JP2011180130A - 生体試料中のアミンの測定方法およびその方法を用いる患者のスクリーニング方法 - Google Patents
生体試料中のアミンの測定方法およびその方法を用いる患者のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011180130A JP2011180130A JP2011019561A JP2011019561A JP2011180130A JP 2011180130 A JP2011180130 A JP 2011180130A JP 2011019561 A JP2011019561 A JP 2011019561A JP 2011019561 A JP2011019561 A JP 2011019561A JP 2011180130 A JP2011180130 A JP 2011180130A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biological sample
- aqueous solution
- creatine
- amine
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 title claims abstract description 20
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims abstract description 16
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 66
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 60
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- BPMFZUMJYQTVII-UHFFFAOYSA-N guanidinoacetic acid Chemical compound NC(=N)NCC(O)=O BPMFZUMJYQTVII-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 36
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 claims abstract description 33
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 claims abstract description 30
- 239000006046 creatine Substances 0.000 claims abstract description 30
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 10
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- GSPZXGHHFDORDC-UHFFFAOYSA-N 2-(diaminomethylideneamino)butanoic acid Chemical compound CCC(C(O)=O)N=C(N)N GSPZXGHHFDORDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- TUHVEAJXIMEOSA-UHFFFAOYSA-N gamma-guanidinobutyric acid Natural products NC(=[NH2+])NCCCC([O-])=O TUHVEAJXIMEOSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims abstract description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 16
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- -1 guanidino compound Chemical class 0.000 abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 abstract 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 7
- 108010073791 Glycine amidinotransferase Proteins 0.000 description 6
- 108010070742 Guanidinoacetate N-Methyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 102000005756 Guanidinoacetate N-methyltransferase Human genes 0.000 description 6
- 108010007169 creatine transporter Proteins 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 102000005566 Succinate-Semialdehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108010084086 Succinate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 108700005875 X-linked Creatine deficiency Proteins 0.000 description 4
- 208000034091 X-linked creatine transporter deficiency Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 201000002997 creatine transporter deficiency Diseases 0.000 description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 3
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 3
- 102000005041 SLC6A8 Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100023153 Sodium- and chloride-dependent creatine transporter 1 Human genes 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 3
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAOCJYIOMOJEB-UHFFFAOYSA-N benzoin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(O)C(=O)C1=CC=CC=C1 ISAOCJYIOMOJEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000028419 Styrax benzoin Species 0.000 description 1
- 235000000126 Styrax benzoin Nutrition 0.000 description 1
- 235000008411 Sumatra benzointree Nutrition 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960002130 benzoin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019382 gum benzoic Nutrition 0.000 description 1
