては、例えば液体ク口マトグラフィ一用の担体として一般に使用されている任意の粉体であるシリカゲル、アルミナ、ガラスビーズ（例えばポーラスガラス）、ゼォライト、ヒドロキシアパタイト又はグラフアイト等を使用することができる。また、複合粉体、例えばポリアミド、ァクリル樹脂、又はポリビニルアルコール等の合成樹脂の表面に、微細な無機粉体、例えばシリカゲル、二酸化チタン又はヒドロキシアバ夕ィトを被覆処理した粉体も使用することができる。

また、多孔性担体の平均粒径は 2〜20 0 mで、比表面積 2 0 0〜3 0 0m² /g、 4 0〜 1 20 Aの細孔を有するものが好適である。特に好適な多孔性担体としては、 6 0〜8 0 Aの細孔を持ち、比表面積が 4 0 0〜 6 0 0 m² Zgで粒径 3〜 5 0 mの球形あるいは破砕型のシリ力ゲルである。

本発明において使用される S i一 H基を有するシリコーン化合物は、下記一般式 I

(R¹ HS i 0) a (R² R³ S i 0) b (R⁴ R⁵ R⁶ S i 0_1/2 ) c

(式 I )

(式 I中 R¹ , R² 及び R³ は相互に独立に水素原子であるか又はハロゲン原子の少なくとも 1個で置換されていることのある炭素数 1〜 1 0の炭化水素基であるが、 R¹ , R² ， R³ が同時に水素原子であることはない。また、 R⁴ , R⁵ , R⁶ は相互に独立に水素原子であるか又はハロゲン原子に少なくとも一個で置換されていることのある炭素数 1〜1 0の炭化水素基である。 aは 0又は 1以上の整数であり、 bは 0又は 1以上の整数であり、 cは 0又は 2であるが、但し cが 0である場合には aと bとの和が 3以上の整数であるものとする）の少なくとも一種である。

上記式 Iのシリコーン化合物は 2種の群からなる。第 1の群は、前記式 Iにおいて c = 0の場合に相当し、下記一般式 I I

(R¹ HS i 0) a (R² R⁵ S i 0) b

(式 I I )

(式 I I中 R' , R² , R³ 、 a及び bは前記と同じ意味である、好ましくは R ¹ ， R ² 及び R ³ が相互に独立にハロゲン原子に少なくとも一個で置換されていることのある炭素数 1〜 1 0の炭化水素基であり、 aと bとの和が 3以上である）で表わされた環状シリコーン化合物である。

この化合物 c s H I Iの代表例を挙げれば以下の通りである。

(式中、 nは 3〜 3 0 0の整数を表わす）

(式 I I I )

b

(式中、 a十 b = 3〜3 0 0 )

(式 I V ) 上記の式 I I I及び式 I Vで示される化合物は、それぞれ単独で又はそれらの混合物の形で使用することができる。

上記式 I I I及び式 I Vの各式において、 _n (又は a + b ) は好ましくは 3〜 7である。 nの値が小さくなるのに従ってその沸点が低下するので、蒸発して担体上に吸着する量が多くなる。特に 3量体及び 4量体は、その立体性質上、重合しやすいので特に適している o

前記式 I Iの環状シリコーン化合物の具体例としては、ジハイドロジェンへキサメチルシクロテトラシロキサン、トリノヽイドロジェンベンタメチルシクロテトラシロキサン、テトラハイドロジェンテトラメチルシクロテトラシロキサン、ジハイドロジェンォクタメチルシクロペン夕シロキサン、トリハイドロジェンヘプタメチルシク口ペンタシロキサン、テトラハイドロジェンへキサメチルシクロべンタンシ Cロ Hキサン、及びペン夕ハイドロジヱンペンタメチルシクロペン夕シロキサン等を挙げることができる。

前記式 Iのシ C s C—リ I

H Hコーン化合物の第二の群は、前記式

1. Iにおいて、 c = 2の場合に相当し、下記一般式 V

(R¹ HS i 0) a (R² R³ S i 0) b (R⁴ R⁵ S i 0_l/2 ) c

(式 V)

(式 V中 R¹ , R² ， R³ , R⁴ , R⁵ ， R⁶ 、 a及び bは前記と同じ意味であり、 cは 2であるが、好ましくは R¹ 〜R⁶ が相互に独立にハロゲン原子の少なくとも 1個で置換されていることのある炭素数 1〜 1 0炭化水素基である）で表わされるシリコーン化合物である。この化合物の代表例としては、下記一般式 V I

