KR100359189B1 - 마이크로-또는세미-마이크로컬럼을갖는액체크로마토그래프 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 용매들을 공급하기 위한 펌프(11A,11B), 용매들을 혼합시키기 위한 혼합기(23) 혼합기내의 용매의 혼합비를 조절하기 위한 조절기(12), 용매와 함께 운반되는 샘플을 분리시키기 위한 크로마토그래프 컬럼(16), 샘플을 용매와 함께 크로마토그래피 컬럼에 공급하기 위한 유로 조절 밸브(24) 및 공급되는 샘플을 검출하기 위한 검출기(17)을 포함하는 액체 크로마토그래프에 관한 것이며, 여기에서, 혼합기(23)은 혼합챔버(232,232a) 및 혼합챔버에 수용된 다공성 매체(234)를 포함하며, 다공성 매체는 상기 혼합 챔버의 크기 및 형태와 부합되는 크기 및 형태를 가져서, 다공성 매체의 외부 표면과 혼합 챔버의 내부 표면 사이에 실질적으로 틈이 형성되지 않게된다.

Description

마이크로- 또는 세미-마이크로 컬럼을 갖는 액체 크로마토그래프
본 발명은 액체 크로마토그래프, 보다 상세하게는 세미-마이크로 컬럼 또는 마이크로 컬럼을 사용하는 액체 크로마토그래프에 관한 것이다.
액체 크로마토그래프는 화학물질을 분리 및 분석하는 수단으로서 널리 사용된다. 특히, 내경이 1-2mm 이하인 세미-마이크로 컬럼 또는 마이크로 컬럼을 사용하는 액체 크로마토그래프는 높은 민감도, 높은 분해능 및 높은 정밀 분석의 유리한 특성의 관점에서 집중적으로 연구되고 있다.
액체 크로마토그래프의 기술 분야에서는, 컬럼을 통해 흐르는 용매의 조성이 시간에 따라 변화하는 소위 구배 용리(gradient elution)가 통상적으로 사용된다.구배 용리에 있어서, 용매의 조성을 정밀하게 조절하는 것이 특히 필요하고, 이 때문에 다수의 용매를 혼합시키기 위한 혼합장치가 사용된다.
구배 용리용으로 직경이 작은 세미-마이크로 컬럼을 이용할 때, 컬럼내에서 이동상(mobile phase)으로서 작용하는 유체의 유속을 통상의 액체 크로마토그래프에 사용되는 유속에 비해 1/5내지 1/10 정도 또는 이보다 작게 설정할 필요가 있다. 이와 관련하여, 해결해야 할 다양한 문제점들이 발생하게 된다.
제 1도는 구배 용리용으로 설계된 통상의 액체 크로마토그래프의 개략적 구조를 도시한 블록 다이아그램이다.
제 1도를 참조하면, 액체 크로마토그래프는 제 1 용매(A)를 펌핑하기 위한 제 1 펌프(11A) 및 제 2 용매(B)를 펌핑하기 위한 제 2 펌프(11B)를 포함하며, 이러한 펌프들(11A, 11B)은 각각 시스템 조절기(12)의 조절하에 각각의 용매들(A, B)을 혼합기(13)에 제공한다. 혼합기(13)내에서 원하는 혼합비율로 혼합한 다음, 용매들(A, B)의 혼합물은 샘플러(14)에 공급되고, 여기에서, 주사기(15)내에 들어있는 샘플용액이 이와 같이 형성된 혼합물에 주입된다. 샘플용액은 분석 대상의 다양한 화학물질을 함유한다. 그 후에, 샘플용액이 용매(A) 및/또는 용매(B)와 함께 컬럼(16)에 공급된다. 컬럼(16)을 통과할 때, 샘플용액내의 화학물질이 분리되어, 용매와 함께 검출기(17)로 공급된다. 그 다음, 검출기(17)는 용매(A) 및/또는 용매 (B)에 함유된 화학물질종의 정량분석 및/또는 정성분석을 수행한다. 검출기(17)내에서 분석을 한 후에, 용매와 화학물질은 폐기물 저장소(18)로 배출된다.
제 2A도 및 제 2B도는 제 1도의 액체 크로마토그래프에 사용되는 다양한 구성의 혼합기(13)를 도시한다.
제 2A도를 참조하면, 혼합기(13)는 챔버(13b)내에서 회전교반기(13a)에 의해 용매들(A, B)을 혼합시킨다. 그러나, 제 2A도의 혼합기(13)는 챔버(13b)의 용기 벽을 따라 실질적으로 어떠한 혼합도 일어나지 않는 사부피(13X)를 생성시키는 경향이 있다. 예컨대, 세미-마이크로-컬럼 액체 크로마토그래프와 같은 저유속 시스템에 있어서는, 사부피(13X)의 효과가 특히 현저하게 나타난다.
제 2C도는 용매(A)로서 메탄올을 사용하고 용매(B)로서 메탄올과 소량의 아세톤(0.05부피%)의 혼합물을 사용한 경우에, 제 2A도의 혼합기(13)의 혼합특성을 나타낸다. 혼합 특성의 측정에 있어서, 혼합 비율은 제 2C도의 좌측에 도시된 프로그램 곡선에 따라 단계적으로 조절함과 동시에 이렇게 혼합된 용매중의 아세톤 함량을 측정한다. 프로그램 곡선의 우측에 있는 곡선은 실제 또는 실측 혼합비율을 나타낸다.
실험에 있어, 용매들(A, B) 만이 200㎛/분으로 설정된 전체 유속으로 컬럼 (16)을 통해 흐르게 된다. 또한, 아세톤의 검출은 245nm의 파장에서 자외선 흡수도를 측정함으로써 실행된다. 제 2A도 및 제 2C도의 실례에서, 프로그램된 혼합비율이 선형으로 증가된 다음 50% 수준에서 유지되는 경우에, 측정된 혼합 비율에 있어서의 일시적 강하가 발생하게 됨을 유의해야 할 것이다. 또한, 프로그램 곡선의 좌측에 있는 실제 특성 곡선은 일반적으로 둥근 쇼울더(shoulder)부를 가지며, 이는 혼합이 프로그램의 제어를 따르지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
제 2B도의 혼합기(13)는 제 2A도의 혼합기의 전술한 문제점을 배제할 수 있도록 제안된 것이다.
제 2B도를 참조하면, 혼합기의 챔버(13b)는 작은 비이드(13c)로 충전되고 용매(A, B)는 비드(bead)들 사이에 형성된 불규칙한 유체 통로를 통해 흐르도록 되어 있다. 이와 같은 구조를 사용함으로써, 프로그램 혼합 비율의 단계적 변화와 결부된 불규칙한 혼합 비율의 문제점이, 용매 혼합물내 아세톤 함량의 측정결과를 나타내는 제 2D도에 지시된 바와 같이 성공적으로 배제될 수 있다. 제 2D도에 있어서, 용매들(A, B)의 혼합은 제 2C도에 도시된 동일한 프로그램 곡선에 따라 수행된다. 다른 한편으로는, 실제의 혼합특성 곡선의 둥근형상의 문제점은 제 2B도의 혼합기 (13)의 구성에 대응되는 제 2D도의 경우에 있어서도 완전히 제거되게 않는데, 이는 용매의 실질적인 혼합이 전혀 일어나지 않는 챔버(13b)내 사부피(13X)가 여전히 존재한다는 것을 나타낸다.
제 3A도와 제 3B도는 제 1도의 액체 크로마토그래프 분석장치에 사용되는 샘플러(14)의 구성을 보여주고 있다.
제 3A도를 참조하면, 샘플러(14)는 회전식 밸브체(14R)를 포함하는 6-포트 밸브로 필수적으로 형성되어 있으며, 여기에서 회전식 밸브체(14R)는 6개의 통로 (141-146)와 함께 형성되고, 앞서의 6개 통로(141-146) 중 2개씩을 각각 연결하는 3개의 상호연결 통로(14a-14c)가 형성되어 있다. 제 3A도에 도시된 바에 따르면, 통로(14a)는 통로(141)과 통로(146)를 서로 연결해주고, 통로(14b)는 통로(142)와 통로 (143)를 서로 연결해주고, 통로(14c)는 통로(145) 및 통로(146)를 서로 연결해준다.제 3A도에 있어서, 통로(141)는 포트(P)에 정렬되어 그 다음 혼합기(13)에 연결되며, 통로(142)는 후술되는 샘플 축적 루우프(147)의 단부에 연결된 부분(A1)에 정렬되며, 통로(143)는 주사기(15)에 연결된 포트(S)에 정렬되고, 통로(144)는 폐기물 저장소(18)에 연결된 포트(D)에 정렬되고, 통로(145)는 루우프(147)의 다른 단부에 연결된 포트(A2)에 정렬되며, 통로(146)는 컬럼(16)에 연결된 포트(C)에 정렬되어 있음을 주목해야 한다. 결과적으로, 혼합기(13)로부터의 용매(A) 및 용매(B)는 연속적으로 상기 통로들(141, 14a, 146)을 거쳐 컬럼(16)에 공급된다. 다시 말해서, 용매만이 제 3A도의 컬럼에 공급된다. 샘플 용액은 전혀 공급되지 않는다. 또한, 제 3A도에서 주사기(15)는 통로들(143, 14b, 142)을 거쳐 루우프(147)와 연통하고, 반면에 루우프(147)는 통로들(145, 14c, 144)을 거쳐 폐기물 저장소(18)와 연통한다는 것을 주목해야 한다. 이와 같이, 샘플용액은 주사기(15)로부터 제 3A도의 루우프(147)로 주입되어 여기에 보유된다.
한편, 제 3B도에서, 회전식 밸브체(14R)는 화살표 방향으로 회전하고, 그 결과 포트(P)는 통로들(142, 14b, 143)을 거쳐서 루우프(147)에 정렬된다. 또한, 포트(C)는 통로들(141, 14a, 146)에 정렬된다. 결과적으로, 혼합기(13)로부터 공급된 용매는 샘플용액을 루우프(147)에 보유한 채로 포트(C)를 거쳐서 컬럼(16)에 운반시킨다. 다시 말해서, 컬럼(16)으로 샘플용액의 주입이 수행된다. 또한, 주사기 (15)는 통로들(144, 14c, 145)을 거쳐 폐기물 저장소(18)에 연결된다.
제 4도는 6-포트 밸브(14)의 구조를 파단시켜 도시한 도면이다.
제 4도를 참조하면, 6-포트 밸브(14)는 회전식 밸브체(14R)가 회전 가능하게 장착된 고정 부재로서 작용하는 정지캡(14S)을 포함한다. 또한, 6-포트 밸브(14)는 앞서의 통로(14a-14c)를 보유하는 또 다른 밸브체(14R2)를 포함한다. 회전식 밸브체(14R)는 통로(141-146)를 직선, 관형상 통로의 형태로 보유하고 있고, 캡 (14C)은 전술한 포트들(P, A1, S, D, A2및 C)을 회전식 밸브체(14R)내의 통로들과 정렬을 이룰수 있도록 보유하고 있다. 정지캡(14S)에 대하여 회전식 밸브체(14R)를 회전시킴으로써, 제 2A도 및 제 2B도에 관하여 설명한 유체 통로의 전환이 달성된다.
제 4도의 6-포트 밸브(14)에 있어서, 통로를 만드는 정밀성에 오차가 발생하는 경우에도 통로(141-146)들이 대응통로(14a-14c)들에 대하여 정확하게 정렬될 수 있도록, 밸브체(14R2)상의 통로(14a-14c)들이 일반적으로 공차를 가진 상태로 형성된다. 반면에, 이러한 공차는 제 5도에 지시된 바와 같은 통로(14a-14c)의 크기의 증가를 초래하게 되는데, 여기에서는 "사부피(14ax)"가 형성되어, 혼합기(13)로부터 루우프(147)로 공급되는 샘플용액의 일부가 "사부피(14ax)"에 체류하게 된다. 이러한 사부피(14ax)는 샘플용액이 컬럼(16)에 공급되는 것을 불완전하게 하고, 검출기(17)에 의해 수행되는 검출에서 오차를 발생시킨다.
제 1도의 액체 크로마토그래프에 있어서, 컬럼(16)에 의해 분리된 샘플용액의 수집이 여러가지 목적으로 요망되는 경우가 있음을 인식해야 한다. 이러한 요건을 충족시키기 위해, 검출기(17)에 의한 분석후에 폐기물 저장소(18)로의 샘플용액의 폐기가 아닌, 샘플 용액이 샘플용기에 수집되는 액체 크로마토그래프의 한 구성이 있다. 한편, 검출기(17)로부터 수득된 샘플용액은 용매에 의해 희석되고, 희석된 폐용액을 회수하기 위한 이러한 구조는 대규모 설비를 필요로 한다. 이렇게 해서, 액체 크로마토그래프의 구조는 불가피하게 대규모화된다.
제 1도의 액체 크로마토그래프에 있어서, 제 4도의 회전식 밸브체(14R)는 일반적으로 스텝핑(stepping)모터에 의해 가동되었다는 점을 주지해야 한다. 이와 같이, 스텝핑 모터는 외부의 구동제어신호에 대한 응답으로 예정 각도로 회전하고 결과적으로 유체통로의 전환이 달성된다. 제 4도에 따른 통상의 6-포트 밸브에 있어서, 캡(14S), 밸브체(14R) 및 밸브체(14R2)는 모두 기계적 내구성과 내마모성의 관점에서 금속으로 형성된다. 이와 같이, 통상의 액체 크로마토그래프는 예컨대 스텝핑 모터를 구동시키는 마이크로컴퓨터와 같은 외부제어장치를 필요로 하여, 분석 후 샘플 용액을 회수하기 위한 구조는 마이크로컴퓨터를 제어장치로서 구비한 장치 내에서만 실현될 수 있다. 또한, 밸브(14)가 금속으로 형성된다는 사실 때문에, 통상의 밸브(14)는 샘플용액 또는 용매에 의해 부식되기 쉬우며, 실제로 분석결과는 밸브(14)의 부식에 의해 야기된 오염으로 인해 신뢰성이 없게 되는 위험이 있다.또한, 밸브(14)의 작동은 부식 또는 마멸로 인해 신뢰할 수 없게 된다.