- 208000015978 inherited metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004190 ion pair chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012332 laboratory investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001121 post-column derivatisation Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
【課題】経済性、簡便性、および迅速性を同時に満たし、従来法でなし得なかった紫外吸光検出器のみによる簡便なグアニジノ化合物の高感度検出法。
【解決手段】弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用い、溶離液としてリン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用し、生体試料中の、特にクレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれるアミンを紫外吸光検出器を用いて測定する方法。および、前記測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
【選択図】図１
【解決手段】弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用い、溶離液としてリン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用し、生体試料中の、特にクレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれるアミンを紫外吸光検出器を用いて測定する方法。および、前記測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
【選択図】図１
Description
本発明は、弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる生体試料中のアミンの測定方法、およびその方法を用いる疾患を有する患者のスクリーニング方法に関する。
精神遅滞は人口の２〜３％に認める非常に頻度の高い病態であるが、根本的治療法がないため、その療育における社会的あるいは経済的負担は小さくない。精神遅滞の原因には先天性・後天性の両方があり様々であるが、最近の分子遺伝学的解析により、先天的な遺伝子異常に起因するものが比較的多いことが分かってきた。中でもクレアチンの生合成・代謝に関わるいくつかの遺伝子の欠損が注目されている。原因遺伝子を特定できれば、先天性の精神遅滞については、より効果的な治療法の開発が可能となる。
例えば、脳内クレアチン欠乏症は、重度の精神遅滞を主要症状とし、てんかん、自閉症、重度の言語障害などの様々な臨床症状を有する疾患である。その先天的な原因として、クレアチン生合成に関わるグアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ）、アルギニン・グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）、およびクレアチントランスポーター（ＳＬＣ６Ａ８）の遺伝子の欠損が知られている（非特許文献１）。
脳内クレアチン欠乏症は、臨床症状を有する患者の脳を磁気共鳴スペクトル装置（ＭＲＳ）で調べて脳内クレアチン値の低下を確認することにより診断されるが、原因遺伝子を特定する手掛かりを得るには、尿や血液中のクレアチン関連化合物（特にグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比）を測定する必要がある。しかし逆に、クレアチン関連化合物の測定法が充分に簡便なものになれば、例えば新生児に対するスクリーニングに加えることによって、発症前から診断し早期に治療を開始できる可能性もかなり高まるはずである。
一方、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）欠損症患者の尿中グアニジノ酪酸／クレアチニン比が高くなるという報告もある（非特許文献２）。
以上のような背景から、生体試料中のアミン（特に部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物）を簡便に定量できる汎用的なスクリーニング手法の開発が強く望まれている。
部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含むグアニジノ化合物のうち、クレアチンとクレアチニンについては、古くから知られている酵素法、または逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（非特許文献３〜８）を用いれば測定できる。
一方、グアニジノ酢酸については、逆相カラムによるクレアチンおよびクレアチニンとの完全分離が困難なことから、ＬＣ−ＭＳ法（非特許文献９）、ＬＣ−ＭＳＭＳ法（非特許文献１０〜１２）、ＧＣ−ＭＳ法（非特許文献１３）、酵素法（非特許文献１４〜１６）が主に検討されている。しかし、質量分析計（ＭＳ）を併用する方法は、高感度であるが高価な装置を必要とする。また酵素法は、簡便かつ高感度であるが、特殊な酵素の入手が難しい。よって、いずれも限られた施設でしか実施できないため、汎用的なスクリーニング手法にはなり得ない。
以上のような背景から、生体試料中のアミン（特に部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物）を簡便に定量できる汎用的なスクリーニング手法の開発が強く望まれている。
部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含むグアニジノ化合物のうち、クレアチンとクレアチニンについては、古くから知られている酵素法、または逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（非特許文献３〜８）を用いれば測定できる。
一方、グアニジノ酢酸については、逆相カラムによるクレアチンおよびクレアチニンとの完全分離が困難なことから、ＬＣ−ＭＳ法（非特許文献９）、ＬＣ−ＭＳＭＳ法（非特許文献１０〜１２）、ＧＣ−ＭＳ法（非特許文献１３）、酵素法（非特許文献１４〜１６）が主に検討されている。しかし、質量分析計（ＭＳ）を併用する方法は、高感度であるが高価な装置を必要とする。また酵素法は、簡便かつ高感度であるが、特殊な酵素の入手が難しい。よって、いずれも限られた施設でしか実施できないため、汎用的なスクリーニング手法にはなり得ない。
カーボンカラムによるイオンペアクロマトグラフィー法で、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンを完全分離した例はある（非特許文献３，７）が、溶離液としてイオンペア試薬（界面活性剤）を添加したクエン酸緩衝液／アセトニトリルを用いるため、ポストカラム誘導体化と蛍光検出の組み合わせという煩雑な手法を必要とするばかりか、溶離液の発泡によるトラブルも発生しやすい。逆相カラムでもグアニジノ酢酸を分離定量できる条件を見つけた例はある（非特許文献１７，１８）が、ベンゾインによるプレカラム誘導体化と蛍光検出の組み合わせ、およびグラジエント溶出という煩雑な手法を必要とし、しかもクレアチンとクレアチニンが重なってしまうため、クレアチン／クレアチニン比の測定には使えない。また、逆相カラムとカーボンカラムを組み合わせた二次元高速液体クロマトグラフィー（２Ｄ−ＨＰＬＣ）法を用いるグアニジノ化合物の測定法も報告されている（特許文献１）が、２種類のカラム、ポンプ２台、蛍光検出器２台、流路切替バルブ、および反応槽を伴う大掛かりな装置を必要とし、さらに溶離液へのイオンペア試薬（界面活性剤）の添加が必須であるため、溶離液の発泡によるトラブルが発生しやすい。よって、これらの方法も汎用的なスクリーニング手法にはなり得ない。
