JP3219296B2 - カラム充填剤及びその製造方法 - Google Patents
カラム充填剤及びその製造方法Info
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Description
造方法、特にその活性基修飾状態の改良に関する。
詰めたカラムが用いられており、血清等の各種物質の混
合試料の分離、分析には液体クロマトグラフィー、特に
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が汎用され、
また工業的にも特定成分の分離・抽出にカラム充填剤が
応用されている。ところで、血清等のタンパク質成分を
多量に含有する生体成分中の薬物や代謝物等をHPLC
を用いて定量する場合、タンパク質のカラム充填剤への
吸着による弊害を除去するため、従来は除タンパク等の
前処理を必要としていた。
時間と労力を要し、且つ分析精度を悪化させるという問
題を有している。そこで、近年これらの除タンパク操作
を行うことなく直接タンパク質成分含有試料を注入し、
この試料中に含まれる各種成分を分離することのできる
カラム充填剤が開発されている。これらの改良されたカ
ラム充填剤は、多孔性ガラスやシリカゲルを担体とし
て、その細孔内外に異なる性質を付与したものである。
ンパク質(アルブミンやグロブリン)は巨大分子なので
細孔内に入らず、且つ親水性の外表面(孔外面)に吸着
されることなくカラムを素通りし、比較的小さな薬物等
の分子は疎水性の内表面(孔内面)に吸着して分離され
ることとなる。このような充填剤の具体例としては、特
開昭60−56256号公報に記載されたものが挙げら
れる。この充填剤では、オクタデシルシリル(ODS)
基を化学結合させたシリカの外表面にタンパク質をコー
トしている。このコート用タンパク質はウシ血清アルブ
ミンあるいは家兎血漿タンパク質よりなり、該タンパク
質をODS結合シリカに吸着、変性させることにより充
填剤を得ている。
パク質をコートしたODSシリカ充填剤では、使用が長
期にわたると吸着・変性したタンパク質が溶離を起こす
ことがあり、また高分離効率のカラムが得られない等、
耐久性や分離能の点で課題を残している。このような点
を改良するため、特開昭61−65159号公報及び特
開平1−123145号公報に記載されたように、 多孔質担体の内表面及び外表面に疎水性基を導入す
る。 それ自身が巨大分子であり、シリカ等の細孔内に侵入
できない酵素を用いて外表面の疎水性基だけを切断す
る。 その後、外表面に親水性基を導入する。 ことにより、カラム充填剤を得る方法も開発されてい
る。
記載の方法では、グリセリルプロピル基を導入した多孔
性シリカを出発原料とし、これにカルボニルジイミダゾ
ールを介してオリゴペプチド(グリシル−フェニルアラ
ニル−フェニルアラニン等)を結合させ、タンパク質加
水分解酵素であるカルボキシペプチダーゼAを用いて加
水分解を行うことにより外表面のフェニルアラニン側鎖
を切断している。その結果、充填剤の内表面には疎水性
リガンドとしてグリシル−フェニルアラニル−フェニル
アラニンが残り、外表面は親水性のグリシル−グリセリ
ルプロピル基となる。
の方法は、アミノプロピル基を導入した多孔性シリカを
出発原料として、トリエチルアミン存在下、オクタノイ
ルクロリドを反応させ、アミド結合を介して疎水性基を
導入し、次にポリミキシン・アシラーゼにより外表面の
アシル基を加水分解し、外表面のアミノ基をグリシドー
ルとの反応を行うことにより親水性とする方法である。
−65159号公報あるいは特開平1−123145号
公報に記載された方法では、酵素反応を利用しているた
め、工程が複雑化するとともに得られた充填剤の特性に
バラツキが生じやすいものであった。また、これらの充
填剤は溶離液のpHが狭い範囲に限定されたり、安定し
た信頼性の高い測定結果を得るのが困難である等の課題
もあった。本発明は前記従来技術の課題に鑑みてなされ
たものであり、その目的は製造が容易でしかも分離能の
高いカラム用充填剤及びその製造方法を提供することに
ある。
に本発明者が鋭意検討した結果、多孔性担体の表面を疎
水性基及び水酸基を有する親水性基で修飾することによ
りタンパク含有試料等の分離能が極めて高いカラム充填
剤が得られることを見出し、本発明を完成するに到っ
た。すなわち本出願の請求項1記載のカラム充填剤は、
Si−R(Rは疎水性基)結合、及びSi−R’(R’
は水酸基を有する親水性基)結合を有するシリコーンポ
リマーで被覆された多孔性担体よりなることを特徴とす
る。
素数1〜18の炭化水素残基であることを特徴とする。
請求項3に記載のカラム充填剤の製造方法は、多孔性担
体をシリコーンポリマーで被覆する被覆工程と、前記被
覆シリコンポリマーの一部の−SiH残基に、二重結合
を有する炭化水素基Rを結合させ、−Si−R基とする
疎水性化工程と、前記被覆シリコンポリマー−SiH残
基の残部の少なくとも一部に、二重結合および水酸基を
有する親水性基R’を結合させ、−Si−R’基とする
親水性化工程と、を含むことを特徴とする。
は、多孔性担体をシリコーンポリマーで被覆する被覆工
程と、前記被覆シリコンポリマーの一部の−SiH残基
に、二重結合および水酸基を有する親水性基R’を結合
させ、−Si−R’基とする親水性化工程と、前記被覆
シリコンポリマー−SiH残基の残部の少なくとも一部
に、二重結合を有する炭化水素基Rを結合させ、−Si
−R基とする疎水性化工程と、を含むことを特徴とす
る。
は、多孔性担体をシリコーンポリマーで被覆する被覆工
程と、前記被覆シリコンポリマーの一部の−SiH残基
に、二重結合を有する炭化水素基Rと、二重結合および
水酸基を有する親水性基R’を修飾し、−Si−R基お
よび−Si−R’基を形成する修飾工程と、を含むこと
を特徴とする。
は、多孔性担体をシリコーンポリマーで被覆する被覆工
程と、前記被覆シリコンポリマーの一部の−SiH残基
に、二重結合を有する炭化水素基Rを結合させ、−Si
−R基とする疎水性化工程と、前記被覆シリコンポリマ
ー−SiH残基の残部の少なくとも一部に、二重結合を
有し他端にエポキシ基を有する中間基を結合させる中間
基修飾工程と、前記中間基のエポキシ基に、グリセリン
基を反応させ、−Si−R’基とする親水性化工程と、
を含むことを特徴とする。以下、本発明の構成を詳細に
説明する。
液体クロマトグラフィー用の担体として一般に使用され
ている任意の粉体であるシリカゲル、アルミナ、ガラス
ビーズ(例えばポーラスガラス)、ゼオライト、ヒドロ
キシアパタイト又はグラファイト等を使用することがで
きる。また、複合粉体、例えばポリアミド、アクリル樹
脂、又はポリビニルアルコール等の合成樹脂の表面に、
微細な無機粉体、例えばシリカゲル、二酸化チタン又は
ヒドロキシアパタイトを被覆処理した粉体も使用するこ
とができる。
μmで、比表面積200〜800m2/g、40〜120
Åの細孔を有するものが好適である。特に好適な多孔性
担体としては、60〜80Åの細孔を持ち、比表面積が
400〜600m2/gで粒径3〜50μmの球形あるい
は破砕型のシリカゲルである。
ン化合物は、下記一般式化1
るか又はハロゲン原子の少なくとも1個で置換されてい
ることのある炭素数1〜10の炭化水素基であるが、R
1,R2,R3が同時に水素原子であることはない。ま