제 6도는 샘플용액을 컬럼(16)에 주입시키기 위해 샘플러(14)에 제공된 샘플 주입 니들(22)을 도시하고 있다. 제 6도에 있어서, 샘플용액은 매팅(matting)(30)에 의해 지시된다. 또한, 액체 크로마토그래프가 클리닝 모드일 때 세척용액(31)를 주입하기 위한 주입용 니들(22)이 사용된다. 상기 니들(22)은 튜브의 한쪽 단부 (32)에서 주사기(15)까지 연장되어 제공되는데, 니들(22)과 튜브(32)간의 연결은 개재(intervening)부재(37)에 의해 달성된다. 통상적으로, 샘플용액(23)을 주입하기 전에 세척 용액을 주입 니들(22)과 튜브(32)에 채우고, 공기를 흡입하여 니들 (22)내에 에어 갭(33)을 형성시킨다. 그 다음에는, 샘플용액(30)의 흡입을 실시하고, 다시 공기의 흡입을 실시하여 니들(22)내에 제 2 공기갭(34)을 형성시킨다. 이렇게 해서, 주입용 니들(22)내에서 에어갭들(33, 34)에 의해 샘플용액(30)을 샌드위치시키고, 상기 갭들(33, 34)과 함께 샘플용액(30)을 컬럼(16)으로 주입시킨다.
제 6도에 도시된 통상의 샘플 주입 공정에 있어서, 샘플용액(30)은 주입시에 컬럼(16)으로 연장되는 파이프의 내벽상에 흡착될 수 있다. 이렇게 함으로써, 컬럼(16)과 검출기(17)에 도달하는 샘플용액(30)이 파이프 내벽상에 흡착되는 것과 같은 양만큼 손실되고, 이러한 샘플의 손실은 측정결과에 오차를 야기하는 문제점을 야기할 가능성이 있다. 이러한 오차 문제는 주입된 샘플용액의 양이 2㎕ 이하의 등급 만큼 적은 크로마토그래프에서 두드러지게 나타난다.
제 7도는 통상의 이중 컬럼 액체 크로마토그래프 분리 시스템을 도시한 것인데, 여기에는 자동 샘플러(14)와 6-포트 전환 밸브(10) 사이에 예비조준(prefocusing)컬럼(예비용 컬럼)(40)이 제공되고, 전술한 주사기(15)와 협동 메카니즘은 통합해서 참조번호(14)로 표시되어 있다. 또한, 펌프들(11A, 11B)을 포함하는 용매-펌핑 시스템은 6-포트 밸브와 협동한다. 제 7도의 구성에 있어서, 예비컬럼(precolumn)(40)를 펌프(11A)에 의해 공급된 용매(A)내로 샘플 주사기에 의해 주입된 샘플이나 표적 물질을 농축시키고, 이렇게 농축된 물질을 분리시키기 위해 펌프(12)에 의해 공급된 용매(B)와 함께 2차 컬럼(분리용 컬럼)(16)으로 이송시킨다. 이렇게 해서, 용매들(A, B)의 전환이 전술한 6-포트 밸브(10)에 의해 달성된다. 이송된 물질들은 분리시키고, 분리컬럼(16)과 협동하는 검출기(17)에 의해 검출한다. 이러한 2중-컬럼 시스템은, 분석전에 샘플처리를 할 필요가 없다는 점에서 유리하며, 이 시스템은 "샘플-처리-불필요" 시스템이라고 통상 불린다.
더 구체적으로는, 6-포트 밸브(10)는 제 1 상태와 제 2 상태 사이에서 전환되는데, 제 1 상태에서는 자동샘플러(14)에 의해 용매(A)에 주입된 샘플이 예비컬럼(40)을 통과한 후 밸브(10)에 공급되고, 연속선으로 지시된 경로를 따라 폐기물 저장소로 추가로 제공되고, 예비컬럼(40)에는 샘플만이 남겨진다. 동시에, 용매(B)는 밸브(10)에 공급되어 제 7도에 도시된 또 다른 연속선을 따라 분리 컬럼(16)으로 공급된다.
한편, 제 2 상태에 있어서, 예비컬럼(40)으로부터의 농축된 샘플은 제 7도에 파선으로 도시된 경로를 따라 분리 컬럼(16)으로 유동하여 분석에 사용되고, 펌프 (2)로부터의 용매(B)는 또 다른 파선으로 도시된 경로를 따라 폐기물 저장소로 유동한다. 이러한 통상의 시스템에서는, 밸브(10)내의 사부피의 문제점이 있게 된다.이러한 사부피의 존재 때문에 6-포트 밸브(10)내에서 유체의 전환이 완전하지 않았었다.
응축컬럼(40)은 샘플용액의 원하는 응축을 수행하는 패킹재료로 채워진다. 반면에 응축컬럼(40)내에서 사용되는 이러한 충전재료는 특히 액체 크로마토그래프가 예컨대 혈청과 같은 다량의 단백질을 함유한 혼합물의 분리 및 분석에 사용되는 경우에는 단백질의 흡착현상을 일으키는 경향을 가진다. 충전재상에 단백질이 흡착되면 샘플용액을 농축시키는 칼럼 충전재의 효과가 실질적으로 감소된다. 그러므로, 통상적으로, 단백질이 응축컬럼(40)에 공급되기 진에 샘플용액으로부터 단백질을 제거시키는 방법이 요망되어 왔다. 물론, 이와 같은 샘플용액의 제조는 과외의 시간이 필요하고 분석의 정밀도나 신뢰도의 저하가 일어날 수 있는 점에서 바람직하지 않다.
그러므로, 샘플용액으로부터 단백질을 제거할 필요성이 배제된, 응축 컬럼(40)에 사용하기 위한 칼럼 충전재가 제안되었다. 일반적으로, 이러한 개선된 칼럼 충전재들은 다공성 유리나 실리카겔을 기재로 하고, 칼럼 충전재와는 특성이 다른 재료가 충전재의 작은 미세공 내측에 제공된다. 결과적으로, 혈청내의 단백질과 같은 거대분자들은 충전재의 구멍속으로 침투하지 못하고 충전재의 친수성 외표면상에 흡착되지 않으면서 응축컬럼(40)을 단순 통과하게 된다. 예컨대 약제의 분자들과 같은 작은 분자들만이 구멍의 친수성 내표면상에 흡착된다.
일본 특허공개 60-56256호에는, 이러한 개선된 충전재의 실례가 기술되어 있다. 종래 기술 참고문헌에 개시된 충전재에 있어서, 단백질은 옥타데실실릴(ODS)이결합되어 있는 실리카체의 외표면을 덮고 있다. 여기에 사용된 단백질은 우혈청 알부민일 수 있으며, 이렇게 ODS로 처리된 실리카 표면을 변형시킨다. 그러나, 앞에 설명된 통상의 충전재에 있어서는, 흡착된 단백질이 지속적으로 사용된 후에는 표면으로부터 방출되어 나오는 문제점이 있다. 또한, 이러한 통상의 충전재는 분리효율이 높은 컬럼을 제공할 수 없다.
이러한 통상의 컬럼 충전재의 결점을 개선시키기 위해, 일본 특허공개 61-65159호 및 1-123145호에서와 같이 다공성 매질의 내표면 및 외표면에 친수성 그룹을 도입시키고 효소에 의해 다공성 매질의 외표면으로부터 친수성 그룹을 선택적으로 단절 및 제거시킴으로써 충전재를 형성하는 다공성 매질을 처리하는 다양한 제안이 있다. 상기 효소가 거대분자이고 충전재를 형성하는 매질의 작은 구멍들의 안쪽으로 침투할 수 없다는 점을 인식해야 할 것이다. 또한, 친수성 그룹은 다공성 매질의 외표면으로 도입된다.
전술한 일본특허 공개 61-65159호의 방법에 있어서, 특히, 글리세릴프로필기가 함침된 다공성 실리카 매질이 출발물질로 사용되고, 올리고펩티드가 카르보닐디이미다졸을 거쳐 이에 결합된다. 또한, 실리카 매질의 외표면상에 있는 페닐알라닌 측쇄는 단백질 분해효소인 카르복시펩티다아제 A에 의해 단절된다. 결과적으로, 칼럼 충전재의 내표면은 소수성 리간드로서 작용하는 글리실-페닐알라닐 페닐알라닌에 의해 도포되고, 충전재의 외표면은 친수성 글리실-글리세릴 프로필기로 덮여진다.
반면에, 상기 1-123145호의 방법에 있어서, 아미노프로필기를 함침시킨 다공성 실리카체가 출발물질로 사용되고, 트리에틸아민의 존재하에 옥타노일클로라이드의 반응을 유발시킴으로써 아미드 결합에 의해 소수성 그룹이 도입된다. 그 다음에는, 실리카 충전재의 외표면상에 있는 아실기가 가수분해되고, 외표면상에 있는 아미노기는 글리시돌과의 반응을 야기시킴으로써 친수성이 된다.
다른 한편, 앞서의 '159호 또는 '145호에 개시된 컬럼 충전재는 효소반응을 이용하기 때문에 컬럼 충전재의 구성이 복잡해지고 얻어진 칼럼 충전재의 특성이 다양하게 가변적인 경향을 가지게 되는 결점을 갖는다.
상기 특허문헌의 통상적인 액체 크로마토그래프에는, 응축컬럼에 공급된 공급된 샘플용액이 컬럼(40)내에서 농축되지 않고 오히려 원치않게 희석될 수 있다는 점에서 응축컬럼(40)의 거대 부피용량과 결부된 다른 결점이 존재한다. 이렇게 되면, 검출 민감도가 저하된다. 응축컬럼(40)은 일반적으로 200㎕를 초과하는 부피용량을 갖는다. 검출 민감도가 지장을 받는 상기의 문제는 특히 소량의 샘플용액을 사용하도록 설계된 장치에서 심각하다.
통상적으로는, 내경이 1-2mm인 세미-마이크로 컬럼대신에 내경이 1mm미만인 마이크로 컬럼을 분리컬럼(16)으로서 사용하는 경우에 보다 우수한 결과가 얻어진다는 것은 알려져 있다. 사실상, 마이크로-컬럼을 사용하는 액체 크로마토그래프 분석은 예컨대 문헌[Scott, R.P. and Kucera, P.J., J. Chromatogr., 125(1978), pp. 271, Tsuda, T. and Novotny, M., Anal. Chem. 50 (1978), pp. 632, Ishii, D. et al., J.Chyromatogr. 124 (1977), PP. 157 and Novotny, M., Anal. Chem. 60 (1988) 500A]에 기술되어 있다. 상기 참고문헌들에서는 다음과 같은 장점이 강조되어 있다 : (1) 많은 이론단을 갖는다는 점; (2) 응축효과로 인해 농축 민감성 검출기가 사용되는 경우에 얻어지는 개선된 반응; (3) 액체 크로마토그래프를 질량분광 측정기와 같이 용매의 제거를 필요로 하는 다른 장치에 연결시키는데 대한 용이성; 및 (4) 감소된 용매 소모량.
이러한 장점에도 불구하고, 마이크로컬럼 액체 크로마토그래프의 실제적 사용은 아마도 유속제어에 있어서의 불안정성과 불량한 컬럼 안정성으로 인해 아직까지 성공적이지 못했다. 등용매 안정성이 체류 시간을 다루는 유속 모드에서 필수적이라는 점에 주목해야 한다. 또한, 이러한 마이크로-컬럼 액체 크로마토그래프는 전형적으로 수십 ㎕ 내지 수백 ㎕ 단위인 제조된 샘플용액의 부피와, 전형적으로는 수 ㎕ 등급인, 액체 크로마토그래프내에 주입된 샘플용액의 부피 사이의 불일치성이 있는 매우 근본적인 문제점을 가지고 있다. 분석 대상 화학물질의 농도수준이 샘플용액내에서 극도로 낮을 때 분석용으로 제조된 샘플용액을 모두 사용하는 것이 바람직하지만, 통상의 마이크로 컬럼 액체 크로마토그래프로는 이러한 요건을 충족시키지 못한다.
또한, 컬럼(16)내의 샘플용액의 유속은 마이크로-컬럼이 사용되는 경우에 분 당 ㎕ 의 수준으로 낮게 설정되어야 한다. 이러한 유속 수준은 유속이 전형적으로 약 0.05 내지 0.2㎖/분으로 설정되는 세미-마이크로 컬럼에 사용된 것보다 실질적으로 더 작다. 컬럼(16)의 직경을 감소시키면, 그 안의 샘플용액의 유속은 더 감소된다. 이와 같이, 직경이 큰 응축컬럼(40)이 마이크로-컬럼(16)에 직접 연결되어 있는 제 7도의 액체 크로마토그래프의 구성에 있어서, 측정을 수행하는데 걸리는시간이 증가되는 문제를 불가피하게 야기하게 된다. 이렇게 함으로써, 분석의 효율은 실질적으로 저하된다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 일반적인 목적은 상기 문제점이 해소된 신규하고 유용한 액체 크로마토그래프를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 더 특별한 목적은 공급되는 용매의 매우 낮은 유속에서도 용매를 실제로 완전히 혼합시킬 수 있는 혼합기가 장착된 액체 크로마토그래프를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 분리컬럼에 샘플용액을 공급하기 위한 샘플러(이 샘플러는 샘플용액을 컬럼에 실질적으로 완전히 공급함)가 장착된 액체 크로마토그래프를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은,
다수의 용매를 공급하기 위한 다수의 펌프;
다수의 펌프로부터 공급된 다수의 용매를 혼합시키기 위한 혼합 수단;
혼합 수단내의 용매의 혼합비를 조절하기 위한 조절수단;
혼합 수단으로부터 공급되는 용매를 수반하는 샘플을 분리시키기 위한 크로마토그래프 컬럼;
혼합 수단과 혼합 수단으로부터의 용매를 수반하는 샘플을 수용하기 위한 크로마토그래프 컬럼 사이에 구비되어 용매와 함께 샘플을 크로마토그래프 컬럼으로 공급하는 유로 조절 수단; 및
크로마토그래프 컬럼에 의해 분리된 샘플을 검출하기 위한 검출 수단을 포함하는 액체 크로마토그래프를 제공하는 데에 있으며,
상기 혼합 수단은 혼합챔버 및 이 혼합챔버에 수용된 다공성 매질을 포함하고, 이 다공성 매질은 상기 펌프로부터 상기 용매를 수용하기 위한 제 1 단부와 상기 유로조절수단으로 상기 용매를 공급하기 위한 제 2 단부 사이로 연장되고 상기 혼합챔버의 크기 및 형태와 동일한 크기 및 형태를 가져서, 상기 다공성 매질의 외부표면과 상기 혼합챔버의 내부표면 사이에 갭이 실제로 형성되지 않게 한다.
