JPH03160365A - 生体液中アミン類の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は蛋白成分を含有する生体液中のアミン類の分析
方法、さらに詳しくは、逆相系の液体クロマトグラフィ
ー法により血漿、血清などに含有される生体アξン類を
、混在している蛋白威分、疎水性戒分の妨害を受けるこ
となく精度よく測定する方法に関する． 〔従来の技術〕 血清、髄液等に含まれるカテコールアくン類、ヒスタミ
ン、セロトニン等のインドールアミン類をはじめとする
生体アミン類を液体クロマトグラフィー法、特に高速液
体クロマトグラフィー法によって測定し病理学的な研究
や診断に利用することが広く行われている．これらの生
体液試料中には一般にアルブ逅ン等の蛋白戒分が含まれ
ているため、これらの蛋白戒分の影響により分析精度や
分析カラム機能が低下したり、該分析力ラムの寿命が短
くなったりする。そのため、生体アξンの測定において
は、予め過塩素酸処理などの除蛋白操作により蛋白戒分
を除いた試料を用いるのが普通である。しかし、このよ
うな方法では除蛋白操作に何段階もの操作を必要とし、
かつ長時間を要するため被測定物質の損失や分解が生じ
る。さらに、上記除蛋白操作は煩雑であるうえ被測定物
質の回収率が悪く、再現性に乏しい。

これに対して、特開昭５８−２２３０６１号公報には蛋
白成分及び非蛋白性の被測定物質を含む試料液を除蛋白
カラムに通して非蛋白質戒分のみを吸着させ蛋白或分を
通過除去した後吸着した非蛋白戒分を溶出させてこれを
分析カラムに導く方法が開示されている。この方法によ
れば、上記除蛋白操作を必要とせず試料中の被測定物質
が直接測定されるため短時間で再現性のよい測定がなさ
れる。

しかし、上記公報に開示された方法を改良し蛋白非吸着
性弱陽イオン交換樹脂を充填した除蛋白カラムを用いた
方法を採用した場合、除蛋白効果は良好であるが、血清
などの生体液試料中に疎水性の強い物質が共存している
場合、その物質は生体アξン頻と共に上記除蛋白力ラム
充填剤に吸着され、さらに溶離液により両物質とも上記
除蛋白力ラムから脱着後、分析カラムに導かれる。本発
明で言う疎水性物質とは生体中で生合威されるコレステ
ロール類、胆汁酸頻、プロゲステロン、アンド口ステロ
ン、エストロジエン等のステロイドホルモン類、ビリル
ビン等があり、また、生体外から供給される脂溶性ビタ
逅ン類や脂溶性薬物等が挙げられる。通常、被測定物質
より疎水性（親油性）が強い物質は逆相クロマトグラフ
ィー用充填剤に対して被測定物質より吸着し易い。従っ
て、被測定物質より疎水性の強い物質は被測定物質に比
較してより長い溶出時間を要する。このように、従来の
除蛋白カラム法では試料中に被測定物質より疎水性が強
い物質が共存している場合、被測定物質よりも疎水性が
強い物質も除蛋白力ラムに吸着し脱着後、分析力ラムに
導入されるため被測定物質単体を測定する場合よりも長
く測定時間を要し、さらには、被測定物質のピークと疎
水性物質のピークが重なる場合、被測定物質の定量性が
損なわれるという欠点がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は上記欠点を解決するものであり、その目的とす
るところは、生体アくン類及び蛋白質を含む生体液試料
中の該アミン類を煩雑な除蛋白操作を行うことなく、さ
らには、夾雑物の影響が少ない条件で短時間に測定する
方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の生体液中アミン類の測定法は、アミン類を含む
生体液試料を前処理移動相と共に該アミン類及び蛋白質
を吸着しない逆相クロマトグラフィー用充填剤充填の第
１除蛋白力ラムに導入し疎水性物質を吸着させると共に
該アミン類及び蛋白質を吸着させることなく該第１除蛋
白カラムを通過させる工程、ｂ．該第１除蛋白カラム通
過液を弱陽イオン交換樹脂充填の第２除蛋白力ラムに導
入し該アミン類を吸着させると共に蛋白質を吸着させる
ことなく該第２除蛋白カラムを通過させることにより蛋
白質を除去する工程、ｃ、該第２除蛋白カラムに溶離液
を供給し該第２除蛋白カラム充填剤に吸着されている該
アミン類を脱着させる工程、ｄ．脱着した該アミン類を
分析力ラムに導いてこれを分析する工程、を包含し、そ
のことにより上記目的が達威される。

