JP2560856B2

JP2560856B2 - カラム充填剤の製造方法

Info

Publication number: JP2560856B2
Application number: JP1246855A
Authority: JP
Inventors: 淳萩中
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1989-09-21
Filing date: 1989-09-21
Publication date: 1996-12-04
Anticipated expiration: 2011-12-04
Also published as: JPH03107759A

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、カラム充填剤の製造方法に関する。さら
に詳しくは、生体試料の液体クロマトグラフィによる分
離分析や除タンパク処理に好適なカラム充填剤の製造方
法に関する。

（ロ）従来の技術従来から、クロマトグラフィ、特に高速液体クロマト
グラフィ（以下、HPLCという）が、血清などの生体試料
中の薬物の分析に汎用されている。しかし、血清などの
タンパクを多量に含む生体試料中の薬物のHPLC分析にお
いては除タンパク操作が不可欠であり、このような前処
理操作は、時間と労力を要しかつ分析精度あるいは確度
を損なうという欠点を有している。

そこで、近年、除タンパク操作を行うことなく直接血
清試料を注入し、この試料中に含まれる各種薬物を分離
・定量することが可能なクロマトグラフィ用充填剤が開
発され、利用されている。これらの充填剤は、多孔性ガ
ラスやシリカゲルを担体として、かつその細孔内外に異
なる性質を付与したものである。かかる充填剤では血清
中のタンパク質（アルブミンやグロブリン）は巨大分子
なので細孔内に入らず、かつ親水性の外表面（孔外面）
に吸着されることなくカラムを素通りし、その一方薬物
のような比較的小さな分子は疎水性の内表面（孔内面）
で吸着され、分離されることになる。

かかる充填剤の具体例としては、特開昭60−56256号
公報に記載された発明が挙げられる。この発明では、オ
クタデシルシリル（ODS）基を化学結合させたシリカ充
填剤の外表面にタンパク質をコートした充填剤が用いら
れている。この充填剤は、ウシ血清アルブミンあるいは
家兎血漿タンパクをカラムに吸着、変性させることによ
り得られる。

また、これと同様な充填剤を製造する方法として、特
開昭61−65159号公報（ピンカートンらの方法）および
特開平１−123145号公報（萩中らの方法）に記載された
ように、１）内表面および外表面に疎水性基を導入す
る、２）次いで、それ自身が巨大分子であり、細孔内に
侵入できない酵素を用いて外表面の疎水性基だけを切断
する、３）その後、外表面に親水性基を導入する方法が
ある。より具体的には前者の方法は、グリセリルプロピ
ル基を導入した多孔性シリカを出発原料とし、これにカ
ルボニルジイミダゾールを介してオリゴペプチド（グリ
シル−フェニルアラニル−フェニルアラニンなど）を結
合させ、タンパク質加水分解酵素であるカルボキシペプ
チダーゼＡを用いて加水分解を行うことにより外表面の
フェニルアラニン側鎖を切断する方法である。その結
果、内表面には疎水性リガンドとしてグルシル−フェニ
ルアラニル−フェニルアラニンが残り、外表面は親水性
のグリシル−グリセリルプロピル基となる。一方、後者
の方法は、アミノプロピル基を導入した多孔性のシリカ
を出発原料として、トリエチルアミン存在下、オクタノ
イルクロリドを反応させ、アミド結合を介して疎水性基
を導入し、次に、ポリミキシン・アシラーゼにより外表
面のアシル基を加水分解し、外表面のアミノ基をグリシ
ドールとの反応を行うことにより親水性とする方法であ
る。

（ハ）発明が解決しようとする課題しかしながら、上述した充填剤のうち、タンパク質を
コートしたODSシリカ充填剤では、使用が長期間にわた
ると吸着、変性したタンパクが溶離を起こすことがあ
り、また高分離効率のカラムが得られないなど、耐久性
や分離性の点で欠点を有している。

また、ピンカートンや萩中らの方法では、酵素反応を
利用しているため、工程が複雑化すると共に得られた充
填剤の特性にバラツキが生じ易く、かつ薬物等の小さな
分子の分離能、分離種等に限界があった。

