DE3138602A1 - "verfahren und reagens zur beseitigung einer truebung in einer biologischen fluessigkeit" - Google Patents

"verfahren und reagens zur beseitigung einer truebung in einer biologischen fluessigkeit"

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DE3138602A1
DE3138602A1 DE19813138602 DE3138602A DE3138602A1 DE 3138602 A1 DE3138602 A1 DE 3138602A1 DE 19813138602 DE19813138602 DE 19813138602 DE 3138602 A DE3138602 A DE 3138602A DE 3138602 A1 DE3138602 A1 DE 3138602A1
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description

9931 /2
Technicon Instruments Corporation.TarrytwonjN.Y.V.St.A.
Verfahren und Reagens zur Beseitigung einer Trübung in einer biologischen Flüssigkeit.
Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur wirksamen Beseitigung einer Trübung in einer biologischen Probe, wie beispielsweise menschlichem Blutserum, sowie ein Reagens, das für diesen Zweck verwendet wird. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Reagens, das aus einem oberflächenaktiven Mittel und einem Enzym besteht, sowie seine Anwendung als Mittel zur Entfernung einer Trübung.
Eine Trübung in einer biologischen Probe kann zu großen Schwierigkeiten führen. Sie führt zu schlechten oder ungenauen Ablesungen und daher höchst fragwürdigen Bestimmungen.
Eine Trübung in Serum- und Plasmaproben stellt gewöhnlich auch eine bedeutende Schwierigkeit für die klinische photometrische Analyse dar. Sie ergibt falsche Daten und häufig irreführende photometrische Bestimmungen von Serumbestandteilen. Man nimmt an, daß die Trübung hauptsächlich durch die Erhöhung des Gehaltes an Triglyzeriden im Serum von Patienten verursacht wird, die unter Hyperlipoproteinaemie mit oder ohne Erhöhung des Gesamtcholesteringehaltes leiden. Eine abnorme Erhöhung des Cholesteringehaltes im Serum korreliert erwiesenermaßen mit einem hohen Arteriosklerose-Risiko. Die Bestimmung von Cholesterin und Triglyzeriden ist deswegen von Bedeutung, da genaue Daten dem Arzt die
;. Diagnostizierung von Hyperlipoproteinaemie sowie die
' * Vorhersage bestimmter Herzkrankheiten erleichtern.
. jt. Andere Untersuchungen, wie die Bestimmung von Aspartat-
L Aminotransferase (GOT), Alanin-Aminotransferase (GPT) '/- 5 und Lactat-Dehydrogenase (LDH) usw. , werden durch die
« „ . ■ gleichen Schwierigkeiten wie die Cholesterin- oder Tri-
-" glyzerid- Bestimmung , wie oben erwähnt, beeinträchtigt,
ί wenn trübe Proben zur Untersuchung vorliegen.
t*\^ 10 Klinische Untersuchungen von trübem Serum sind
•%i.- ^" bisher derart gehandhabt worden, daß man die Proben in
„- großen Mengen an einem oberflächenaktiven Mittel , wie
|<Y beispielsweise Polyoxiäthylierter Laurinsäure (US-PS
p. 3 853 465 und US-PS 4 184 848) behandelte. Da lediglich
15 oberflächenaktive Mittel verwendet wurden, waren zum Herbeiführen einer wirksamen Klärung große Mengen an
_ „ diesem Mittel erforderlich. Hohe Konzentrationen an
*>.< oberflächenaktiven Mitteln führen aber häufig zu einer
3„ Wechselwirkung mit anderen chemischen oder enzymatischen
20 Umsetzungen und verursachen eine Komplizierung der Ana-
tt" lyse.
w Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung
eines Reagenzes, das eine Klärung von getrübten bioli-
25 gischen Proben ohne die Anwendung hoher Konzentrationen an oberflächenaktiven Mitteln herbeiführt, sowie ein Verfahren zur Herbeiführung der Klärung der Trübung insbesondere in solchen Fällen, in denen die Probe auf einen bestimmten Bestandteil , wie beispielsweise Cholesterin,
30 hin photometrisch analysiert werden soll.