陽イオンクロマトグラフィーを用いるグアニジノ化合物の測定法も複数報告されているが、いずれも強酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる方法である（特許文献２〜５、非特許文献１７，１８）。強酸性陽イオン交換体はスルホ基のような強酸性官能基を有するので、弱酸であるリン酸の水溶液や緩衝液は溶出力が弱すぎて溶離液として適用できない。よく用いられる硝酸、硫酸、メタンスルホン酸などの強酸の水溶液は紫外（ＵＶ）吸光のバックグランドが高いため、最も汎用的な紫外吸光検出器の利用は困難であり、充分な感度を得るにはプレカラム（またはポストカラム）誘導体化と蛍光検出の組み合わせという煩雑な手法が必要となる（特許文献２〜５）。４種類のクエン酸緩衝液と水酸化ナトリウム水溶液を用いた段階的ｐＨグラジエント法も報告されているが、１〜２時間程度の溶出時間と誘導体化・蛍光検出を必要としている（非特許文献１９，２０）。したがって、これらの方法も汎用的なスクリーニング手法にはなり得ない。
一方、生体試料中のアミンをＬＣ−ＭＳ法やＨＰＬＣ法で測定する際は、機器の保護や感度改善などの目的で、あらかじめ除タンパク処理を行なうのが好ましく、沈澱法、限外ろ過法、固相抽出法など種々の方法がある。最近ではミックスモードの固相抽出カートリッジを利用した例もある（非特許文献２１）。
Ｃ．Ｊａｋｏｂｓら，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００５年，第３６１巻，ｐ．１−９
Ｅ．Ｅ．Ｗ．Ｊａｎｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，２００６年，第１７６２巻，ｐ．４９４−４９８
Ｔ．Ｓｍｉｔｈ−Ｐａｌｍｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００２年，第７８１巻，ｐ．９３−１０６
Ｇ．Ｗｅｒｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９９０年，第５２５巻，第２号，ｐ．２６５−２７５
Ｍ．Ｄｕｎｎｅｔｔら，Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１９９１年，第５１巻，第２号，ｐ．１３７−１４１
Ｈ．Ｍｕｒａｋｉｔａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８８年，第４３１巻，第２号，ｐ．４７１−４７３
Ｙ．Ｉｎａｍｏｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，１９９８年，第７０７巻，ｐ．１１１−１２０
Ｔ．Ｓｈｉｒａｉら，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７年，第６３巻，第５号，ｐ．７６９−７７１
Ｍ．Ｙａｓｕｄａら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年，第２５３巻，ｐ．２３１−２３５
Ｏ．Ｂｏｄａｍｅｒら，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００１年，第３０８巻，ｐ．１７３−１７８
Ｓ．Ｃｏｇｎａｔら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４年，第５０巻，第８号，ｐ．１４５９−１４６１
Ｒ．Ｓ．Ｃａｒｌｉｎｇら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８年，第４５巻，ｐ．５７５−５８４
Ｄ．Ｈｕｎｎｅｍａｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ，１９９７年，第２０巻，ｐ．４５０−４５２
Ｙ．Ｓｈｉｒｏｋａｎｅら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７年，第３３巻，第３号，ｐ．３９４−３９７
Ｙ．Ｓｈｉｒｏｋａｎｅら，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，１９９１年，第２０２巻，ｐ．２２７−２３６
Ｙ．Ｓｈｉｒｏｋａｎｅら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１年，第３７巻，第３号，ｐ．４７８−４７９
Ｃ．Ｃａｒｄｕｃｃｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００１年，第７５５巻，ｐ．３４３−３４８
Ｃ．Ｃａｒｄｕｃｃｉら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２年，第４８巻，第１０号，ｐ．１７７２−１７７８
Ｓ．Ｎａｔｅｌｓｏｎ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８４年，第３０巻，第２号，ｐ．２５２−２５８
Ｇ．Ｐｅｒｅｚら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６年，第２２巻，第２号，ｐ．２４０−２４２
Ｙ．Ｏｈｍａｅら，鑑識科学，２００４年，第９巻，第１号，ｐ．７１−７８
尿や血液中のグアニジノ化合物（例えば、グアニジノ酢酸）を測定する方法としては、背景技術の項で述べたように種々の方法が知られているが、経済性、簡便性、および迅速性を同時に満たすものがないため、いずれも臨床検査の場で採用されていないのが現状である。本発明が解決しようとする課題は、従来技術の難点を克服し、経済性、簡便性、および迅速性を同時に満たすグアニジノ化合物の測定方法を提供すること、中でも、従来法でなし得なかった紫外吸光検出器のみによる極めて簡便な高感度検出法を提供することである。
本発明者らは鋭意検討の結果、弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いれば、生体試料中のグアニジノ化合物の測定をはるかに安価・簡便な方法で、しかも迅速に実施できることを見出した。特に、リン酸水溶液、ギ酸水溶液を溶離液に使えるため、紫外吸光検出器のみによる高感度検出が可能となった。カラムに負荷をかけないための除タンパク法として、沈澱法、限外ろ過法、固相抽出法などを組み合わせれば、より実用的な測定方法となる。
本発明は以下の項目からなる。
［１］弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる生体試料中のアミンの測定方法。
［２］弱酸性陽イオン交換体が、カルボキシル基を有する親水性ポリマー粒子である前記［１］に記載の測定方法。
［３］溶離液として、リン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用する前記［１］または［２］に記載の測定方法。
［４］アミンが、紫外吸光法で検出可能なアミンである前記［１］に記載の測定方法。
［５］アミンが、部分構造としてＨ2ＮＣ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物である前記［１］または［４］に記載の測定方法。
［６］アミンが、クレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれる前記［１］、［４］、または［５］に記載の測定方法。
［７］紫外吸光検出器を用いる前記［４］〜［６］のいずれかに記載の測定方法。
［８］生体試料が、ヒトの尿である前記［１］に記載の測定方法。