본 발명에 따르면, 용매의 혼합은 다공성 매질에서 일어난다. 이에 의해, 다공성 매질과 혼합챔버 사이에 실질적으로 어떠한 사부피도 형성되지 않으며, 혼합챔버에 공급된 용매들은, 이들이 다공성 매질을 통해 제 1 단부로부터 제 2 단부로 통과하므로 다소 완전히 혼합된다. 이에 의해, 프로그램 곡선에 따라 용매의 조성이 조절되는 구배 용리를 위해 액체 크로마토그래프가 사용되는 경우에, 용매의 조성의 정확한 조절이 달성된다.
본 발명의 또 다른 목적은
다수의 용매를 공급하기 위한 다수의 펌프;
다수의 펌프로부터 공급된 다수의 용매를 혼합시키기 위한 혼합 수단;
혼합 수단내의 용매의 혼합비를 조절하기 위한 조절수단;
혼합 수단으로부터 공급되는 용매를 수반하는 샘플을 분리시키기 위한 크로마토그래프 컬럼;
혼합 수단과 혼합 수단으로부터의 용매를 수반하는 샘플을 수용하기 위한 크로마토그래프 컬럼 사이에 구비되어 용매와 함께 샘플을 크로마토그래프 컬럼에 공급하는 제 1 유로 수단; 샘플을 용매와 함께 상기 크로마토그래프 컬럼에 공급하기 위한 제 2 유로 수단; 제 2 유로 수단을 폐기물 저장소와 선택적으로 연통시키기 위한 제 3 유로 수단; 및 공급된 샘플을 보유하기 위한 샘플 홀더를 포함하는 유로 전환 수단(밸브 수단);
크로마토그래프 컬럼에 의해 분리된 샘플을 검출하기 위한 검출 수단을 포함하는 액체 크로마토그래프로서,
상기 밸브 수단이 상기 혼합 수단에 연결된 제 1 포트; 상기 샘플홀더의 제 1 단부에 연결된 제 2 포트; 상기 샘플을 수용하기 위한 제 3 포트; 상기 폐기물 저장소에 연결된 제 4 포트; 상기 샘플 홀더의 제 2 단부에 연결된 제 5 포트; 및 상기 크로마토그래프 컬럼에 연결된 제 6 포트를 포함하는 고정부재;
제 1 표면 및 제 2 반대표면에 의해 규정되는 회전식 밸브체로서, 상기 회전식 밸브가 고정 부재상에서 회전 가능하게 제공되어 제 1 표면에서 고정 부재와 활주 가능한 맞물림을 형성하며; 제 1 상태와 제 2상태 사이에서 회전 가능하며, 상기 제 1 상태에서, 상기 제 1 유로가 상기 제 1 포트와 일치하고, 상기 제 2 유로가 상기 제 2 포트와 일치하고, 상기 제 3 유로가 상기 제 3 포트와 일치하고, 상기 제 4 유로가 상기 제 4 포트와 일치하고, 상기 제 5 유로가 상기 제 5 포트와 일치하고, 상기 제 6 유로가 상기 제 6 포트와 일치하며, 상기 제 2 상태에서, 상기 제 1 유로가 상기 제 6 포트와 일치하고, 상기 제 2 유로가 상기 제 1 포트와 일치하고, 상기 제 3 유로가 상기 제 2 포트와 일치하고, 상기 제 4 유로가 상기제 3 포트와 일치하고, 상기 제 5 유로가 상기 제 4 포트와 일치하고, 상기 제 6 유로가 상기 제 5 포트와 일치하도록 제 1 내지 제 6 유로를 가지며; 상기 제 2 표면상에, 상기 제 1 유로와 제 6 유로를 연결시키는 제 1 홈, 상기 제 2 유로와 제 3 유로를 연결시키는 제 2 홈, 상기 제 4 유로와 제 5 유로를 연결시키는 제 3 홈을 수반하는 회전식 밸브체; 및
상기 회전식 밸브체와 함께 회전하도록 상기 회전식 밸브체의 상기 제 2 표면상에 제공되며, 제 2 표면과 친밀하게 접촉되어 제 2 표면상에 제공되는 밀봉부재를 포함하는 액체 크로마토그래프를 제공하는데에 있다.
회전식 밸브체의 제 2 표면 또는 바닥표면이 홈의 형태의 유체 통로를 지니는 본 발명에 따르면, 밀봉부재에 유체의 통로에 공차(tolerance)를 제공하는 것이 더 이상 필요하지 않으며, 밀봉 부재상의 홈의 공차로 인한 사부피의 형성의 문제점이 성공적으로 제거된다.
본 발명의 또 다른 목적은,
용매를 펌핑시키기 위한 펌프;
상기 용매로부터 샘플을 분리시키기 위한, 상기 펌프로부터 상기 용매가 공급되는 크로마토그래프 컬럼;
제 1 유로 조절수단에 공급되는 상기 용매 및 상기 샘플을 상기 크로마토그래프 컬럼에 함께 공급하기 위해 상기 용매 및 추가로 샘플이 공급되는, 상기 펌프와 상기 크로마토그래프 컬럼 사이에 배치된 제 1 유로 조절수단;
크로마토그래프 컬럼에 의해 분리된 샘플을 검출하기 위한 검출 수단;
다수의 샘플을 함유하는 다수의 용기를 포함하는 샘플 홀더 메카니즘;
상기 제 1 유로 조절수단에 상기 수집된 샘플을 공급하기 위해 상기 다수의 용기중 하나로부터 샘플을 선택적으로 수집하기 위한 샘플 주입수단; 및
상기 검출수단에서의 검출후에, 상기 검출수단으로부터 상기 샘플을 상기 샘플 주입수단으로 선택적으로 공급하기 위한 제 2 유로 조절수단을 포함하는 액체 크로마토그래프를 제공하는 데에 있으며, 상기 샘플 주입수단은 상기 샘플 홀더 메카니즘중의 상기 용기중 하나에서 상기 제 2 유로 조절수단으로부터 공급된 상기 샘플을 저장한다.
본 발명에 따르면, 제 2 유로 조절수단은 크로마토그래프 컬럼에서의 분리 및 검출수단에서의 분석후에 샘플 홀더 메카니즘중의 용기에 샘플을 선택적으로 공급하여, 크로마토그래피 분석후에 샘플이 여전히 분석하려는 샘플과 함께 샘플 홀더 메카니즘에 보유되게 된다. 이에 의해, 크로마토그래프 분석후에, 추가의 공정 및 다양한 목적을 위해 분석된 샘플을 사용하는 것이 가능하다. 여전히 분석하려는 샘플 및 이미 분석된 샘플이 공통 샘플 홀더 메카니즘에 보유되므로, 액체 크로마토그래프 분석기는 조밀한 크기를 갖는다. 제 1 및 제 2 유로 조절수단은 6개의 포트, 및 6개의 포트 중 2개를 각각 연결시키는 3개의 유로를 갖는 6-포트 밸브 메카니즘에 의해 용이하게 실현된다. 본 발명은 용매 및 샘플의 전체 유속이 200㎕/분 이하의 수준으로 유지되는 세미-마이크로 또는 마이크로 컬럼을 갖는 액체 크로마토그래프에 특히 유용하다.
본 발명의 또 다른 목적은,
(a) 공기를 샘플 주입 튜브내로 유도하여 샘플 주입 튜브내에 공기 갭을 형성시키는 단계;
(b) 상기 액체 크로마토그래프에서 액체 크로마토그래피 분석의 결과에 영향을 주지 않을 정도의 조성을 갖는 불활성 액체를 상기 샘플 주입튜브내로 주입시켜서, 상기 샘플 주입 튜브내에 불활성 액체 소적을 생성시키는 단계(상기 단계 (a) 및 (b)는 최소한 한번은 수행됨);
(c) 상기 단계(b)후에, 샘플 용액을 상기 샘플 주입튜브내로 유도하여 상기 샘플 주입튜브내에 샘플 액체 소적을 생성시키는 단계; 및
(d) 상기 샘플 액체 소적의 크로마토그래피 분석을 위해 상기 샘플액체 소적 및 상기 불활성 액체 소적을 크로마토그래프 컬럼에 공급하는 단계(단계(d)는 상기 샘플 액체 소적이 상기 크로마토그래프 컬럼에 공급된 후, 하나 이상의 상기 불활성 액체 소적이 공급되도록 수행됨)를 포함하여, 액체 크로마토그래프의 사용으로 샘플을 분석하기 위한 방법을 제공하는데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은
샘플을 분리하기 위해 용매를 수반하는 샘플이 공급되는 크로마토그래프 컬럼;
공급되는 상기 샘플용액을 검출시키기 위해 상기 크로마토그래프 컬럼으로부터 상기 샘플용액이 공급되는 검출수단;
상기 샘플용액을 상기 크로마토그래프 컬럼에 공급하기 위해 상기 크로마토그래프 컬럼에 연결된 파이핑 시스템;
상기 샘플용액을 보유하기 위한 제 1 용기,
상기 샘플용액의 검출에 영향을 주지 않는 불활성 용액을 보유하기 위한 제 2 용기;
상기 제 1 용기로부터 상기 샘플용액을 유도하고 상기 샘플용액을 샘플 액체 소적의 형태로 보유하기 위한 샘플 주입 수단으로서, 상기 제 2 용기로부터 상기 불활성 용액을 추가로 유도하고 상기 불활성 용액을 불활성 액체 소적의 형태로 보유하며, 상기 샘플 액체 소적 및 상기 불활성 액체 소적을 상기 파이핑 시스템에 주입시키는 샘플 주입 수단; 및
상기 샘플 주입 수단이 하나 이상의 공기갭에 의해 서로 분리된 하나이상의 상기 불활성 액체 소적을 보유하고, 상기 샘플 주입 수단이 하나 이상의 불활성 액체 소적이 상기 샘플 주입 수단에 보유된 후에 상기 샘플용액을 유도하도록 상기 샘플 주입 수단을 조절하기 위한 주입 조절 수단으로서, 상기 샘플 액체 소적이 상기 파이핑 시스템에 주입된 후 상기 하나 이상의 불활성 액체 소적이 주입되도록 상기 샘플 주입수단을 추가로 조절하기 위한 주입 조절 수단을 포함하는 액체 크로마토그래프를 제공하는데에 있다.
본 발명에 따르면, 크로마토그래프 컬럼까지 연장되는 튜브의 벽에 잔류하는 샘플 액체는 샘플 액체 소적을 따르는 하나 이상의 불활성 액체 소적과 함께 포획되고 컬럼으로 운반된다. 이에 의해, 실제로 전체 샘플 용액이 분석용의 크로마토그래프에 공급되고, 분석 결과의 정확성 뿐만 아니라 신뢰성이 개선된다.
본 발명의 또 다른 목적은 2차 크로마토그래프 분석에 앞서 샘플용액을 농축시키기 위한 응축컬럼을 갖는 이중 컬럼 크로마토그래프를 제공하는데에 있으며, 여기에서 응축컬럼의 부피측정 용량은 세미·마이크로 또는 마이크로 분리컬럼과 함께 사용하기에 충분할 정도로 작다.
본 발명의 또 다른 목적은,
용매를 펌핑시키기 위한 펌프;
샘플용액에 함유된 샘플을 분리하기 위해 샘플용액이 공급되는 분리컬럼;
상기 분리컬럼에 의해 분리된 상기 샘플을 검출하기 위한 검출 수단;
상기 용매중에 상기 샘플을 함유하는 샘플용액을 생성시키기 위해 상기 용매에 샘플을 주입시키기 위해 상기 펌프로부터 상기 용매가 공급되는 샘플 주입 수단;
주입 수단과 분리 컬럼 사이에 제공된 응축 컬럼으로서, 샘플을 농축시켜서 농축된 샘플용액을 생성시키기 위해 상기 샘플 주입수단으로부터 상기 샘플용액이 공급되고, 상기 분리컬럼에 상기 샘플용액으로서 상기 농축된 샘플용액을 공급하는 응축 컬럼(응축컬럼은 2㎖ 미만의 부피측정 용량을 갖고, Si-R 결합 및 Si-R' 결합(R은 소수성 그룹을 나타내고, R'은 친수성 그룹을 나타냄)을 갖는 실리콘 중합체에 의해 피복된 다공성 매질의 컬럼 충전재로 충전됨)을 포함하는 액체 크로마토그래프를 제공하는 데에 있다.
응축컬럼에 대해 작은 부피측정 용량을 갖는 컬럼을 사용하는 본 발명에 따르면, 응축컬럼내에서 샘플용액의 원하지 않는 희석의 문제점이 제거될 수 있으며, 샘플용액의 응축의 결과로서 정확한 분석이 얻어질 수 있다. Si-R 결합 및 Si-R'결합을 갖는 실리콘 중합체에 의해 피복된 다공성 매질을 사용함으로써, 칼럼 충전재의 외부표면상에 단백질의 흡착이 제거될 수 있고, 샘플용액의 신뢰성 있는 응축이 달성될 수 있다. 본 발명이 효소반응에 의존하지 않음을 주목하여야 한다.
본 발명의 또 다른 목적은,
각각의 용매를 펌핑시키기 위한 적어도 2개의 펌프;
상기 컬럼으로부터 운반된 샘플을 분리시키기 위한 분리컬럼;
상기 분리컬럼에 의해 분리된 상기 샘플을 검출하기 위한 검출수단;
상기 용매내에 상기 샘플을 함유하는 샘플용액을 생성시키도록 상기 용매에 샘플을 주입시키기 위해 상기 펌프로부터 상기 용매가 공급되는 샘플 주입 수단;
공급된 샘플용액을 농축시키기 위해 상기 주입수단과 상기 분리컬럼사이에 제공되는 다수의 예비컬럼(상기 예비컬럼중 적어도 하나는 분리컬럼보다 큰 직경을 가짐)을 포함하는 액체 크로마토그래프를 제공하는 데에 있다.
본 발명에 따르면, 분리컬럼에서 샘플의 분리가 달성되기 전에 샘플용액의 안정하고 효과적인 응축이 달성될 수 있다. 결과로서, 희석된 샘플용액에 대해 고선택도 분석이 가능해진다. 예비컬럼의 사용에 의해, 제 1단계 분리에서 이동상의 유속의 감소가 방지될 수 있고, 분석에 대한 증가된 시간의 문제점이 효과적으로 제거된다. 이와 관련하여, 본 발명은 분리컬럼을 위해 세미-마이크로 또는 마이크로 컬럼을 사용하는 액체 크로마토그래프에 대해 특히 유리하다. 제 2 단계 분리에서 샘플용액의 감소된 유속으로 인해 이러한 세미-마이크로 또는 마이크로 컬럼 액체 크로마토그래프에서 검출 민감도가 최대화됨을 주목해야 한다. 또한, 분리컬럼에서의 이러한 감소된 유속은 질량분광기와 같은 다른 분석장치에 샘플용액을 공급한다는 관점에서 유리하다. 그외에, 샘플용액의 이러한 감소된 유속은 용매의 감소된 소모의 관점에서 바람직하다.