Gegenstand der Erfindung ist ein zur Herbeiführung der Klärung einer Trübung einer biologischen Probe wirksames Reagens,das ein oberflächenaktives Mittel 35 der Formel:
O (CH2CH2O)xH
R-C-N'
CH2CH2O )yH
worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 5 bis 17 Kohlenstoffatomen und χ und y jeweils 1 bedeuten, sowie ein Enzym enthält, das aus Cholesterin-Esterase oder Lipase oder einem Gemisch daraus besteht.
Durch die Mitverwendung eines Enzyms (Cholesterin-Esterase oder Lipase) , das dem Klärungsmittel gemäß der Erfindung zugesetzt wird, kann der Vorteil erzielt werden, daß das oberflächenaktive Mittel nur in einer verhältnismäßig niedrigen Konzentration vorhanden zu sein braucht.
Der genaue Mechanismus der Trübungsklärung auf — grund des Einsatzes des erfindungsgemäßen Mittels ist noch nicht bekannt. Möglich ist jedoch, daß in den Fällen, in denen Patienten unter Hyperlipaemie leiden, die in den Serenproben gefundene Trübung hauptsächlich auf einen erhöhten Gehalt an Triglyzeriden zurückzuführen ist. Triglyzeride sind wasserunlöslich und normalerweise im Inneren des Fettkerns mit Cholesterinestern in dem Lipoproteinkomplex verborgen. Die Herbeiführung einer Klärung einer lipaemisehen Probe muß durch die Spaltung des Lipoproteins mit Hilfe eines oberflächenaktiven Mittels, wie beispielsweise des Laurinsäurediäthanolamids ( DEA) , und anschließende Hydrolyse der Triglyzeride durch die Enzymbase herbeigeführt werden. Das oberflächenaktive Mittel hilft auch mit bei der Auflösung von Fettsäuren, die dabei in Freiheit gesetzt werden. Ohne Enzym gibt es keine Klärung der Trübung.
Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Reagens in wäßriger, gepufferter Form etwa 0,05 bis etwa 2,5 g oberflächenaktives Mittel pro dl und insbesondere 0,1 bis etwa 0,5 g oberflächenaktives Mittel pro dl sowie mindestens etwa 0,025 Einheiten Enzym pro ml
(Cholesterin - Esterase) , bezogen auf die Gesamtmenge des Reagenzes. Das erhaltene Mittel besitzt einen pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 7,0 .
Wenn das Mittel eine Lipase als Enzym enthält,
beträgt der Gehalt an oberflächenaktivem Mittel etwa 0,05 bis etwa 2,5 und vorzugsweise o,1 bis etwa o,5 g/dl sowie der Gehalt an Enzym mindestens etwa 1,0 Einheiten pro ml des erhaltenen Mittels, das einen pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 8,0 besitzt.
Bei beiden Enzymformulierungen kann der verwendete Puffer ein Maleatpuffer sein, und zwar in Form des Natrium- oder Kaliumsalzes; ferner ein Phosphat- , Borat- , Zitrat-, Succinat^Imidazol-azetat-jTrispuffer usw. Es kann jedoch jeder beliebige geeignete Pufferverwendet werden.
Ein derartiger Puffer ist jeder Puffer, der einen konstanten pH-Wert in dem gewünschten Bereich aufrechterhält, ohne eine der Komponenten zu stören.
■,■■-:- Wenn ein Maleatpuffer verwendet wird, beispiels-
^;^ weise das Kalium- oder Natriumsalz, wird er in einer
ti*:'"':-'* 30 Menge zugesetzt, daß eine etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M- 'p}-# Lösung erhalten wird und der pH-Wert der erhaltenen
^' Formulierung etwa 5,0 bis etwa 7»0 beträgt.
ΨΤ-λ, Ähnliche Konzentrationen werden für die anderen
H?" 35 Puffer angewandt.