た、R4,R5,R6は相互に独立に水素原子であるか又
はハロゲン原子に少なくとも一個で置換されていること
のある炭素数1〜10の炭化水素基である。aは0又は
1以上の整数であり、bは0又は1以上の整数であり、
cは0又は2であるが、但しcが0である場合にはaと
bとの和が3以上の整数であるものとする)の少なくと
も一種である。
らなる。第1の群は、前記化1においてc=0の場合に
相当し、下記一般式化2
あるが、好ましくはR1、R2及びR3が相互に独立にハ
ロゲン原子に少なくとも一個で置換されていることのあ
る炭素数1〜10の炭化水素基であり、aとbとの和が
3以上である)で表わされた環状シリコーン化合物であ
る。
である。
独で又はそれらの混合物の形で使用することができる。
上記化3及び化4の各式において、n(又はa+b)は
好ましくは3〜7である。nの値が小さくなるのにした
がってその沸点が低下するので、蒸発して担体上に吸着
する量が多くなる。特に3量体及び4量体は、その立体
性質上、重合しやすいので特に適している。
例としては、ジハイドロジェンヘキサメチルシクロテト
ラシロキサン、トリハイドロジェンペンタメチルシクロ
テトラシロキサン、テトラハイドロジェンテトラメチル
シクロテトラシロキサン、ジハイドロジェンオクタメチ
ルシクロペンタシロキサン、トリハイドロジェンヘプタ
メチルシクロペンタシロキサン、テトラハイドロジェン
ヘキサメチルシクロペンタシロキサン、及びペンタハイ
ドロジェンペンタメチルシクロペンタシロキサン等を挙
げることができる。
は、前記式化1においてc=2の場合に相当し、下記一
般式化5
記と同じ意味であり、cは2であるが、好ましくはR1
〜R6が相互に独立にハロゲン原子の少なくとも1個で
置換されていることのある炭素数1〜10の炭化水素基
である)で表わされる直鎖状シリコーン化合物である。
この化合物の代表例としては、下記一般式化6
体例としては、1,1,1,2,3,4,4,4-オクタメチルテトラシ
ロキサン、1,1,1,2,3,4,5,5,5-ノナメチルペンタシロキ
サン、及び1,1,1,2,3,4,5,6,6,6-デカメチルヘキサシロ
キサン等を挙げることができる。前記一般式化1で表わ
されるシリコーン化合物は、気相状態又は液相状態で前
記多孔性担体と接触させる。
密閉容器を用い、120℃以下好ましくは100℃以下
の温度下で、好ましくは200mmHg以下さらに好ましく
は100mmHg以下の圧力下において、前記シリコーン化
合物の蒸気を分子状態で担体表面上に接触させる方法、
120℃以下好ましくは100℃以下の温度下で前記シ
リコーン化合物とキャリアーガスとの混合ガスを担体と
接触させる方法等により行うことができる。この気相処
理に適したシリコーン化合物としては、例えばテトラヒ
ドロテトラエチルシクロテトラシロキサン、テトラヒド
ロテトラメチルシクロテトラシロキサンを挙げることが
できる。
例えば前記シリコーン化合物を溶解することができる揮
発性溶媒であるベンゼン、ジクロロメタン、又はクロロ
ホルム等、特にはヘキサンに溶解した1〜50重量%シ
リコーン化合物溶液を担体1重量部に対してシリコーン
化合物0.01〜1重量部になるように担体に添加すれ
ば良い。この場合、攪拌下に添加することが好ましい。
担体表面上でのシリコーン化合物の表面重合は前記接触
処理後の担体を温度50〜200℃で2時間以上放置あ
るいは攪拌することによって行うことができる。
作用により促進されるので、特に触媒を加える必要はな
い。ここで、「活性点」とはシロキサン結合(Si−O
−Si)またはSi−H(ヒドロシリル)基をもつシリ
コーン化合物の重合を触媒することのできる部位であ
り、例えば酸点、塩基点、酸化点、又は還元点を意味す
る。表面重合は、担体表面の活性点がシリコーンポリマ
ーの被膜で覆われてしまうまで行われる。担体自体の活
性が非常に弱い場合には、前記接触処理前又は後の担体
にアルカリ触媒例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウム若しくは水酸
化カルシウム等、アルキル金属触媒例えばジブチル錫等
を適宜添加した後に重合させても良い。
覆の構造には2種類のものがある。すなわち、重合がシ
ロキサン結合(−Si−O−Si)の開裂及び再結合に
よって起きるシリコーンポリマーでは−Si−O−Si
−単位の鎖状構造のみを持ち、一方重合がH2O又はO2
の存在下におけるヒドロシリル結合(Si−H)同士の
架橋反応によって起きる場合には、
なる。
種類や反応条件(温度、触媒等)によって、それぞれ単
独に進行する場合と、両方の型の重合が同時に進行する
場合とがある。そして、重合の程度も様々である。以上
のように、本発明においては分子量の低いシリコーン化
合物を担体と接触させるので、シリコーン化合物が担体
の細孔内部にまで侵入して粉体の実質的全表面上に付着
又は吸着して重合し、シリコーンポリマーの極めて薄い
被膜(3Å〜30Åの被膜)が担体上に形成され、担体
の多孔性が実質的に元のまま維持される。この多孔性
は、続いて実施するビニル化合物付加等によっても実質
的に損われない。
たシリコーンポリマーの分子量(重量平均分子量)は1
5万以上である。但し、シリコーン化合物の場合、重合
により高分子化するにつれ、水や有機溶媒に溶けにくく
なってしまい、ポリマーを抽出して分子量を測定するこ
とはできず、また担体表面上にコートされている状態で
のポリマーの分子量を測定することも不可能である。
クロロホルム抽出し、ポリスチレン換算でポリマーの分
子量を求めたところ、最大15万のポリマーが存在する
ことが確認された。従って、クロロホルムに抽出されな
い状態にまで充分に重合させたポリマーの分子量は、1
5万以上であると言うことができるが、より詳しく分子
量を確認することは困難である。
は、未反応のSi−H基が残存している。このSi−H
基に、分子中にビニル基を有する炭化水素を反応させる
ことによって、Si−C結合を有するシリコーンポリマ
ーとすることができる。前記のビニル化合物としては、
例えば一般式
1〜40のアルキル基、炭素数4〜8のシクロアルキル
基若しくはシクロアルケニル基、又は炭素数1〜20の
アルキル基で置換されていることのあるアリール基であ
る)で表わされる化合物を使用することができる。
R8及びR9がともに水素原子であるエチレン、R8及び
R9の一方が水素原子であって他方が水素原子以外の置
換基であるビニル化合物例えばα−オレフィン化合物、
R8及びR9がともに水素原子以外の同じ置換基である対
称形ビニル化合物、あるいはR8及びR9が水素以外の異
なる置換基である非対称形ビニル化合物のいずれかであ
っても良い。
いてR8及びR9が相互に独立に、水素原子;炭素数4〜
20のアルキル基例えば1−ヘキシル基、1−オクチル
基、1−デシル基、1−ドデシル基、1−ヘキサデシル
基、又は1−オクタデシル基;シクロヘキシル基又はシ
クロヘキセニル基;フェニル基又はナフチル基;又は炭
素数1〜4の低級アルキル基で置換されているフェニル
基又はナフチル基であるビニル化合物である。
キシル基、ヘキサデシル基、又はフェニル基であるビニ
ル化合物を付加させると、それぞれ従来の化学結合型充
填剤のC4−タイプ、C8−タイプ、C18−タイプ又はフ
ェニルタイプに相当するものを得ることができる。前記