본 발명의 다른 목적 및 추가의 특징은 첨부도면과 함께 이해할 경우에 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
제 8도는 본 발명에 따른 제 1의 구체예를 나타낸다. 보다 상세하게는, 제 8도는 제 1도의 액체 크로마토그래프에 사용되는 혼합기(23)의 단면도이다.
제 8도를 참조하면, 혼합기(23)는 스테인레스강 또는 플라스틱 재료의 원통형 용기(232)로 형성되는데, 상기 원통형 용기(232)는 그 내부에 상응하는 원통형 혼합 챔버(232a)와 함께 형성되어 있다. 전형적으로, 혼합 챔버(232a)는 내경이 1.0-5.0mm이며 길이가 3-10mm이다.
혼합 챔버(232a)는 원통형 혼합 챔버(232a')에 해당하는 원통 형상을 갖는 다공성 수지체(234)로 충전되며, 다공성 수지체(234)는 챔버(232a)의 내경 및 길이에 상응하여 각각 1.0-5.0mm의 외경과 3-10mm의 길이를 갖는다. 예컨대, 혼합챔버 (232a)가 1.5mm의 내경을 가질 때, 다공성 수지체(234)의 외경은 1.5mm이다. 다공성 수지체(234)는 다공성 플루오로카본 수지로 형성될 수 있으며, 소정의 직경을 가지는 플루오로카본의 다공성 슬랩(slab)을 스탬핑하여 용이하게 수득될 수 있다.
제 9도에 도시된 바와 같이, 혼합 챔버(232a)는 수지 디스크들(234a, 234b',...)로 충전되고 스탬핑되며, 상기 수지 디스크(234a'234b'...)는 소정의 수로 적층되어 소정길이의 상기 수지체(234)를 형성한다. 이러한 수지 디스크로 혼합 챔버(232a)를 충전함으로써, 혼합 챔버(232a)로부터 실제로 완전한 사부피를 제거할 수 있다.
제 8도를 다시 참조하면, 소성의 스테인레스강으로 된 한쌍의 필터(237, 238)가 수지체(244)의 양단부에 배치되며, 스테인레스강의 양쪽 캡(233, 235)은 스테인레스강(232)의 각 단부에 제공된다. 캡(233, 235)은 포트(231, 236)를 수반하며 용기(232)의 단부에서 용기(232)상에 나사식으로 고정된다. 포트(231)는 분지된 단부(231a, 231b')를 가지며, 용매(A)는 펌프(11A)에 의해 단부(231a)로 공급된다. 유사하게, 용매(B)는 펌프(11B)에 의해 단부(231b)로 공급된다. 이와 같이, 공급된 용매(A, B)는 다공성 수지체(234)를 통해 흐를 때 서로 혼합되고 출구 포트(236)로부터 배출된다.
이하에는, 본 발명에 따른 제 2의 구체예가 제 10도를 참고로 기재될 것이며, 제 10도는 6-포트 밸브(14) 대신 제 1도의 액체 크로마토그래프에 사용되는 6-포트 밸브(24)의 구조를 나타낸다.
제 10도를 참조하면, 6-포트 밸브(24)는 제 4도의 정지캡(14)과 실질적으로동일한 정지캡(24S)을 포함하며, 회전식 밸브체(24R)는 앞서의 정지캡(24S)과 결합된다. 보다 상세하게는, 회전식 밸브체(24R)는 제 1 단면(24f) 및 제 2 반대 단면 (24g)에 의해 정의되는 원통 형상을 가지며, 단면(24f)이 활주 가능하나 캡(24S)과 밀접히 체결되어 있도록 정지캡(24S) 상에 장착된다. 결과로서, 회전식 밸브체 (24R) 및 정지캡(24S) 사이에 밀봉부가 형성된다. 또한, 회전 가능한 밸브체(24R)의 단면상에 다른 캡(24R2)이 제공된다.
회전식 밸브체(24R)에는, 제 4도의 회전식 밸브체(14R)와 유사하게 단면 (24f)에서 단면(24g)까지 연장되는 6개의 직선 유로(241-246)가 제공되어 있다. 한편, 제 10도의 회전식 밸브체(24R)는 유로로서 단면(24g)상에 홈(24a-24c)을 수반한다. 제 10도에 나타낸 바와 같이, 홈(24a)은 통로(241)와 통로(246)를 연결시키고, 홈(24b)은 통로(242)와 통로(243)를 연결시키고, 홈(24c)은 통로(244)와 통로(245)를 연결시킨다. 회전식 밸브체(24R)상에 홈(24a-24c)의 형성과 관련하여, 캡(24R2)상에는 어떠한 홈도 제공되지 않는다.
회전식 밸브체(24R)는 세라믹 또는 수지로 형성될 수 있다. 세라믹이 회전식 밸브체(24R)로 사용될 때, 홈(24a-24c)은 유로(241-246)의 형성과 동시에 가공함으로써 그린(green) 몸체상에 형성될 수 있다. 회전식 밸브체(24R)가 PEEK(폴리에테르 에테르케톤)과 같은 수지로 형성될 때, 홈(24a-24c)은 회전식 밸브체(24R)의 몰딩과 동시에 형성되거나 형성된 회전식 밸브체(24R)의 단면(24g)을 가공함으로써형성될 수 있다. 이들 방법 중의 어떠한 방법에 있어서도, 홈(24a·24c)은 유로(241-246)와 정확하게 정렬하여 형성된다. 즉, 제 5도에 도시된 종래의 경우와 달리, 공차를 보장하기 위해 지나치게 큰 유로(241-246)를 형성할 필요가 없으며, 사부피가 바람직하게 제거된다. 이와 관련하여, 사부피에서 샘플 용액의 원치 않는 체류도 제거되며, 크로마토그래피 분석의 정확도가 실질적으로 개선된다.
제 10도의 6-포트 밸브에 있어, 캡(24R2)은 나사와 같은 적합한 수단에 의해 회전식 밸브체(24R)상에 단단히 고정되는 단순한 디스크일 수 있다. 물론, 회전식 밸브체(24R)와 디스크(24R2) 사이의 계면에서 조밀한 밀봉부가 형성된다.
제 1도의 액체 크로마토그래프의 6-포트 밸브(24)의 조작뿐만 아니라 파이프 시스템의 구조가 선행기술을 참조하여 기재된 바와 실질적으로 동일하기 때문에 이들에 대한 추가의 설명은 생략하기로 한다.
제 11도는 제 1도의 액체 크로마토그래프상에 제 10도의 6-포트 밸브를 장착하기 위한 구조를 나타낸다.
제 11도를 참조하면, 회전식 밸브체(24R, 24R2)는 스테인레스강의 케이스 (24c)에 함께 수용되며, 정지캡(24S)은 케이스(24C)에 나사식으로 고정된다. 또한, 밸브체(24R, 24R2)가 로드(24D)상에 장착되어 로드(24D)와 일체로 회전된다. 추가로 정지캡(24S)은 제 1도에 나타낸 여러 파이프의 삽입을 수용하기 위한 여러 나사 모양의 구멍을 포함한다. 또한, 샘플 용액을 보유하는 주사기(15)의 샘플 주입 튜브를 수용하기 위한 정지캡(24S)에 가이드 부재(24i)가 제공된다.
제 12도는 제 8도의 혼합기와 제 10도의 6-포트 밸브(24)와의 조합체가 제 1도의 액체 크로마토그래프에 사용되는 경우에 대한 용매 전환 응답을 나타낸다. 제 12도에 있어서, 실험 조건은 전체 유속이 100㎕/분으로 설정되는 것을 제외하고는 제 2A-2D도의 경우와 실질적으로 동일하게 설정된다. 제 12도로부터, 본 발명에 따른 액체 크로마토그래프가 전체 유속이 작은 경우에도 용매 조성의 급격한 변화 및 용매의 전환에 대한 충분한 응답을 제공함을 알 수 있을 것이다.
이하에는, 본 발명에 따른 제 3의 구체예가 제 13도를 참조로 기술될 것이며, 이전에 설명된 부분이 동일한 참조 부호로 표시되므로, 이들에 대한 설명은 생략하기로 한다.
제 13도를 참조하면, 액체 크로마토그래프는 분석 대상 샘플을 보유하는 다수의 샘플 바이얼(21a)을 포함하는 샘플 홀더(21)를 포함한다. 각각의 바이얼(21a)은 약 200㎕의 용량을 가지며, 샘플 주입 니들(22)이 위치 P1에서 바이얼중 하나의 바이얼(21a)내로 삽입되도록 위치 P1과 위치 P2사이에 가동적으로 샘플 주입 니들(22)을 운반하기 위한 로봇(22a)이 제공된다. 샘플 주입 니들(22)은 튜브에 의해 주사기(15)에 연결되며, 주사기(15)는 니들(22)을 통해 바이얼(21a)에서 샘플을 취한다. 샘플 루프(147)는 니들(22)을 수용하기에 적합한 주입 포트(14x)와 함께 형성되며, 주사기(15)내에 보유된 샘플은 니들(22)이 주입 포트(14x)에 상응하는 위치(P2)로 움직일 때 주입 포트(14x)를 통해 루우프(147)로 주입된다.
도해된 액체 크로마토그래프에 있어, 검출기(17)의 유출구에 제 2의 6-포트 밸브(24B)가 추가로 제공되며, 여기에서 제 2의 6-포트 밸브(24B)는 분석후 검출기 (17)로부터 배출되는 샘플을 선택적으로 폐기물 저장소(18) 또는 샘플 주입 니들 (22)로 공급한다. 제 13도에 도시된 상태에서, 분석 후 검출기(17)로부터 배출된 샘플은 화살표로 표시된 공급로를 따라 폐기물 저장소(18)로 공급된다. 한편, 배출된 샘플을 샘플 주입 니들(22)로 공급할 때, 샘플은 T-조인트(15a)내에 제공된 유로(15b)를 통해 니들(22)로 공급된다. T-조인트(15a)내의 유로(15b)는 주사기(15)로부터 공급된 샘플 및 밸브(24B)로부터 공급된 샘플중 어떠한 것도 주입 니들(22)로 공급한다는 사실에 주목해야 한다.
도시된 장치는 용기(25A)내의 린스 액체가 펌프(25)에 의해 상기 6-포트 밸브(23B)로 공급되도록 컬럼(16)을 세척하는데 사용되는 세척 액체를 보유하기 위한 용기(25A) 및 이와 협동하는 파이프 시스템을 포함한다. 제 13도에 도시된 바와 같이, 린스 액체는 니들(22)을 세척하기 위해 조인트(15a)를 통해 니들(22)로 공급된다. 니들(22)을 세척할 때, 로보트(22a)는 상기 위치(P1, P2)와 상이한 세척 위치(P3)로 니들(22)을 이동시킨다.
제 14도는 6-포트 밸브(24B)가 제 13도의 상태에 대해 회전된 상태를 나타낸다. 제 14도의 상태에 있어서, 검출기(17)로부터 배출된 샘플은 화살표로 표시된 경로를 따라 밸브(24B)를 통과하며 T-조인트(15a)내의 유로(15b)를 통해 샘플 주입 니들(22)내로 공급된다. 한편, 용기(25A)로부터의 리스 액체는 밸브(24B)에서 차단된다. 이와 같이, 이 상태에서 샘플 홀더(21)의 선택된 바이얼에 상응하는 적합한 위치로 니들(22)을 이동시킴으로써, 검출기(17)로부터 배출된 샘플이 앞서의 바이얼(21a)에 수집된다.
분리 컬럼(16)으로서 컬럼 내경이 1.0-2.0mm인 세미-마이크로 컬럼을 사용하는 경우, 용매의 전체 유속은 최대한 50-200㎕/분이어야 한다. 이와같이, 용매에 의한 배출된 샘플의 희석은 어떠한 문제점도 일으키지 않으며, 이와 같이 수집된 샘플은 수집된 샘플을 다루기에 충분한 수액 마이크로 리터 용량을 갖는 바이얼 (21a)에 저장된다.
제 15A 및 15B도는 6-포트 밸브(24B)에 의해 검출기(17)로부터 배출된 샘플의 유로 변경을 나타낸다.
제 15A도를 참조하면, 6-포트 밸브(24B)는 통로(241B-246B)를 연결하는 통로 (24aB-23cB)뿐만 아니라 직선 통로(241B-246B)를 수반하는 회전식 밸브체(23R)를 포함한다. 이때, 통로(24aB)는 통로(241B)와 통로(246B)를 연결시키며, 통로(24bB)는 통로(242B)와 통로(243B)를 연결시키고, 통로(23c)는 통로(235)와 통로(236)를 연결시켜야 한다. 제 15A도의 상태에서, 통로(241B)는 T-조인트(15a)를 통해 샘플 주입 니들(22)에 연결되는 포트(1)와 일치되고, 통로(242B)는 검출기(17)의 출구에 연결된 포트(D)와 일치되며, 통로(243B)는 폐기물 저장소(18)에 연결된 포트(W)와 일치된다. 한편, 통로(246B)는 린스 액체를 보유하는 용기(25A)에 연결된 포트(C)와 일치되며, 통로(245B, 246B)는 아무데도 연결되지 않는다. 즉, 검출기(17)로부터 배출된 샘플은 통로(23b) 및 포트(W)를 통과한 후 폐기물 저장소(18)로 공급된다. 한편, 용기(25A)내의 세척용액은 통로(24aB)를 통해 샘플 주입 니들(22)로 연결된다.
한편, 제 15B도의 상태에서, 밸브체(24RB)는 화살표 방향으로 회전하며, 포트(1)는 통로(242B, 24bB, 243B)를 통해 검출기(17)에 연결된다. 또한, 포트(C)는 통로(241B, 24aB, 246B)에 연결된다. 한편, 통로(246B)는 아무데도 연결되지 않는다. 따라서, 용기(25A)로부터의 린스 액체가 통로(246B)에서 차단된다. 제 15B도에 있어, 폐기물 저장소(18)에 연결된 포트(W)는 통로(23cB)를 통해 통로(245B)에 연결된다. 그러나, 이 경우, 통로(245B)에 연결된 포트가 없기 때문에 폐기물 저장소(18)로의 어떠한 샘플 배출도 일어나지 않는다.
제 16도는 제 3의 구체예의 변형된 형태를 도시한다.