［９］生体試料が、除タンパク処理されたものである前記［１］または［８］に記載の測定方法。
［１０］前記［１］〜［９］のいずれかに記載の測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
［１１］疾患が、精神・神経疾患である前記［１０］に記載のスクリーニング方法。
［１２］精神・神経疾患が、精神遅滞、自閉症および／またはてんかんである前記［１１］に記載のスクリーニング方法。
［１］弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる生体試料中のアミンの測定方法。
［２］弱酸性陽イオン交換体が、カルボキシル基を有する親水性ポリマー粒子である前記［１］に記載の測定方法。
［３］溶離液として、リン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用する前記［１］または［２］に記載の測定方法。
［４］アミンが、紫外吸光法で検出可能なアミンである前記［１］に記載の測定方法。
［５］アミンが、部分構造としてＨ2ＮＣ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物である前記［１］または［４］に記載の測定方法。
［６］アミンが、クレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれる前記［１］、［４］、または［５］に記載の測定方法。
［７］紫外吸光検出器を用いる前記［４］〜［６］のいずれかに記載の測定方法。
［８］生体試料が、ヒトの尿である前記［１］に記載の測定方法。
［９］生体試料が、除タンパク処理されたものである前記［１］または［８］に記載の測定方法。
［１０］前記［１］〜［９］のいずれかに記載の測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
［１１］疾患が、精神・神経疾患である前記［１０］に記載のスクリーニング方法。
［１２］精神・神経疾患が、精神遅滞、自閉症および／またはてんかんである前記［１１］に記載のスクリーニング方法。
本発明の測定方法を利用することにより、例えば、精神遅滞などの臨床症状を有する患者の尿中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、グアニジノ酪酸／クレアチニン比を測定し、原因遺伝子を精査すべき患者のスクリーニングが可能となる。また、スクリーニングから得られた情報をもとにグアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ）、アルギニン・グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）、クレアチントランスポーター（ＳＬＣ６Ａ８）、およびコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）のいずれかの欠損症に対する遺伝子解析を行ない、それぞれの原因遺伝子欠損症に応じた有効な治療を開始することが期待できる。さらに、新生児の尿を用いたスクリーニング検査を行なうことで、発症前から診断し、早期に治療を開始できる可能性もある。
本発明の測定方法による有意点は、最も汎用的な液体クロマトグラフィー用装置である紫外吸光検出器付きＨＰＬＣ装置に市販の弱酸性陽イオンクロマトグラフィー用カラムを取り付けるだけでも実施可能であり、また、有機溶媒を用いなくても測定可能である点である。特別な廃液処理を必要とせず環境にも優しく、機器分析の専門家がいない多くの医療施設でも安価で容易に導入できる画期的な方法である。
本発明で用いる弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムは、特に限定されないが、例えばカルボキシル基を有する基材、好ましくはカルボキシル基を有するポリマー粒子、より好ましくはカルボキシル基を有する親水性ポリマー粒子が充填されたカラムであり、その形状は円柱状のものに限らず、キャピラリーカラムのようなものでもよい。また、カラム内重合法で製造され必要に応じて修飾されるモノリスカラムなども含まれる。好ましい市販カラムとしては、例えばＳｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）などが挙げられる。
本発明でいう生体試料とは、特に限定されないが、例えば尿、血液、脳脊髄液であり、好ましくはヒトの尿である。また、除タンパク処理されたものが好ましく、アセトニトリルの添加による沈澱法で除タンパク処理されたものがより好ましい。
本発明でいうアミンは、脂肪族アミンでも芳香族アミンでもよく、１級、２級、３級のアミノ基またはアンモニウム基、あるいは４級アンモニウム基のいずれかを含むものであれば特に限定されないが、好ましくは紫外吸光法で検出可能なアミン、より好ましくは部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物、さらに好ましくはクレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、グアニジノ酪酸からなる群から選ばれる化合物である。
本発明で用いる溶離液は、特に限定されないが、リン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒が、紫外（ＵＶ）吸光のバックグランドが低いので好ましい。環境に配慮して、有機溶媒を使用しない溶離液を選択することもできる。場合によっては純水を使用できる可能性もある。溶離液のｐＨは２以上７以下が好ましい。
本発明で用いる検出器は、特に限定されないが、例えば紫外吸光検出器、紫外可視吸光検出器、示差屈折検出器、蛍光検出器、化学発光検出器などが挙げられる。高価な質量分析計を併用しないでアミンそのものを検出するのが簡便で好ましいが、感度を上げるためにポストカラム法などで誘導体化したものを検出してもよい。機器分析の専門家がいない多くの医療施設でも容易に導入できるという観点からは、紫外吸光検出器のみでアミンそのものを検出する方法が最も好ましい。検出波長は特に限定されないが、例えば２００〜３００ｎｍ、好ましくは２０５〜２８０ｎｍ、より好ましくは２１０〜２６０ｎｍである。
本発明の測定方法を用いるスクリーニング方法の対象となる疾患は、特に限定されないが、例えば精神・神経疾患、腎疾患、悪性腫瘍などが挙げられる。これらの疾患の中でも、精神遅滞、自閉症、てんかんなどの精神・神経疾患が好ましく、特に精神遅滞が好ましい。
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は下記の例により何等限定されるものではない。
実施例１：標準試料の測定
ＨＰＬＣ装置を用いて、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンの測定を行なった。測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）、
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
記録計：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃｋ ＣＲ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
溶離液：２ｍＭリン酸水溶液、
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
温度 ：室温（２５℃）、
試料と注入量：１０ｐｐｍ クレアチン ２５μｌ、
５０ｐｐｍ グアニジノ酢酸 ２５μｌ、
１０ｐｐｍ クレアチニン ２５μｌ、
（以上３種を混合注入）。