CH₃

(式中、 nは 2〜100の整数を表わす）

(式 V I ) で表わされる化合物を挙げることができる。

上記式 Vの直鎖状シリコーン化合物の具体例としては、し 1 , 1， 2, 3, 4 , 4, 4ーォクタメチルテトラシロキサン、 1 , 1， 1, 2, 3, 4, 5， 5， 5—ノナメチルペン夕シロキサン、及び 1 , 1 , 1 , 2, 3 , 4, 5 , 6, 6, 6—デカメチルへキサシ口キサン等を挙げることができる。前記一股式 1で表わされるシリコーン化合物は、気相状態又は液相状態で前記多孔性担体と接触させる。

スルホン基を有するスぺーサ一部分

担体表面を被覆したシリコーンポリマー中には、スルホン基を有するスぺーサ部分がある。その構造としては、例えば一般式

( S i ) - R ₈ - X (式 V I I )

(式中、 R ₈ は、炭素数 1〜4 0の直鎖状或いは分枝構造を有するアルキル基若しくは該アルキル基の対応する構成炭素原子の一部を酸素原子或いは窒素原子で置換してなる酸素原子或いは窒素原子を含有する置換基、炭素数 4〜 8のシクロアルキル基或いはシク口アルケニル基若しくは該シクロアルキル基或いは該シクロアルケ二ル基の対応する構成炭素原子の一部を酸素原子或いは窒素原子で置換してなる酸素原子或いは窒素原子を含有する置換基、又は炭素数 1〜 2 0のアルキル基で置換されていることのあるァリール基若しくは該ァリール基の対応する構成炭素原子の一部を酸素原子或いは窒素原子で置換してなる酸素原子或いは窒素原子を含有する置換基、又は主鎖構造中にベンゼン環構造或いはシクロアルカン構造を有する炭素数 1〜 4 0のアルキル基若しくは該アルキル基の対応する構成炭素原子の一部を酸素原子或いは窒素原子で置換してなる酸素原子或いは窒素原子を含有する置換基であり、 Xはスルホン基である）で表わされる。

親水性基

本実施例にかかる液体クロマトグラフィ用充塡剤は、上記のようにして得たシリコーンポリマー被覆担体の表面に— S i— R ' ( R ' は親水性基）を有する。親水性基 R ' としては、その内部に水酸基を有するものが望ましく、例えば次の式 V I I I に示すテトラオール構造を有した置換基等が用いられる。 S i+CH₂ CH₂ -CH₂ OCH₂ CH-CH₂ - 0-CH₂ CHCH₂ -η 、 OH OH

(式 V I I I ) また、このテトラオール構造をポリオール構造とした置換基も同様に用いることができる。

以上のようにして得た充塡剤は、シリカゲルをシリコーンポリマーで被覆しているため、シリ力ゲル上のシラノ一ル基の影響が出現しにくく、塩基性物質の吸着がほとんど見られない。

図 5は、本発明にかかる一実施例であるカラム充塡剤のカチオン性物質に対する保持特性を示すクロマトグラムである。

使用したカラム充塡剤は、 S i— R— X (Rはその構造が下式 I Xのように示されるスぺ一サ一部分であり、 Xはスルホン基）結合. 及び S i— R' (R' は水酸基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆されたシリ力ゲルよりなる。

R =

(式 I X) 尚、シリ力ゲルには約 6 0 Aの細孔を有し、平均粒径 5 mの球形シリカゲル粉体を使用した。かかるカラム充塡剤の製造については、特開平 8— 2 6 2 0 0 4 号公報に記載された方法に従い、更に所定の化学反応方法を適宜使用して行なった。

この本発明にかかる一実施例であるカラム充塡剤を内径 2. 0 m m、長さ 1 Ommのカラムに充塡し、カチオン性物質としてカテコールアミンを含む被測定試料（濃度が 1 0 0 p pmとなるようにカテコールアミンを血清に添加したもの）をそれに導入し、得られるクロマトグラムからカテコールアミンの溶出状況を調べ、その力チオン性物質に対する保持性能を調べた。

以下に分離条件を示す。

移動相： 1 0〃Μ EDTA- 2 N a,

2 5 mM リン酸緩衝液（p H= 6. 9 )

流速： 1 0 0 分

分離温度（カラム温度）： 3 5 ° C

検出方法： UV検出（ 2 5 4 nm)