제 16도에 도시된 구조에서, 샘플 홀더(21)는 직사각형으로 형성되며, 바이얼(21a)를 열과 행으로 샘플 홀더(21)에 형성된다. 이렇게 하여, 영역(121a)내의 바이얼이 영역(121a')내의 바이얼과는 상이한 크기를 갖도록 두개의 영역(121a, 121a')이 샘플 홀더(21)상에 형성된다. 예컨대, 영역(121a')내의 바이얼은 영역(121a) 내의 바이얼에 비하여 더 큰 용적을 갖는다. 이렇게 하여, 회수된 샘플은 검출기(17)로부터 배출된 샘플이 용매에 의해 희석되어 부피가 증가하는 경우에도 저장가능하다.
이하에는, 본 발명에 따른 제 4의 구체예가 제 13도 및 제 14도에 도시된 액체 크로마토그래프에 사용되는 밸브 유니트(50)를 도시하는 제 17도를 참조하여 기술될 것이다.
제 13도 및 제 14도의 액체 크로마토그래프는 두 개의 6-포트 밸브(14, 23)를 사용한다. 이와 같이, 본 발명에 따른 제 17도의 밸브 유니트는 단일 밸브 유니트(50) 형으로 밸브(14, 23)를 조립한다.
사시도로서 밸브 유니트(50)를 도시하는 제 17도를 참조하면, 밸브 유니트 (50)는 디스플레이 장치(53), 키 패드(54) 및 전원 스위치(55)가 제공되어 있는 전방 패널(52)을 포함하는 케이스(51)를 갖는다.
제 18도는 케이스(51)의 내부를 나타낸다.
제 18도를 참조하면, 캐이스(51)는 6-포트 밸브(14)를 가동시키는 제 1 밸브 가동 모터(62) 및 6-포트 밸브(24B)를 가동시키는 제 2 밸브 가동 모터(63)를 포함하며, 상기 모터(62)가 감속(reduction) 메카니즘(64)을 통해 밸브(14)를 작동시킨다. 유사하게, 모터(63)는 감속 메카니즘(65)을 통해 밸브(24B)를 가동시킨다. 모터(62, 63)를 구동시키기 위하여, 밸브 유니트(50)의 케이스(51)에 인쇄 회로 보드 (66)가 제공되며, 상기 인쇄 회로 보드(66)는 모터(62, 63) 및 전환 조절기(67)를 제어하기 위한 마이크로컴퓨터를 수반한다.
전방 패널(52)상의 디스플레이 장치(53)는 액정 디스플레이일 수 있으며 키 패드(54)를 통해 입력되는 내용을 포함하여 밸브 유니트(50)의 상태를 나타낸다. 키 패드(54)는 마이크로컴퓨터(68)로의 데이타 및 프로그램 입력뿐만 아니라 밸브유니트(50)의 여러가지 설정에 사용된다. 전원 스위치(55)는 밸브 유니트(50)내의 여러 전기적 요소의 전력을 온-오프하는데 사용된다. 그 다음, 전환 조절기(67)는 입력 전력의 고주파수 전환을 유발하여 안정화된 전력 공급원으로서 작용한다.
밸브(14)를 구동시키기 위한 모터(62)는 D.C. 모터일 수 있으며, 상기한 환원 메카니즘(53)을 통해 밸브(14)에 연결된 출력 샤프트를 갖는다. 유사하게, 모터(64)는 d.c. 모터일 수 있으며, 환원 메카니즘(65)에 의해 밸브(24B)에 연결된 출력 샤프트를 갖는다. 상기한 바와 같이, 모터(62, 63)는 마이크로컴퓨터(68)의 제어하에 구동되며, 밸브(14)에 대해 제 3A 및 3B도 또는 밸브(24B)에 대해 제 15A 및 15B도를 참조하여 앞서 기술된 유로의 전환이 달성된다.
모터(62, 63)를 제어하기 위한 마이크로컴퓨터(68)가 일체형 유니트(50) 형태로 제공된다는 사실 때문에, 유니트(50) 외부에 외부 제어기가 제공될 필요가 없다. 이와 관련하여, 외부 제어기의 사용과 관련된 전기 접속 및 여러 와이어를 제거시킬 수 있다.
이하에는, 본 발명에 따른 제 5 의 구체예가 앞서 기술된 제 13 및 제 14도와 상응하는 제 19 및 20도를 참조하여 기술될 것이다. 따라서, 제 13 및 14도를 참조하여 앞서 기술된 부분은 동일한 참조 부호로 표시되므로, 이들에 대한 설명은 생략하기로 한다.
제 19 및 20도를 참조하면, 액체 크로마토그래프는 시스템 제어기(70)를 포함하며, 상기 시스템 제어기(70)는 로보트(22a) 및 샘플 홀더(21) 및 더 나아가서 주사기(50)를 제어하며, 시스템 제어기(70)는 밸브(14) 및 펌프(15)뿐만 아니라 액츄에이터(39)에 의해 주사기(50)를 제어한다.
또한, 나중에 기술된 불활성 액체를 보유하는 용기(38)가 샘플 홀더(21)에 별도로 제공된다. 용기(38)는 샘플 주입 니들(22)이 위치(P1, P2)와는 상이한 위치 (P3)에서 용기안에 보유된 액체를 취할 수 있도록 샘플 홀더(21)부근에 제공된다.
이러한 구체예에 있어서, 시스템 제어기(70)는 용기(38)내에 보유된 불활성 액체가 먼저 유입되고 공기 갭을 중간 흡입하면서 샘플이 유입되도록 니들(22)로 샘플을 이끄는 순서를 제어한다. 결과로서, 샘플 소적(30a)이 튜브(32)의 단부에 제공된 샘플 주입 니들(22)에 보유되며, 튜브(32)가 린스 액체(31)로 채워지고, 하나 이상의 불할성 액체 소적(30b)이 제 21 또는 22도에 나타낸 바와 같은 갭(33a)에 의해 린스 액체(31) 및 샘플(30a)로부터 분리된 니들(22)에 보유된다. 샘플 소적(30a)이 샘플 루우프(147)로 주입될 때, 시스템 제어기(70)는 샘플 소적(30a)이 먼저 주입되고 다음에 하나 이상의 불활성 액체 소적(30b)이 주입되도록 주사기 (15)의 액츄에이터(39)를 조작한다. 소적(30b)을 형성하는 불활성 액체는 샘플 소적(30a)의 조성을 변화시키거나 반응하지 않는 물질로 형성된다.
제 23도는 22a의 구조를 상세히 나타낸다.
제 23도를 참조하면, 로보트(22a)는 기본 본체(240), 및 본체(240)에 대해 가동적으로 보유되는 아암(244)을 갖는다. 계속하여, 기본 본체(240)는 X-방향으로 수평축(241a, 241b)상에 이동가능하게 유지된다. 또한, 아암(244)은 Z-방향으로 본체(240)에 장착된 수직축(245a, 245b)을 따라 이동가능하다.
로보트(22a)의 본체(240)는 도시하지 않은 섀시(chassis)에 장착되며, 스텝핑 모터(242) 및 동기 타이밍 벨트(243)에 의해 대시에 대해 X-방향으로 움직인다. 기본 본체(240)는 계속하여 스텝핑 모터(246)를 수반하며, 스텝핑 모터(246)는 타이밍 벨트(247)에 의해 Z-방향으로 아암(244)을 구동시킨다.
아암(244)은 커넥터(249)에 의해 샘플 주입 니들(22)을 운반한다. 또한, 샘플 주입 니들(22)의 팁 단부를 보호하기 위해 기본 본체(240)에 보호가이드(24B)가 제공된다.
제 19 및 20도의 제어기(70)는 스텝핑 모터(242, 246)를 구동시키며, 로보트 (22a)는 제어기(70)의 제어하에 Z-방향 뿐 아니라 X-방향으로 샘플 주입 니들(22)를 이동시킨다. 이러한 제어의 결과로서, 샘플 주입 니들(22)은 샘플 주입 니들 (22)에 불활성 액체 또는 샘플을 수집하기 위하여 불활성 액체를 함유하는 용기 (38)내로 또는 바이얼(22a)내로 선택적으로 삽입된다. 또한, 니들(22)은 내부에 보유하고 있는 불활성 액체 소적(30b) 뿐 아니라 샘플 소적(30a)을 주입 포트(14x)로 주입하기 위한 주입 포트(14x)에 상응하는 위치로 이동된다.
이하에는 제어기(70)에 의한 제어가 제 24도의 흐름도를 참조하여 상세히 기술될 것이다.
제 24도를 참조하면, 공정은 전체 파이프 시스템이 린스 액체를 흘려 세척하는 단계(S10)에 의해 시작된다.
단계(S10) 후, 제어기(70)는 샘플 주입 니들(22)의 팁 단부가 임의의 샘플 주입 포트(14x), 샘플 바이얼(21a), 및 불활성 액체의 용기(38)로부터 이격되어 있는 위치에서 샘플 주입 니들(22)이 보유되도록 단계(S12)에서 로보트(22a)를 가동시킨다. 이 상태에서, 제어기(70)는 니들(22)로 공기를 유도하도록 주사기 액츄에이터 유니트(39)를 가동시킨다. 이렇게 하여, 공기 흡입의 결과로서 제 21도에 참조부호 "33"으로 나타낸 바와 같이 약 200nl의 공기갭이 니들(22)내에 형성된다.
그 다음, 단계(S14)는 불활성 액체를 니들(22)내로 유도하기 위해 니들(22)을 바이얼(38)에 보유되어 있는 불활성 액체내로 이동시키도록 수행된다. 이렇게 하여, 불활성 액체 소적(30b)이 전형적으로 200nl의 부피로 니들(22)내에 형성된다. 단계(S14) 이후, 공기를 니들(22)로 유도하도록 바이얼(38)로부터 튜브를 먼방향으로 이동시키기 위해 단계(S16)이 수행된다. 결과로서, 또 다른 갭(33a)이 전형적으로 200nl의 부피로 제 21도에 도시된 바와 같이 형성된다. 또한, 단계(S18)에서, 제 21도에 참조부호 "30a"로 나타낸 바와 같이 샘플 소적을 형성하도록 니들 (22)내로 샘플 액체를 유도하기 위해 하나의 바이얼(21a)에 보유된 샘플 액체내로 니들(22)를 이동시키도록 로봇(22a)이 이동한다. 단계(S18)후, 니들(22)은 바이얼 (21a)로부터 먼 방향으로 이송되며, 단계(S20)에서의 공기 흡입이 이루어져 또 다른 갭(35)이 형성되어, 샘플 소적(30a)이 갭(34a, 35)에 의해 측면으로 샌드위칭된다. 또한, 니들(22)이 샘플 주입 포트(14x)내로 삽입되고 니들(22)내의 샘플 소적 (30a)이 샘플 루우프(147)로 주입된 후, 불활성 액체 소적(30b)이 주입되는 단계 (S22)가 수행된다. 단계(S22)에서, 액츄에이터(39)의 가동은 L1으로 나타낸 부분에 해당하는 샘플 주입 니들(22)의 일부 성분만을 샘플 루우프(147)로 주입되는 식으로제어된다. 그 다음, 이와 같이 주입된 샘플 액체 소적(30a)이 컬럼(16)으로 공급되고, 상기한 6-포트 밸브(14)를 통해 검출기(17)로 추가로 공급된다.
제 24도의 순서에 따르면, 샘플을 검출기(17)로 공급하기 위해서는 샘플 소적(30a)이 먼저 공급된 후, 불활성 액체 소적(30b)이 공급되어야 한다. 즉, 파이프 시스템에 남은 모든 샘플 액체가 불활성 액체 소적(30b)에 의해 수집되고, 샘플 소적(30a)과 함께 컬럼(16) 및 검출기(17)로 공급된다. 이렇게 하여, 파이프 시스템 내벽상에서의 샘플 액체의 손실은 제 24도의 흐름도에 나타낸 공급 순서를 사용함으로써 효과적으로 제거되며, 매우 정확한 샘플 분석이 가능해진다. 본 발명에 의해 수행된 실험에 따르면, 샘플 부피가 2㎕로 설정될 때의 피크 면적에 대해 0.2%의 상대 표준편차(RSD)를 달성하는 것이 가능하였다. 제 24도의 공정에 있어서, 단계(S12, S14)를 반복하여 제 22도에 나타낸 바와 같은 다수의 불활성 액체 소적을 형성시키는 것도 물론 가능하다.
불활성 액체의 조성은 세척 용액의 조성 및 샘플의 조성에 의존하며, 린스 액체의 조성은 평가된 샘플 조성을 기초로 하여 결정되고, 불활성 액체의 조성은 린스 액체의 조성에 기초하여 결정된다. 또한, 불활성 액체로서 린스 액체를 사용하는 것도 가능하다. 하기 표 1은 세척용액 및 불활성 액체의 여러 가능한 조합을 나타낸다.
표 I
이하에는, 본 발명의 제 6 구체예가 제 25도를 참조하여 설명될 것이다.
제 25도의 구체예에 있어서, 액체 크로마토그래프는 시스템이 6-포트 밸브 (10A)로서 6-포트 밸브(10) 대신, 제 10도에 도시된 6-포트 밸브(24)를 사용하는 것을 제외하고는, 제 7도의 시스템과 실질적으로 동일한 구조를 갖는다. 대안적으로, 제 13도의 구체예를 참조로 설명된 샘플 수집 시스템과 조합하여 제 17도의 이중-밸브가 사용될 수 있다. 밸브(10A)에 대해 사부피가 실질적으로 없는 밸브를 사용함으로써, 용매를 실질적으로 완전하게 전환시킬 수 있다. 밸브(24) 및 그로 인한 밸브(10A)의 구조가 이미 설명되었기 때문에 이 설명은 반복되지 않을 것이다.
본 구체예에서, 예비컬럼(40)은 Si-R 결합 및 Si-R' 결합(R은 소수성 그룹을 나타내고, R'은 친수성 그룹을 나타냄)을 갖는 실리콘 중합체에 의해 피복된 다공성 매질의 컬럼 충전재를 사용한다. 이와같은 컬럼 충전재를 사용함에 의해, 혈청과 같은 단백질을 함유한 샘플을 분석할 때, 높은 효율로 단백질을 분리할 수 있다. 이로 인해, 표적 물질의 효과적인 농도가 달성된다.
본 발명에 있어서, 실리카겔, 알루미나, 다공성 유리 비드, 제올라이트, 히드록시아파타이트 및 흑연과 같은 액체 크로마토그래프중에 공통적으로 사용되는 다공성 매질이 예비컬럼(40)의 충전재로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 실리카 겔, 이산화티타늄, 히드록시아파타이트 등과 같은 무기 분말에 의해 피복된 수지 코어로 형성된 복합 분말이 사용될 수 있다. 수지 코어에 대해 폴리아미드, 아크릴산 수지, 폴리비닐 알코올 등과 같은 재료를 사용할 수 있다.