上記条件で測定したクロマトグラムを図１に示す。上記条件のうち溶離液のみを２ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約３．５）から５ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約３）、１０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約２）に換えて測定したクロマトグラムを各々図２、図３に示す。これらの結果から得られたリン酸水溶液濃度と保持時間の関係を図４（クレアチン、グアニジノ酢酸）、図５（クレアチニン）に示す。
ＨＰＬＣ装置を用いて、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンの測定を行なった。測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）、
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
記録計：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃｋ ＣＲ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
溶離液：２ｍＭリン酸水溶液、
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
温度 ：室温（２５℃）、
試料と注入量：１０ｐｐｍ クレアチン ２５μｌ、
５０ｐｐｍ グアニジノ酢酸 ２５μｌ、
１０ｐｐｍ クレアチニン ２５μｌ、
（以上３種を混合注入）。
上記条件で測定したクロマトグラムを図１に示す。上記条件のうち溶離液のみを２ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約３．５）から５ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約３）、１０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約２）に換えて測定したクロマトグラムを各々図２、図３に示す。これらの結果から得られたリン酸水溶液濃度と保持時間の関係を図４（クレアチン、グアニジノ酢酸）、図５（クレアチニン）に示す。
実施例２：尿の測定１
健常人の尿５００μｌにアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに２ｍＭリン酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例１と同様の条件で測定した。
溶離液：２ｍＭリン酸水溶液
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度 ：室温（２５℃）
注入量：２５μｌ
得られたクロマトグラムを図６に示す。
健常人の尿５００μｌにアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに２ｍＭリン酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例１と同様の条件で測定した。
溶離液：２ｍＭリン酸水溶液
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度 ：室温（２５℃）
注入量：２５μｌ
得られたクロマトグラムを図６に示す。
実施例３：尿の測定２
ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿にアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに２ｍＭリン酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例２と同様の条件で測定した。得られたクロマトグラムを図７に示す。
ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿にアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに２ｍＭリン酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例２と同様の条件で測定した。得られたクロマトグラムを図７に示す。
実施例４：標準試料の測定
ＨＰＬＣ装置を用いて、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンの測定を行なった。測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）、
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
記録計：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃｋ ＣＲ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
溶離液：０．０３％ギ酸水溶液、
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
温度 ：室温（２５℃）、
試料と注入量：１０ｐｐｍ クレアチン ２５μｌ、
５０ｐｐｍ グアニジノ酢酸 ２５μｌ、
１０ｐｐｍ クレアチニン ２５μｌ、
（以上３種を混合注入）。
上記条件で測定したクロマトグラムを図８に示す。上記条件のうち溶離液のみを０．０３％ギ酸水溶液から０．０５％ギ酸水溶液、０．１％ギ酸水溶液に換えて測定したクロマトグラムを各々図９、図１０に示す。これらの結果から得られたリン酸水溶液濃度と保持時間の関係を図１１（クレアチン、グアニジノ酢酸）、図１２（クレアチニン）に示す。
ＨＰＬＣ装置を用いて、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンの測定を行なった。測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）、
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
記録計：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃｋ ＣＲ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
溶離液：０．０３％ギ酸水溶液、
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
温度 ：室温（２５℃）、
試料と注入量：１０ｐｐｍ クレアチン ２５μｌ、
５０ｐｐｍ グアニジノ酢酸 ２５μｌ、
１０ｐｐｍ クレアチニン ２５μｌ、
（以上３種を混合注入）。
上記条件で測定したクロマトグラムを図８に示す。上記条件のうち溶離液のみを０．０３％ギ酸水溶液から０．０５％ギ酸水溶液、０．１％ギ酸水溶液に換えて測定したクロマトグラムを各々図９、図１０に示す。これらの結果から得られたリン酸水溶液濃度と保持時間の関係を図１１（クレアチン、グアニジノ酢酸）、図１２（クレアチニン）に示す。
実施例５：尿の測定３
健常人の尿５００μｌにアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに０．０３％ギ酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例４と同様の条件で測定した。
溶離液：０．０３％ギ酸水溶液
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度 ：室温（２５℃）
注入量：２５μｌ
得られたクロマトグラムを図１３に示す。
健常人の尿５００μｌにアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに０．０３％ギ酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例４と同様の条件で測定した。
溶離液：０．０３％ギ酸水溶液