この発明はかかる状況下なされたもであり、高い除タ
ンパク能及び薬物の分離能を有しかつ耐久性が高く、し
かも再現性良く簡便に製造することができる充填剤の製
造方法を提供しようとするものである。

（ニ）課題を解決するための手段かくしてこの発明によれば、多孔質担体の孔外面を、
無触媒下で親水性基を有すシランカップリグ剤と反応さ
せることにより該シランカップリグ残基で修飾し、次い
で孔内面を、触媒の存在下でアリール基又はキラル分解
能を呈する置換基を有するシランカップリング剤残基と
反応させることにより該シランカップリグ残基で修飾す
ることを特徴とするカラム充填剤の製造方法が提供され
る。

この発明のカラム充填剤の母体となる多孔性担体とし
ては、表面に水酸基を有する水不溶性物質が使用でき、
例えば、いわゆる多孔性シリカゲルや多孔性ガラスを用
いることができる。ただし、これ以外にも水酸基を有す
る合成樹脂で作製された多孔性ポリマーを用いることが
できる。かかる多孔性担体は通常、粒径５〜20μｍでか
つ比表面積が200〜500m²/g程度の多孔性のものが適して
いる。

この発明のカラム充填剤の製造方法は、上記多孔性担
体の内外面を、異なる置換基を有するシランカップリン
グ剤残基で修飾するものである。

ここで、孔内面は、アリール基又はキラル分割能を呈
する置換基を有するシランカップリング剤残基で修飾す
る。ここでアリール基としては、例えばフェニル基、ナ
フチル基等が挙げられ、キラル分解能を呈する置換基と
しては、例えば、シクロデキストリン含有基、分岐シク
ロデキストリン含有基、キラルアミドおよび尿素誘導体
含有基、クラウンエーテル含有基等が挙げらる。ここで
アリール基含有シランカップリング剤残基による修飾
は、疎水性の程度の差に基づいて薬物を分離する場合に
主として採用され、キラル分解能を呈するシランカップ
リング剤残基による修飾は、光学活性の薬物の各対掌体
を分離する場合に主として採用され、適宜選択される。

一方、孔外面は新水性基を有するシランカップリング
剤残基で修飾する。ここで親水性基としては、水酸基、
アミノ基、カルボキシル基等が挙げられる。この孔外面
の修飾は、主として、充填剤へのタンパク質の吸着や保
持を防止し、除タンパク処理やタンパク質分離除去処理
を円滑に行う目的で行う。

上記孔内外面の修飾は、例えば、多孔性シリカゲルあ
るいは多孔性ガラスなどの多孔性担体の表面水酸基に各
々各種置換基を有するシランカップリング剤を縮合付加
させ、必要に応じて末端置換基を変性するか他の置換基
に変換することにより行うことができる。かかるシラン
カップリング剤としては、置換トリ（低級アルコキシ）
シラン、末端置換アルキルトリ（低級アルコキシ）シラ
ン等が適しており、具体的には、置換−トリメトキシシ
ラン、置換−トリエトキシシラン、γ−置換−プロピル
トリメトキシシラン、γ−置換−プロピルトリエトキシ
シラン等が挙げられる。これらのうち、孔内面修飾用の
シランカップリング剤の一つの好ましい例としてアリー
ル基−置換トリメトキシ（又はエトキシ）シランや、３
−イソシアナートプロピルトリメトキシ（又はエトキ
シ）シランとシクロデキストリンとを反応させて得られ
るカルバミン酸シクロデキストリンエステル置換プロピ
ルトリメトキシ（又はエトキシ）シラン等が挙げられ
る。また、孔外面修飾用のシランカップリング剤の一つ
の好ましい例としえは、３−グリジドキシプロピルトリ
メトキシ（又はエトキシ）シランが挙げられる。

