DE2644501C3 - Prüfmittel zur Bestimmung von Bilirubin in Urin - Google Patents

Prüfmittel zur Bestimmung von Bilirubin in Urin

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Description

\ R
25
oder eine tautomere Form davon besitzt wobei R jo eine verbindende Gruppe darstellt, die zur Bildung eines 5- oder 6-gliedrigen Ringes beiträgt der noch zusätzliche Substituenten enthalten kann.
5. Mittel nach Anspruch I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat 2,6-Dioxo- J5 pyrimidin oder ein Derivat davon ist.
6. Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat die Formel
40
oder eine tautomere Form davon besitzt, wobei R1 und R2 jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe und R3 und R4 jeweils ein Wasserstoffatom oder Halogenatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten oder R3 und R4 zusammen mit der Äthylengruppe in dem heterocyclischen Ring ein isocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem bilden.
7. Mittel nach Anspruch I bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat die Formel
R1
\ /ν Ν N
J\ /\ , ONN
R2
oder eine tautomere Form davon besitzt, wobei R1 und R2 jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe und R3 ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe oder eine bydroxysubstituierte niedere Alkylgruppe bedeuten.
8. Mittel nach Anspruch I bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat Coffein, Dyphyllin, Uridin, Urazol, 2-Imidazolidon und/oder Parabansäure ist
9. Mittel nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet daß die organische Sulfonsäure oder deren Salz eine aromatische Sulfonsäure oder ein Salz davon sind.
10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet daß die aromatische Sulfonsäure Sulfosalicylsäure, Naphthalindisulfonsäure und/oder Biphenyldisulfonsäure ist.
Der diagnostische Wert der Bilirubinbestimmung in Urin ist bekannt Urin von einer gesunden Person enthält keine nennenswerte Menge Bilirubin (weniger als 0,05 mg/100 ml). Verschiedene Krankheitszustände, wie Gallenstauung und hämolytische und hepatische Erkrankungen, führen jedoch dazu, daß Bilirubin im Urin in einer abnorm hohen Konzentration auftritt Es ist allgemein anerkannt daß das Vorhandensein von Bilirubin im Urin in einer Konzentration über 0,05 mg/ 100 ml ein Anzeichen ist für einen abnormen klinischen Zustand, der die Durchführung umfangereicherer diagnostischer Verfahren erforderlich macht, um die spezifische verursachende Erkrankung festzustellen.
Es ist ferner bekannt daß im wesentlichen das gesamte Bilirubin, das in pathologischem Urin vorkommt, in konjugierter Form vorliegt. Bilirubin ist ein Abbauprodukt der Hämgruppe von Hämoglobin und wird, wenn es erst im Blutstrom entstanden ist, von der Leber aufgenommen, wo es durch Veresterung mit Glucuronsäure konjugiert wird. Die entstehenden BiIirubinglucuronide sind außerordentlich gut wasserlöslich im Gegensatz zu freiem Bilirubin, das in Wasser sehr wenig löslich ist Die konjugierten Bilirubine können dadurch frei von der Leber in die Nieren gehen, wo, unter normalen Umständen, im wesentlichen das gesamte konjugierte Bilirubin in Urobilinogen umgewandelt und als Bestandteil des Urins ausgeschieden wird. Bei verschiedenen pathologischen Zuständen wird konjugiertes Bilirubin selbst im Urin ausgeschieden.
Bilirubin wird Üblicherweise bei Routine-Urinuntersuchungen nachgewiesen, aufgrund seiner Reaktion mit verschiedenen Diazoniumverbindungen in saurem Medium unter Bildung eines gefärbten Azobilirubinkomplexes. Während in der Literatur verschiedene Testverfahren angegeben sind, ist das im klinischen Labor im allgemeinen bevorzugte Mittel ein Teststreifen. Die Diazoniumverbindung ist in einem Träger absorbiert, der eine vorbestimmte Menge Urin absorbieren kann, wenn er augenblicklich in eine Urinprobe getaucht wird. Eine etwaige Farbreaktion kann in weniger als einer Minute abgelesen werden. Die Herstellung und Anwendung von Bilirubinteststreifen ist im einzelnen in der US-PS 35 85 001 beschrieben. Während die bekannten Teststreifen ein schnelles und bequemes Verfahren zur Bestimmung von Urinbilirubin ermöglichen, ist es allgemein bekannt, daß die zur Verfügung stehenden Teststreifen nicht ausreichend empfindlich sind, um ßilirubingehalte nachzuweisen, die nur
leicht gegenüber dem normalen Gehalt erhöht sind, d. h. zwischen 0,05 und 0,8 mg Bilirubin pro 100 ml.
Es werden einige Versuche berichtet, die Empfindlichkeit der Reaktion zwischen Diazoniumverbindungen und Harnbifirubin zu erhöhen. Die bekannten Testsysteme besitzen jedoch bestimmte Nachteile.
In der US-PS 38 80 588 ist eine Gruppe von Diazoniumverbindungen beschrieben, die die Farbreaktion des Azobilirubinkomplexes erhöhen und die störenden Farbreaktionen mit Urobilinogen, das dem Bilirubin strukturell und chemisch nahe verwandt ist, verringern sollen. Die angegebenen Diazoniumverbindungen bilden jedoch im Gegensatz zu den üblichen Verbindungen störende gefärbte Produkte mit Bestandteilen von Urin, wie Homogentisinsäure (2^5-Dihydroxyphenylessigsäure) und 5-Hydroxyindol-3-essigsäure. Die zuletzt genannte Verbindung ist ein normaler Bestandteil von Urin und so geringe Mengen wie 1 mg/100 ml dieses Bestandteils in Urin führen zu falschen positiven Ergebnissen,'wenn die in der genannten Druckschrift erwähnten Diazoniumverbindungen angewandt werden.
Ein weiterer Versuch, die Empfindlichkeit der in Teststreifen eingebauten Diazoniumreagentien zu verbessern, ist in der US-PS 38 53 476 beschrieben, die die Anwendung bestimmter Phosphorsäurediester als Mittel zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Verstärkungsmittel für die Reaktion zwischen der Diazoniumverbindung und Bilirubin offenbart Aufgrund der Unverträglichkeit dieser Phosphorsäurediester mit jo einem wäßrigen Meümm, müssen jedoch Teststreifen entsprechend dieser Druckschrift dur<.h ein Doppelimprägnierverfahren hergestellt «erden.
Es ist zu bemerken, daß verschiede'*? sogenannte »Beschleunigungsmittel« beschrieben worden sind im r, Zusammenhang mit dem Nachweis von Bilirubin in Serum mit Hilfe einer Diazokupplungsreaktion. Derartige Mittel umfassen Coffein, Dyphillin, Natriumacetat. Natriumbenzoat, Gummiarabikum und verschiedene andere chemisch nicht verwandte Verbindungen, w Die Anwendung derartiger Beschleunigungsmittel bei Bilirubinuntersuchungen in Serum wurde bereits um 1920 in der Literatur beschrieben, aber niemals auf Bilirubinuntersuchungen im Harn angewandt Das liegt an der allgemein bekannten Tatsache, daß solche Be- v, schleunigungsmittel auf eine Form von Bilirubin wirken, die im Urin nicht in nennenswerten Mengen vorhanden ist Derartige Beschleunigungsmittel sollen die Diazokupplung von freiem Bilirubin beschleunigen. Es wird über keine Wirkung auf die Kupplung von konjugiertem vt Bilirubin berichtet, da bei Bilirubinuntersuchungen in Serum die konjugierten Formen von Bilirubin verhält' nismäßig schnell mit den Diazoniumverbindungen reagieren, ohne daß Beschleuniger erforderlich sind. Daher werden die konjugierten Formen von Bilirubin in Serum als direkt reagierendes Bilirubin bezeichnet, während freies Bilirubin, das das Vorhandensein von Beschleunigern erforderlich macht, um zu einer schnellen Reaktion zu führen, als indirekt bindendes Bilirubin bezeichnet wird.
Über die Anwendung von Dyphylin zur Bestimmung von Bilirubin in Urin wird nur einmal berichtet (Scandinavian journal of Clinical Laboratory Investigation, Supplement 56 [196I]). In diesem Falle war die Anwendung jedoch speziell dafür vorgesehen, um die gleiche Wirkung zu erreichen, wie sie in der Literatur in Beziehung auf Bilirubinuntersuchungen in Serum angegeben ist, nämlich die Diazokupplung von freiem Bili rubin zu beschleunigen, das, wie bekannt ist, in dem untersuchten Urin nur in sehr geringen Mengen vorhanden sein kann. Das dort beschriebene Verfahren umfaßt ein mühsames flüssiges Testsystem und es findet sich kein Hinweis auf die Anwendung einfacher Teststreifen. Das dort beschriebene Verfahren hat auch in der Fachwelt wenig Beachtung gefunden zur Entwicklung empfindlicherer Biürubinteststreifen, wie dart us hervorgeht, daß man zu den in den oben erwähnten US-PS 38 53 476 und 38 80 588 angegebenen, mit Nachteilen behafteten Testsystemen Zuflucht genommen hat
Es ist Aufgabe der Erfindung ein Prüfmittel zu entwickeln, mit dessen Hilfe es durch einfaches Eintauchen und Ablesen möglich ist, auch gering erhöhte Bilirubingehalte im Urin nachzuweisen.
Diese Aufgabe wird ausgehend von einem Prüfmittel zum Nachweis von Bilirubin in einer Urinprobe, bestehend aus einer Trägermatrix, enthaltend eine Diazoniumverbindung, die mit Harnbilirubin unter Auftritt einer Farbänderung reagiert einen Bestandteil, der imstande ist in der Urinprobe einen sauren pH-Wert zu erzeugen und ein Verstärkungsmittel, dadurch gelöst, daß das Verstärkungsmittel ein Addukt aus Harnstoff oder einem Harnstoffderivat und einer organischen Sulfonsäure oder einem SiIz davon ist
Das Harnstoffderivat kann ein acyclisches niederes Alkylderivat von Harnstoff oder eine cyclische Ureidoverbindung oder ein Derivat davon sein. Eine cyclische Ureidoverbindung oder ein Derivat davon ist bevorzugt und besonders eine solche, die zur Gruppe der Xanthine gehört.
Das Vorhandensein des speziellen erfindungsgemäßen Verstärkungsmittels führt zur Bildung von intensiver gefärbten Azobilirubinkomplexen, wodurch die Empfindlichkeit der Testreaktion wesentlich erhöht wird. Außerdem hat es sich gezeigt daß das spezielle Verstärkungsmittel eine bathochrome Wirkung auf die Testreaktion besitzt indem die in seiner Gegenwart entstehenden Azobilirubinkomplexe im allgemeinen veränderte Absorptionsspektren besitzen, wodurch Farben auftreten, die leichter von denen durch erwartete Störreaktionen verursachten Farben zu unterscheiden sind. Ferner hat es sich gezeigt, daß das spezielle Verstärkungsmittel auch als Stabilisator für die Diazoniumverbindung wirkt wenn das Prüfmittel in trockenem Zustand in einen Träger eingebaut ist.
Diese Vorteile bei de: Durchführung des Testverfahrens werden ergänzt durch Vorteile bei der Herstellung des Prüfmittels. Bei der Herstellung des bevorzugten Teststreifens wird das Prüfmittel üblicherweise entweder durch Sättigung des Trägers mit einer Lösung der Reagentien und anschließendes Trocknen oder durch Herstellung des Trägers in Gegenwart einer Lösung der Reagentien und anschließendes Härten in den Träger eingebaut. Bisher waren, um einen Teststreifen nach dem ersten Verfahren herzustellen, verschiedene Sättigungs- und Trocknungsstufen erforderlich. Wie im einzelnen in der US-PS 35 85 004 angegeben, mußte, um eine ausreichende Menge eines sauren Bestandteils in den T-äger nach bekannten Verfahren einzubauen, eine speziell gebaute, eine Säure freisetzende Verbindung angewandt werden. Da eine derartige Verbindung bei Berührung mit einem wäßrigen Medium eine Mineralsäure freisetzte, konnte sie nicht zu der ursprünglichen Diazoniumsaizlösung zugesetzt werden, mit der der Träger imprägniert wurde. Die verschiedenen Sättigungsverfahren bei der Herstellung
sind nicht nötig, wenn das erfindungsgemäß verwendete Verstärkungsmittel zu der ursprünglichen Diazoniumsalzlösung zugegeben wird, da weniger Säure erforderlich ist, um empfindliche Testergebnisse zu erhalten, und die erforderliche Menge an Säure kann in Form einer festen Säure zur Verfügung gestellt werden, wie einer organischen Säure,
Die vorliegende Erfindung führt daher zu verbesserten Prüfmitteln zum Nachweis von Bilirubin in einer Urinprobe mit einer erhöhten Empfindlichkeit der Diazokupplungsreaktion, erhöhter Stabilität der trockenen Formen des Prüfmittels, verringerter Störung durch zusätzliche Bestandteile des Urins und Vereinfachung des Herstellungsverfahrens.
Verschiedene Ureidoverbiudungen haben sich als zur Herstellung des erfindungsgemäßen Verstärkungsmittels geeignet erwiesen. Im Zusammenhang dieser Beschreibung umfassen Ureidoverbindungen solche Verbindungen, die die Gruppe
\ Il /
N —C—N
/ \
enthalten, die im folgenden als Ureidogruppe bezeichnet wird. Ureidoverbindungen umfassen als Gruppe Harnstoff und verschiedene Harnstoffderivate. Cycli- jo sehe Ureidoverbindungen, die durch einen heterocyclischen Ring charakterisiert sind, der eine Ureidogruppe enthält, sind besonders geeignet. Beispiele für derartige cyclische Ureidoverbindungen sind Cytosin, das ein aminosubstituiertes 2-Oxopyrimidin ist, und 2-Imidazolidon sowie andere 5- und 6-gliedrige oxoheterocyclische Verbindungen. Besonders geeignete cyclische Ureidoverbindungen sind solche mit einer dicxoheierocyclischen Ringstruktur der Formel
A,
(D
systeme, Beispiele für geeignete Verbindungen der Formel I sind die substituierten und nicht substituierten 3,5-Dioxo-l ^,4-triazole, wie Urazol, die substituierten und nicht substituierten 2,4,5-Trioxoimidazole, wie Parabansäure und die substituierten und nicht substituierten 2,5-Dioxoimidazole, wie 1-Methylhydantoin und 7,8-Benzo-1,3-diazaspiro[4,5]-decan-2,3-dion.
Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind 2,6-Dioxopyrimidine und Derivate davon, wie Uridin. Von den 2,6-Dioxopyrimidinen sind besonders bevorzugt solche Verbindungen der Formel
20
ONF, (II)
R2
oder einer tautomeren Form davon, wobei R1 und R2 jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten, und R3 und R4 (1.) jeweils Wasserstoffoder Halogenatome oder eine niedere Alkylgruppe oder (2.) zusammen mit der Äthylengruppe in dem heterocyclischen Ringsystem ein substituiertes oder unsubstituiertes isocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem bilden, das die gewünschten Verstärkungseigenschaften nicht wesentlich verschlechtert. Verbindungen der Formel II umfassen 5-Bromuracil, 1,3-Dimethyl-6,7-diphenyllumazin und Xanthin und Derivate davon.
Von den cyclischen Ureidoverbindungen sind die am meisten bevorzugten Xanthin und dessen De-ivate der Formel
40
(IM)
50
oder erwer tautomeren Form davon, wobei R eine verbindende Gruppe ist, die zur Bildung eines 5- oder 6-gliedrigen Ringes beiträgt, und wobei der heterocyclische Ring Substituenten enthalten kann, die die gewünschte Verstärkungswirkung nicht wesentlich verschlechtern. Andere Substituenten als Wasserstoffatome können an den Stickstoffatomen in dem heterocyclischen Ring vorhanden sein und sind üblicherweise substituierte oder unsubstituierte niedere Alkylgruppen, d. h. solche mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen. Eine große bo Vielzahl von Substituenten kann an die Verbindungsgruppe R gebunden sein, da angenommen wird, daß die Verstärkungswirkung in erster Linie auf das Vorhandensein der Ureidogruppe zurückzuführen ist. Derartige Substituenten sind üblicherweise Wasserstoff- oder Halogenatome, Alkylgruppen, substituierte oder nicht substituierte kondensierte isocyclische oder heterocyclische aliphatische oder aromatische Ringoder einer tautomeren Form davon, wobei R1 und R2 jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten und R3 ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe oder eine hydraxysubstituierte niedere Alkylgruppe ist. Diese Verbindungen sind bevorzugt aufgrund ihrer besonders deutlichen zusätzlichen Stabilisierungswirkung auf die Diazoniumvcrbindung. Die^e Verbindungen umfassen Coffein, Dyphyllin und 3-Isobutyl-l-methylxanthin.
Andere Ureidoverbindungen können ebenfalls geeignet sein, solange die gewünschte Verstärkungswirkung durch die Addukte hervorgerufen wird, die sie mit organischen Sulfonsäuren oder deren Salzen bilden. Neben Harnstoff selbst haben sich die acyclischen niederen Alkylderivate von Harnstoff als geeignet erwiesen als Bestandteil der Verstärkungsmittel. Ein Beispiel für acyclische niedere Alkylderivate von Harnstoff ist Tetramethylharnstoff.
Der andere Bestandteil des Adduktes neben dem Ureidobestandteil in dem Verstärkungsmittel kann irgendeine Verbindung umfassen, die eine oder mehrere Sulfonsäuregruppen enthält oder ein Salz davon oder Formen, die mit der jeweiligen Ureidoverbindung unter Bildung eines wasserlöslichen Adduktes mit der gewünschten Verstärkungseigenschaft reagieren. Derartige Verbindungen besitzen die allgemeine Formel
K)
in der R1 ein organischer Rest ist und R- ein Wasserstoffatom, wobei eine Sulfonsäuregruppe entsteht, oder ein salzbildender Bestandteil, üblicherweise ein anorganisches Kation, wie ein Alkali-, z. B. Natrium- oder Kaliumion usw. Die aromatischen Sulfonsäuren und η deren Salze sind bevorzugt, da sie zusätzlich dazu beitragen, die Diazoniumkomponenle sowohl in trockener For!", wenn sie mit deiv. Verstiirkij"cTCr!'l!t*f*! 7ticarnrr!pn ist. als auch in Lösung, wie sie während des Herstellungsverfahrens auftritt, zu stabilisieren. Aroma- -'" tische Sulfonsäuren und ihre Salze sind bekannte Stabilisatoren für Diazoniumsalzlösungen. Besonders geeignete aromatische Sulfonsäuren und Salze davon sind Sulfosalicylsäurc. die Naphthalindisulfonsäuren. wie 1.5-Naphthalindisulfonsäure. und die Biphenyidisulfon- y< säuren, wie 4,4'Biphenyldisulfonsäure und deren Salze.
Die in dem Prüfmittel enthaltene Diazoniumverbindung kann irgendeine der bekannten Diazoniumverbindungen sein, üblicherweise in Form von Salzen, die mit Harnbilirubin unter Bildung eines gefärbten !" Komplexes kuppeln, wodurch eine Farbänderung auftritt. Allgemein sind die am meisten bevorzugten Diazoniumverbindungen, die Aryldiazoniumverbindungen. die die diazotierten Formen von 2,4-Dichloranilin, p-Nitroanilin. p-Chloranilin. 2.5-Dichloranilin, 4-Chlor- r> o-anisidin, 3,3'-Dimethoxybenzidin und 2-Methoxy-5-nitroanilin umfassen. Andere Verbindungen, von denen angegeben ist. daß sie imstande sind mit Harnbilirubin zu kuppeln, können ebenfalls angewandt werden. -»i'
Das Prüfmittel kann auch einen zusätzlichen Stabilisator für die Diazoniumverbindung enthalten. Ein derartiger Stabilisator dient, wie bekannt, dazu, störende Diazokupplungsreaktionen zu hemmen, indem er den anionischen Teil der Diazoniumverbindung blockiert. ■»"> Ferner dient ein derartiger Stabilisator mit dazu, die Diazoniumverbindung während der Herstellung des Prüfmittels und während der Testreaktion in gelöstem Zustand zu halten. Der Stabilisator kann aus einer großen Gruppe von Verbindungen ausgewählt werden, ">o wie Fluoroboraten. Übergangsmetallhalogenverbindungen, wie Zink- und Kobaltchloriden, und aromatischen und aliphatischen Sulfonsäuren und Salzen, einschließlich der oben als bevorzugte Bestandteile der Verstärkungsmittel erwähnten.
Der den sauren pH-Wert einstellende Bestandteil des Prüfmittels kann aus einer Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen bestehen, die imstande sind, einen sauren pH-Wert in der zu untersuchenden Urinprobe einzustellen. Es ist bekannt, daß eine saure Umgebung bei der Testreaktion die Störung durch Ascorbinsäure verringert, den gefärbten Azobilirubinkomplex stabilisiert und den molaren Extinktionskoeffizienten des Komplexes erhöht und dadurch die kolorimetrische Reaktion verstärkt. Eine bevorzugte stark saure Um- &5 gebung wird erreicht, wenn der den pH-Wert einstellende Bestandteil einen pH-Wert von weniger als 3 ergibt bei einer Konzentration von 0,1 n. Während ein den sauren pH-Wert einstellender Bestandteil in Form einer festen Säure, wie einer organischen Säure, bevor?ugt ist. besitzt eine derartige Säure vorzugsweise einen pK„-Wert von weniger als ungefähr 4. Beispiele für geeignete organische Säuren sind Citronensäure, Sulfosalicylsilure. Weinsäure, Bernsteinsäure, Cyclohexansulfaminsäure und Maleinsäure. Wenn der saure Bestandteil eine Sulfonsäuregruppe enthält, wie im Falle von Sulfosalicylsäure, kann diese Verbindung auch gleichzeitig als Bestandteil des Verstärkungsmittels und/oder als Stabilisator für die Diazoniumverbindung dienen. So würde, wenn das Prüfmittel hergestellt würde aus einer Lösung der Diazoniumverbindung. des den sauren pH-Wert einstellenden Bestandteils und des Verstärkungsmittel, ein ausreichend großer Überschuß an einer organischen Sulfonsäurc oder einem Salz davon als Quelle für das Material, das als pH-Wert einstellenilrr RrtMnHtpil wirkt, ak Din/oniumstabilisiilor und als Bestandteil des Verstärkungsmittels dienen.
In dem Prüfmittel können gegebenenfalls noch zusätzliche Substanzen enthalten sein. Oberflächenaktive Mittel können enthalten sein, um die Benetzbarkeit des Prüfnittels mit der Urinprobe zu erhöhen. Löslichmachende Mittel können in dem Prüfmittel vorhanden sein. Derartige löslichmachende Mittel verhindern die Ausfällung der wirksamen Bestandteile des Prüfmittels während der Herstellung und während der Testreaktion. Ein Beispiel für ein löslichmachendes Mittel ist ein äquimolares Copolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid und besitzt in Lösung eine löslichmachende (solubilisierende) Wirkung, besonders in Beziehung auf das Verstärkungsmittel.
Der Anteil der Bestandteile in dem Prüfmittel kann in weiten Grenzen variieren, je nach der angewandten Form und dem angewandten Testverfahren. Die folgende Tabelle gibt die möglichen und bevorzugten Mengenverhältnisse der Bestandteile des Prüfmittels in trockener Form an, wie es in einer Prüfvorrichtung vorliegt, ausgedrückt als Gewichtsprozent.
/.uiii^igtri ncvtu /uj;n:
Bereich Bereich
Diazoniumverbindung 0.05-10 0.2-2
Saurer Bestandteil 1-80 20-50
Verstärkungsmittel 5-80 30-60
Stabilisierungsmittel 0-50 1-15
Löslichmachendes Mittel 0-30 2-10
Der Träger liegt üblicherweise in Form einer Matrix vor, die imstande ist, ein vorher bestimmtes Volumen der Urinprobe aufzunehmen und festzuhalten. Eine derartige Matrix kann aus saugfähigem Papier, einer porösen polymeren Membran, einem in Wasser quellbaren Gel, einem Absorptionsmittel, einem inerten gewebten oder nicht gewebten Stoff usw. bestehen. Die Reagentien können in den Träger eingebaut werden durch Imprägnieren oder durch chemische oder physikalische Bindung oder aufgrund der Herstellung des Trägers in Gegenwart einer Lösung des Prüfmittels. Der Träger ist üblicherweise an einem Halter oder Griff befestigt oder auf andere Weise mit ihm verbürgen, wie einem inerten Kunststoffstreifen, wobei eine Prüfvorrichtung entsteht die ein bequemes Mittel darstellt zur Handhabung des Trägers bei der Analyse einer Urinprobe.
ίο
Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Prüfmittels bringt man die Testprobe mit dem Prüfmittel zusammen und beobachtet eine etwa auftretende Farbreaktion entweder visuell oder mit Hilfe eines Gerätes. Die Probe besteht üblicherweise aus rohem Urin, kann jedoch unter bestimmten Umständen verdünnter oder auf .widere Weise behandelter Urin sein.
Die Erfindung liefert ein Prüfmittel das geeignet ist zum Nachweis von Harnbilirubin mit einer Empfindlichkeil von 0.1 mg/tOOml in weniger als ■' Minute. Das Prüfmittel behält seine Empfindlichkeit bis zu drei Monaten bei 40°C in trockener Form bei. FZs hat sich durch analytische Verfahren gezeigt, daß die Zersetzung der Diazoniumverbindung in dem trockenen Prüfmittel nach der Erfindung wesentlich geringer ist. als in bekannten Prüfmitteln.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erüiuicri:
Beispiel I
Herstellung und Anwendung von Prüfmitteln zum
Nachweis von Bilirubin und Nachweis der Wirkung der Verstärkungsmittel auf die Reaktion zwischen einer Diazoniumverbindung und Harnbilirubin
Eine Standard-Diazoniumsalzlösung wurde hergestellt durch Zusammengeben der folgenden Bestandteile:
2,4-Dichloranilin 1.125
1,5-Naphthalin-disulfonsäure- 9g
natriumsalz
Sulfosalicylsäure 105 g
Natriumnitrit 1.5 g
Copolymer aus Melhylvinyläther 150 ml
und Maleinsäureanhydrid
(10% wäßrige Lösung)
Methanol 75OmI
Destilliertes Wasser 600 ml
10 50-ml-Anteilt' der Standard-Diazoniumsalzlösung wurden in getrennte Bechergläser gegeben. Zu 9 der Bechergläser wurden dann getrennt die verschiedenen in Tabelle Il angegebenen Ureidoverbindungen zugegeben, wobei deren Sulfonsäureaddukte entstanden. Getrennte Abschnitte Filterpapier wurden jeweils mit einer uCr i\j i^OjurigcM gc^utiigt Uno ge*roc.»"e*. .^is jeweiligen mit dem Reagens imprägnierten Papierstücke, die eine leicht gelbliche Farbe besaßen, wurden in etwa quadratische Kissen von 5 mm geschnitten, die an Kunststoffstreifen mit einem Doppelklebeband befestigt wurden. Je 3 Kissen der entstehenden 10 Reihen von Reagensstreifen wurden getrennt augenblicklich in 3 Urinproben getaucht, enthaltend 0,0, 0,4 und 1,6 mg Harnbilirubin pro 100 ml. Die Intensität der Farbänderung in den Kissen wurde mit Hilfe willkürlicher Einheiten notiert, wobei 0 keine Farbänderung andeutete. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.
Tabelle I
Ureidoverbindung Zu 50 ml Beobachtete Intensität bei der 0,4 1.6 25
Standard Farbreaktion ι der Farbänderung entsprechenden Bilirubinkonzen- 5 30
lösung tration (mg/100 ml) 10 30
zugesetzte 10 ΊΛ
Menge (g) 0,0 >30
Keine purpur 0 12 28
Coffein 5 purpur 0 8 >30
5-Bromuracil 4 purpur 0 10 >30
7,S-5eilzi>-i,4-uiaza:>piiu-[4,j]-ijci_aii-2,4-ui LH I J LMdU G 13 30
l,3-Dimethyl-6,7-diphenyllumazin 1 blau 0 9 >30
1-Methylhydantoin 5 blau 0 11
Parabansäure 5 purpur 0
Uridin 5 purpur 0
Harnstoff 5 blau 2
3-lsobutyl-l-methylxanthin I blau 0
Beispiel 2
Herstellung und Anwendung von Prüfmitteln zum Nachweis der Wirkung der erfindungsgemäßen Verstärkungsmittel auf die Reaktion zwischen einer Diazoniumverbindung und Harnbilirubin
Eine Standard-Diazoniumsalzlösung wurde hergestellt durch Zusammengeben der folgenden Bestandteile:
p-Nitroanilin 0,75 g
1,5-Naphthalindisulfonsäure- 6g
natriumsalz
Sulfosalicylsäure 70 g
Natriumnitrit 1,0 g
Copolymer wie in Beispiel 1) 200 ml
(5% wäßrige Lösung)
Methanol 500 ml
Destilliertes Wasser 300 ml
4 50-ml-Anteile der Standard-Diazoniumsalzlösung wurden in getrennte Bechergläser gegeben. Zu 3 der Bechergläser wurden 5 g der in Tabelle Il angegebenen verschiedenen Ureidoverbindungen gegeben, wodurch deren Sulfonsäureaddukte entstanden. Getrennte Abschnitte Filterpapier wurden jeweils mit einer der vier Lösungen gesättigt und getrocknet. Die jeweiligen mit Reagens imprägnierten Papierabschnitte besaßen eine gelbliche Farbe und wurden in etwa quadratische
bo Stücke von 5 mm geschnitten, die mit Doppelklebeband an Kunststoffstreifen befestigt wurden. Jeweils 5 der entstehenden 4 Gruppen von Streifen wurden getrennt augenblicklich in 5 Urinproben, enthaltend 0,0, 0,2, 0,4, 0,8 und 1,6 mg Harnbilirubin auf 100 ml eingetaucht Die
Intensität der Farbänderung auf den Kissen wurde, wie in Beispiel 1, beobachtet. Die Farbe der Kissen nach der Reaktion war purpur. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.
Tabelle II
Ureidoverbindung
Coffein
Parabansäure
Uridin
Intensität der Farbänderung bei der entsprechenden Bilirubinkonzentration (mg/100 ml)
0,0 0.2 0,4 0,8 1,6
0 10 10 10
5 15 15 15
10 20 20 20
Beispiel 3
Nachweis der Wichtigkeit, eine organische Säure oder π ein Salz davon zu verwenden, das Sulfonsäuregruppen enthält, zur Herstellung des Adduktes mit Verstär-
nt Hip Ronlrti
inn -/iv tern ρ η ριπργ
niumverbindung und Harnbilirubin
Eine Standard-Diazoniumsalzlösung wurde hergestellt durch Zusammengehen der folgenden Bestandteile:
2,4-Dichloranilin
Oxalsäure
Natriumnitrit
Methanol
Destilliertes Wasser
0.5 g 35 g
0,5 g 250 ml 250 ml
4 50-ml-Anteile der Standard-Diazoniumsalzlösung wurden in getrennte Bechergläser gegeben. Zu 3 der Bechergläser wurden jeweils 5 g der verschiedenen in Tabelle III angegebenen Ureidoverbindungen gegeben, wobei die Oxalsäureaddukte dieser Verbindungen ent-
standen. Getrennte Abschnitte Filterpapier wurden jeweils mit einer der vier Lösungen gesättigt und getrocknet. Die entstehenden mit Reagens imprägnierten Papierabschnitte, die eine gelbliche Farbe besaßen, wurden in etwa quadraiische Stücke von 5 mm geschnitten und mit Doppelklebeband an Kunststoffstreifen befestigt. Jeweils 3 der 4 verschiedenen Reagensstreifen wurden getrennt augenblicklich in 3 Uririproben, enthaltend 0,0, 0,4 und 1,6 mg Bilirubin pro 100 ml, getaucht. Die Intensität der Farbänderung wurde, wie in Beispiel I. bewertet. Die entstehende Farbe der Kissen war purpur. Die Ergebnisse sind in Tabelle 111 angegeben.
Tabelle III
Ureidoverbindung
Intensität der Farbänderung bei der je-
konzentration
(mg/100 ml)
Keines
Coffein
/.e-Ben/o-U-dia/aspiro-
[4.5]-decan-2.4-dion
Parabansäure
0.0
0
ο ο
0.4
Aus diesen Werten kann man sehen, daß die Addukte von Ureidoverbindung und Oxalsäure keine verstärkende Wirkung auf die Reaktion zwischen der Diazoniumverbindung und Harnbilirubin besitzen, während in den Beispielen I und 2 gezeigt werden konnte, daß die Addukte von Ureidoverbindung und Sulfonsäuren bei der Testreaktion als Verstärkungsmittel wirken.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Prüfmittel zum Nachweis von Bilirubin in einer Urinprobe, bestehend aus einer Trägermatrix, enthaltend eine Diazoniumverbindung, die mit Harn- bilirubin unter Auftritt einer Farbänderung reagiert, einen Bestandteil, der imstande ist, in der Urinprobe einen sauren pH-Wert zu erzeugen und ein Verstärkungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß das Verstärkungsmittel ein Addukt aus Harnstoff oder einem Harnstoffderivat und einer organischen Sulfonsäure oder einem Salz davon ist
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat ein acyclisches niederes Alkylderivat von Harnstoff ist
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat eine cyclische Ureidoverbindung oder ein Derivat davon ist
4. Mittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß die cyclische Ureidoverbindung oder deren Derivat eine dioxoheterocyclische Ringstruktur der Formel
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