そして、比較例として、従来技術である充塡剤（表面にフニル基を備えたもの）を充塡した市販のカラムを使用して、同様の分離条件で同じ試料の保持性能を調べた。

図 5 (A) は本発明にかかる一実施例であるカラム充填剤を使用した場合のクロマトグラムを示し、図 5 (B) には比較例のカラム充塡剤を使用した場合のクロマトグラムを示す。

図 5 (A) に示すように、本実施例のカラム充填剤を使用した場合、カテコールアミン（ノルェピネフリン（ N E ) , ェピネフリン (E) 及びドーパミン（D) ) は、血清中の夕ンパク質が保持されずボイドボリユーム付近に溶出した後、カラム内に保持され溶出される。

しかし、比較例では、血清中のタンパク質及び溶剤等々と共に力テコールアミンは素早くカラムから溶出してしまって、カラム内で保持されず、クロマトグラムは分離状態のカテコールァミンのピ一クを示さない。

以上より、本発明にかかる一実施例であるカラム充塡剤が血清中のタンパク質は保持せず、カテコールアミン等のカチオン性物質を効率よく保持、ひいては濃縮することが明らかとなった。

尚、本発明にかかる実施例である充塡剤は、カテコールアミンのみではなく、図 6に示す多様なカチオン性物質を保持、濃縮できる _c このとき、移動相中の塩濃度を変化させることにより、その保持を調整することも可能である。

図 7は本発明にかかる実施例である充塡剤を使用した場合の移動相中塩濃度の変化による保持の調整を示すグラフである。このとき、グラフの縦軸は保持比の対数であり、横軸は塩の濃度（m M ) である。

分離条件を以下に示す。

カラムのサイズ： 2 . 0 m m X 1 0 m m

分離温度： 3 5 ° C

移動相：リン酸緩衝液（P H = 6 . 9 )

リン酸緩衝液中の塩濃度： 5， 1 0 , 2 5， 5 0及び 1 0 0 111 ^^ 流速： 0 . 1 m 1 Z分

検出法： U V検出

試料：各カチオン性物質が 1 0 0 p p mの濃度である溶液試料注入量： 2 / 1

図 7に示されるように、本発明にかかる実施例である充填剤は、多様なカチオン性物質に対して、多様な塩濃度の移動相を使用し、保持の調整を行なうことができる。

次に、本実施例にかかる充填剤を用いて血清等の生体成分中の薬物や代謝物、特にカチオン性の化合物を既に説明した本発明の液体クロマトグラフィ装置を用いて定量する場合、繁雑な前処理なしに生体成分を直接注入しても十分な分析が可能である。

図 8は、上記したカラム充塡剤を濃縮用カラム 3 0 , 4 0に充塡して分析処理を行った実験例を示している。図 8 (A) は従来の力ラム充塡剤を濃縮用カラム 3 0, 4 0に充填して分析処理を行った実験例を示しており、また図 8 (B) は上記した本実施例に係る力ラム充塡剤を濃縮用カラム 3 0， 4 0に充塡して分析処理を行った実験例を示している。

図 8 (A) の従来のカラム充墳剤を濃縮用カラム 3 0 , 4 0に充塡して分析処理を行った実験例においては、分離カラムについても従来のカラム充塡剤を充填したものを用いた。そして、移動相たる溶剤は図中のピーク S, T, Uで示される目的化合物の分離が最も良くなるように選択がなされて、濃縮用には p H 6. 0の 5 mMりん酸緩衝液 Zァセトニトリル（= 9 8/2) 溶液が用いられ、分離用には p H 2. 3の 5 mMの 1 一オクタンスルホン酸ナトリウムを含む 5 0 mMりん酸緩衝液/ァセトニトリル（= 9 4Z 6) 溶液が用いられ、その流速は 0. l m l Z分とされた。

分離状況の検出には電気化学検出器を用いた。

被測定試料はヒト尿とし、如何なる前処理もせずに 1 0 1を用いた。

次に、図 8 (B) は上記した本実施例に係るカラム充塡剤を濃縮用カラム 3 0， 4 0に充塡して分析処理を行った実験例においては、分離カラムに内径 2. 0 mm長さ 1 5 0 mmの強力チオン交換カラムを用いた。

そして、移動相たる溶剤は図中のピーク S, T， Uで示される目的化合物の分離が最も良くなるように選択がなされて、濃縮用には ρ Η 5. 5の 1 O mMりん酸緩衝液が用いられ、分離用には p H 3. 0の 1 0 0 mMりん酸緩衝液が用いられ、その流速は 0. 2 m 1 _ 分とされた。