Zusätzlich zu den genannten Komponenten kann ein Mittel zur Erhöhung der Löslichkeit bei dem erfindungsgemäßen Mittel zugesetzt werden. Ein derartiges löslichkeitserhöhendes Mittel kann jedes Material sein, das das oberflächenaktive Mittel beim Löslichmachen unterstützt. Beispielsweise eignen sich Salze der Gallensäuren hierfür besonders, wie beispielsweise Natriumcholat, Natriumdesoxycholat usw.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das oberflächenaktive Mittel aus einer Verbindung der obigen Formel, in der R einen Alkylrest bedeutet,wie beispielsweise Laurinsäure-diäthanolamid oder Oleinsäurediäthanolamid.
Das Enzym ist tierischen Ursprungs, beispielsweise tierisches Pankreasgewebe, oder stammt von einem Mikroorganismus.
Biologische Proben, die mit dem erfindungsgemäßen Mittel behandelt werden, sind beispielsweise menschliches Blutserum und Plasma.
Das beschriebene Reagens führt nach Kombination mit einer biologischen Probe zu einer trübungsklärenden Wirkung. Es wird üblicherweise in wäßriger, gepufferter Form eingesetzt.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Reagens zur wirksamen Klärung von Trübungen einer biologischen Probe, die photometrisch analysiert werden soll, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es mindestens ein oberflächenaktives Mittel der Formel
(CH2CH2O)xH
(CH2CH20)yH
worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 5 bis 17 Kohlenstoffatomen und χ und y ganze Zahlen bewirken, deren Summe nicht größer als 11 ist, sowie ein Enzym enthält, das aus Cholesterin- Esterase oder Lipase oder einem Gemisch daraus besteht.
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Ein bevorzugtes Reagens enthält ein oberflächenaktives Mittel der obigen Formel, in der R eine Alkylgruppe, insbesondere Laurylgruppe, bedeutet und die Summe von χ und y 5 sowie das Enzym eine Lipase ist. Formulierungen mit diesem Reagens enthalten zweckmäßigerweise Polyäthylenglykol-p-isooctylphenyläther oder andere geeignete oberflächenaktive Mittel.
Ein weiteres bevorzugtes Reagens, das eine wirksame Klärung trüber Proben im pH-Bereich von 2 bis 10 bewirkt, enthält ein Gemisch aus zwei oberflächenaktiven Mitteln, nämlich von Laurinsäurediäthanolamid (x = y = 1) und äthoxylierter Laurinsäure (x+y =5).
Unter Verwendung dieser genannten oberflächenaktiven Mittel werden entsprechende Enzymformulierungen hergestellt.
30
Geeignete oberflächenaktive Mittel der obigen allgemeinen Formel sind beispielsweise Laurinsäurediäthanolamid, Myristinsäure-diäthanolamid, Kaprinsäurediäthanolamid, Ölsäure-diäthanolamid und Kokossäurediäthanolamid.
"Wenn das Reagens mit einer biologischen Probe vereinigt wird, beseitigt es wirksam die Trübung in der Probe und gestattet, daß die Probe genau photometrisch analysiert werden kann. Auf diese Weise wird eine Probe,
die photometrisch auf Cholesterin analysiert werden soll, mit Vorteil behandelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagens und ein Verfahren zum wirksamen Beseitigen von Trübungen in einer biologischen Probe durch Verwendung eines bestimmten oberflächenaktiven Mittels und eines Enzyms. Das oberflächenaktive Mittel besitzt die Formel :
0 ^(CH2CH2O)xH
R-C-N^
(CH2CH2O) H
worin R eine Alkyl - oder Alkenylgruppe von 5 bis 17 Kohlenstoffatomen bedeutet und χ und y jeweils 1 sind. Vorzugsweise besteht das oberflächenaktive Mittel aus Laurinsäure-diäthanolamid.
Die Enzymkomponente besteht aus Cholesterin-Esterase oder Lipase oder einem Gemisch aus beiden.