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度 ：室温（２５℃）
注入量：２５μｌ
得られたクロマトグラムを図１３に示す。
実施例６：尿の測定４
ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿にアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに０．０３％ギ酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例５と同様の条件で測定した。得られたクロマトグラムを図１４に示す。
ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿にアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに０．０３％ギ酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例５と同様の条件で測定した。得られたクロマトグラムを図１４に示す。
本発明の測定方法を利用することにより、例えば、精神遅滞などの臨床症状を有する患者の尿中のグアニジノ酢酸、クレアチン／クレアチニン比を測定し、原因遺伝子を精査すべき患者のスクリーニングが可能となる。また、スクリーニングから得られた情報をもとに遺伝子解析を行ない、グアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ）、アルギニン・グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）、およびクレアチントランスポーター（ＳＬＣ６Ａ８）のいずれかの欠損症を特定できた場合、それぞれの原因遺伝子欠損症に応じた有効な治療を開始できる。さらに、新生児の尿検査を行なうことで、早期に治療を開始できる可能性もある。本発明の測定方法は、最も汎用的な液体クロマトグラフィー用装置である紫外吸光検出器付きＨＰＬＣ装置に、市販の弱酸性陽イオンクロマトグラフィー用カラムを取り付けるだけでも実施可能であるため、機器分析の専門家がいない多くの医療施設でも容易に導入できる。また、有機溶媒を用いなくても測定可能なので、特別な廃液処理を必要とせず環境にも優しい。
さらに、溶離液としてギ酸水溶液を用いた場合、質量分析計（ＭＳ）との併用も可能である。
さらに、溶離液としてギ酸水溶液を用いた場合、質量分析計（ＭＳ）との併用も可能である。
Claims (12)
- 弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる生体試料中のアミンの測定方法。
- 弱酸性陽イオン交換体が、カルボキシル基を有する親水性ポリマー粒子である請求項１に記載の測定方法。
- 溶離液として、リン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用する請求項１または２に記載の測定方法。
- アミンが、紫外吸光法で検出可能なアミンである請求項１に記載の測定方法。
- アミンが、部分構造としてＨ2ＮＣ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物である請求項１または４に記載の測定方法。
- アミンが、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれる請求項１、４または５に記載の測定方法。
- 紫外吸光検出器を用いる請求項４〜６のいずれかに記載の測定方法。
- 生体試料が、ヒトの尿である請求項１に記載の測定方法。
- 生体試料が、除タンパク処理されたものである請求項１または８に記載の測定方法。
- 請求項１〜９のいずれかに記載の測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
- 疾患が、精神・神経疾患である請求項１０に記載のスクリーニング方法。
- 精神・神経疾患が、精神遅滞、自閉症および／またはてんかんである請求項１１に記載のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011019561A JP5662182B2 (ja) | 2010-02-08 | 2011-02-01 | 生体試料中のアミンの測定方法およびその方法を用いる患者のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010025346 | 2010-02-08 | ||
| JP2010025346 | 2010-02-08 | ||
| JP2011019561A JP5662182B2 (ja) | 2010-02-08 | 2011-02-01 | 生体試料中のアミンの測定方法およびその方法を用いる患者のスクリーニング方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011180130A true JP2011180130A (ja) | 2011-09-15 |
| JP5662182B2 JP5662182B2 (ja) | 2015-01-28 |
Family
ID=44691756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011019561A Active JP5662182B2 (ja) | 2010-02-08 | 2011-02-01 | 生体試料中のアミンの測定方法およびその方法を用いる患者のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5662182B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016526669A (ja) * | 2013-06-12 | 2016-09-05 | ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ | 全身の骨格筋量を決定するための方法 |
| JP2018138914A (ja) * | 2011-12-07 | 2018-09-06 | グラクソスミスクライン エルエルシー | 全身骨格筋量の定量方法 |
| US10386371B2 (en) | 2011-09-08 | 2019-08-20 | The Regents Of The University Of California | Metabolic flux measurement, imaging and microscopy |
| US10466253B2 (en) | 2004-02-20 | 2019-11-05 | The Regents Of The University Of California | Molecular flux rates through critical pathways measured by stable isotope labeling in vivo, as biomarkers of drug action and disease activity |
| JP2020530904A (ja) * | 2017-08-14 | 2020-10-29 | クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ エルエルシー | マススペクトロメトリーによるグアニジノ酢酸、クレアチン、及びクレアチニンの検出及び定量 |
| CN115290770A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-11-04 | 北京君德同创生物技术股份有限公司 | 一种胍基乙酸含量的测定方法 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4591551A (en) * | 1981-07-13 | 1986-05-27 | University Of Southern California | Radioenzymatic method for assaying normetanephrine and octopamine |