ビニル化合物と前記シリコーンポリマー被覆粉体との反
応は、例えば溶媒の存在下において50〜300℃、気
相あるいは液相で2時間以上接触させることにより行う
ことができる。触媒としては、白金属触媒すなわちルテ
ニウム、ロジウム、パラジウム、オスミウム、イリジウ
ム又は白金の化合物が適している。特にパラジウム化合
物及び白金化合物が良好である。
拡散反射スペクトルの測定により行える。すなわち、21
60cm-1のSi−H基の吸収は、ビニル化合物の付加によ
り吸収強度が大幅に減少し、これに変って2800cm-1〜30
00cm-1に新たにアルキル基に基づく吸収が表われる。従
って、この吸収強度の比を求めることによって反応率が
計算される。
ためには、上記のようにして得たシリコーンポリマー被
覆担体の表面のSiH基の一部を親水性に変える必要が
ある。ここで、水酸基を有する親水性基としては、次の
化10に示すテトラオール等が用いられる。
される。
れば、ポリオールが形成され、これらもまた本発明の水
酸基を有する親水性基として用い得る。
次の化12に示すポリオキシエチレンアリルエーテルを
用いることも好適である。
ルは化13に示すようにアリルアルコールにエチレンオ
キサイドを付加させることによって合成することができ
る。
を特徴とする従来の充填剤とはタイプが異なり、使用可
能なpH範囲も2〜10と極めて広く、従来の充填剤で
は用い得なかったアルカリ性溶媒でも使用でき、安定性
も非常に良い。
等の生体成分中の薬物や代謝物をHPLCを用いて定量
する場合、繁雑な前処理なしに生体成分を直接注入して
も精度よく分析が可能である。なお、本発明により得ら
れる充填剤は、完全なポリマーコート型であり、ルイス
酸を用いないため、2−エチルピリジンやN,N’−ジ
メチルアニリンのような塩基性物質も溶出可能である。
れた多孔性担体を、まず疎水性化し、その次に親水性化
する方法で製造することができる。すなわち、図1
(A)に示すように多孔性担体10の表面を、前述した
方法によりシリコーンポリマー12で被覆する。この
際、シリコーン単体の有する−SiH基は重合に用いら
れるが、そのすべてが消費されてしまうわけではない。
そして、図1(B)に示すようにそのシリコーンポリマ
ー12に残存する−SiH基と、二重結合を有する疎水
性基Rを反応させ、−SiR基14とする。なお、ここ
でシリコーンポリマー12のすべての−SiH基が−S
iR基となってしまうと、後の水酸基を有する親水性基
導入が行ない得ないので、疎水性基Rの添加量ないし反
応条件を目的に応じて定める。
リマー12の未反応−SiH基と、二重結合および水酸
基を有する親水性基R’(図中○−で示す)16を反応
させ、親水性の−SiR’基を形成する。従って、シリ
コーンポリマー12の表面は、疎水性基Rと水酸基を有
する親水性基R’により修飾されたいわゆるミックスド
ファンクション構造となり、両基の修飾割合等により特
異的な溶離特性を得ることができる。なお、疎水性化−
親水性化法は、特に保持に大きな影響を及ぼす疎水性基
の導入が容易に制御可能なため、疎水性基の導入量を調
整することにより保持の大きさを調整できる利点があ
る。
れた多孔性担体を、まず親水性化し、その次に疎水性化
する方法でも製造することができる。すなわち、図2
(A)に示すように多孔性担体10の表面を、シリコー
ンポリマー12で被覆する。そして、図2(B)に示す
ようにそのシリコーンポリマー12に残存する−SiH
基と、二重結合および水酸基を有する親水性基R’(図
中○−で示す)16を反応させ、−SiR’基16とす
る。なお、ここでシリコーンポリマー12のすべての−
SiH基が−SiR’基16となってしまうと、後の疎
水性基導入が行ない得ないので、水酸基を有する親水性
基R’の添加量ないし反応条件を目的に応じて定める。
リマー12の未反応−SiH基と、二重結合を有する疎
水性基Rを反応させ、疎水性の−SiR基14を形成す
る。この親水性化−疎水性化法は、先に親水性化を行な
うため、その親水性化率は大きく、タンパク質の吸着は
少ない。親水性化反応は、水中で行なうことが望まし
く、シリコーンポリマーで覆われたシリカゲルは撥水性
があり、反応は細孔外表面から起こっていく。従って、
細孔外表面は相対的に細孔内表面と比較してより親水性
であると考えられる。疎水性化は相対的に外より内で起
こりやすいと考えられる。
れた多孔性担体の親水性化および疎水性化を同時に行な
う方法でも製造することができる。すなわち、図3
(A)に示すように多孔性担体10の表面を、シリコー
ンポリマー12で被覆する。そして、図3(B)に示す
ようにそのシリコーンポリマー12に残存する−SiH
基と、末端に二重結合を有する疎水性基R、および末端
に二重結合を有し、水酸基を有する親水性基R’(図中
○−で示す)を反応させ、親水性の−SiR基14およ
び疎水性の−SiR’基16とする。
が一回でよいという利点がある。相対的に疎水性基(ス
チレン等)の化合物を水酸基を有する親水性基の化合物
(テトラオール、ポリオール等)よりその添加量を少な
くし、反応性の違い(疎水性基の化合物は水酸基を有す
る親水性基化合物よりかさ高くなく、反応性はより高い
と考えられる)によって目的とする充填剤を得ることが
できる。反応溶媒としてはアルコール(スチレンおよび
テトラオール等を同時に混合することも可能)が望まし
い。
れた多孔性担体を、まず疎水性化し、その次にエポキシ
基を有するエポキシ化合物を導入し、該末端エポキシ基
に水酸基を有する親水性基を結合させて親水性化する方
法で製造することができる。すなわち、図4(A)に示
すように、多孔性担体10の表面を、前述した方法によ
りシリコーンポリマー12で被覆する。
コーンポリマー12に残存する−SiH基と、二重結合
を有する疎水性基Rを反応させ、−SiR基14とす
る。なお、ここでシリコーンポリマー12のすべての−
SiH基が−SiR基となってしまうと、後の親水性基
導入が行ない得ないので、疎水性基Rの添加量ないし反
応条件を目的に応じて定める。
リマー12の未反応−SiH基と、二重結合及びエポキ
シ基を有するエポキシ化合物18を反応させる。このた
め、エポキシ化合物は二重結合端でシリコーンポリマー
と結合し、エポキシ基を有する状態となる。次に図4
(D)に示すように水酸基を有する親水性基(図中○で
示す)20を反応させ、親水性の−SiR’基16を形
成する。
は、先に疎水性基を導入した後、まずアリルグリシジル
エーテル(末端に二重結合、もう一つの末端にエポキシ
基)のようなテトラオールよりかさ高くない基を導入
し、さらにグリセリンやジグリセリンを反応させること
により、親水性化密度を大きくすることが可能である。
このため、タンパク質の回収率が高くなる。例えば、ま
ず始めに疎水性基(フェニル基、C8、C18)を導入
し、その後アリルグリシジルエーテル(一方の末端に二
重結合をもち、好ましくは他方の末端にエポキシ基をも
つもの)を結合させ、ジグリセリン、グリセリン等の水
酸基を有する親水性基をもつものをエポキシ基に結合さ
せる。
のような末端に二重結合をもつものと、Si−H基の反
応は白金酸等を触媒として反応させる(ヒドロシリル
化)。また、エポキシ基とジグリセリン等の反応は、ル
イス酸、四級アンモニウム塩、三級アミン等が用いられ
る。なお、アリルグリシジルエーテル付加後、酸性溶液
中でエポキシ環を開環させ、ジオール型にするだけでも