本発明により測定しうる生体アミン類としてはカテコー
ルアくン類、インドールアミン類、ポリアくン類、ヒス
タミン類が挙げられる。これらは主に生体或分として血
液中や髄液中あるいは尿中に存在する物質である。

本発明の方法は例えば第１図囚及び■に示す装置により
具体化される。この装置は接続端Ａ−Ｆを有する六方バ
ルブ４に、第２除蛋白力ラム５が接続ＩｆｉＢ，Ｅを介
して接続されている。また、第１除蛋白力ラム１０が大
方バルブ接続端Ａ及び試料導入装置３の間に接続されて
いる。除蛋白液収容槽１１中の除蛋白液１が定流量ボン
ブ２によって試料導入装置３及び第１除蛋白力ラム１０
さらに接続端Ａ，Ｂを経て第２除蛋白カラム５に送られ
、そこから接続端Ｅ，　　Ｆを通り系外に排出される。

第１除蛋白力ラム１０に充填される充填剤は、一定の条
件、例えば水あるいはある特定のｐ　Ｈ　１１衝液中で
は親油戒分を吸着しアミン類及び蛋白或分は吸着しない
。第ｌ除蛋白カラム１０の充填剤としては通常の逆相ク
ロマトグラフィー用の充填剤、特に親水性の高い充填剤
が用いられる。例えば、水酸基、エーテル基等の親水性
の基をぞの表面６こ有ずる高分子系ゲルが用いらｈる。

その素材としては、例えばテトラメチロールメタントリ
アクリレートやｎ一エチレングリコールジメタクリレー
ト（ｎは２〜４）の単独重合体、もしくはこれらと他の
単量体との共重合体でなる粒子が挙げられる。特に怒濁
重合によって得られる粒径２０〜３０μｍ程度の微粒子
を用いることが望ましい。また、第２除蛋白力ラム５に
充填される充填剤は、一定の条件、例えば水あるいはあ
る特定のｐｉ｛の緩衝液中ではアミン類を吸着し蛋白戒
分を吸着しない。そして他の条件、例えば上記とは異な
るｐＨや塩濃度の緩衝液中ではカラムに吸着した上記ア
ミン類を溶離する性質を有する。第２除蛋白カラム５の
充填剤としては、通常の陽イオン交換樹脂、特にカルボ
キシル基をその表面に有し、親水性の高い弱阻イオン交
換樹脂を用いるのが好ましい。その素材としては、例え
ばスチレンとジビニルヘンゼンの共重合体にカルボキシ
ル基をその表面に導入した高分子系ゲルでなる粒子が挙
げられる。特に、懸？Ｗｊ重合によって得られる粒径２
０〜３０ｔ！ｍ程度の微粒子を用いることが好ましい。

試料としては、例えば、上記生体アミン類を含む除蛋白
処理の行われていない血清試料が用いられる。除蛋白液
としては水や各緩衝液が使用され得、特に、水もしくは
弱アルカリ性の低濃度緩衝液が好適である。

上記試料は試料導入装置３より糸内に導入され、定流量
ボンプ２より除蛋白液と共に移送されて第１除蛋白カラ
ム１０に達する。上記試料中の疎水性物質は第１除蛋白
力ラム１０の充填剤に吸着する。

試料中のアミン類及び蛋白或分は吸着されずに第ｌ除蛋
白カラム１０を通過し六方バルブ４の接続端Ａ，Ｂを経
て第２除蛋白力ラム５に導かれる。第２除蛋白カラム５
の充填剤表面のカルボキシル基は除蛋白液により十分解
離して陰性に荷電しており、試料中の陽性に荷電してい
るアミン類と特異的にイオン結合を形或することにより
アミン類がカラム充填剤に吸着される。一方、試料中の
蛋白或分は吸着されず第２除蛋白カラムを通過し、六方
バルブ４の接続端Ｅ，Ｆを経て系外に排出される。

他方、溶離液槽６１中の｝容離液６は定流量ボンブ７に
より接続端Ｄ及びＣを経由して液体クロマトグラフィー
の分析力ラム８へ送られる。ついで第１図■に示すよう
に、六方バルブ４を切り換えて接続端Ｄを已に接続する
と、定流量ポンブ７により溶離液槽６１の溶離液６が接
続端Ｄ及びＥを経て第２除蛋白カラム５に供給される．
溶離液がカラム５を通過することにより、吸着されてい
たアミン類が溶離され（脱着し）、溶離液と共に接続端
Ｂ及びＣを経て分析カラム８に達する。アミン類は分析
カラム８で分離され、分析カラム８以降に設けられた図
外の適切な検出器により検出される。