この発明のカラム充填剤の製造方法は、多孔性担体の
表面水酸基における孔内面と孔外面の反応性の差を利用
するものであり、これにりカラム充填剤を効率良く作製
することができる。すなわち、多孔性担体は、細孔内部
の表面（孔内面）及び細孔外部の表面（孔外面）に水酸
基を有するが、本発明者に知見によれば、孔外面におけ
る化学反応性が孔内面に比して高い。従って、この反応
性の差を利用して、まず、孔外面修飾用シランカップリ
ング剤を、孔内面との反応が実質的に無視できる緩和な
縮合反応条件下で多孔性担体に作用させて実質的に孔外
面のみに対応するシランカップリング剤残基を結合さ
せ、次いで孔内面修飾用シランカップリング剤を、孔内
面との反応が円滑に進行する強い縮合反応条件下で多孔
性担体に作用させて残存する水酸基との縮合によって孔
内面に対応するシランカップリング剤残基を結合させ、
この後、必要に応じて各シランカップリング剤残基の置
換基を変性・変換等することにより簡便に作製すること
ができる。

ここでいずれの縮合反応も、実質的に無水の非極性溶
媒（例えば、トルエン、ベンゼン、キシレン等）中に、
還流下で多孔性担体をカップリング剤と接触させて行う
ことができるが、孔外面への選択的修飾のための緩和な
縮合反応条件としては無触媒条件が選択され、孔内面へ
の修飾のための強い縮合反応条件としては縮合触媒を添
加した条件が選択される。ここで用いる縮合触媒として
は、有機塩基が適しており、例えば、N,N−ジイソプロ
ピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン等が挙
げられる。

なお、各々の縮合反応に供する多孔性担体とカップリ
ング剤の量はとくに限定されないが、通常、表面シラノ
ール量（例えば8.5μmol/m²）に対し、カップリング剤
0.5〜4.0当量程度とするのが適している。また縮合触媒
を用いる際の量としてはカップリング剤に対し、2.5当
量程度で充分である。

また、孔外面の修飾に例えば末端グリシドキシアルキ
ルトリアルコキシシランを用いた場合には、孔内面修飾
後に、末端グリシドキシ基を親水性基に変性する必要が
あり、この変性は、エポキシ環を水解してジオールに変
換することにより達成できる。ことに末端グリシドキシ
基を用いると製造途中で孔外面に結合したシランカップ
リング剤残基の活性水素の保護を行うことなく孔内面の
修飾を行うことができるため、一つの好ましい態様であ
る。

このようにして得られたこの発明のカラム充填剤は、
適当なカラム容器に充填され、液体クロマトグラフィ用
カラムや除タンパク処理用カラムとして好適に用いるこ
とができる。

（ホ）作用多孔性担体の孔内面に修飾され、アリール基又はキラ
ル分割能を呈する置換基を有するシランカップリング剤
残基は、細孔内に侵入しうる薬物等の比較的小さな種々
の分子をその疎水性の程度の差又は包接錯体あるいはジ
アステレオマー錯体の安定性の差に基づいて効率良く分
離するように作用する。一方、孔外面に修飾され、親水
性基を有するシランカップリング剤残基は、多孔性担体
にタンパク質等の巨大分子の吸着や保護を防止するよう
作用する。

そして、これらの作用が相俟って薬物等の高精度な分
離分析が長期間に亘って可能となり、血清等の生体試料
の直接分離も可能となる。

（ヘ）実施例実施例１（工程１）３−グリシドキシプロピル基を有する孔外面
の調製 Develosil 60−５（粒径５μｍ、細孔径60Å、多孔性
シリカ；野村化学社製）2gにトルエン120mlを加え、共
沸により水を除いた後、３−グリシドキシプロピルトリ
メトキシシラン3.8mlを加えた後、無触媒条件下90〜95
℃で５時間撹拌する。反応済みシリカを濾取し、60mlの
トルエンおよび60mlのメタノールで洗浄し、下記に示す
ごとき外面が３−グリシドキシプロピルエーテル化され
たシリカを得る。