전형적으로, 다공성 매질은 2-200㎛의 직경을 가지며 200-300㎡/g의 비표면적을 갖는다. 추가로, 다공성 매질은 일반적으로 40-120Å 직경의 미세 구멍을 갖는다. 3-50㎛의 직경과 400-600㎡/g의 비표면적을 갖는 매질을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 다공성 매질은 60-80Å 직경의 미세 구멍을 가지며 구형 또는 불규칙적인 형태를 가질 수 있다.
상기한 바와 같이, 다공성 매질은 Si-H기를 갖는 실리콘 화합물로 피복되며, 여기에서 실리콘 화합물은 하기 일반식(1)로 제시된다:
(R1HSiO)a(R2R3SiO)b(R4R5R6SiO1/2)c'(1)
상기 식에서, 각각의 R1내지 R3은 C1내지 C10의 탄화수소 그룹이며, 탄소원자중 적어도 하나는 수소 또는 할로겐 원자에 의해 치환될 수 있다. 모든 그룹 R1내지 R3이 수소로 형성된 경우는 제외되어야 한다. 추가로, 각각의 R4내지 R6는 C1내지 C10을 갖는 탄화수소기를 나타내며, 탄소원자중 적어도 하나는 수소 또는 할로겐 원자에 의해 치환될 수 있다. 추가로, a와 b는 각각 0 이상의 정수이며, c는 0 또는 2이다. c=0 일때, a와 b는 a와 b의 합이 3 이상이 되는 정수의 값을 갖는다.
상기 실리콘 화합물은 하기의 제 1 및 제 2군 화합물을 포함하는데, 제 1군 화합물은 C=0인 경우에 해당하는 고리형 실리콘 화합물이며, 일반적으로 하기의 일반식(2)로 나타낸다:
(R1HSiO)a(R2R3SiO)b'(2)
상기 식에서, R1-R3는 하나 이상의 탄소 원자를 할로겐 원자에 의해 치환될 수 있으며 a 와 b의 합이 3을 초과한다는 것을 제외하고는 상기와 같다. 이러한 군에 속하는 대표적 화합물을 하기 일반식(3, 4)로서 나타낼 수 있다.
상기 식에서, n은 3 내지 300 의 정수이거나, a+b = 3 내지 300 이다.
어떠한 상기의 화합물도 개별적으로 또는 혼합물의 형태로 사용될 수 있다. 어떠한 상기의 화합물에 있어서도, n 또는 a+b의 값은 3과 7사이의 범위가 바람직하다. 매개변수 n의 값이 증가됨에 따라, 화합물의 비점은 감소된다. 다시 말하면, 화합물이 쉽게 증발되어 매질상에 부착된다. 특히, 입체화학적 특성과 관련된 중합 용이성에 기인하여 삼합체 및 사합체가 바람직하다.
상기 고리형 실리콘 화합물의 예로는 디히드로겐-헥사메틸시클로테트라실록산, 트리히드로겐-펜타메틸시클로테트라실록산, 테프라히드로겐-테트라메틸시클로테트라실록산, 디히드로겐-옥타메틸시클로펜타실록산, 트리히드로겐-헵타메틸시클로펜타실록산, 테트라히드로겐-헥사메틸시클로펜타실록산, 및 펜타히드로겐-펜타메틸시클로펜타실록산이 있다.
한편, 상기의 제 2 군 실리콘 화합물은 상기 일반식(1)중에 c=2인 경우에 상응하며 R1-R6는 하나 이상의 탄소원자를 할로겐 원자에 의해 치환시킨 탄화수소기 이다. 이 군의 전형적인 실리콘 화합물은 하기 일반식(5)으로서 나타낸다.
상기 식에서, n은 2-100 사이의 정수를 나타낸다.
상기 일반식(5)의 화합물은 1,1,1,2,3,4,4,4-옥타에틸실록산, 1,1,1,2,3, 4,5,5,5-노나메틸펜타실록산, 및 1,1,1,2,3,4,5,6,6,6-데카메틸헥사실록산을 포함한다.
일반식(1)을 갖는 실리콘 화합물은 증기상 상태 또는 액체상 상태로 상기 다공성 매질에 접촉된다. 실리콘 화합물을 증기상 형태로 접촉시킬 때, 기밀 밀봉된 용기가 사용되며, 이곳에서 상기 실리콘 화합물 증기의 분자들은 120℃ 미만, 바람직하게는 100℃ 이만의 온도에서, 200mmHg 미만, 바람직하게는 100mmHg 미만의 압력하에 다공성 매질의 표면과 접촉된다. 대안적으로, 상기 실리콘 화합물과 운반 가스의 혼합 가스가 다공성 매질의 충진재와 접촉시키는데 사용될 수 있다. 상기 증기상 처리는 예컨대, 테트라히드로테트라에틸시클로테트라실록산, 테트라히드로테트라메틸시클로테트라실록산 등과 같은 실리콘 화합물에 대해 수행되는 것이 바람직하다.
한편, 액상 처리에 있어서, 상기 실리콘 화합물을 용해시킬 수 있는 벤젠, 클로로포름 또는 특히 헥산과 같은 휘발성 용매가 사용되며 0.01-1중량%의 실리콘 화합물 용액이 제조된다. 1중량부의 매질에 0.01-1중량부의 실리콘 화합물을 첨가하는 비율로 다공성 매질에 상기 제조한 용액을 첨가하고 이 용액을 교반시킨 후, 실리콘 화합물과 다공성 매질의 혼합물을 50∼200℃의 온도에서 2시간 이상 두면 매질의 표면상에서 중합반응이 일어난다.
상기 표면 중합은 매질 표면상의 활성점에 의해 촉진되므로 어떠한 특정의 촉매도 필요하지 않다. 여기서, "활성점"은 실록산(Si-O-Si) 결합 또는 규소-수소 (Si-H) 결합을 포함하는 실리콘 화합물의 중합을 촉진시키는 부분을 의미하며, 다양한 산성점, 염기성점, 산화점 및 환원점을 포함한다. 표면 중합은 매질상의 활성점들이 실리콘 중합체 필름에 의해 모두 피복될 때까지 진행된다. 매질의 활성이 매우 낮을 때, 수산화나트륨, 수산화리튬, 수산화 암모늄 등과 같은 알칼리성 촉매또는 디부틸틴과 같은 알킬 금속 촉매에 의해, 접촉 처리전 또는 후에, 매질을 처리 할 수 있다.
충전 매질의 표면을 피복시키는 실리콘 중합체에 대한 2가지 상이한 구조가 공지되어 있다. 한가지는 중합이 실록산 결합(-Si-O-Si)의 절단 및 재결합의 결과로서 일어나는 실리콘 중합체로, 이 중합체는 -Si-O-Si- 사슬만을 포함한다. 다른 한가지는 중합이 H2O 또는 O2의 존재하에 규소-수소(Si-H) 결합의 브리징 결과로서 일어나는 실리콘 중합체이다. 이 경우, 중합은 하기 반응식(6)과 같이 진행되며, 상기 실리콘 중합체는 그 안에서 망상구조(7)를 포함한다.
상기 두가지 타입의 중합은 매질 또는 온도 및 촉매와 같은 중합조건
에 따라 독립적으로 또는 동시에 일어날 수 있다. 추가로, 중합도를 다양하게 변화시킬 수 있다.
상기 서술한 방법중에, 작은 분자량을 갖는 실리콘 화합물은 충전재상의 미세 구멍 안으로 관통하여 실질적으로 다공 내면을 포항한 충전재의 전체 표면은 3-30Å의 두께를 갖는 필름을 형성하는 실리콘 화합물에 의해 피복된다. 이러한 과정중에서, 매질의 다공성 구조는 보존되어야 한다. 추가로, 매질의 다공성 구조는 실리콘 중합체 화합물의 침착에 이어서 비닐 화합물의 침착 후에도 보존된다.
다공성 매질의 표면상에 이러한 방식으로 형성된 실리콘 중합체 화합물은 일반적으로 150,000 이상의 분자량(수평균 분자량)을 갖는다. 실리콘 화합물은 중합반응이 진행됨에 따라 물 또는 유기용매에 대한 용해성이 줄어든다는 사실은 공지되어 있다. 이와 같이, 분자량 측정을 위해 중합체를 추출한다는 것은 일반적으로 불가능하다. 또한 중합체가 매질의 표면상에 피복물을 형성하는 상태에 있는 중합체의 분자량을 측정하는 것도 불가능하다.
이와 같은 상황하에 분자량을 측정하기 위해, 클로로포름의 사용에 의해 중합반응의 여러 단계에서 중합체가 추출된다. 이러한 과정중에, 분자량이 최대 150,000 에 이르는 중합체가 존재함이 확증되었다. 이것은 중합체를 클로로포름에 의해 추출하기 전에는 150,000을 초과한 분자량을 갖는다는 것을 시사한다. 한편,분자량에 대한 추가의 분석은 곤란하다.
소수성 그룹
한편, 충전재의 표면을 피복시키는 실리콘 중합체는 반응되지 않은 Si-H기를 포함하다. 이와 같이, Si-H기상에서 분자중에 비닐을 함유한 탄화수소를 반응시킴으로써 Si-C 결합을 함유하는 실리콘 중합체를 형성할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 하기 일반식(8)을 갖는 비닐 화합물을 사용할 수 있다.
R8-CH=CH-R9(8)
상기 식에서, R8과 R9각각은 1-40개의 탄소 또는 수소원자를 함유하는 알킬기, 4-8개의 탄소원자를 함유하는 시클로알켄일기, 및 1-20개의 탄소원자를 함유하는 알킬에 의해 치환될 수 있는 알켄일기일 수 있다.
상기 비닐 화합물은, R6과 R9둘다가 수소인 에틸렌, R6과 R9중 하나가 수소이고 다른 하나가 수소 이외의 다른 기인α-올레핀 화합물과 같은 비닐 화합물, R8과 R9둘다가 수소 이외의 기인 대칭성 비닐 화합물, 및 R8과 R9이 수소 이외의 서로 다른 기인 비대칭성 비닐 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 비닐 화합물은 화합물중에 R8과 R9각각이 4-20개의 탄소원자를 갖는 알킬기, 예컨대 1-헥실기, 1-옥틸기, 1-데실기, 1-도데실기, 1-헥사데실기, 1-옥타데실기, 시클로헥실기 또는 시클로헥세닐기; 페닐 또는 나프틸기; 또는 1-4개의 탄소원자를 함유하는 저급 알킬기에 의해 치환된 페닐 또는 나프틸기인 화합물을 포함한다.
에틸기, 헥사데실기 및 페닐기로부터 형성된 R8기와 R9기에 대해 수소를 함유하는 화합물이 비닐 화합물에 대해 사용될 때, C4-타입, C8-타입, C16-타입 및 페닐 타입으로서 공지된 통상의 화학 결합 타입 충전 재료가 수득된다. 상기 비닐 화합물과 실리콘 중합체 분말과의 반응은 예컨대 50-300℃ 의 온도에서 용매의 존재하에 2시간 이상 동안에 달성될 수 있다. 이와같은 반응에 있어서, Ru, Rh, Pd, Os, Ir, Pt 등과 같은 촉매들이 사용될 수 있다.
상기 비닐 화합물과 실리콘 화합물의 반응은 FT-IR 분석기에 의해 수행된 확산 반사 분광기에 의해 확증된다. 비닐 화합물을 첨가한 반응의 결과로서, 2160cm-1에서 Si-H 기의 흡수율은 실제적으로 줄어들고, 알킬기의 새로운 흡수 피크가 2800cm-1-3000cm-1의 파장에서 나타난다. 흡수 피크의 비율로 반응 정도를 평가할 수 있다.
친수성 그룹
본 구체예의 액체 크로마토그래프의 충전재를 형성하기 위하여, 충전재료의 표면을 피복시키는 실리콘 중합체 피복물의 Si-H기의 일부를 친수성이 되게 변형시킬 필요가 있다. 이러한 목적으로, 하기 반응식(9)에 따른 테트라올이 사용될 수 있다.
테트라올의 합성은 하기 반응식(10)에 의해 이루어진다.
추가로, 폴리올은 디글리세린을 폴리글리세린으로 치환함으로써 형성되며, 이렇게 형성된 폴리올은 본 발명의 친수성 그룹으로서 또한 사용될 수 있다. 더욱이, 상기 일반식(10)에서 제시한 폴리옥시에틸렌아릴에테르를 사용할 수 있으며, 이 폴리옥시에틸렌아릴에테르는 알릴알코올에 에틸렌 옥사이드를 첨가시킴으로써 합성된다.
이렇게 하여 수득된 충전재는 pH 2-10의 넓은 범위에서 효과적이라는 점에서 화학적 결합 타입의 통상의 충전재 보다 우수한 장점을 갖는다. 특히, 상기 충전재는 알칼리성 용매중에서 사용될 수 있으며, 개선된 안전성을 제공한다. 통상의 충전재는 알칼리성 용매중에서 사용될 수 없었다.
본 발명은 복잡한 샘플 제조의 필요성을 제거하여, 여러가지 약물 또는 혈청과 같은 생체내 대사 산물의 액체 크래마토그래피 분석에 특히 유리하다. 분석을 위해 생물학적 샘플들을 직접 주입하여 매우 정확한 분석을 할 수 있다. 본 발명의 충전 재료는 완전히 중합체 코팅된 타입이며 루이스산을 사용하지 않는다. 이와 같이, 2-에틸피리딘 또는 N,N'-디메틸아닐린과 같은 염기성 재료를 추출할 수 있다.
소수성에서 친수성으로의 변형 과정
본 구체예의 충전재는 다공성 매질을 피복시키는 실리콘 중합체의 표면을 소수성으로 변형시킨 다음에 표면을 친수성으로 변형시키는 과정에 의해 형성된다. 따라서, 실리콘 중합체가 먼저 사용되어 제 27A도에 도시된 다공성 매질(110)의 표면상에 피복물(112)을 형성시킨다. 이 때문에, 실리콘의 -Si-H기의 일부만이 중합반응에 사용되며, 나머지 -SiH기는 사용되지 않은 채로 남는다. 이와 같이, 제 27B도의 단계에 있어서, 잔류하는 -SiH기와 이중결합을 함유한 소수성 그룹(R)(114)이 제 27B도에 도시된 바와 같이 반응하여 -SiR기를 형성한다. 제 27B도의 단계중에, 소수성 그룹(R)의 양 및/또는 반응조건은 모든 -SiH기가 소모되지 않도록 조절된다. 따라서, 실리콘 필름(112)의 표면상에 반응하지 않은 -SiH기가 여전히 존재하게 된다.
