DE2855363C2

DE2855363C2 -

Info

Publication number: DE2855363C2
Application number: DE2855363A
Authority: DE
Inventors: Helmut Dr.Phil.Nat. 8120 Weilheim Rehner; Walter Dr.Rer.Nat. 6800 Mannheim Rittersdorf
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1978-12-21
Filing date: 1978-12-21
Publication date: 1981-02-19
Also published as: US4298498A; JPS5587046A; JPS6142823B2; DE2855363B1

Description

0,002 bis 0,4 g	2,4-DimethylpyrroIcarbonsäure(3),
0 bis 0.1 g	Bilirubinsalz,
0 bis 5,0 g	Aluminiumacetylacetonat oder
	eine äquivalente Menge der ent
	sprechenden Magnesium- oder
	Berylliumverbindung,
0 bis 0.1 g	Nitrit,
0 bis 7 g	Albumin,
0 bis 0.1 g	Hämoglobin.
0,3 bis 100 g	Puffersubstanz, pH 7,5 bis 9,0,

0,007 bis 0.2 g	2,4- Dimethylpyrrolcarbonsäu-
	re(3).
0 bis 0.07 g	Bilirubinsalz,
0 bis 2.0 g	Aluminiumacetylacetonat oder
	eine äquivalente Menge der ent
	sprechenden Magnesium- oder
	Berylliumverbindung,
0 bis O.Ol g	Nitrit.
0 bis 3.0 g	Albumin,
0 bis 3.0 g	D( + )-Glucose,
0 bis 0.04 g	Hämoglobin,
3 bis 25 g	Puffersubstanz, pH 7.8 bis 8.5.
in fester oder flüssiger Form, bezogen auF 1 I Lösung,
enthält.

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in fester ode,· gelöster Form, bezogen auf 1 11 ösung, enthält

3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es

JO

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Die Erfindung betrifft ein Kontrollreagens für Teststreifen zum Nachweis von Urobilinogen und gegebenenfalls weiteren diagnostisch relevanten Bestandteilen im Harn.

Für routinemäßige Harnuntersuchungen werden in so zunehmendem MaBe Teststreifen verwendet. Unter Teststreifen werden hierbei feste streifenförmige, stabförmige oder anders geformte Trägermaterialien verstanden, welche Reagenzien enthalten, die beim Eintauchen in die zu untersuchenden Lösungen v> charakteristische Farbreaktionen geben, welche rein qualitativ oder semiquantitativ bzw. quantitativ sein können. Bei derartigen Teststreifen ist es von Zeit zu Zeit erforderlich, eine Funktionskontrolle vorzunehmen, um den Prozentsatz der falsch-negativen Befunde <>o möglichst klein zu halten, Für diese Funktionskontrolle werden vorzugsweise sogenannte Kontrollurine eingesetzt.

Diese Kontrollurine bcMehui meist aus gcpooltem humanem Harn, der durch Aufstocken mit gewünschten η> llarnbestandtcilen oftmals in einen »pathologischen« Harn überführt wird. Aus Haltbarkeitsgründen werden die Kontrollurine. im folgenden als Kontrollreagenzien bezeichnet, zumeist gefriergetrocknet Zur Anwendung erfolgt Rekonstitution mit Wasser oder einem Verdünnungsmittel, welches oft Aceton und/oder stabilisierte Erythrozyten enthält Das rekonstituierte Kontrollreagens stellt dann die einsatzbereite Kontrollösung, d. h. den Kontrollurin, dar.

Statt humanen Harn als Basis des KontroUreagens zu verwenden, kann man auch künstliches gepuffertes Gemisch verwenden, welches den Eigenschaften des humanen Hams möglichst nahekommen sollte. Künstliche Kontrollurine sind als einsatzbereite Lösungen und in Tabletten- bzw. Pulverform bekannt und handelsüblich.

Zu den diagnostisch relevanten Bestandteilen des Harns gehört das Urobilinogen. Der Nachweis von Urobilinogen im Harn, der zumeist durch Azo-Kupplung mit einem p-Methoxybenzoldiazoniumsalz erfolgt dient der Erkennung von Leber- und hämolytischen Erkrankungen. Die meisten bekannten Kontrollurine enthalten jedoch kein Urobilinogen, da diese Verbindung recht instabil ist Man hat deshalb bereits versucht Urobilinogen durch eine andere Verbindung zu ersetzen, die wie Urobilinogen reagiert und außerdem auch stabil ist