よい。
説明する。なお、本発明はこれにより限定されるもので
はない。また、配合量は重量%で示す。
より製造された充填剤 製造法 約60Åの細孔を有し、平均粒径5μmの球形シリカゲ
ル粉体10gと環状シリコーン化合物(前記化1におい
て、R1=CH3、a=3〜5、b=0、c=0のもの)
2gとを、両者が連結された別々の密封容器にとり、環
状シリコーン化合物を窒素バブリングすることによって
気相状態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重合させ
た。
し、恒温槽内において105℃で1時間加熱した。冷却
後、粉体10gを200mlの三ツ口フラスコに取り、反
応溶液としてトルエン40ml、触媒として塩化白金酸の
トリ−n−ブチルアンモニウム塩1mg、スチレン(疎水
性基R)118.4mg(Si−H基のモル数に対して3
%(モル比)に相当)、p−t−ブチルカテコール(ス
チレンの重合禁止剤)10mgとを加えて油浴中におい
て120℃で5時間還流加熱した後、グラスフィルター
(G−4)を用いて濾過し、さらにトルエンおよびアセ
トンで充分洗浄し、しかる後105℃の恒温槽に入れ1
時間乾燥させた。
て塩化白金酸1mgを500mlの三ツ口フラスコにとり、
これに水100ml、およびテトラオール(水酸基を有す
る親水性基R’)10gを加えて油浴中で4時間還流加
熱した。これをグラスフィルターで濾過し、続いて水お
よびアセトンで充分洗浄し、しかる後105℃の恒温槽
に入れ1時間乾燥して本実施例にかかる液体クロマトグ
ラフィー用充填剤を得た。 溶出例1−1 実施例1にかかる充填剤1.5gをパッカーとポンプを
用い、内径4.6mm、長さ10cmのステンレススチール
製カラムに平衡スラリー法で充填し、充填カラムを作成
した。
漿(試料A)、およびラットコントロール血漿にカルバ
マゼピン(10μg/ml)を標準添加したもの(試料B)
の分離を調べた。移動相は、100mM NaH2PO4−
100mM Na2HPO4−CH3CN(42.5−4
2.5−15)を1.0ml/minで送液し、検出は285
nmで行なった。また、注入量は10μlであった。得ら
れたクロマトグラムを図5に示す。
で、ラット血漿タンパクのピークが注入後直ちに溶出し
た。図5(B)は試料Bを示すもので、ラット血漿タン
パクの後に、カルバマゼピンのピークが溶出し、血漿
成分と良好に分離している。溶出例1−2 実施例1にかかる充填剤をパッカーとポンプを用い、内
径4.6mm、長さ10cmのステンレススチール製カラム
に平衡スラリー法で充填し、充填カラムを作成した。
漿(試料A)、およびラットコントロール血漿にフェニ
トイン(40μg/ml)を標準添加したもの(試料B)の
分離状態を調べた。移動相は、100mM NaH2PO4
−100mM Na2HPO4−CH3CN(42.5−4
2.5−15)を1.0ml/minで送液し、検出は254
nmで行なった。また、注入量は10μlであった。得ら
れたクロマトグラムを図6に示す。
血漿タンパクのピークが注入後直ちに溶出した。図6
(B)は試料Bを示すもので、ラット血漿タンパクの後
に、フェニトインのピークが溶出し、血漿成分と良好
に分離している。溶出例1−3 実施例1にかかる充填剤をパッカーとポンプを用い、内
径4.6mm、長さ15cmのステンレススチール製カラム
に平衡スラリー法で充填し、充填カラムを作成した。
漿(試料A)、およびラットコントロール血漿にテオフ
ィリン(10μg/ml)およびカフェイン(10μg/ml)
を標準添加したもの(試料B)の分離状態を調べた。移
動相は、100mM NaH2PO4−100mM Na2H
PO4−CH3CN(47.5−47.5−5)を1.0
ml/minで送液し、検出は270nmで行なった。また、注
入量は10μlであった。
7(A)は試料Aを示すもので、ラット血漿タンパクの
ピークが注入後直ちに溶出した。図7(B)は試料Bを
示すもので、ラット血漿タンパクの後に、テオフィリン
およびカフェインのピークが溶出し、血漿成分と良
好に分離している。
たシリカゲルの元素分析測定を行なうことにより、Si
−H基のモル数を算出し、得られたSi−H基のモル数
に対して3%に相当するスチレンの量(モル数)を決定
している。なお、このシリコーンポリマーの被覆の反応
条件によって微妙にSi−H基の量が異なるため、添加
量は常にこの量比でいいというわけではない。ただし、
一般的には前記条件下でスチレンの添加量は100〜4
00mgの範囲である。
より、保持力の調整が可能となる。一般に添加量が増加
すると保持力も大きくなる。図8にはスチレンをモル比
で3%…(A),5%…(B),10%…(C)とした
場合の、ナフタレン(↓で示す)のクロマトグラムの変
化を示している。なお、測定条件は、カラムサイズ:内
径4.6mm×長さ100mm、温度:40℃、移動相:メ
タノール/水=50/50、流速:1.0mm/ml、検出
器:UV(254nm)である。
るまでの保持時間が、スチレンの量が多くなるにつれて
大きくなることが理解される。塩基性物質の溶出 本実施例にかかる充填剤は、親水性化ないし疎水性化処
理にルイス酸を用いないため、完全なポリマーコート型
であり、ルイス酸に起因する金属が残存していない。こ
のため、図9にも示すように2−エチルピリジンやN,
N’−ジメチルアニリンのような溶出も可能である。
より製造された充填剤(1) 製造法 約60Åの細孔を有し、平均粒径5μmの球形シリカゲ
ル粉体10gと環状シリコーン化合物(化1において、
R1=CH3、a=3〜5、b=0、c=0のもの)2g
とを、両者が連結された別々の密封容器にとり、環状シ
リコーン化合物を窒素バブリングすることによって気相
状態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重合させた。
続いて、容器からシリカゲル粉体を取り出し、恒温槽内
において105℃で1時間加熱した。
スコに取り、これに触媒として塩化白金酸0.5mg、テ
トラオール(水酸基を有する親水性基R’)5g、水4
0mlを加えて、油浴中において0.5時間還流加熱し
た後、グラスフィルター(G−4)を用いて濾過し、さ
らに水およびアセトンで充分洗浄し、しかる後105℃
の恒温槽に入れ2時間乾燥させた。
口フラスコにとり、これに触媒として塩化白金酸のトリ
−n−オクチルメチルアンモニウム塩0.5mgと1−オ
クテン(疎水性基R C8)40mlを加えて油浴中で5
時間還流加熱した。これをグラスフィルターで濾過し、
続いてクロロホルムおよびアセトンで充分洗浄し濾過し
た後、105℃の恒温槽に入れ2時間乾燥して実施例2
にかかる液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
0cmのステンレススチール製カラムに平衡スラリー法で
充填し、充填カラムを作成した。このカラムを用いてラ
ットコントロール血漿(試料A)、およびラットコント
ロール血漿にフェニトイン(40μg/ml)を標準添加し
たもの(試料B)の分離状態を調べた。移動相は、10
0mM NaH2PO4−100mM Na2HPO4−CH3
CN(42.5−42.5−15)を1.0ml/minで送
液し、検出は254nmで行なった。また、注入量は10
μlであった。