그 다음, 제 27C도의 단계에 있어서, 실리콘 중합체 피복물(112)상에 남아 있는 -SiH기는 이중결합을 함유한 친수성 그룹(R')(116)과 반응하여 친수성 그룹 SiR'를 형성한다. 제 27C도의 상태에 있어서, 실리콘 중합체(112)의 표면은 소수성 그룹 및 동시에 친수성 그룹의 복합된 작용 구조를 나타낸다. 소수성 그룹과 친수성 그룹(114, 116)의 비를 변화시킴으로써 특유한 추출 특성을 얻을 수 있다. 소수성-친수성 변형 과정은 소수성 그룹의 도입이 용이하다는데 있어 유리하다. 친수성 변형은 충전재의 보유 특성에 특히 중요한 영향을 미친다.
친수성에서 소수성으로의 변형 과정
본 구체예에 따른 충전재에 있어서, 다공성 매질(110)의 표면이 제 28A도에 제시된 것처럼 실리콘 중합체 필름(112)에 의해 먼저 피복된 후, 제 28B도에 제시된 것처럼 표면을 변형시키는 과정에 의해 친수성이 된다. 제 28B도의 과정에서, 실리콘 중합체(112)의 표면상에 남아있는 -SiH 기들이 이중 결합을 포함한 친수성 그룹(R')(116)과 반응하여 -SiR'기를 형성한다. 제 28B도의 과정에 있어서, 친수성 그룹(R')의 양 또는 반응조건은 중합체 필름(112)상의 모든 -SiH기가 소모되지 않도록 조절된다.
이렇게 처리된 표면은 제 28C도의 과정에서 추가로 처리되고, 여기에서 이중 결합을 포함한 소수성 그룹(R)(114)이 도입되어 실리콘 중합체 필름(112)의 표면상에 남아있는 -SiH기와 반응한다.
중합체 표면이 친수성이 되는 변형이 먼저 수행되는 본 구체예의 과정중에 표면의 대부분을 천수성이 되게 변형시킬 수 있다. 결과적으로, 중합체 표면상에 단백질 분자의 흡착이 최소화된다. 표면을 친수성으로 변형시키는 과정은 수중에서 수행되는 것이 바람직하다. 실리콘 중합체로서 피복된 실리카겔은 일반적으로 반발성을 나타나며 반응은 구멍 외부의 표면으로부터 시작된다. 따라서, 구멍의 내부와 비교했을 때 구멍의 외부가 친수성이 더 큰 것으로 생각된다. 이것은 반대로 구멍의 외부와 비교했을 때 구멍의 내부 중에서 소수성이 되는 과정이 더욱 많이 일어난다는 것을 시사한다.
소수성과 친수성 변형이 동시에 일어나는 과정
본 구체예의 실리콘 중합체로 피복된 다공성 충전재는 매질 표면을 소수성으로 변형시키는 과정과 친수성으로 변형시키는 과정을 동시에 수행함으로써 형성될 수 있다.
따라서, 제 29A도의 단계에 있어서, 다공성 매질(110)은 실리콘 중합체에 의해 피복되어 중합체 필름(112)을 형성한다. 그 다음, 제 29B도의 단계에 있어서, 실리콘 중합체 필름(112)의 표면상의 -SiH기는 각각의 그 말단에 이중 결합을 갖는 소수성 그룹(R)(114) 및 친수성 그룹(R')(116)과 동시에 반응한다.
본 구체예의 과정은 반응이 한번에 일어난다는 장점이 있다. 테트라올, 폴리올 등과 같은 친수성 그룹의 공급원으로서 작용하는 화합물에 대해 스티렌과 같은 소수성 그룹의 공급원으로서 작용하는 화합물의 비율을 줄임으로써, 반응성의 차이에 기인하여 원하는 충전재를 얻을 수 있다. 이것은 소수성 화합물이 친수성 화합물 보다 적은 부피를 가지며 좀더 큰 반응성을 갖는 것으로 생각된다. 본 구체예의 과정에서, 용매로서 알코올을 사용할 수 있다. 이렇게 하여, 스티렌과 테트라올을 동시에 혼합할 수도 있다.
소수성 변형-에폭시화-친수성 변형 과정
본 구체예에 있어서, 충전재는 제 30A도에 도시된 바와 같은 실리콘 중합체 필름(112)에 의해 다공성 충전재(110)의 표면을 피복시킨 후, 제 30B도에 도시된 바와 같이 중합체 필름(112)의 표면을 소수성으로 변형시킴으로써 제조된다. 제 30B도의 과정에 있어서, 이중 결합을 포함하고 있는 소수성 그룹(R)(114)은 필름 (112)상의 -SiH기와 반응한다. 상기에 서술된 다른 구체예들과 유사하게, 소수성 그룹을 도입하기 위한 반응은 중합체 필름(112)의 표면상에 소수성 그룹이 모두 사용되지 않도록 소수성 그룹의 양 또는 반응조건을 조정하는 방식으로 조절된다.
추가로, 제 30C도의 단계에 있어서 과정은 에폭시기(18)를 함유하는 에폭시화합물을 도입시키기 위해 수행된다. 이렇게 도입된 에폭시기(18)는 이중결합을 가지며, 이중 결합에 의해 실리콘 중합체 필름(112)상에 반응하지 않은 -SiH기와 결합된다. 추가로, 친수성 그룹(120)은 제 30D도에 도시된 바와 같이 도입되는데, 이 친수성 그룹(120)은 제 30C도의 단계에서 이전에 도입된 에폭시기(118)의 자유 말단에 대하여 결합한다. 결과적으로, 에폭시기(118) 및 또한 친수성 그룹(120)로부터 친수성 그룹(SiR')이 형성된다.
제 30A-30D도의 공정을 사용함으로써, 실리콘 중합체의 친수성 부분의 밀도를 추가로 증가시킬 수 있다. 본 공정에 있어서, 아크릴글리시딜 에테르와 같은 테트라올보다 더 작은 부피를 갖는 그룹은 소수성 그룹 도입단계 후에 도입된 후, 글리세린 또는 디글리세린과 반응하며, 여기에서 아크릴글리시딜 에테르는 단부에서 이중 결합을 가지며 다른 단부에서 에폭시 그룹을 갖는다. 친수성 부분의 증가된 밀도의 결과로서, 본 구체예의 충전재는 증가된 단백질 회수율을 제공한다. 보다 특정의 구체예에 있어서, 페닐 그룹과 같은 소수성 그룹이 먼저 도입되고 일단에서 이중결합 및 다른 단부에서 에폭시 그룹을 갖는 아크릴글리시딜 에테르와 반응한다. 또한, 친수성 그룹, 예를 들어 -OH 또는 -COOH기를 갖는 디글리세린 또는 글리세린과 같은 그룹이 에폭시 그룹에 결합된다.
아크릴글리실에테르와 같은 단부에 이중결합을 가지는 그룹과 소수성 그룹 사이의 반응(히드로실릴화반응)은 Pt 촉매하에서 행해진다. 또한, 에폭시기와 디글리세린과 같은 화합물 사이의 반응은 루이스산, 4차 암모늄염, 3차 아민 등의 존재하에서 행해진다. 대안적으로, 아크릴글리시딜 에테르를 첨가한 후 산성 용액중에서 에폭시 고리를 단순 개방시켜 디올을 형성시킬 수 있다.
제 31A-31C도는 제 26도의 장치에 의해 얻은 액체 크로마토그래프의 결과를 나타내며, 이는 제 26도의 구조를 변경한 것이고, 희석 샘플을 분석하도록 설계된다.
제 26도를 참조하면, 표적 물질을 함유하는 샘플 용액은 6-포트 밸브(10A)의 제 1상태에서 오토 샘플러(14)로부터 공급되며, 제 26도의 실선으로 표시한 바와 같이 예비컬럼(40)을 통해 흐르게 된다. 이렇게 하여, 표적 물질은 예비컬럼(40)의 충전재료에 의해 포획되고, 증가된 농도 수준으로 그안에 보유된다. 이러한 상태에서, 용매(B)는 표적 물질이 혼입되지 않으면서 펌프(11B)로부터 분리컬럼(16)에 공급된다. 그 다음, 밸브(10A)는 용매(B)가 밸브(10A)를 통해 예비컬럼(40)내로 펌핑되는 제 2 상태로 전환된다. 이렇게 하여, 예비컬럼(40)에 보유된 표적 물질은 용매(B)와 함께 파선으로 도시된 경로를 따라 분리컬럼(16)으로 용리된다.
제 31A도는 통상의 컬럼 충전재가 예비컬럼(40)에 사용되는 경우를 나타낸다. 한편, 제 31B 및 31C도는 본 구체예에 따른 충전 물질이 사용된 결과를 나타낸다. 제 31B도의 실험에 있어서, 1/20의 농도 수준으로 희석된 샘플이 20㎕의 양으로 도입되어, 3분 동안 예비컬럼(40)에서 농축된다. 한편, 제 31C도의 경우, 1/80의 농도 수준으로 희석된 샘플이 80㎕의 양으로 도입되며, 농축과정은 3분 동안 수행된다.
제 31B도 및 31C도로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 분석 대상표적 물질의 피크(S)는 제 31A도의 통상의 경우와 비교할 때 동일한 첨예도를 나타내며, 단백질과 같은 보유되지 않은 성분을 나타내는 피크(P)는 실제로 감소된다. 명백하게, 샘플 피크(S)의 이러한 강도 및 단백질 피크(P)의 감소된 강도는 단백질이 예비컬럼(40)내 충전물질의 친수성 외표면에 흡착되지 않음을 나타낸다. 본 발명에 따른 컬럼 충진재로 효소를 사용하지 않기 때문에, 개선된 안정성 및 분석의 개선된 재현성을 얻을 수 있다.
이하에는, 본 발명의 제 7의 구체예가 제 32도를 참조하여 기술될 것이다. 제 32도에 있어서, 상기한 부분과 동일하게 구성된 부분은 동일한 참조 부호에 의해 표시되어 있으며, 동일 부분들에 대한 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 구체예에 있어서, 샘플용액내의 샘플을 농축시키기 위하여, 분리 컬럼(16) 및 6-포트 밸브(10A) 사이에 제 2 농축 컬럼(40a)이 제공된다. 샘플 용액은 샘플과 기술하고자 하는 제 1용매의 혼합물이다. 컬럼(149)은 전형적으로 1-4mm의 내부 직경을 가지며 상대적으로 약 10-15mm의 작은 길이를 갖는다. 이 때문에 컬럼(40a)은 약 200㎕의 부피용량을 가지며, 샘플을 분리하는 충전재로 충전된다.
작은 길이를 갖는 컬럼(40a)의 사용은, 정량 분석을 하기 위해 필요한 이론단의 수를 제공할 수는 없을지라도, 압력 증가를 완화시킨다는 점에서, 특히 불순물을 함유하는 경향이 있는 생물학적 샘플을 반복적으로 주사되는 경우에 유리하다. 컬럼(40)에 있어서, 용매 또는 이동상의 속도는 0.1-1.0ℓ/분으로 설정된다.
그 다음, 컬럼(40)을 통해 통과된 샘플 용액은 제 2농축 과정을 위해 전술된 그 다음 컬럼(40a)에 공급되며, 여기에서 컬럼(40a)은 2.0mm의 내부직경과 35mm의길이를 가질 수 있다.
컬럼(40)은 컬럼(40a)의 상류측에 배치된다. 따라서, 제 32도의 구체예는 상류측 컬럼(40)이 하류측 컬럼(40a)과 비교해서 좀 더 큰 직경을 갖도록 구조된 것임을 주목해야할 것이다. 따라서, 오토 샘플러(14)에 의해 주입된 샘플은 컬럼(40) 및 컬럼(40a)를 통해 연속적으로 이동하며, 이때마다 농축이 일어난다. 컬럼(40) 및 컬럼(40a) 중에서 농축시킨 후, 샘플은 추출용 분리컬럼(16)에 제공되고, 여기에서 컬럼(16)은 전형적으로 마이크로-컬럼일 수 있으며, 1.0mm의 내부직경 및 250mm의 길이를 갖는다. 저어도 하나가 주된 분리 칼럼보다 큰 직경을 갖는 다수의 농축 칼럼을 사용하는 구성은, 칼럼(16)을 위해 마이크로 칼럼 또는 세미마이크로 칼럼을 사용하는 액체 크로마토그래프에 특히 유리하다.
조작시에, 밸브(10A)는 제 33A도에 나타낸 상태로 고정되고, 샘플은 오토 샘플러(14)에 의해 예비컬럼(40)내로 주입된다. 이에 의해, 펌프(25)는, 용매(A)에 대해 0.5 내지 1.0㎖/분의 유속이 얻어지고, 단백질 또는 다른 원하지 않는 성분이 예비컬럼(40)을 통해 포착됨이 없이 통과하도록 구동된다. 제 33A도의 상태에서, 용매(B)는 분석하려는 표적 물질 없이, 컬럼(40a) 및 추가로 컬럼(16)에 공급된다.
표적 물질이 제 33A도의 상태에서 예비컬럼(40)으로부터 용리를 시작할 때, 6-포트 밸브(10A)는 제 33B도의 상태로 전환되며, 여기에서 예비컬럼(40)에서 농축된 샘플이 용리되고 용매 A에 의해 컬럼(40a)으로 이동한다. 다시 언급하면, 원하지 않는 성분은 컬럼(40a)을 통해 통과하고, 컬럼(40a)에서 표적 물질의 농축이 일어난다. 제 33B도의 상태에서, 용매(B)는 분리 컬럼(16)을 통해 농축됨이 없이 흐른다.
추가로, 밸브(10A)는 제 33A도의 상태로 다시 전환되며, 여기에서 컬럼(40a)에서 농축된 물질은 컬럼(16)을 통한 이행을 시작한다.
제 33A도의 상태로부터 제 33B도로의 밸브(10A)의 전환 조작에 있어서, 펌프 (25)의 유속을 변화시켜서 컬럼(40a)에서의 과도한 압력 증가를 방지할 필요가 있었다. 컬럼(40a)에 대해 1.0 내지 4.0mm의 내부 직경 및 50mm미만의 길이를 갖는 컬럼을 사용하는 본 구체예에서는, 0.1 내지 0.5㎖/분 정도로 비교적 높은 수준으로 유속을 유지시키는 것이 가능하다. 이에 의해, 펌프(25)의 이러한 감소된 유속에 의해 야기되는 분석의 지속시간의 원하지 않는 증가가 성공적으로 제거되고, 크로마토그래프의 감소된 조작 시간으로 원하는 분석이 수행될 수 있다.