分析カラム８に充填される充填剤は第１及び第２除蛋白
カラムに用いられている充填剤よりも吸着性の高いもの
が使用される。このような吸着性の高い充填剤を用いる
ことにより第２除蛋白カラムに吸着されていたア稟ン類
を溶離液によって完全に脱着させ、これをそのまま分析
カラムに流しここでアミン類を精度よく分離し分析する
ことができる。分析カラム８に充填される吸着性の高い
充填剤としては、ボリマー系担体あるいはシリカ系担体
にオクタデシル基、オクチル基、スルホプ口ピル基等を
化学結合させたものが好ましい。例えば、ＴＳＫ　ｇｅ
ｔ　ＳＣＸ　　（東ソー■）　、Ａｓａｈｉｐａｋ　Ｏ
ＤＰ〔旭化成工業■）　、ＬＩＣＲＯＳＯＲＢ　ＲＰ−
１８，　ＬＩＣＲＯＳＯＲＢＲＰ−８　（メルク社）　
、ＹＭＣ　Ｐａｃｋ　ＯＤＳ，　ＹＭＣ　Ｐａｃｋ　Ｃ
ａ〔■ＹＭ″Ｃ〕が挙げられる。

〔作　用〕

本発明では、生体液試料中の疎水性物質は逆相系のクロ
マトグラフィー用ゲルが充填された第１除蛋白力ラムに
吸着除去され、さらに弱陽イオン交換樹脂が充填された
第２除蛋白カラムでアごン頻のみがイオン結合を形威し
て吸着されるため蛋白或分とも効果的に分離される。疎
水性物質が予め第ｌ除蛋白力ラムで除去されているため
分析力ラム８に導入されるのはアミン類のみであり夾雑
ピークの少ない条件で、かつ、従来より短時間で測定可
能となる。蛋白或分及び疎水性物質の除去されたアミン
類は通常の高速液体クロマトグラフィーにおける方法と
同様に分析力ラム８で分離され測定される。このように
疎水性妨害物質が共存する生体液中アξン類の一般的な
測定方法として多方面で利用され得る。

〔実施例〕

以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが
、これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するもの
ではない。

実施例１ 囚　第１除蛋白カラム充填剤ゲルの調製４重量％のボリ
ビニルアルコール水溶液４００ｍにテトラエチレングリ
コールジメタクリレート４０ｇ１テトラメチロールメタ
ントリアクリレー｝１０ｇ，｝ルエン４０ｇ１及び過酸
化ベンゾイル１．５ｇを加えた，　４００ｒＰＩｌで攪
拌しながら８０℃で１０時間反応させた後、熱水及びア
セトンで洗浄し、粒子径２０〜３０μｍの高分子球状多
孔体を得た。

■　第２除蛋白カラム充填剤ゲルの調製４重量％のポリ
ビニルアルコール水溶液５００ｍにジビニルベンゼン３
０ｇ，スチレン１０ｇ，メタクリル酸３０ｇ，トルエン
５０ｇ，及びペンゾイル１．５ｇを加えた。４００ｒｐ
ｎ＋で攪拌しなから８０゜ＣでＩＯ時間反応させた後、
熱水及びアセトンで洗浄し、粒子径２０〜３０μｍの高
分子球状多孔体を得た。