図10(A)は試料Aを示すもので、ラット血漿タンパ
クのピークが注入後直ちに溶出した。図10(B)は試
料Bを示すもので、ラット血漿タンパクの後に、フェニ
トインのピークが溶出し、血漿成分と良好に分離して
いる。溶出例2−2 実施例2で作成した充填剤を、内径4.6mm、長さ10
cmのステンレススチール製カラムに平衡スラリー法で充
填し、充填カラムを作成した。
漿(試料A)、およびラットコントロール血漿にカルバ
マゼピン(10μg/ml)を標準添加したもの(試料B)
の分離状態を調べた。移動相は、100mM NaH2P
O4−100mM Na2HPO4−CH3CN(42.5−
42.5−15)を1.0ml/minで送液し、検出は28
5nmで行なった。また、注入量は10μlであった。得
られたクロマトグラムを図11に示す。図11(A)は
試料Aを示すもので、ラット血漿タンパクのピークが注
入後直ちに溶出した。
ト血漿タンパクの後に、カルバマゼピンのピークが溶
出し、血漿成分と良好に分離している。溶出例2−3 実施例2で作製した充填剤を、内径4.6mm、長さ10
cmのステンレススチール製カラムに平衡スラリー法で充
填し、充填カラムを作成した。このカラムを用いてラッ
トコントロール血漿(試料A)、およびラットコントロ
ール血漿にフェノバルビタール(20μg/ml)を標準添
加したもの(試料B)の分離状態を調べた。移動相は、
100mM NaH2PO4−100mM Na2HPO4−C
H3CN(45−45−10)を1.0ml/minで送液
し、検出は240nmで行なった。また、注入量は10μ
lであった。
た。図12(A)は試料Aを示すもので、ラット血漿タ
ンパクのピークが注入後直ちに溶出した。図12(B)
は試料Bを示すもので、ラット血漿タンパクの後に、フ
ェノバルビタールのピークが溶出し、血漿成分と良好
に分離している。
より製造した充填剤(2) 製造法 約60Åの細孔を有し、平均粒径5μmの球形シリカゲ
ル粉体5gと環状シリコーン化合物(化1において、R
1=CH3、a=3〜5、b=0、c=0のもの)2gと
を、両者が連結された別々の密封容器にとり、環状シリ
コーン化合物を窒素バブリングすることによって気相状
態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重合させた。
し、恒温槽内において105℃で1時間加熱した。冷却
後、粉体5gを200mlの三ツ口フラスコに取り、これ
に触媒として塩化白金酸0.5mg、テトラオール5gと
水40mlとを加えて油浴中において0.5時間還流加熱
した後、グラスフィルター(G−4)を用いて濾過し、
さらに水およびアセトンで充分洗浄し、しかる後105
℃の恒温槽に入れ2時間乾燥させた。
ラスコにとり、これに触媒として塩化白金酸のトリ−n
−ブチルアンモニウム塩0.5mgとスチレン(疎水性基
Rフェニル)25mlを加えて油浴中で5時間還流加熱し
た。これをグラスフィルターで濾過し、続いてトルエ
ン、クロロホルムおよびアセトンで充分洗浄し濾過した
後、105℃の恒温槽に入れ2時間乾燥して本実施例に
かかる液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
0cmのステンレススチール製カラムに平衡スラリー法で
充填し、充填カラムを作成した。このカラムを用いてラ
ットコントロール血漿(試料A)およびラットコントロ
ール血漿にフェニトイン(40μg/ml)を標準添加した
もの(試料B)の分離状態を調べた。移動相は、100
mM NaH2PO4−100mM Na2HPO4−CH3C
N(42.5−42.5−15)を1.0ml/minで送液
し、検出は254nmで行なった。また、注入量は10μ
lであった。得られたクロマトグラムを図13に示す。
ト血漿タンパクのピークが注入後直ちに溶出した。図1
3(B)は試料Bを示すもので、ラット血漿タンパクの
後に、フェニトインのピークが溶出し、血漿成分と良
好に分離している。溶出例3−2 実施例3で作成した充填剤を、内径4.6mm、長さ10
cmのステンレススチール製カラムに平衡スラリー法で充
填し、充填カラムを作成した。
漿(試料A)およびラットコントロール血漿にカルバマ
ゼピン(10μg/ml)を標準添加したもの(試料B)の
分離状態を調べた。移動相は、100mM NaH2PO4
−100mM Na2HPO4−CH3CN(42.5−4
2.5−15)を1.0ml/minで送液し、検出は285
nmで行なった。また、注入量は10μlであった。得ら
れたクロマトグラムを図14に示す。図14(A)は試
料Aを示すもので、ラット血漿タンパクのピークが注入
後直ちに溶出した。図14(B)は試料Bを示すもの
で、ラット血漿タンパクの後に、カルバマゼピンのピ
ークが溶出し、血漿成分と良好に分離している。
より製造した充填剤(3) 製造法 約60Åの細孔を有し、平均粒径5μmの球形シリカゲ
ル粉体10gと環状シリコーン化合物(化1において、
R1=CH3、a=3〜5、b=0、c=0のもの)2g
とを、両者が連結された別々の密封容器にとり、環状シ
リコーン化合物を窒素バブリングすることによって気相
状態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重合させた。
続いて、容器からシリカゲル粉体を取り出し、恒温槽内
において105℃で1時間加熱した。
スコに取り、これに触媒として塩化白金酸0.5mg、テ
トラオール(水酸基を有する親水性基R’)5g、水4
0mlを加えて油浴中において6時間還流加熱した後、
グラスフィルター(G−4)を用いて濾過し、さらに水
およびエタノールで充分洗浄し、しかる後105℃の恒
温槽に入れ2時間乾燥させた。
口フラスコにとり、これに触媒として塩化白金酸のトリ
−n−オクチルメチルアンモニウム塩0.5mgと1−オ
クタデセン(疎水性基R C18)30mlを加えて油浴中
で5時間還流加熱した。これをグラスフィルターで濾過
し、続いてクロロホルム、メタノールおよび水で充分洗
浄し濾過した後、105℃の恒温槽に入れ2時間乾燥し
て実施例4にかかる液体クロマトグラフィー用充填剤を
得た。
0cmのステンレススチール製カラムに平衡スラリー法で
充填し、充填カラムを作成した。このカラムを用いてラ
ットコントロール血漿(試料A)およびラットコントロ
ール血漿にフェノバルビタール(20μg/ml)を標準添
加したもの(試料B)の分離状態を調べた。移動相は、
100mM NaH2PO4−100mM Na2HPO4−C
H3CN(45−45−10)を1.0ml/minで送液
し、検出は240nmで行なった。また、注入量は10μ
lであった。得られたクロマトグラムを図15に示し
た。
ト血漿タンパクのピークが注入後直ちに溶出した。図1
5(B)は試料Bを示すもので、ラット血漿タンパクの
後に、フェノバルビタールのピークが溶出し、血漿成
分と良好に分離している。溶出例4−2 実施例4で作成した充填剤を、内径4.6mm、長さ10
cmのステンレススチール製カラムに平衡スラリー法で充
填し、充填カラムを作成した。
漿(試料A)およびラットコントロール血漿にカルバマ
ゼピン(10μg/ml)を標準添加したもの(試料B)の
分離を調べた。移動相は、100mM NaH2PO4−1
00mM Na2HPO4−CH 3CN(42.5−42.