（工程２）フェニル基を有する孔内面の調製工程１で得た３−グリシドキシプロピシリカ2gにトル
エル80mlを加え撹拌しておく。さらに、フェニルトリメ
トキシシラン2mlおよびN,N−ジイソプロピルエチルアミ
ン（縮合触媒）6mlを加えた後、撹拌しながら９時間還
流する。反応済みシリカを濾取し60mlのトルエンおよび
60mlのメタノールで洗浄し、下記に示すごとき孔内面が
フェニルシリルエーテル化されたシリカを得る。

（工程３）孔内面にフェニル基、孔外面にジオール基を
有するシリカの調製上記で調製した充填剤2gをpH3.0の過塩素酸水溶液80m
l中に加え、撹拌しながら４時間還流する。得られたシ
リカを水60mlおよびメタノール60mlで洗浄し、孔内面が
フェニル基含有シランカップリング剤残基、孔外面がジ
オール基含有シランカップリング剤残基で修飾されたシ
リカからなる下記に示すこの発明の充填剤を得た。

実施例２（工程１）３−グリシドキシプロピル基を有する孔外面
の調製 Chemcosorb 5SI（粒径５μm,細孔径80Å、多孔性シリ
カ；ケムコ社製）2gにトルエン80mlを加え、共沸により
水を除いた後、３−グリシドキシプロピルトリメトキシ
シラン0.8mlを加えた後、無触媒条件下90〜95℃で５時
間撹拌する。反応済みシリカを濾取し、60mlのトルエン
および60mlのメタノールで洗浄し、孔外面が３−グリシ
ドキシプロピルシリルエーテル化されたシリカを得る。

（工程２）光学分割能を呈する孔内面の調製（β−シク
ロデキストリンを孔内面に化学結合した充填剤の調製）予め、80℃に加熱したピリジン70mlに、乾燥したβ−
シクロデキストリン4.5gを加え撹拌しておく。窒素気流
下、３−イソシアナートプロピルトリエトキシシラン2.
64gを徐々に加え、約５時間（イソシアナートの2200−2
300cm^-1の赤外吸収スペクトルが消失するまで）反応す
る。この溶液に、上記（工程１）で調製したシリカ2gを
加え、撹拌しながら20時間還流する。反応済みシリカを
濾取し、ピリジン、アセトン、メタノールおよび水、各
60mlで洗浄し、下記に示す修飾シリカを得た。

（工程３）孔内面にβ−シクロデスキトリン、孔外面に
ジオール基を有する充填剤の調製上記（工程２）で調製したシリカ約2gを５％のアセト
ニトリル水溶液中に加え、24時間室温で撹拌し、孔内面
に、β−シクロデスキトリンを有するシランカップリグ
剤残基、孔外面がジオール基含有シランカップリング剤
残基で修飾された下記に示すこの発明の充填剤を得た。

実施例３実施例１で作製した充填剤を、内径4.6mm、長さ5cmの
HPLC用ステンレス管に充填した。このカラムを用いて、
ヒトコントロール血清（試料Ａ）およびヒトコントロー
ル血清にフェノバルビタール（20μg/mL）、フェニトイ
ン（40μg/mL）およびカルバマゼピン（10μg/mL）を標
準添加したもの（試料Ｂ）の分離を調べた。移動相は、
100mM NaH₂PO₄−100mM Na₂HPO₄−CH₃CN（4.5−4.5−
１）を0.6mL/minで送液し、検出は254nmで行なった。ま
た、注入量は10μＬであった。得られたクロマトグラム
を第１図に示した。第１図のＡは試料Ａを示すもので、
ヒト血清タンパクのピークが、注入後直ちに溶出した。
第１図のＢは試料Ｂを示すもので、ヒト血清タンパクの
後に、フェノバルビタール、フェニトインおよびカ
ルバマゼピンのピークが溶出し、血清成分と良好に分
離している。