| JPS61205500A (ja) * | 1985-03-11 | 1986-09-11 | Kikkoman Corp | グアニジノ酢酸の定量方法 |
| JPS61254852A (ja) * | 1985-05-08 | 1986-11-12 | Shimadzu Corp | ヒスタミンの分析方法及び装置 |
| JPS63212861A (ja) * | 1987-03-02 | 1988-09-05 | Tosoh Corp | バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸およびクレアチニンの同時分析方法およびその装置 |
| JPH03160365A (ja) * | 1989-11-17 | 1991-07-10 | Sekisui Chem Co Ltd | 生体液中アミン類の測定法 |
| JPH0674946A (ja) * | 1992-08-28 | 1994-03-18 | Shimadzu Corp | イミダゾール化合物の分析方法 |
| JP2000009712A (ja) * | 1998-06-26 | 2000-01-14 | Toshihiko Hanai | グアニジノ化合物類分析方法および装置 |
| JP2002107350A (ja) * | 2000-10-03 | 2002-04-10 | Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd | ５−ヒドロキシクレアチニンの測定法 |
| JP2010527452A (ja) * | 2007-05-15 | 2010-08-12 | ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン | 血漿メタネフリンを検出するための装置および方法 |
-
2011
- 2011-02-01 JP JP2011019561A patent/JP5662182B2/ja active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4591551A (en) * | 1981-07-13 | 1986-05-27 | University Of Southern California | Radioenzymatic method for assaying normetanephrine and octopamine |
| JPS61205500A (ja) * | 1985-03-11 | 1986-09-11 | Kikkoman Corp | グアニジノ酢酸の定量方法 |
| JPS61254852A (ja) * | 1985-05-08 | 1986-11-12 | Shimadzu Corp | ヒスタミンの分析方法及び装置 |
| JPS63212861A (ja) * | 1987-03-02 | 1988-09-05 | Tosoh Corp | バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸およびクレアチニンの同時分析方法およびその装置 |
| JPH03160365A (ja) * | 1989-11-17 | 1991-07-10 | Sekisui Chem Co Ltd | 生体液中アミン類の測定法 |
| JPH0674946A (ja) * | 1992-08-28 | 1994-03-18 | Shimadzu Corp | イミダゾール化合物の分析方法 |
| JP2000009712A (ja) * | 1998-06-26 | 2000-01-14 | Toshihiko Hanai | グアニジノ化合物類分析方法および装置 |
| JP2002107350A (ja) * | 2000-10-03 | 2002-04-10 | Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd | ５−ヒドロキシクレアチニンの測定法 |
| JP2010527452A (ja) * | 2007-05-15 | 2010-08-12 | ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン | 血漿メタネフリンを検出するための装置および方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6014041138; 東舘 栄ら: '体液中のグアニジノ化合物の高感度迅速定量法' 分析化学 Ｖｏｌ． ３３、Ｎｏ． ７, 1984, Ｐ３６６-３７０ * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10466253B2 (en) | 2004-02-20 | 2019-11-05 | The Regents Of The University Of California | Molecular flux rates through critical pathways measured by stable isotope labeling in vivo, as biomarkers of drug action and disease activity |
| US10386371B2 (en) | 2011-09-08 | 2019-08-20 | The Regents Of The University Of California | Metabolic flux measurement, imaging and microscopy |
| JP2018138914A (ja) * | 2011-12-07 | 2018-09-06 | グラクソスミスクライン エルエルシー | 全身骨格筋量の定量方法 |
| JP2016526669A (ja) * | 2013-06-12 | 2016-09-05 | ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ | 全身の骨格筋量を決定するための方法 |
| JP2020530904A (ja) * | 2017-08-14 | 2020-10-29 | クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ エルエルシー | マススペクトロメトリーによるグアニジノ酢酸、クレアチン、及びクレアチニンの検出及び定量 |
| JP7203086B2 (ja) | 2017-08-14 | 2023-01-12 | クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ エルエルシー | マススペクトロメトリーによるグアニジノ酢酸、クレアチン、及びクレアチニンの検出及び定量 |
| CN115290770A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-11-04 | 北京君德同创生物技术股份有限公司 | 一种胍基乙酸含量的测定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5662182B2 (ja) | 2015-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5662182B2 (ja) | 生体試料中のアミンの測定方法およびその方法を用いる患者のスクリーニング方法 | |
| Bejjani et al. | Elevated glutamatergic compounds in pregenual anterior cingulate in pediatric autism spectrum disorder demonstrated by 1H MRS and 1H MRSI | |