5−15)を1.0ml/minで送液し、検出は285nmで
行なった。また、注入量は10μlであった。
図16(A)は試料Aを示すもので、ラット血漿タンパ
クのピークが注入後直ちに溶出した。図16(B)は試
料Bを示すもので、ラット血漿タンパクの後に、カルバ
マゼピンのピークが溶出し、血漿成分と良好に分離し
ている。
製造した充填剤 製造法 約60Åの細孔を有し、平均粒径5μmの球形シリカゲ
ル粉体10gと環状シリコーン化合物(化1において、
R1=CH3、a=3〜5、b=0、c=0のもの)2g
とを、両者が連結された別々の密封容器にとり、環状シ
リコーン化合物を窒素バブリングすることによって気相
状態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重合させた。
し、恒温槽内において105℃で1時間加熱した。冷却
後、粉体3gを200mlの三ツ口フラスコに取り、これ
に触媒として塩化白金酸0.5mg、テトラオール(水酸
基を有する親水性基R’)1.638g、スチレン(疎
水性基R フェニル)0.1219g、p−t−ブチル
カテコール1mgおよびジメチルホルムアミド40mlを加
えて油浴中において120℃で5時間還流加熱した後、
グラスフィルター(G−4)を用いて濾過し、さらにア
セトンおよび水で充分洗浄し、しかる後105℃の恒温
槽に入れ2時間乾燥させた。
で被覆したシリカゲルにおける、シリコーンポリマーの
Si−H基の総モル数を10としたとき、テトラオー
ル:スチレンのモル比が10:2となる場合の添加量で
ある。なお、ここでは、Si−H基のモル数から換算
し、その添加量を決定しているが、この添加量は任意に
かえることができる。また、疎水性基の添加量をSi−
H基の総モル数より少なくし、テトラオールの添加量は
過剰量を加えても問題はない。すなわち、テトラオール
の量をスチレン(1−オクタデセン,1−オクテン等)
より過剰に加えることができる。
が、−SiH基とテトラオールとの反応性と比較して極
めて大きいためである。なお、反応溶媒はエタノール、
メタノール、イソプロパノール等のアルコールあるいは
水−アルコール系が好ましいと考えられる。溶出例5−1 上記実施例5で作成した充填剤を内径4.6mm、長さ1
0cmのステンレススチール製カラムに平衡スラリー法で
充填し、充填カラムを作成した。
漿(試料A)、およびラットコントロール血漿にフェニ
トイン(40μg/ml)を標準添加したもの(試料B)の
分離を調べた。移動相は、100mM NaH2PO4−1
00mM Na2HPO4−CH 3CN(42.5−42.
5−15)を1.0ml/minで送液し、検出は254nmで
行なった。また、注入量は10μlであった。得られた
クロマトグラムを図17に示した。
ト血漿タンパクのピークが注入後直ちに溶出した。図1
7(B)は試料Bを示すもので、ラット血漿タンパクの
後に、フェニトインのピークが溶出し、血漿成分と良
好に分離している。溶出例5−2 実施例5で作成した充填剤を、内径4.6mm、長さ10
cmのステンレススチール製カラムに平衡スラリー法で充
填し、充填カラムを作成した。
漿(試料A)、およびラットコントロール血漿にカルバ
マゼピン(10μg/ml)を標準添加したもの(試料B)
の分離を調べた。移動相は、100mM NaH2PO4−
100mM Na2HPO4−CH3CN(42.5−4
2.5−15)を1.0ml/minで送液し、検出は285
nmで行なった。また、注入量は10μlであった。得ら
れたクロマトグラムを図18に示す。図18(A)は試
料Aを示すもので、ラット血漿タンパクのピークが注入
後直ちに溶出した。図18(B)は試料Bを示すもの
で、ラット血漿タンパクの後に、カルバマゼピンのピ
ークが溶出し、血漿成分と良好に分離している。
化法 製造法 約60Åの細孔を有し、平均粒径5μmの球形シリカゲ
ル粉体10gと環状シリコーン化合物(化1において、
R1=CH3、a=3〜5、b=0、c=0のもの)2g
とを、両者が連結された別々の密封容器にとり、環状シ
リコーン化合物を窒素バブリングすることによって気相
状態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重合させた。
続いて、容器からシリカゲル粉体を取り出し、恒温槽内
において105℃で1時間加熱した。
スコに取り、これに触媒として塩化白金酸のトリ−n−
ブチルアミン塩0.5mg、スチレン(疎水性基R フェ
ニル)0.1579g、トルエン40mlおよびp−t−
ブチルカテコール10mgを加えて油浴中において120
℃で5時間還流加熱した後、グラスフィルター(G−
4)を用いて濾過し、さらにトルエンおよびアセトンで
充分洗浄し、しかる後105℃の恒温槽に入れ2時間乾
燥させた。次いで、乾燥粉体と、触媒として塩化白金酸
0.5mgとを200mlを三ツ口フラスコにとり、イソプ
ロピルアルコール30mlおよびアリルグリシジルエーテ
ル(中間基)15gを加えて油浴中で5時間還流加熱し
た。これをグラスフィルターで濾過し、続いてイソプロ
ピルアルコールおよびアセトンで充分洗浄した後、濾過
し105℃の恒温槽に入れ1時間乾燥させた。
口フラスコにとり、これに触媒としてリン酸二水素アン
モニウム0.2gと水40mlおよびジグリセリン4gを
加えて油浴中で5時間還流加熱した。これをグラスフィ
ルターで濾過し、水およびアセトンで充分洗浄した後、
濾過し、105℃の恒温槽に入れ1時間乾燥させて実施
例6にかかる充填剤を得た。溶出例6−1 上記実施例6で作成した充填剤を内径4.6mm、長さ1
0cmのステンレススチール製カラムに平衡スラリー法で
充填し、充填カラムを作成した。
漿(試料A)、およびラットコントロール血漿にフェノ
バルビタール(20μg/ml)を標準添加したもの(試料
B)の分離状態を調べた。移動相は、100mM NaH
2PO4−100mM Na2HPO4−CH3CN(45−
45−10)を1.0ml/minで送液し、検出は240nm
で行なった。また、注入量は10μlであった。得られ
たクロマトグラムを図19に示す。図19(A)は試料
Aを示すもので、ラット血漿タンパクのピークが注入後
直ちに溶出した。図19(B)は試料Bを示すもので、
ラット血漿タンパクの後に、フェニトインのピークが
溶出し、血漿成分と良好に分離している。
より製造された充填剤 製造法 約80Åの細孔を有し、平均粒径5μmの球形シリカゲ
ル粉体10gと環状シリコーン化合物(前記化1におい
て、R1=CH3、a=3〜5、b=0、c=0のもの)
2gとを、両者が連結された別々の密封容器にとり、環
状シリコーン化合物を窒素バブリングすることによって
気相状態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重合させ
た。続いて、容器からシリカゲル粉体を取り出し、恒温
槽内において105℃で1時間加熱した。
ラスコに取り、反応溶液としてトルエン40ml、触媒と
して塩化白金酸のトリ−n−ブチルアンモニウム塩1m
g、スチレン(疎水性基R)197.3mg(Si−H基
のモル数に対して5%(モル比)に相当)、p−t−ブ
チルカテコール(スチレンの重合禁止剤)10mgとを
加えて油浴中において120℃で5時間還流加熱した
後、グラスフィルター(G−4)を用いて濾過し、さら
にトルエンおよびアセトンで充分洗浄し、しかる後10
5℃の恒温槽に入れ1時間乾燥させた。
て塩化白金酸1mgを500mlの三ツ口フラスコにとり、
これに水100ml、およびテトラオール(水酸基を有す
る親水性基R’)10gを加えて油浴中で4時間還流加
熱した。これをグラスフィルターで濾過し、続いて水お
よびアセトンで充分洗浄し、しかる後105℃の恒温槽
に入れ1時間乾燥して本実施例にかかる液体クロマトグ
ラフィー用充填剤を得た。 溶出例7−1 実施例7にかかる充填剤1.5gをパッカーとポンプを
用い、内径4.6mm、長さ10cmのステンレススチール
製カラムに平衡スラリー法で充填し、充填カラムを作成
した。
清にカルバマゼピン(10μg/ml)を標準添加したもの
を試料とし試料注入を連続して行い、試験開始時と50
0回連続注入後のカルバマゼピンのk’及びピ−ク形状
について調べた。移動相は、100mM NaH2PO4−
100mM Na2HPO4−CH3CN(44−44−1
2)を1.0ml/minで送液し、検出は285nmで行なっ