Das daraus gebildete Reagens erwies sich überraschend als hochwirksam zur Beseitigung von Trübungen in einer biologischen Probe. Es ist daher äußerst geeignet, um eine biologische Probe , die trübe ist, in eine klare Probe zu überführen.
Die so behandelte Probe kann kolorimetrisch auf jeden beliebigen Einzelbestandteil analysiert werden , solange die bei der Bestimmung verwendeten Reagenzien nicht mit dem oberflächenaktiven Mittel und dem Enzym auf störende Weise reagieren.
Typische Bestimmungen, die tinter Verwendung des genannten Reagenses durchgeführt werden können, sind beispielsweise Bestimmungen von Cholesterin, Triglyzeriden und Kreatinphosphatkenase.
Die Enzymkomponente kann aus einer tierischen Quelle stammen, wie beispielsweise Pankreasgewebe, oder auch von einem Mikroorganismus.
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fc,..
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Als besondere Ausbildung umfaßt die Erfindung ein Reagens und ein Verfahren zum wirksamen Entfernen von Trübungen aus biologischen Flüssigkeiten , die photometrisch analysiert werden sollen. Das Reagens umfaßt mindestens ein oberflächenaktives Mittel, das breiter als oben durch die Formel
(CH2CH2O)xH
Il
R-C-N
definiert ist, worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe von 5 bis 17 Kohlenstoffatomen bedeutet und χ und y ganze Zahlen sind, deren Summe nicht größer als 11 ist, sowie ein Enzym, das aus Cholesterin-Esterase oder Lipase oder einem Gemisch daraus besteht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das oberflächenaktive Mittel ein solches der obigen Formel, in der R einen Alkylrest bedeutet und χ und y jeweils 1 sind. Beispiele für derartige Verbindungen sind Laurinsäure-diäthanolamid, Myristinsäurediäthanolamid und Kaprinsäure-diäthanolamid. Bevorzugt sind ebenfalls oberflächenaktive Mittel der obigen Formel, in denen R ein Alkenylrest ist und χ und y jeweils 1 sind, sowie Ölsäure-diäthanolamid und Kokossäure-
diäthanolamid. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform "besitzt das oberflächenaktive Mittel die obige Formel, bei der R eine Alkylgruppe bedeutet und die Summe von χ und y 5 ist.
Die Enzymkomponente kann von einer tierischen
Quelle stammen , wie Pankreasgewebe, oder von einem Mikroorganismus.
Wenn das Reagens zum Analysieren verwendet wird, wird es in wäßriger, gepufferter Form mit einer biologischen Probe vereinigt. Die trübe Probe wird klar und ist für die Analyse geeignet.
Proben, die sich von dem erfindungsgemäßen Reagens wirksam klären und zur Analyse vorbereiten lassen, sind beispielsweise menschliches Blutserum und Plasma.
Das Verfahren und das Reagens gemäß der Erfindung sind in mindestens zweierlei Hinsicht einzigartig. Sie erlauben die Bestimmung von Bestandteilen in biologischen Proben in einem klaren, freien Zustand ohne Störungen durch Trübungen und gestatten außerdem wegen der Wechselwirkung zwischen dem teilchenförmigen oberflächenaktiven Mittel und dem verwendeten Enzym die Verwendung von geringeren Enzymmengen, als sie normalerweise beispielsweise bei der Cholesterinbestimmung verwendet werden. In letzterer Hinsicht kann die Verwendung geringerer Mengen ohne Erniedrigung der Reaktionsgeschwindigkeiten als Verbesserung der Geschwindigkeit der enzymatischen Umsetzung angesehen werden.