分離状況の検出には電気化学検出器を用いた。

被測定試料はヒト尿とし、如何なる前処理もせずに 1 0 1を用いた。結果は、図 8に示すクロマトグラム中の分析目的物のピーク S ,

T , Uの分離状況によって判断される。

同図から明らかなように、従来用いていたカラム充塡剤を用いた場合においては、目的化合物のピーク S , T , Uは何れも不要な化合物ピークと重なって現れており、十分な分離がなされたとは言えない。

それに比べて、上記した本実施例に係るカラム充塡剤を用いて分析処理を行った実験例の方は、分析目的物のピーク S， T , Uは何れも単独かつ急峻に現れており、十分な分離がなされたことがわかる o

これは、本実施例に係るカラム充塡剤がその外表面に有するスルホン基を有した置換基の効果などにより、安定した濃縮処理、特にカチオン性の分析目的物に対して高い濃縮効果を実現でき、その結果、装置の被測定試料の分離能力が高いため、良好な分析結果となって現れたものと考えられる。

Claims

請求の範囲

1. ポンプ（ 1 1 , 4 5 A) により供給される溶媒に混在する被測定試料を分離する分離用カラム（ 1 6， 4 3) と、

該ポンプ（ 1 1 , 4 5 A) と該分離用カラム（ 1 6， 4 3 ) との間に配設され、該ポンプから該溶媒を供給されると共に試料注入配管（ 2 2, 4 1 ) より該被測定試料を供給され、該被測定試料を該溶媒と共に該分離用カラム（ 1 6, 4 3) に供給する流路制御手段 ( 1 4, 4 2 ) と、

該分離用カラム（ 1 6， 4 3) で分離された該被測定試料が供給されると共に、供給された該被測定試料を分析処理する検出手段（ 1 7, 4 4 ) と、

該被測定試料を格納した複数の容器（ 2 1 a) を担持する試料保持機構（ 2 1， 4 1 ) と、

前記複数の容器（ 2 1 a) の一つから該被測定試料を選択的に採取してこれを該流路制御手段（ 1 4, 4 2) に供給する試料注入手段（ 2 2， 4 1 ) と、

該流路制御手段（ 1 4, 4 2) と該分離用カラム（ 1 6, 4 3 ) との間に設けられ、該溶媒と共に供給される該被測定試料を濃縮処理する濃縮用カラム（ 3 0， 4 0 ) と

を設けており、

該濃縮用カラム（ 3 0, 4 0 ) の内容量を 2. 0 ミリリットル未満とすると共に、

該濃縮用カラム（ 3 0, 4 0 ) 内に、 S i 一 R— X (Rはスぺ一サ一部分、 Xはスルホン基）結合、及び S i — R' (R' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなるカラム充塡剤を充塡してなる構成としたことを特徴とする液体クロマトグラフィ装置。

2. 請求項 1記載の液体クロマトグラフィ装置において、前記カラム充塡剤における親水性基 R' を、水酸基を有する親水性基としたことを特徴とする液体クロマトグラフィ装置。

3. 請求項 1又は請求項 2記載の液体クロマトグラフィ装置において、

前記カラム充塡剤におけるスぺーサ一部分 Rを、炭素数 1〜4 0 の炭化水素残基又は該炭化水素残基の構成炭素原子の一部を酸素原子若しくは窒素原子で置換した置換基としたことを特徴とする液体クロマトグラフィ装置。

4. 請求項 1乃至請求項 3の何れか一項記載の液体クロマトグラフィ装置において、

前記濃縮用カラム（ 3 0, 4 0 ) 内に充塡された充填剤を構成する多孔性担体はシリカゲルであることを特徴とする液体クロマトグラフィ装置。

5. 請求項 1乃至請求項 4の何れか一項記載の液体クロマトグラフィ装置において、

前記分離用カラム（ 1 6, 4 3 ) は、内容量が 2. 0 ミリリットル未満であり、

充塡剤としてカチオン交換機能を有したイオン交換用充塡剤を充塡されたカチオン交換カラムであることを特徴とする液体クロマトグラフィ装置。

6. 使用されるカラム本体の内容量が 2. 0 ミリリットル未満であるとともに、

該カラム本体に充塡する充塡剤に、 S i —R— X (Rはスぺーサ一部分、 Xはスルホン基）結合、及び S i 一 R' (R' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなるカラム充填剤を用いている、供給された被測定試料の濃縮を行うために設けられた濃縮用カラム（ 3 0, 4 0 ) に、