た。また、注入量は10μlであった。
図20(A)は試料の試験開始時を示すもので、コウシ
血清タンパクのピークが注入後直ちに溶出し、カルバマ
ゼピンのk’は13.2であった。図20(B)は試
料注入500回目を示すもので、コウシ血清タンパクの
後に、カルバマゼピンのピークが溶出し、k’は1
3.7と試験開始時とほとんど変化なく、またピ−ク形
状も変化なく、本充填剤は非常に安定であった。
より製造された充填剤 製造法 約80Åの細孔を有し、平均粒径5μmの球形シリカゲ
ル粉体10gと環状シリコーン化合物(前記化1におい
て、R1=CH3、a=3〜5、b=0、c=0のもの)
2gとを、両者が連結された別々の密封容器にとり、環
状シリコーン化合物を窒素バブリングすることによって
気相状態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重合させ
た。続いて、容器からシリカゲル粉体を取り出し、恒温
槽内において105℃で1時間加熱した。
スコに取り、反応溶液としてトルエン40ml、触媒とし
て塩化白金酸のトリ−オクチルメチルアンモニウム塩2
mg、1−オクテン(疎水性基R)170.1mg(Si−
H基のモル数に対して10%(モル比)に相当)とを加
えて油浴中において120℃で5時間還流加熱した後、
グラスフィルター(G−4)を用いて濾過し、さらにト
ルエンおよびアセトンで充分洗浄し、しかる後105℃
の恒温槽に入れ1時間乾燥させた。
して塩化白金酸1mgを200mlの三ツ口フラスコにと
り、これに水40ml、およびポリオキシエチレンアリル
エ−テル(エチレンオキサイド16モル添加物)(水酸
基を有する親水性基R’)4gを加えて油浴中で4時間
還流加熱した。これをグラスフィルターで濾過し、続い
て水およびアセトンで充分洗浄し、しかる後105℃の
恒温槽に入れ1時間乾燥して本実施例にかかる液体クロ
マトグラフィー用充填剤を得た。 溶出例8−1 実施例8にかかる充填剤をパッカーとポンプを用い、内
径4.6mm、長さ10cmのステンレススチール製カラム
に平衡スラリー法で充填し、充填カラムを作成した。
清(試料A)、およびコウシコントロール血清にテオフ
ィリン(10μg/ml)及びカフェイン(10μg/ml)を
標準添加したもの(試料B)の分離状態を調べた。移動
相は、100mM NaH2PO4−100mM Na2HP
O4−CH3CN(47.5−47.5−5)を1.0ml
/minで送液し、検出は270nmで行なった。また、注入
量は10μlであった。 得られたクロマトグラムを図
21に示す。
シ血清タンパクのピークが注入後直ちに溶出した。図2
1(B)は試料Bを示すもので、コウシ血清タンパクの
後に、テオフィリン及びカフェインのピークが溶出
し、血清成分と良好に分離している。溶出例8−2 実施例8にかかる充填剤1.5gをパッカーとポンプを
用い、内径4.6mm、長さ10cmのステンレススチール
製カラムに平衡スラリー法で充填し、充填カラムを作成
した。
清にフェノバルビタ−ル(20μg/ml)を標準添加した
ものを試料とし試料注入を連続して行い、試験開始時と
500回連続注入後のフェノバルビタ−ルのk’及びピ
−ク形状について調べた。移動相は、100mM NaH
2PO4−100mM Na2HPO4−CH3CN(42.
5−42.5−15)を1.0ml/minで送液し、検出は
254nmで行なった。また、注入量は20μlであっ
た。
図22(A)は試料の試験開始時を示すもので、コウシ
血清タンパクのピークが注入後直ちに溶出し、フェノバ
ルビタ−ルのk,は5.85であった。図22(B)は
試料注入500回目を示すもので、コウシ血清タンパク
の後に、フェノバルビタ−ルのピークが溶出し、k,
は5.85と試験開始時と変化なく、またピ−ク形状も
ほとんど変化なく、本充填剤は非常に安定であった。
より製造された充填剤 製造法 約80Åの細孔を有し、平均粒径5μmの球形シリカゲ
ル粉体10gと環状シリコーン化合物(前記化1におい
て、R1=CH3、a=3〜5、b=0、c=0のもの)
2gとを、両者が連結された別々の密封容器にとり、環
状シリコーン化合物を窒素バブリングすることによって
気相状態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重合させ
た。続いて、容器からシリカゲル粉体を取り出し、恒温
槽内において105℃で1時間加熱した。
スコに取り、反応溶液としてトルエン20ml、触媒とし
て塩化白金酸のトリ−n−ブチルアンモニウム塩2mg、
スチレン(疎水性基R)157.9mg(Si−H基のモ
ル数に対して10%(モル比)に相当)、p−t−ブチ
ルカテコール(スチレンの重合禁止剤)1mgとを加えて
油浴中において120℃で5時間還流加熱した後、グラ
スフィルター(G−4)を用いて濾過し、さらにトルエ
ンおよびアセトンで充分洗浄し、しかる後105℃の恒
温槽に入れ1時間乾燥させた。
塩化白金酸1mgを200mlの三ツ口フラスコにとり、こ
れに水40ml、およびポリオキシエチレンアリルエ−テ
ル(水酸基を有する親水性基R’)6gを加えて油浴中
で5時間還流加熱した。これをグラスフィルターで濾過
し、続いて水およびアセトンで充分洗浄し、しかる後1
05℃の恒温槽に入れ1時間乾燥して本実施例にかかる
液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。 溶出例9−1 実施例9にかかる充填剤をパッカーとポンプを用い、内
径4.6mm、長さ10cmのステンレススチール製カラム
に平衡スラリー法で充填し、充填カラムを作成した。
清(試料A)、およびコウシコントロール血清にフェノ
バルビタ−ル(20μg/ml)、カルバマゼピン(10μ
g/ml)、フェニトイン(40μg/ml)を標準添加したも
の(試料B)の分離状態を調べた。移動相は、100mM
NaH2PO4−100mM Na2HPO4−CH3CN
(42.5−42.5−15)を1.0ml/minで送液
し、検出は254nmで行なった。また、注入量は10μ
lであった。
図23(A)は試料Aを示すもので、コウシ血清タンパ
クのピークが注入後直ちに溶出した。図23(B)は試
料Bを示すもので、コウシ血清タンパクの後に、フェノ
バルビタ−ル、カルバマゼピン及びフェニトイン
のピークが溶出し、血清成分と良好に分離している。
により製造された充填剤 製造法 約80Åの細孔を有し、平均粒径5μmの球形シリカゲ
ル粉体10gと環状シリコーン化合物(前記化1におい
て、R1=CH3、a=3〜5、b=0、c=0のもの)
2gとを、両者が連結された別々の密封容器にとり、環
状シリコーン化合物を窒素バブリングすることによって
気相状態でシリカゲル粉体表面に接触させ表面重合させ
た。続いて、容器からシリカゲル粉体を取り出し、恒温
槽内において105℃で1時間加熱した。
スコに取り、反応溶液としてトルエン20ml、触媒とし
て塩化白金酸のトリ−n−ブチルアンモニウム塩2mg、
スチレン(疎水性基R)315.8mg(Si−H基のモ
ル数に対して20%(モル比)に相当)、p−t−ブチ
ルカテコール(スチレンの重合禁止剤)1mgとを加え
て油浴中において120℃で5時間還流加熱した後、グ
ラスフィルター(G−4)を用いて濾過し、さらにトル
エンおよびアセトンで充分洗浄し、しかる後105℃の
恒温槽に入れ1時間乾燥させた。
塩化白金酸1mgを200mlの三ツ口フラスコにとり、こ
れに水40ml、およびポリオキシエチレンアリルエ−テ
ル(水酸基を有する親水性基R’)6gを加えて油浴中
で5時間還流加熱した。これをグラスフィルターで濾過
し、続いて水およびアセトンで充分洗浄し、しかる後1
05℃の恒温槽に入れ1時間乾燥して本実施例にかかる
液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。 溶出例10−1 実施例10にかかる充填剤1.5gをパッカーとポンプ
を用い、内径4.6mm、長さ10cmのステンレススチー
ル製カラムに平衡スラリー法で充填し、充填カラムを作
成した。
清(試料A)、およびコウシコントロール血清にコルチ
ゾ−ル(10μg/ml)及びコルチコステロン(10μg/
ml)を標準添加したもの(試料B)の分離を調べた。移
動相は、100mM NaH2PO4−100mM Na2H
PO4−CH3CN(42.5−42.5−15)を1.