Die üblichste klinische Bestimmung von Cholesterin in einer biologischen Flüssigkeit ist die Bestimmung von Gesamtcholesterin, das sowohl freies Choleste-
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is
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rin als auch Cholesterinester umfaßt. Sowohl Cholesterin als auch seine Ester sind in Serum mit anderen Lipiden und verschiedenen Proteinen in mikromolekularen Komplexen vorhanden, die Lipoproteine genannt werden, und Cholesterinester sind normalerweise als der Hauptbestandteil ( 60 bis 80 %) des Gesamtcholesterins vorhanden. Sie sind allgemein wasserunlöslich und normalerweise im Inneren des Komplexes verborgen und Enzymen gegenüber unzugänglich. Bei der Bestimmung von Gesamtcholesterin durch ein vollständig enzymatisches Verfahren - gleich ob automatisiert oder von Hand - müssen zunächst Cholesterin und Cholesterinester durch ein geeignetes oberflächenaktives Mittel in Freiheit gesetzt werden. Die Cholesterinester werden anschließend durch Cholesterin-Esterase zu freiem Cholesterin hydrolysiert, das seinerseits durch Cholesterin-Oxydase zu Cholestinon und Wasserstoffperoxid oxydiert wird.
ir' .
Das beschriebene Verfahren kann automatisch durchgeführt werden, wie beispielsweise durch Verwendung eines automatischen Analysengerätes, oder auch von Hand.
Bei der Herstellung der Reagenzien zur Verwendung beim Analysieren gemäß dem Verfahren nach der Erfindung wird eine wäßrige Lösung hergestellt, die außer dem oberflächenaktiven Mittel und dem Enzym weitere Materialien enthält, die dem Fachmann bekannt und für derartige Zwecke verwendet werden.
Beispielsweise werden zur Bestimmung von Chole
sterin die folgenden Bestandteile in den angegebenen Konzentrationsbereichen verwendet:
Bestandteil
Peroxidase 0,8 2,0 Einh/1
Cholesterin-Oxidase 0,025 - 0,3 Einh/1
Cholesterin-Esterase 0,025 - 0,3 Einh/1
Oberflächenaktives Mittel 0,05 - 0,5 g/dl
Natriumcholat 0,05 - o,5 g/dl
Natrium-p-hydroxybenzoat 2,5 - 6 g/dl
4-Aminoantipyrin 0,5 - 2,0 mM
Maleinsäure 0,1 - 0,5 M
pH 5,5 - 7,0
Verhältnis Probe/Reagens 100 400
Bei der obigen Formulierung ist es bevorzugt, Cholesterin-Esterase aus einer tierischen Quelle , wie beispielsweise aus Pankreas, zu verwenden; jedoch werden äquivalente Ergebnisse mit Cholesteroin-Esterase aus einem Mikroorganismus erhalten.
Beisp_iel_2
Trübungsbeseitigung als__Funktion_von_Cholesterin-Esterase_
Drei ml Klärungsreagens mit einem Gehalt an Kaliummaleat (0,1 M), Natriumcholat (0,25 g/dl), Laurinsäure- diäthanolamid (0,2 g/dl) , Cholesterin-Esterase (0,08 Einheiten pro. ml bis 0,8 Einheiten pro ml), und einem End-pH-Wert von 6,0 werden mit 0,025 ml lipaemischem Serum (Triglyzeride von etwa 1400 mg/dl) vermischt. Das Umsetzungsgemisch wird innerhalb 10 Min. bei einer Temperatur von 450C klar. Die zum Klären verwendete Cholesterin-Esterase kann aus Pankreas oder aus einem Mikroorganismus stammen.
Verwendung zur Bestimmung von_CbQiesterin_^
Für die Endpunktchemie , wie in diesem Beispiel erläutert, werden die Bestandteile zur Cholesterinbestimmung in das Reagens zur Beseitigung der Trübung eingeschlossen.