| Xu et al. | Analytical methods for amino acid determination in organisms | |
| US8945933B2 (en) | Liquid chromatography-mass spectrometry methods for multiplexed detection and quantitation of free amino acids | |
| WO2017077401A1 (en) | Method for the ultra-sensitive determination of catecholamines and their metabolites | |
| BRPI0813954A2 (pt) | análise de aminoácidos no fluido do corpo através de cromatografia líquida-espectometria de massa | |
| Domingues et al. | Simultaneous determination of amino acids and neurotransmitters in plasma samples from schizophrenic patients by hydrophilic interaction liquid chromatography with tandem mass spectrometry | |
| Zhang et al. | Dysregulated urinary arginine metabolism in older adults with amnestic mild cognitive impairment | |
| CA2766675A1 (en) | Methods and systems for multiplex analysis of biomolecules by liquid chromatography-mass spectrometry | |
| Gałęzowska et al. | Determination of amino acids in human biological fluids by high-performance liquid chromatography: Critical review | |
| CA2800680A1 (en) | Methods of determining amyloid beta turnover in blood | |
| Tortorella et al. | Serum and CSF N-acetyl aspartate levels differ in multiple sclerosis and neuromyelitis optica | |
| Amorini et al. | Metabolic profile of amniotic fluid as a biochemical tool to screen for inborn errors of metabolism and fetal anomalies | |
| Kim et al. | A reference measurement procedure for amino acids in blood using isotope dilution ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry | |
| Ali et al. | Chromatographic determination of low-molecular mass unsaturated aliphatic aldehydes with peroxyoxalate chemiluminescence detection after fluorescence labeling with 4-(N, N-dimethylaminosulfonyl)-7-hydrazino-2, 1, 3-benzoxadiazole | |
| Blomqvist et al. | High-throughput analysis of sulfatides in cerebrospinal fluid using automated extraction and UPLC-MS/MS | |
| JPWO2016098757A1 (ja) | アミノ酸またはアシルカルニチンの検出方法 | |
| Zhang et al. | Evaluation of the oxidative deoxyribonucleic acid damage biomarker 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine in the urine of leukemic children by micellar electrokinetic capillary chromatography | |
| Souza et al. | Direct coupling of fiber-in-tube solid-phase microextraction with tandem mass spectrometry to determine amyloid beta peptides as biomarkers for Alzheimer's disease in cerebrospinal fluid samples | |
| Janzen et al. | UPLC–MS/MS analysis of C5-acylcarnitines in dried blood spots | |
| JP2011058863A (ja) | 慢性腎臓病判定用血清マーカー、及び、その検出方法、装置 | |
| González-Domínguez et al. | High-throughput metabolomics based on direct mass spectrometry analysis in biomedical research | |
| CA2910773A1 (en) | Method for determining free copper | |
| Akiyama et al. | Simultaneous measurement of monoamine metabolites and 5-methyltetrahydrofolate in the cerebrospinal fluid of children | |
| Hampel et al. | High-throughput analysis of water-soluble forms of choline and related metabolites in human milk by UPLC-MS/MS and its application |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140131 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20140814 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140926 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141030 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141121 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141204 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5662182 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |