DE2855363B1

DE2855363B1 - Kontrollreagens fuer Teststreifen zum Nachweis von Urobilinogen im Harn

Info

Publication number: DE2855363B1
Application number: DE2855363A
Authority: DE
Inventors: Helmut Dr Phil Nat Rehner; Walter Dr Rer Nat Rittersdorf
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1978-12-21
Filing date: 1978-12-21
Publication date: 1980-05-29
Also published as: US4298498A; JPS5587046A; DE2855363C2; JPS6142823B2

Description

15

20

in fester oder gelöster Form, bezogen auf 11 Lösung, enthält

3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es

30

0,002 bis 0,4 g	2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3),
0 bis 0,1 g	Bilinibinsalz,
0 bis 5,0 g	Aluminiumacetylacetonat oder
	eine äquivalente Menge der ent
	sprechenden Magnesium- oder
	BeryHiumverbindung,
0 bis 0,1 g	Nitrit,
0 bis 7 g	Albumin,
0 bis 0,1 g	Hämoglobin,
03 bis 100 g	Puffersubstanz, pH 7,5 bis 9,0,

0,007 bis 02 g	2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäu-
	re{3).
0 bis 0,07 g	Bilinibinsalz,
0 bis 2,0 g	Aluminiumacetylacetonat oder
	eine äquivalente Menge der ent
	sprechenden Magnesium- oder
	BeryHiumverbindung,
0 bis 0,01 g	Nitrit
0 bis 3,0 g	Albumin,
0 bis 3,0 g	D(+)-Glucose,
0 bis 0,04 g	Hämoglobin,
3 bis 25 g	Puffersubstanz, pH 7,8 bis 8,5,
in fester oder flüssiger Form, bezogen auf 1 1 Lösung,
enthält

40

45

Die Erfindung betrifft ein Kontrollreagens für Teststreifen zum Nachweis von Urobilinogen und gegebenenfalls weiteren diagnostisch relevanten Bestandteilen im Harn.

Für routinemäßige Harnuntersuchungen werden in zunehmendem Maße Teststreifen verwendet Unter Teststreifen werden hierbei feste streifenförmige, stabförmige oder anders geformte Trägermaterialien verstanden, welche Reagenzien enthalten, die beim Eintauchen in die zu untersuchenden Lösungen charakteristische Farbreaktionen geben, welche rein qualitativ oder semiquantitativ bzw. quantitativ sein können. Bei derartigen Teststreifen ist es von Zeit zu Zeit erforderlich, eine Funktionskontrolle vorzunehmen, um den Prozentsatz der falsch-negativen Befunde w möglichst klein zu halten. Für diese Funktionskontrolle werden vorzugsweise sogenannte Kontrollurine eingesetzt

Diese Kontrollurine bestehen meist aus gepoltem humanem Harn, der durch Aufstocken mit gewünschten Harnbestandteilen'oftmalsUh'eine »pathologischen« Harn überführt wird. Aus Haltbarkeitsgründen werden die Kontrollurine, im folgenden als Kontrollreagenzien bezeichnet zumeist gefriergetrocknet Zur Anwendung erfolgt Rekonstitution mit Wasser oder einem Verdünnungsmittel, welches oft Aceton und/oder stabilisierte Erythrozyten enthält Das rekonstituierte Konstrollreagens stellt dann die einsatzbereite Kontrollösung, & h. den Kontrollurin, dar.

Statt humanen Harn als Basis des Kontrollreagens zu verwenden, kann man auch künstliches gepuffertes Gemisch" verwenden, welches den Eigenschaften des humanen Harns möglichst nahekommen sollte. Künstliche" Kontrollurine sind als einsatzbereite Lösungen und "in Tabletten- bzw. Pulverform bekannt und handelsüblich.

Zu den diagnostisch relevanten Bestandteilen des Harns gehört das Urobilinogen. Der Nachweis von Urobilinogen im Harn, der zumeist durch Azo-Kupplung mit einem p-Methoxybenzoldiazoniumsalz erfolgt, dient der Erkennung von Leber- und hämolytischen Erkrankungen. Die meisten bekannten Kontrollurine enthalten jedoch kein Urobilinogen, da diese Verbindung recht instabil ist Man hat deshalb bereits versucht Urobilinogen durch eine andere Verbindung zu ersetzen, die wie Urobilinogen reagiert und außerdem auch stabil ist