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Drei ml einer Zusammensetzung, die 0,125 Einheiten Cholesterin-Esterase je ml , 0,125 Einheiten Cholesterin-Oxidase je ml, 1,6 Einheiten Peroxidase je ml, ferner 4-aminoantipyrin (0,6 mM), Natriumhydroxybenzoat (25 mM) , sowie 0,25 g Natriumcholat pro dl, 0,2 g Laurinsäure-diäthanolamid je dl und Kaliummaleat (0,1 M) enthielt und einen pH-Wert von 6,0 aufwies, wurden mit 0,025 ml einer lipaemischen Serumprobe vermischt. Das Gemisch wurde anschließend 4 bis 5 Minuten bei 45°C bebrütet. Danach wurde das Gesamtcholesterin durch Messung der Farbintensität bei 520 nm bestimmt. Ohne die Trübungsbeseitigung durch das Laurinsäure-diäthanolamid und die Cholesterin -Esterase führt die Cholesterin bestimmung in den dann trüben Proben stets zu falschen Ergebnissen.
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Trübungsbeseitigung_durch_Candida_Li2ase
Drei ml eines Trübungsbeseitigungsreagenses mit einem Gehalt von 0,2 g Laurinsäure-diäthanolamid je dl, 0,25 g Natriumcholat pro dl und 25 Einheiten Lipase je ml, sowie Maleatpuffer und einem pH-Wert von 6,0 werden mit
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0,025 ml lipaemischem Serum vermischt. Die trübe Probe wird nach 5 minütiger Bebrütung bei 45°C klar.
Wird eine äquivalente Menge eines Trübungsbeseitigungsmittels verwendet, das ein Gemisch aus Laurinsäur e-diäthanolamid und äthoxylierter Laurinsäure (x+y=5) verwendet, so werden vergleichbare Ergebnisse der Trübungsbeseitigung erzielt.
Drei ml eines Trübungsbeseitigungsreagenses mit einem Gehalt von 0,2 g eines oberflächenaktiven Mittels der Formel
0 (CH2CH2O) H
(CH0CH0O) H
Z Z 7
worin χ + y = 5 ist, je dl,0,4g Polyäthylenglykose p-isooctylphenyläther (Triton X-100) je dl , ferner
Kaliummaleat (0,2 M) und 25 Einheiten Lipase je ml,sowie einem pH-Wert von 6,0 werden mit 0,05 ml einer lipaemischen Probe vermischt und bei 450C bebrütet. Nach drei Minuten wird die trübe Probe klar. 25
Die Geschwindigkeit der Trübungsbeseitigung wird durch Erhöhung der Pufferkonzentration erhöht.
Ähnliche Ergebnisse werden durch Anwendung höherer Konzentrationen an epoxylierter Laurinsäure (x + y = 5) ohne Mitwirkung von Triton X - 100 erzielt.
A. Zusammensetzung
Es wird eine Zusammensetzung für ein diagnosti-
M8&
sches Reagens in Form einer wäßrigen Lösung von einem Liter hergestellt, wobei die folgenden Bestandteile verwendet werden:
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Bestandteil Konzentration g
Äpfelsäure 11,6 g
KOH 10,0 mM
EDTA (K2) 2,7 mM
Natriumcholat 5,8 mM
Natriuiff-p-hydroxybenzoat 25,0 mM
4-Aminoantipyrin 0,6 g
Laurinsäure-diethanolamid 2,0 Einheiten
Cholesterin-Esterase 125 Einheiten
Cholesterin-Oxidase 125 Einheiten
Meerrettich-Peroxidase 800
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Der pH-Wert wird auf 6,0 eingestellt.
Das Reagenssystem kann aufbewahrt und in Form einer wäßrigen Lösung verwendet werden, oder die Lösung kann auf herkömmliche Weise gefriergetrocknet und mit Wasser rekonstituiert werden, wenn sie gebrauchsfertig gemacht werden soll.
B. Bestimmung_von_Gesamtcholesterin_
^'*ίl3fcitl, t;
Drei ml des obigen Reagenses werden mit 0,025 ml Serum oder rekonstituiertem Serum standard-vermischt, das bzw. der bis zu 500 mg Cholesterin pro dl enthält. Die Umsetzung wird 4 bis 5 Minuten lang bei 45°C durchgeführt. Die Extinktion der Proben bei 525 nm wird gegen eine Blindprobe aus dem Reagens gemessen.