제 33A도 및 제 33B도의 시스템에서, 유속은 마이크로 또는 세미 마이크로 컬럼에 상응하는 수준으로 설정된다. 이러한 유속의 대표적 예는 분리 컬럼(16)의 컬럼 직경의 함수로서 하기의 표 II에 기재되어 있다.
표 II
제 32도의 시스템을 사용함으로써, 컬럼(40) 및 컬럼(40a)의 사용에 의해 샘플을 농축시킴에 의해, 과다한 분석 시간없이 마이크로 또는 세미마이크로 컬럼의 사용으로 대용량의 크로마토그래피가 수행될 수 있다. 제 32도 및 33도와 관련하여 설명되는 본 발명의 구성에 따르면, 측정을 위해 필요한 시간이 상당히 감소한다. 0.5㎖/분의 용매 유속으로 농축컬럼(40)내로의 샘플의 1분 주입이 농축 컬럼(40)으로 0.5㎖ 샘플 용액을 공급함을 주목해야 할 것이다. 농축 컬럼(40a)이 2.0mm의 내부 직경 및 35mm의 길이를 가질 경우, 0.25㎖/분의 용매 유속으로 0.5㎖ 샘플 용액의 공급이 약 2분내에 샘플 농축을 완결시킨다. 컬럼(40a)의 사부피가 0.06㎖ 정도이기 때문에, 1mm의 내부 직경을 갖는 컬럼이 컬럼(16)에 대해 사용될 경우에, 컬럼(16)으로의 추가의 샘플 용액의 공급이 약 1분내에 완결된다.
상기 결과는, 컬럼(16)에서 샘플 용액을 분리시키기 위해 훨씬 더 긴 시간을 필요로 하는 제 25도의 2개의 컬럼 시스템보다 상당히 개선된 것이다. 컬럼(16)에 대해 1mm의 내부 직경을 갖는 컬럼이 0.5㎖/분의 똑같은 유속 조건하에, 2.0mm의 내부 직경 및 35mm의 길이를 갖는 컬럼(40)과 조합하여 사용되는 경우, 컬럼(16)에서의 유속의 돌연한 감소로 인해 컬럼(16)에서의 샘플의 분리를 완결시키기 위해 약 10분을 갖는 것이 필요하다. 다른 한편으로는 0.8mm의 내부 직경을 갖는 컬럼이 사용되는 경우, 25분간의 훨씬 더 긴 시간이 필요하다. 다시 말하면, 통상적인 2개의 컬럼 시스템과 비교하여, 본 구체예의 구성을 사용함으로써, 20분간의 시간의 감소가 가능해진다.
더욱더, 컬럼(16)내로 유동하는 샘플 용액의 부피가 컬럼(40)의 사부피에 상응하여 최소가 되게 된다. 이에 의해, 샘플을 분리시키기 위한 분리컬럼(16)의 조작이 상당히 안정된다.
각각의 용매를 펌핑시키기 위한 2개의 펌프(25, 26)와 함께 3개의 컬럼 및 2개의 용매를 사용하는 본 구체예에서는, 펌프(25)에 의해 컬럼(16)으로 용매(25a)를 공급하는 것이 가능해지며, 동시에 농축 컬럼(40)에서 샘플의 농축이 진행된다. 이와 같이하여, 컬럼(40)내에서의 농축 과정의 완결시에 6-포트 밸브가 전환되는 경우, 분리 컬럼(16)의 상태를 빠르게 안정화시킬 수 있다. 이에 의해, 검출기(17)의 출력 파형에서 일정치 않을 검출 피크의 문제점이 제거되며, 분석의 재현성 뿐만 아니라 신뢰성에 대해 상당한 개선이 달성된다.
더욱더, 본 구체예의 액체 크로마토그래프가 컬럼(40)과 칼럼(16) 사이의 직접 연통을 생략한다는 것이 주목된다. 컬럼(40)은 액체 크로마토그래피 분석의 어떤 순간에도 10MPa를 초과하는 고압을 결코 받지 않는다. 농축 컬럼에서의 증가된 압력이 분석의 감소된 정밀도를 유도함을 알아야 한다. 본 구체에에서는, 이러한 분석의 질 저하가 일어나지 않는다.
제 34도는 안티필레프틱(antipileptic)에 대해 사용되는 카르바마비핀 (Carbamabipine)의 분석의 결과를 도시한 것이다.
분석은 하기 구성의 칼럼에 기초하여 수행되었다:
컬럼(40)
컬럼 : 내부직경 = 40mm
길이 = 10mm
캡슐 팩(capsulel pack) = MF 카트리지 컬럼
이동상 : 0.1 M 인산염 완충액 ;
컬럼(40a)
컬럼 : 내부 직경 = 2.0mm
길이 = 35mm
캡셀 파크(capcell pak: 등록상표) = 페닐
이동상 : 0.1M 인산염 완충액 및 아세토니트닐 (비 : 85:15) ;
컬럼 16
칼럼: 내부 직경 = 1.5mm
길이 ; 250mm
캡셀 파크 = 페닐
이동상 : 85:15의 비율을 갖는, 0.1M 인산염 완충액 및 아세토니트닐 분석은 하기의 단계들에 따라 수행되었다:
(1) 분석을 시작한 시간으로부터 1.8분 동안 0.5㎖/분의 펌프(25)의 유속 및 동시에 0.1㎖의 펌프(26)의 유속을 유지하면서 제 33도에 도시된 A-위치에서 제 32도의 밸브(10A)를 유지시키는 단계 :
(2) 단계(1)후에, 분석시작으로부터 12분이 경과될 때까지, 0.25㎖/분의 펌프(25) 유속 및 동시에 0.1㎖/분의 펌프(26) 유속으로 제 33도의 B-위치에 도 32의 밸브(10A)를 유지시키는 단계 ; 그리고
(3) 단계(2) 후, 0.5㎖/분의 펌프(25) 유속 및 동시에 0.1㎖/분의 펌프(26) 유속을 유지하면서, 제 33A도의 A-위치에 제 32도의 밸브(10A)를 유지시키는 단계.
분석에 있어, 검출은 254nm의 파장을 갖는 자외선 흡수를 검출하는 검출기 (17)에 의해 이루어진다. 분리는 40℃에서 100㎕의 주입된 샘플의 양에 대해 이루어졌다.
제 34도는 검출기(17)에 의해 얻은 분석결과를 나타낸다. 제 34도로부터 명확히 볼 수 있듯이, 표적 화합물의 피크는 검출 시작으로부터 21.32분의 시간에 상응하여 우수한 S/N 비를 보인다.
본 발명은 3가지 컬럼을 사용하는 구조에 제한되지 않고, 4가지 이상의 컬럼을 사용하는 경우에도 또한 적용될 수 있다.
추가의 본 발명은 상기 설명한 구체예들에 제한되지 않고 본 발명의 범주를 벗어나지 않은 여러가지 변경 및 변환이 가능하다.
제 1도는 통상적인 액체 크로마토그래프의 구조를 도시한 다이아그램이다.
제 2A도 내지 제 2D도는 제 1도의 액체 크로마토그래프의 조작특성을 도시한 다이아그램이다.
제 3A도 및 3B도는 제 1도의 액체 크로마토그래프에 사용되는 6-포트 밸브의 조작을 도시한 다이아그램이다.
제 4도는 제 1도의 액체 크로마토그래프에 사용되는 6-포트 밸브의 통상적인 구조를 도시한 다이아그램이다.
제 5도는 제 4도의 액체 크로마토그래프의 일부를 확대된 크기로 도시한 다이아그램이다.
제 6도는 제 1도의 액체 크로마토그래프에 사용되는 샘플 주입튜브의 구조를 도시한 다이아그램이다.
제 7도는 샘플용액을 농축시키기 위한 농축 컬럼을 사용하는 통상적인 이중 컬럼 액체 크로마토그래프의 구조를 도시한 다이아그램이다.
제 8도는 본 발명의 제 1 구체예에 따르는 액체 크로마토그래프에 사용하기 위한 혼합기의 구조를 도시한 다이아그램이다.
제 9도는 사부피(dead volume)의 생성없이 샘플용액을 혼합시키기 위해 제 8도의 혼합기에 사용되는 다공성 매질의 구조를 도시한 다이아그램이다.
제 10도는 본 발명의 제 2 구체예에 따르는 액체 크로마토그래프에 사용하기 위한 6-포트 밸브의 구조를 분해도로 도시한 다이아그램이다.
제 11도는 정단면도로 제 10도의 6-포트 밸브를 입면 단면도로 도시한 다이아그램이다.
제 12도는 제 8도의 혼합기 및 제 10도의 6-포트 밸브를 사용하는 액체 크로마토그래프의 조작특성을 도시한 다이아그램이다.
제 13도는 본 발명의 제 3 구체예에 따르는 액체 크로마토그래프의 구조를 도시한 다이아그램이다.
제 14도는 서로 다른 상태에서 제 13도의 액체 크로마토그래프를 도시한 다이아그램이다.
제 15A도 및 제 15B도는 샘플용액을 회수하기 위해 사용되는 밸브의 상태를 도시한 다이아그램이다.
제 16도는 제 13도의 액체 크로마토그래프에 사용되는 샘플홀더를 도시한 다이아그램이다;
제 17도는 본 발명의 제 4 구체예에 따르는 액체 크로마토그래프에 사용하기 위한 밸브장치를 도시한 다이아그램이다.
제 18도는 제 17도의 밸브장치의 내부를 도시한 다이아그램이다.
제 19도는 본 발명의 제 5 구체예에 따르는 액체 크로마토그래프의 구조를 도시한 다이아그램이다.
제 20도는 서로 다른 상태에서 제 19도의 액체 크로마토그래프를 도시한 다이아그램이다.
제 21도는 제 19도의 액체 크로마토그래프에서 샘플 주입 튜브내로의 샘플 용액의 유도를 도시한 다이아그램이다.
제 22도는 샘플 주입 튜브내로 샘플용액을 유도하는 또 다른 실례를 도시한, 제 21도와 유사한 다이아그램이다.
제 23도는 제 19도의 액체 크로마토그래프에 사용되는 메카니즘의 구조를 도시한 다이아그램이다.
제 24도는 본 발명의 제 5 구체예에 따라 샘플 주입 튜브내로 샘플용액을 유도하는 방법을 도시한 흐름도이다.
제 25도는 본 발명의 제 6 구체예에 따르는 액체 크로마토그래프를 도시한 블록 다이아그램이다.
제 26도는 서로 다른 상태에서 제 25도의 크로마토그래프를 도시한 블록 다이아그램이다.
제 27A도 내지 27C도는 제 6 구체예의 액체 크로마토그래프에 사용되는 충전재료의 표면을 피복시키는 실리콘 중합체막상에 친수성 및 소수성자리를 형성시키는 방법을 도시한 다이아그램이다.
제 28A도 내지 제 28C도는 제 6 구체예의 액체 크로마토그래프에 사용되는 충전재료의 표면을 피복시키는 실리콘 중합체막상에 친수성 및 소수성 자리를 형성시키는 또 다른 방법을 도시한 다이아그램이다.
제 29A도 및 제 29B도는 제 6 구체예의 액체 크로마토그래프에 사용되는 충전재료의 표면을 피복시키는 실리콘 중합체막 상에 친수성 및 소수성 자리를 형성시키는 또 다른 방법을 도시한 다이아그램이다.
제 30A도 내지 제 30D도는 제 6 구체예의 액체 크로마토그래프에 사용되는 충전제의 표면을 피복시키는 실리콘 중합체막상에 친수성 및 소수성 자리를 형성시키는 또 다른 방법을 도시한 다이아그램이다.
제 31A도 내지 31C도는 본 발명의 제 6 구체예에서 달성되는 농도의 효과를 도시한 다이아그램이다.
제 32도는 본 발명의 제 7 구체예에 따르는 액체 크로마토그래프의 구조를 도시한 다이아그램이다.
제 33A도 및 제 33B도는 2가지 서로 다른 상태에서 제 32도의 액체 크로마토그래프를 도시한 다이아그램이다.
제 34도는 본 발명의 제 7 구체예의 액체 크로마토그래프에 의해 수행된 액체 크로마토그래프 분석의 일례를 도시한 다이아그램이다.
*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명 *
A,B : 용매 11A,11B : 펌프
12 : 조절수단 14,23 : 유로조절수단
147: 샘플홀더 14x,15,22,22a : 샘플주입수단
16 : 크로마토그래프 칼럼 17 : 검출수단
21 : 샘플홀더 메카니즘 21a : 용기
23 : 혼합 수단 232,232a: 혼합챔버
234: 다공성 매질 24 : 유로조절수단
24a,24b,247: 유로 수단 P,A,S,D,A2,C : 포트
24R : 밸브체 24R2: 밀봉부재
25,26 : 펌프 33a : 공기갭
40,40a : 예비컬럼 64,65 : 구동수단
66,68 : 제어수단

Claims (3)

  1. 용매를 펌핑시키지 위한 펌프;
    공급된 샘플 용액에 함유된 샘플을 분리하기 위한 분리 컬럼;
    분리 컬럼에 의해 분리된 샘플을 검출하기 위한 검출 수단;
    용매중에 샘플을 함유하는 샘플 용액을 생성시키기 위해 샘플을 펌프로부터 공급된 용매에 주입시키기 위한 샘플 주입 수단 및
    샘플 주입 수단과 분리 컬럼 사이에 제공되고, 샘플 주입 수단으로부터의 샘플 용액을 농축시켜 농축된 샘플 용액을 생성시키며, 샘플 용액으로서 농축된 샘플 용액을 분리 컬럼에 공급하는 응축 컬럼을 포함하는 액체 크로마토그래프로서,
    응축 컬럼이 200㎕ 이하의 부피 용량 가지며, R이 소수성 그룹을 나타내고, R'이 친수성 그룹을 나타내는 Si-R 결합 및 Si-R' 결합을 갖는 실리콘 중합체에 의해 피복된 다공성 매질의 컬럼 충전재로 충전됨을 특징으로 하는 액체 크로마토그래프.
  2. 제 1항에 있어서, 친수성 그룹(R')이 히드록실기를 포함함을 특징으로 하는 액체 크로마토그래프.
  3. 제 1항에 있어서, 소수성 그룹(R)이 C1내지 C18의 탄화수소 그룹을 포함함을특징으로 하는 액체 크로마토그래프.
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