Es ist bereits ein künstliches Kontrollreagens (Kontrollurin) bekannt welches eine organische Verbindung als Urobilinogensubstitut enthält die jedoch mit einer anderen Reaktionsfarbe auf dem Urobilinogen-Testfeld des entsprechenden Teststreifens reagiert als das Urobilinogen selbst Dies macht eine quantitative Konzentrationsabschätzung dieses Parameters unmöglich, da sich kein Farbvergleich durchführen läßt. Daher ist im Funktionstest nur eine Ja/Nein-Entscheidung möglich.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Kontrollreagens für Urinuntersuchungs-Teststreifen zu schaffen, welche zum Nachweis von Urobilinogen geeignet sind, und welches für die Urobilinogen-Funktionskontrolle eine von Urobilinogen verschiedene stabile Substanz enthält, die eine Reaktionsfarbe auf dem Urobilinogen-Testfeld liefert, welche mit der Urobilinogenfärbung direkt vergleichbar ist und daher eine quantitative Konzentrationsabschätzung möglich macht. Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Kontrollreagens der vorstehend genannten Art zu schaffen, welches eine Urobilinogen-Ersatzsubstanz enthält, welche im Nachweissystem für Urobilinogen durch Azo-Kupplung mit einem p-Methoxybenzoldiazonium-salz sich analog wie Urobilinogen verhält und bei gleichzeitigem Vorhandensein eines Nachweissystems für Bilirubin auf Basis der Azo-Kupplung mit 2,6-Dichlorbenzoldiazonium-salz nicht stört

Gelöst wird die obige Aufgabe durch ein Kontrollreagens der eingangs genannten Art welches gekennzeichnet ist durch einen bestimmten Gehalt an 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3) oder deren Alkali- oder Erdalkalisalz als Kontrollsubstanz für Urobilinogen.

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3) bzw. deren Alkalioder Erdalkalisalze, vorzugsweise das Natriumsalz, Urobilinogen bezüglich Reaktionsfähigkeit, Farbbildung und Empfindlichkeit in idealer Weise in einem derartigen Kontrollreagens substituieren können. Insbesondere reagiert überraschenderweise diese Verbindung nicht mit dem aktiveren 2,6-Dichlorbenzol-diazoniumsalz, welches dem Bilirubinnachweis dient und stört daher hier nicht durch Vortäuschung eines Bilirubingehalts. Die Untersuchung der Haltbarkeit dieser Verbin-

COPY

dung ergab, daß sowohl die freie 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3) als auch die genannten Salze, insbesondere die Alkalisalze und hier besonders das Natriumsalz, ausreichend stabil sind und daher das instabile Urobilinogen in idealer Weise in einem derartigen Kontrollreagens substituieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Reagens als Ketonkörpersubstitut das Acetylacetonat von Aluminium, Magnesium oder/und Beryllium. Diese Verbindungen sind ausreichend stabil, unterliegen bei den in Frage kommenden pH-Werten nicht der Hydrolyse, führen nicht zur Bildung von wasserunlöslichen Metallhydroxiden und stören den Urobilinogennachweis nicht. Bevorzugt wird die Aluminiumverbindung. Die genannten Acetylacetonate sind praktisch farblos.

Zweckmäßigerweise enthält das erfindungsgemäße Kontrollreagens zusätzlich auch noch bestimmte Mengen der übrigen, üblicherweise als diagnostisch relevant angesehenen Bestandteile des Harns. Hier sind insbesondere zu nennen Nitrit, Eiweiß, insbesondere Albumin, Glucose, Blut (Hämoglobin) und zur Prüfung der pH-Wert-Bestimmung Puffersubstanz. Als Nitrit kommen die leicht löslichen Alkali- und Erdalkalinitrite in Betracht, bevorzugt wird Natriumnitrit Als Eiweiß wird zweckmäßig Albumin, beispielsweise vom Rind, verwendet Glucose wird in Form der D(+)-Glucose eingesetzt, Bilirubin liegt in Form eines löslichen Salzes, vorzugsweise des Natriumsalzes, vor. Für den Parameter Blut wird zweckmäßig Hämoglobin, beispielsweise vom Rind, vorgesehen.

Als Puffersubstanzen können prinzipiell alle gängigen Puffer verwendet werden, die im pH-Bereich 7,5 bis 9,0 puffern. Beispiele sind

Triäthanolamin/HCl,

Natriumpyrophosphat/HCI,

Natriumdiäthylbarbiturat/HCl,

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan/HCl,

Borax/Borsäure,

Natriumborat/HCl,

zwitterionische Puffer nach Good, wie etwa

N,N-bis-(2-Hydroxyäthyl)-glycin,

N-[Tris-(hydroxymethyl)-methyl]-gIycinund

2-[4-(2-Hydroxyäthyl)-piperazinyl(l)]-äthan-

sulfonsäure.

Eine bevorzugte Pufferkapazität beträgt 5 bis 25 mMoI/1 der Lösung.

Eine derartige bevorzugte Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Kontrollreagens enthält

0,002 bis 0,4 g 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3),
0 bis 0,1 g Bilirubinsalz,

Tabelle

0 bis 5,0 g

0 bis 0,1 g
0 bis 7 g
0 bis 0,1 g
0,3 bis 100 g

Aluminiumacetylacetonat oder einer entsprechenden Menge der entsprechenden Magnesium- oder Berylliumverbindung,
Nitrit,
Albumin,
Hämoglobin,
Puffersubstanz, pH 7,5 bis 9,0,

ίο in fester oder gelöster Form, bezogen auf 11 gebrauchsfertige Lösung.

Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung enthält

0,007 bis 0,2 g 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3),

0 bis 0,07 g Bilirubinsalz,

0 bis 2,0 g Aluminiumacetylacetonat oder einer

äquivalenten Menge der entsprechenden Magnesium- oder Berylliumverbindung,

0 bis 0,01 g Nitrit,

0 bis 3,0 g Albumin,

0 bis 3,0 g D(H- )-Glucose,

0 bis 0,04 g Hämoglobin,

0,3 bis 25 g Puffersubstanz, pH 7,8 bis 8,5,

in fester oder flüssiger Form, bezogen auf 11 Lösung.

In den obengenannten Reagenzien beziehen sich die Mengenangaben auf die zur Auflösung in 11 Wasser bestimmte Menge an Feststoff bzw. auf den Gehalt von 11 fertiger Kontrollreagenslösung (künstlicher Urin). Es versteht sich, daß das Reagens auch Vielfache oder Bruchteile der obigen Zusammensetzung enthalten kann, vorausgesetzt die Mengenrelation der Einzelkomponenten bleibt im obigen Rahmen. Als Puffersubstanz wird Natrium-diäthylbarbiturat/Diäthylbarbitursäure bevorzugt.

Ferner können die Kontrollreagenzien noch weitere Bestandteile enthalten, die in Kontrollurinen bekannt sind, wie z. B. andere Zucker, Ascorbinsäure, Farbstoffe, Hormone, Harnstoff, Enzyme und dergleichen. Ferner können Tablettierungshilfsmittel, Füllmittel, Bindemittel, Stabilisatoren, wie z.B. Antioxidantien, oder/und Gleitmittel zugegeben werden.

Die überlegene Stabilität der im erfindungsgemäßen Kontrollreagens enthaltenen 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3) oder ihres Natriumsalzes im Vergleich zum Natriumsalz des Urobilinogens zeigt nachstehende Tabelle. Die Stabilitätsuntersuchungen wurden an Lösungen durchgeführt, die durch Auflösen von Reagenstabletten erhalten wurde, in denen außer den in der Tabelle aufgeführten Substanzen noch Natriumnitrit, Puffer, pH 8,0, Rinderserumalbumin, Glucose, Natriumbilirubinat Aluminiumacetylacetonat und Hämoglobin vom Rind enthalten waren.

Substanz

Ausgangswert

mg/100 ml = 100%

Konzentrationsänderung (%) bei Lagerung bei

35 C

1 Wo 2 Wo 3 Wo 6 Wo

12Wo

Natriumsalz von 7,87

Urobilinogen

2,4-Dimethylpyrrol- 6,59

carbonsäure (3)

Natriumsalz von 2,4-Di- 7,99

methylpyrrolcarbonsäure (3)

-43

-1

+6

-57 -64

-1

+6

-1 -4

+5 -3

-7

Die obigen Werte zeigen die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Kontrollreagens bezüglich Stabilität gegenüber einem urobilinogenhaltigen Reagens gleicher Zusammensetzung. Darüber hinaus hat das erfindungsgemäße Kontrollreagens den Vorteil, eine quantitative Abschätzung des Urobilinogengehaltes durch Vergleich mit der bei der Azo-Kupplung des 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3)-Bestandteils entwikkelten Färbung möglich zu machen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß keine Störung des Bilirubinnachweises auftritt. In der bevorzugten Ausführungsform kommt hinzu, daß auch die Kontrolle der Ketonkörpernachweisreaktion ohne Störung der anderen Nachweisreaktionen und ohne Verringerung der Stabilität des Reagens möglich ist.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Die folgende Tabelle zeigt die Zusammensetzung eines erfindungsgemäßen Kontrollreagens in Form einer Tablette, die zum Auflösen in 15 ml Wasser unter Bildung der gebrauchsfertigen Kontroilösung bestimmt ist.

. Parameter	10	Eiweiß ..	Substanz	Menge/
		Glucose		Tablette
Nitrit	15 Ketonkprper. ,	NaNO₂	0,0675 mg
pH-Wert	Urobilinogen'	Natriumdiäthylbarbi-	26 mg/32 mg
	turat/Diäthylbarbitur-	(pH 8,0)
	säure
₂₀ Bilirubin	Albumin	15,0000 mg
Blut	D(+)-Glucose	15,0000 mg
. Al(Acetylacetonat)₃	8,10 mg
2,4-Dimethylpyrrol-	2,2000 mg
carbonsäure (3),
Natriumsalz
Bilirubin, Alkalisalz	0,5221 mg
Hämoglobin	0,0200 mg

Claims

Patentansprüche:

1. Kontrollreagens für Teststreifen zum Nachweis von Urobilonogen und gegebenenfalls weiteren diagnostisch relevanten Bestandteilen im Harn, gekennzeichnet durch einen bestimmten Gehalt an 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3) oder deren Alkali- oder Erdalkalisalz als Kontrollsub- ·■<■■■-· stanz für Urobilinogen. io.·

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekenn- ' zeichnet, daß es