実施例４実施例２で作製した充填剤を、内径4mm、長さ100mmの
HPLC用ステンレス管に充填した。このカラムを用いて、
ヒトコントロール血清（試料Ａ）およびヒトコントロー
ル血清にヘキソバルビタール（100μg/mL）を標準添加
したもの（試料Ｃ）の分離特性を調べた。移動相は、10
0mM NaH₂PO₄−100mM Na₂HPO₄−CH₃CN（2.5−2.5−１）
を0.8mL/minで送液し、検出は254nmで行なった。また、
注入量は20μＬであった。得られたクロマトグラムを第
２図に示した。第２図のＡは試料Ａを示すもので、ヒト
血清タンパクのピークが、注入後直ちに溶出した。第２
図のＣは試料Ｃを示すもので、ヒト血清タンパクの後に
ヘキソバルビタール（ｄ−体とｌ−体）のピークが溶
出し、血清成分と良好に分離している。

そして、実施例３及び４における血清タンパクの回収
率はほぼ100％であった。このことはジオール基含有シ
ランカップリング剤残基がシリカの孔外面に一様に結合
されているが、孔内面には実質的に結合していないこと
を示すものである。

実施例５実施例２で得られた充填剤を内径4.6mm、長さ30mmの
ステンレス管に充填し、血清試料の除タンパク用カラム
として用いた。ヒトコントロール血清にフェニトイン
（５μg/mL）およびカルバマゼピン（１μg/mL）を標準
添加し、50μＬを注入した。カラムスイッチングのため
の液体クロマトグラフ流路図は、第３図に示した。図
中、１は分析用移動相、２はポンプ、３は除タンパク用
カラム、４はスイッチングバルブ（バルブ切換時間点
線:0〜５分、実線:5〜８分、点線:8分〜である）、５は
分析カラム、６は検出器、７は記録計、８はインジェク
ター、９はポンプ、10は前処理用移動相を各々示すもの
である。また、図中スイッチングバルブの点線は前処理
カラムと分析カラムが切り離されている状態を、実線は
前処理カラムと分析カラムが連結されている状態を示す
ものである。

ここで前処理用移動相10として、14mM NaH₂PO₄−6mM
Na₂HPO₄を流速0.8mL/minで送液し血清試料50μＬのイン
ジェクター８から注入し、５分間前処理を行ない分析カ
ラム５で分析を行なった。分析条件は、固定相としてNu
cleosil（ヌクレオシル）5C18（ナーゲル社製）を内径
4.6mm、長さ150mmのHPLC用ステンレス管に充填したもの
を用い、分析用移動相１として14mM NaH₂PO₄＋6mM図Na₂
HPO₄−CH₃CN−CH₃OH（5.5/2.5/2）を流速0.8mL/minで送
液し、検出は230nmの吸収によって行なった。第４図に
得られたクロマトグラムを示した。図中、はフェニト
イン、はカルバマゼピンを示すものである。このよう
に、この発明の充填剤は、除タンパク用カラムとして有
効に機能していることがわかる。

（ト）発明の効果この発明の製造方法で得られるカラム充填剤は、孔外
面は十分な親水性を有し、孔内面は十分な疎水性あるい
はキラル認識能を呈するために血清などのタンパクを含
む生体試料中の薬物の分析において直接注入による薬物
の分析が可能であり、また除タンパク用カラムとしての
使用も能である。

そしてこの発明のカラム充填剤の製造方法は、酵素反
応を用いずシランカップリング剤を用いた化学反応によ
るので、簡便でかつ良好な再現性が得られる。更に得ら
れるカラム充填剤は、化学結合によって内外面に異なる
性質が付与されているため、変質等を生じず耐久性も優
れたものである。

従って、この発明のカラム充填剤の液体クロマトグラ
フィの分野における有用性は極めて大なるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第４図は、各々、この発明のカラム
充填剤を使用して生体試料を分離分析した結果を例示す
るクロマトグラム図、第３図は、実施例で使用した液体
クロマトグラフ流路図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】多孔質担体の孔外面を、無触媒下で親水性
基を有するシランカップリグ剤と反応させることにより
該シランカップリグ残基で修飾し、次いで孔内面を、触
媒の存在下でアリール基又はキラル分解能を呈する置換
基を有するシランカップリング剤残基と反応させること
により該シランカップリグ残基で修飾することを特徴と
するカラム充填剤の製造方法。