０　生体アミンの測定 第１図に示す測定装置を用いて血漿中のノルアドレナリ
ン、アドレナリン、ドーパミンの測定を行った．第１除
蛋白カラム１０としては囚項で得られた充填剤ゲルを内
径４ｍｍ、長さ２０ｍのステンレス製カラムに充填した
ものを使用した．また、第２除蛋白力ラム５としては■
項で得られた充填剤ゲルを内径４ｍｍ、長さ２０ｍのス
テンレス製カラムに充填したものを使用した．分析カラ
ム８としては、ＯＤＳ系の逆相クロマトグラフィー用の
市販のカラム（バックドカラムＡ−３０３．山村化学社
製；カラムサイズ内径４．６ｍ、長さ２５０ｍ）を用い
た。除蛋白液としてはエタノールと１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８．３）の混合液（容量比８／９２）を、そし
て溶離液６゛としては、５ｍＭペンタンスルホン酸ナト
リウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）とメ
タノールとの混合液（容量比８５／１５）を使用した． まず、第１図囚に示すように、定流量ポンブ２により除
蛋白液１を０．６ｄ／分の割合で第１除蛋白カラム１０
、さらに六方バルブ４の接続端Ａ．Ｂを経て第２除蛋白
カラム５に流しながら、試料導入装置３から試料血漿５
００μｌを注入した。この試料は、正常人男子血漿であ
る。試料注入８分後に六方バルブ４を切り換え第１図■
に示すように接続した．ボンプ７により、溶離液槽６１
中から溶離液６を１．Ｏｄｌ分の割合で六方バルブの接
続端Ｄ，Ｅ，第２除蛋白カラム５そして六方バルブの接
続端Ｂ，Ｃを経て液体クロマトグラフの分析カラム８へ
通した．上記溶離液の流通により被測定物質が溶離し分
析カラムにより分離されて検出器（図外）により検出さ
れた．検出器としては、電気化学検出器（Ｍ　４６０　
：　Ｗａ−ｔｅｒｓ社製）を用い、印可電圧６５０ｍＶ
で測定を行った．得られたクロマトグラムを第２図囚に
示す．第２図囚においてノルアドレナリンのピークａ及
びアドレナリンのピークｂ１　ドーパミンのピークＣが
確認される。

比較例１ 第１除蛋白カラム１０を使用しないこと以外は実施例１
と同様である．得られたクロマトグラムを第２図■に示
す。第２図■においてノルアドレナリン、アドレナリン
及びドーバ逅ンのピーク以外に夾雑ピークｄが確認され
る． 実施例２ 試料として正常男子尿を用い、溶離液として５ｌペンタ
ンスルホン酸ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（
ρＩ｛３．０）とメタノールの混合液（容量比８０／２
０）を用いたこと以外は実施例工と同様である。得られ
たクロマトグラムを第３図囚に示す。

第３図囚においてセロトニンのビークｅが確認サれる。

比較例２ 第１除蛋白カラム１０を使用しないこと以外は実施例２
と同様である。得られたクロマトグラムを第３図■に示
す。第３図■において、セロトニンのピーク以外に夾雑
ビークｆ．ｇが確認される。

〔発明の効果］ 本発明によれば、蛋白或分が共存する試料（血漿、血清
、尿）において、被測定物質が、該蛋白成分及び疎水性
夾雑戒分の影響を受けることなく高精度で、かつ短時間
に測定される。従って、本法により各種診断や病理研究
が効果的になされ得る。

【図面の簡単な説明】

第１図囚及び■は本発明方法の実施に用いられる測定装
置の一例を示す接続図、第２図囚及び第３図囚は本発明
の実施例で得られたクロマトグラム、第２図（Ｉ３）及
び第３図■は第１除蛋白力ラムを使用しない例における
第２図（４）及び第３図囚に対応ずるクロマトグラムで
ある。 １：除蛋白液、２：定流量ボンブ、３：試料導入装置、
４：六方バルブ、５：第２除蛋白カラム、６：溶離液、
７：定流量ポンプ、８：分析力ラム、ＩＯ：第１除蛋白
カラム、Ｉｌ：除蛋白液収容槽、６工：溶離液槽

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミン類を含む生体液試料を高速液体クロマトグ
   ラフィーで測定するにあたり、ａ、該試料を前処理移動
   相と共に該アミン類及び蛋白質を吸着しない逆相クロマ
   トグラフィー用充填剤充填の第１除蛋白カラムに導入し
   疎水性物質を吸着させると共に該アミン類及び蛋白質を
   吸着させることなく該第１除蛋白カラムを通過させる工
   程、ｂ、該第１除蛋白カラム通過液を弱陽イオン交換樹
   脂充填の第２除蛋白カラムに導入し該アミン類を吸着さ
   せると共に蛋白質を吸着させることなく該第２除蛋白カ
   ラムを通過させることにより蛋白質を除去する工程、ｃ
   、該第２除蛋白カラムに溶離液を供給し該第２除蛋白カ
   ラム充填剤に吸着されている該アミン類を脱着させる工
   程、ｄ、脱着した該アミン類を分析カラムに導いてこれ
   を分析する工程、を包含する生体液中アミン類の測定法
   。