Es ist bereits ein künstliches KontroUreagens (Kontrollurin) bekannt welches eine organische Verbindung als Urobilinogensubstitut enthält die jedoch mit einer anderen Reaktionsfarbe auf dem Urobilinogen-Testfeld des entsprechenden Teststreifens reagiert als das Urobilinogen selbst Dies macht eine quantitative Konzentrationsabschätzung dieses Parameters unmöglich, da sich kein Farbvergleich durchführen läßt. Daher ist im Funktionstest nur eine Ja/Nein-Entscheidung möglich.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein KontroUreagens für Urinuntersuchungs-Teststreifen zu schaffen, welche zum Nachweis von Urobilinogen geeignet sind, und welches für die Urobilinogen-Funktionskontrolle eine von Urobilinogen verschiedene stabile Substanz enthält, die eine Reaktionsfarbe auf dem Urobilinogen-Testfeld liefert, welche mit der Urobilinogenfärbung direkt vergleichbar ist und daher eine quantitative Konzentrationsabschätzung möglich macht. Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Kontrollreagens der vorstehend genannten Art zu schaffen, welches eine Urobilinogen· Ersatzsubstanz enthält welche im Nachweissystem für Urobilinogen durch Azo-Kupplung mit einem p-Methoxybenzoldiazonium salz sich analog wie Urobilinogen verhält und bei gleichzeitigem Vorhandensein eines NachweissysfTis für Bilirubin auf Basis der Azo-Kupplung mit 2.6-Dichlorbenzoldiazonium-salz nicht stört.

Gelöst wird die obige Aufgabe durch ein Kontrollrea gens der eingangs genannten Art, welches gekennzeichnet ist durch einen bestimmten Gehalt an 2.4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3) oder deren Alkali- oder Erdalkalisalz als Kontrollsubstanz für Urobilinogen.

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3) bzw. deren Alkalioder Erdalkalisalze, vorzugsweise das Natriumsalz. Urobilinogen bezüglich Reaktionsfähigkeit. Farbbildung und Empfindlichkeit in idealer Weise in einem derartigen Kontrollreagens substituieren können. Insbesondere reagiert überraschenderweise diese Verbindung nicht mit dem aktiveren 2,6-Dichlorbenzol-diazoniumsalz, welches dem Bilirubinnachweis dient und stört daher hier nicht durch Vortäuschung eines Bilirubingehalts. Die Untersuchung der Haltbarkeit dieser Verbir.-

dung ergab, daß sowohl die freie 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3) als auch die genannten Salze, insbesondere die Alkalisalze und hier besonders das Natriumsalz, ausreichend stabil sind und daher das instabile Urobilinogen in idealer Weise in einem derartigen Kontrollreagens substituieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Reagens als Ketonkörpersubstitut das Acetylacetonat von Aluminium, Magnesium oder/und Beryllium. Diese Verbindungen sind ausreichend stabil, unterliegen bei den in Frage kommenden pH-Werten nicht der Hydrolyse, führen nicht zur Bildung von wasserunlöslichen Metallhydroxiden und stören den Urobilinogennachweis nicht Bevorzugt wird die Aluminiumverbindung. Die genannten Acetylacetonate sind praktisch farblos.

Zweckmäßigerweise enthält das erfindungsgemäße Kontrollreagens zusätzlich auch noch bestimmte Mengen der übrigen, üblicherweise als diagnostisch relevant angesehenen Bestandteile des Harns. Hier sind insbesondere zu nennen Nitrit, Eiweiß, insbesondere Albumin, Glucose, Blut (Hämoglobin) und zur Prüfung der pH-Wert-Bestimmung Puffersubstanz. Als Nitrit kommen die leicht löslichen Alkali- und Erdalkalinitrite in Betracht, bevorzugt wird Natriumnitrit Als Eiweiß wird zweckmäßig Albumin, beispielsweise vom Rind, verwendet Glucose wird in Form der D( + )-Glucose eingesetzt. Bilirubin liegt in Form eines löslichen Salzes, vorzugsweise des Natriumsalzes, vor. Für den Parameter Blut wird zweckmäßig Hämoglobin, beispielsweise vom Rind, vorgesehen.

Als Puffersubs' ¹TUeIi können prinzipiell alle gängigen Puffer verwendet werden, die im pH-Bereich 7,5 bis 9,0 puffern. Beispielt· sind

Triäthanolamin/HCI, Natriumpyrophosphat/HCI, Natriumdiäthylbarbiturat/HCl, Tris-thydroxymethylJ-aminomethan/HCI, Borax/Borsäure, Natriumborat/HCI,

zwitterionische Puffer nach Good, wie etwa

N.N-bis-(2-Hydroxyäthyl)-glycin, N-[Tris-(hydroxymethyI)-methyl]-glycinund

2-[4-(2-Hydroxyäthyl)-piperazinyI(l)]-äthan-

sulfonsäure.

Eine bevorzugte Pufferkapazität beträgt 5 bis 25 mMol/I der Lösung.

Eine derartige bevorzugte Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Kontrollreagens enthält

0,002 bis 0,4 g 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3), 0 bis 0,1 g Bilimbinsalz,

Tabelle

0 bis 5,0 g Aluminiumacetylacetonat oder einer

entsprechenden Menge der entsprechenden Magnesium- oder Berylliumverbindung,
0 bis 0,1 g Nitrit,

0 bis 7 g Albumin,

0 bis 0,1 g Hämoglobin,

0,3 bis 100 g Puffersubstanz, pH 7 A bis 9,0,

in fester oder gelöster Form, bezogen auf 1 1 gebrauchsfertige Lösung.

Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung enthält

0,007 bis 0,2 g	2,4- Dimethylpyrrolcarbonsäure(3),
O bis 0,07 g	Bilimbinsalz,
0 bis 2,0 g	Aluminiumacetylacetonat oder einer
	äquivalenten Menge der entspre
	chenden Magnesium- oder Berylli
	umverbindung,
0 bis 0,01 g	Nitrit,
0 bis 3,0 g	Albumin,
Ö bis 3,0 g	D(+)-Giucose,
0 bis 0,04 g	Hämoglobin,
03 bis 25 g	Puffersubstanz, pH 7,8 bis 8,5,

in fester oder flüssiger Form, bezogen auf 1 I Lösung.

In den obengenannten Reagenzien beziehen sich die Mengenangaben auf die zur Auflösung in 1 1 Wasser bestimmte Menge an Feststoff bzw. auf den Gehalt von 1 I fertiger Kontrollreagenslösung (künstlicher Urin). Es versteht sich, daß das Reagens auch Vielfache oder Bruchteile der obigen Zusammensetzung enthalten kann, vorausgesetzt, die Mengenrelation der Einzelkomponenten bleibt im obigen Rahmen. Als Puffersubstanz wird Natrium-diäthylbarbiturat/Diäthylbarbitursäure bevorzugt

Ferner können die Kontrollreagenzien noch weitere Bestandteile enthalten, die in Kontrollurinen bekannt sind, wie z. B. andere Zucker, Ascorbinsäure, Farbstoffe, Hormone, Harnstoff, Enzyme und dergleichen. Ferner können Tablettierungshilfsmittel, Füllmittel, Bindemittel, Stabilisatoren, wie z. B. Antioxidantien, oder/und Gleitmittel zugegeben werden.

Die überlegene Stabilität der im erfindungsgemäßen Kontrollreagens enthaltenen 2,4-DimethyIpyrroIcarbonsäure(3) oder ihres Natriumsalzes im Vergleich zum Natriumsalz des Urobilinogens zeigt nachstehende Tabelle. Die Stabilitätsuntersuchungen wurden an Lösungen durchgeführt die durch Auflösen von Reagenstabletten erhalten wurde, in denen außer den in der Tabelle aufgeführten Substanzen noch Natriumnitrit. Puffer. pH 8.0, Rinderserumalbumin, Glucose. Natriumbilirubinat, Aluminiumacetylacetonat und Hämoglobin vom Rind enthalten waren.

Substanz

Ausgangv wert

mg/100 ml = 100%

Kon/enlrationsänderung <%) hei Lagerung bei
35 (

I Wo

2 Wo

.1 Wo

6 Wo

12Wo

Nalriumsalz von 7,87 Urobilinogen

2,4-Dimethylpyrrol- 6,59

carbonsäure (3)

Natriumsalz von 2,4-Di- 7,99

methylpyrrolcarbonsäure (3)

-43 -57

+6

-64

+5 -3

-7

Die obigen Werte zeigen die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Kontrollreagens bezüglich Stabilität gegenüber einem urobilinogenhaltigen Reagens gleicher Zusammensetzung. Darüber hinaus hat das erfindungsgemäße Kontrollreagens den Vorteil, eine quantitative Abschätzung des Urobilinogengehaltes durch Vergleich mit der bei der Azo-Kupplung des 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3)-Bestandteijs entwikkelten Färbung möglich zu machen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß keine Störung des Bilirubinnachweises auftritt In der bevorzugten Ausführungsform kommt hinzu, daß auch die Kontrolle der Ketonkörpernachweisreaktion ohne Störung der anderen Nachweisreaktionen und ohne Verringerung der Stabilität des Reagens möglich ist Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Die folgende Tabelle zeigt die Zusammensetzung eines erfindungsgemäßen Kontrollreagens in Form einer Tablette, die zum Auflösen in 15 ml Wasser unter Bildung der gebrauchsfertigen Kontrollösung bestimmt ist

Parameter

Substanz

Menge/ Tablette

Nitrit	NaNO₂
pH-Wert	Natriumdiäthylbarbi- turat/Diäthylbarbitur säure
Eiweiß	Albumin
Glucose	D(+)-Glucose
Ketonkörper	Al(Acetylacetonat)₃
Urobilinogen	2,4-Dimethylpyrrol- carbonsäure (3), Natriumsalz
Bilirubin	Bilirubin, Alkalisalz
Blut	Hämoglobin

0,0675 mg 26 mg/32 mg (pH 8,0)

15,0000 mg 15,0000 mg 8,10 mg 2,2000 mg

0,5221 mg 0,0200 mg

Claims

Patentansprüche:

1. Kontrollreagens für Teststreifen zum Nachweis von Urobilonogen und gegebenenfalls weiteren diagnostisch relevanten Bestandteilen im Harn, gekennzeichnet durch einen bestimmten Gehalt an 2,4-Dimethylpyrrolcarbonsäure(3) oder deren Alkali- oder Erdalkalisalz als Kontrollsubstanz für Urobilinogen.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es