0ml/minで送液し、検出は254nmで行なった。また、
注入量は10μlであった。得られたクロマトグラムを
図24に示す。
ので、コウシ血清タンパクのピークが注入後直ちに溶出
した。図24(B)は試料Bを示すもので、コウシ血清
タンパクの後に、コルチゾ−ル及びコルチコステロン
のピークが溶出し、血清成分と良好に分離している。溶出例10−2 実施例10にかかる充填剤をパッカーとポンプを用い、
内径4.6mm、長さ10cmのステンレススチール製カラ
ムに平衡スラリー法で充填し、充填カラムを作成した。
清にトリメトプリム(25μg/ml)を標準添加したもの
を試料とし、試料注入を連続して行い、試験開始時と3
50回連続注入後のトリメトプリムのk’及びピ−ク形
状について調べた。移動相は、100mM NaH2PO4
−100mM Na2HPO4−CH3CN(45−45−
10)を1.0ml/minで送液し、検出は254nmで行な
った。また、注入量は20μlであった。
図25(A)は試料の試験開始時を示すもので、コウシ
血清タンパクのピークが注入後直ちに溶出し、トリメト
プリムのk’は6.88であった。図25(B)は試料
注入350回目を示すもので、コウシ血清タンパクの後
に、トリメトプリムのピークが溶出し、k’は6.8
6と試験開始時とほとんど変化なく、またピ−ク形状も
変化なく、本充填剤は非常に安定であった。
ム充填剤は、シリコーン樹脂が担体を均一にコートした
樹脂カプセル型であるため、個々の粉体の持つ極性基
(例えばシリカゲルのシラノール基)の影響をほとんど
受けない。また、充填剤の外表面の一部は親水性である
ため、タンパク質等の吸着は行われず、安定でしかも分
離能に優れた充填剤を得ることができる。
明図である。
明図である。
程説明図である。
化法の工程説明図である。
態の説明図である。
状態の説明図である。
状態の説明図である。
状態の説明図である。
状態の説明図である。
状態の説明図である。
状態の説明図である。
状態の説明図である。
状態の説明図である。
離状態の説明図である。
Claims (6)
- 【請求項1】 Si−R(Rは疎水性基)結合、及びS
i−R’(R’は水酸基を有する親水性基)結合を有す
るシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなる
ことを特徴とするカラム充填剤。 - 【請求項2】 請求項1に記載のカラム充填剤におい
て、Rは炭素数1〜18の炭化水素残基であることを特
徴とするカラム充填剤。 - 【請求項3】 多孔性担体をシリコーンポリマーで被覆
する被覆工程と、 前記被覆シリコンポリマーの一部の−SiH残基に、二
重結合を有する炭化水素基Rを結合させ、−Si−R基
とする疎水性化工程と、 前記被覆シリコンポリマー−SiH残基の残部の少なく
とも一部に、二重結合および水酸基を有する親水性基
R’を結合させ、−Si−R’基とする親水性化工程
と、 を含むことを特徴とするカラム充填剤の製造方法。 - 【請求項4】 多孔性担体をシリコーンポリマーで被覆
する被覆工程と、 前記被覆シリコンポリマーの一部の−SiH残基に、二
重結合および水酸基を有する親水性基R’を結合させ、
−Si−R’基とする親水性化工程と、 前記被覆シリコンポリマー−SiH残基の残部の少なく
とも一部に、二重結合を有する炭化水素基Rを結合さ
せ、−Si−R基とする疎水性化工程と、 を含むことを特徴とするカラム充填剤の製造方法。 - 【請求項5】 多孔性担体をシリコーンポリマーで被覆
する被覆工程と、 前記被覆シリコンポリマーの一部の−SiH残基に、二
重結合を有する炭化水素基Rと、二重結合および水酸基
を有する親水性基R’を修飾し、−Si−R基および−
Si−R’基を形成する修飾工程と、 を含むことを特徴とするカラム充填剤の製造方法。 - 【請求項6】 多孔性担体をシリコーンポリマーで被覆
する被覆工程と、 前記被覆シリコンポリマーの一部の−SiH残基に、二
重結合を有する炭化水素基Rを結合させ、−Si−R基
とする疎水性化工程と、 前記被覆シリコンポリマー−SiH残基の残部の少なく
とも一部に、二重結合を有し他端にエポキシ基を有する
中間基を結合させる中間基修飾工程と、 前記中間基のエポキシ基に、グリセリン基を反応させ、
−Si−R’基とする親水性化工程と、 を含むことを特徴とするカラム充填剤の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP04788092A JP3219296B2 (ja) | 1991-02-28 | 1992-02-03 | カラム充填剤及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3-57785 | 1991-02-28 | ||
JP5778591 | 1991-02-28 | ||
JP04788092A JP3219296B2 (ja) | 1991-02-28 | 1992-02-03 | カラム充填剤及びその製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0572190A JPH0572190A (ja) | 1993-03-23 |
JP3219296B2 true JP3219296B2 (ja) | 2001-10-15 |
Family
ID=26388089
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP04788092A Expired - Lifetime JP3219296B2 (ja) | 1991-02-28 | 1992-02-03 | カラム充填剤及びその製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3219296B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP0686848A1 (en) * | 1994-05-09 | 1995-12-13 | Shiseido Company Limited | Liquid chromatograph having a micro and semi-micro column |
TW520440B (en) | 1997-03-28 | 2003-02-11 | Shiseido Co Ltd | A liquid chromatography apparatus and a packing material for the chromatographic column |
JP2000111535A (ja) * | 1998-09-30 | 2000-04-21 | Neos Co Ltd | 液体クロマトグラフィー用充填剤 |
JP3995935B2 (ja) * | 2000-02-10 | 2007-10-24 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | クロマトグラフィー用充填剤 |
-
1992
- 1992-02-03 JP JP04788092A patent/JP3219296B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
神田武利、坂本敦男及び横内未知夫、日本化学会第61春季年会講演予稿集▲I▼、61st、No.1、第615頁 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0572190A (ja) | 1993-03-23 |
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