溶剤に混在された被測定試料を供給して、該被測定試料を濃縮し- 濃縮された被測定試料を、溶剤に混在する被測定試料を分離する分離用カラム（ 1 6, 4 3) に供給して分離し、

分離された被測定試料を、供給された被測定試料を分析処理する検出手段（ 1 7、 4 4 ) に供給て分析処理することを特徴とする分析方法。

7. 移動相たる溶剤や被測定試料の流路を制御して溶剤の供給や溶剤と被測定試料の混合を担う流路制御装置（ 1 4, 4 2) に、該溶剤をポンプ（ 1 1 , 4 5 A) により供給すると共に、該流路制御装置（ 1 4, 4 2) に接続され試料の該流路制御装置（ 1 4, 4 2) への供給を担う試料注入配管（ 2 2， 4 1 ) より被測定試料を該流路制御装置（ 1 4, 4 2) に供給して被測定試料を該溶剤に混在させ、

該ポンプ（ 1 1 , 4 5 A) の溶剤供給圧力に従い該溶剤に混在された被測定試料を、被測定試料を濃縮処理するために設けられた、充塡剤を充塡してなる濃縮用カラム（ 3 0, 4 0 ) に供給し、該濃縮用カラム（ 3 0, 4 0 ) により該被測定試料を濃縮し、濃縮された被測定試料を該ポンプ（ 1 1 , 4 5 A) の溶剤供給圧力に従い、溶剤に混在する被測定試料を分離する分離用カラム（ 1 6, 4 3 ) に供給し、

該分離用カラム（ 1 6, 4 3 ) により該濃縮された被測定試料分離し、

分離された被測定試料を該ポンプ（ 1 1 , 4 5 A) の溶剤供給圧力に従い、供給された被測定試料を分析処理する検出手段（ 1 7、 4 4 ) に供給し、

該検出手段（ 1 7、 4 4 ) により該分離された被測定試料を分析処理する分析方法であって、

該濃縮用カラム（ 3 0， 4 0 ) の内容量を 2. 0 ミリリットル未満とすると共に、

該濃縮用カラム（ 3 0, 4 0 ) 内の充塡剤に、 S i — R— X (R はスぺ一サ一部分、 Xはスルホン基）結合、及び S i 一 R' (R' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなる力ラム充塡剤を用いたことを特徴とする分析方法。

8 . 請求項 7記載の分析方法において、

前記分離カラム（ 1 6 , 4 3 ) に、内容量が 2 . 0 ミリリットル未満であって、充塡剤としてカチオン交換機能を有したイオン交換用充塡剤を充塡されたカチオン交換カラムを用いることを特徴とする分析方法。

9 . カチオン性の化合物を含む生体試料に請求項 7又は請求項 8の何れか記載の分析方法を施して、該生体試料中の該カチオン性物質を分析することを特徴とする分析方法。

1 0 . カチオン性の化合物とタンパク質を含む生体試料に請求項 7 又は請求項 8の何れか記載の分析方法を施して、該生体試料中の該カチオン性物質を分析することを特徴とする分析方法。

1 1 . 被測定試料は血漿又は血清又は尿又は唾液又は生体組織から採取された生体組織構成物であり、

該測定試料中に請求項 7又は請求項 8の何れか記載の分析方法を施して、該測定試料中のカチオン性物質を分析することを特徴とする分析方法。

1 2 . S i - R - X ( Rはスぺ一サ一部分、 Xはスルホン基）結合、及び S i— R ' ( R ' は親水性基）結合を有するシリコーンポリマ一で被覆された多孔性担体よりなることを特徴とするカラム充塡剤。

1 3 . 請求項 1 2記載のカラム充塡剤において、

前記 S i— R ' 結合における親水性基 R ' が、水酸基を有する親水性基であることを特徴とするカラム充塡剤。

1 4 . 請求項 1 2又は請求項 1 3記載のカラム充塡剤において、前記 S i 一 R— X結合におけるスぺーサ一部分 Rを、炭素数 1〜 4 0の炭化水素残基又は該炭化水素残基の構成炭素原子の一部を酸素原子若しくは窒素原子で置換した置換基としたことを特徴とするカラム充塡剤。

1 5 . 請求項 1 2乃至請求項 1 4記載のうち何れか一項記載のカラム充墳剤において、

前記充塡剤を構成する多孔性担体はシリカゲルであることを特徴とするカラム充塡剤。