Trübiingsbeseitigiing_bei_der_Bestimmung_der_Aktivität von Kreatinghosghatlcenase (.9_PK)_Y,25 li£aemischem_Serum
Zwei ml Imidazol-acetatpuffer . (0,1 M) vom pH-Wert 6,7 mit einem Gehalt an 0,4 % Laurinsäurediäthanolamid, 25 Einheiten Cholesterin-Esterase aus Pankreas je dl, 0,25 g Natriumcholat pro 100 ml sowie Thioglyzerin (20 mM) werden mit 0,05 ml lipaemischem Serum vermischt. Nach 15 minütiger Befrrütung bei 37°C sinkt der Wert für die Trübung bei 340 nm von einer optischen Dichte ( O.D.) von 2,3 auf eine solche von 0,02. Die klare Probe wird anschließend mit 1 ml CPK Reagens vermischt, das Kreatinphosphat (116,7 mM) , ADP (6,7 mM), AMP (16,7 mM), EDTA (6,7 mM), NADP (6,7 mM), 125 Einheiten Hexokinase pro dl und 100 Einheiten Glukose 6-phosphat Dehydrogenase ((6PDH ) pro dl , hergestellt in Imidazol-acetatpuffer (0,1 M) vom pH-Wert 6,7 , enthält. Die Aktivität der CPK wird bei 340 nm und 37°C in Form des herkömmlichen Verfahrens messend verfolgt.

Claims (1)

  1. Pdrkslraße 13
    6000 Frankfurt a. M. 1 9931
    TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown,N.Y.,VSTA.
    P_a_t_e_n_t_a_n_s_£_r_ü_c_h_e_
    1. Reagens zum Beseitigen einer Trübung einer biologischen Probe ,
    dadurch gekennzeichnet, daß es ein oberflächenaktives Mittel der Formel
    (CH2CH2O)xH
    R-C-N
    ^^~^- (CH2CH20)yH
    worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 5 bis 17 Kohlenstoffatomen bedeutet und χ und y jeweils 1 sind, sowie ein Enzym enthält, das aus Cholesterin-Esterase oder Lipase oder einem Gemisch daraus besteht.
    2. Reagens gemäß Anspruch 1,
    dadurch gekennzeichnet, daß es in wäßriger,gepufferter Form vorliegt, daß das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von etwa 0,05 bis etwa 2,5 g/dl und das Enzym in Form von Cholesterin-Esterase und in einer Konzentration von mindestens etwa 0,025 Einheiten pro ml der erhaltenen Zusammensetzung vorliegen und die Zusammensetzung einen pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 7,0 aufweist.'
    3. Reagens gemäß Anspruch 2,
    dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ein Maleat in einer Konzentration von etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M ist und der pH-Wert der erhaltenen Zusammensetzung bei etwa 5,0 bis etwa 7>0 liegt.
    4. Reagens gemäß Anspruch 2,
    dadurch gekennzeichnet,
    r- daß es außerdem ein Mittel zur Erhöhung der Löslichkeit
    r** enthält.
    \ 5
    5· Reagens gemäß Anspruch 4, v ' dadurch gekennzeichnet,
    daß das Mittel zur Erhöhung der Löslichkeit aus Natrium- >\v, cholat oder Natriumdesoxycholat in einer Menge besteht,
    f, 1° daß etwa eine Konstellation von 0,25 g/dl der gesamten Ä - < Zusammensetzung erreicht werden.
    6. Reagens gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    f. w 15 daß es in wäßriger,gepufferter Form vorliegt, daß das £-,- oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von
    fc ^ etwa 0,05 bis etwa 2,5 g/dl und das Enzym in Form
    einer Lipase und in einer Konzentration von mindestens etwa 1,0 Einheiten pro ml der erhaltenen Zusammensetzung vorliegen und daß die Zusammensetzung einen pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 8,0 aufweist.
    7. Reagens gemäß Anspruch 6,
    _ dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ein Maleat in einer Konzentration von etwa 0,05 "bis etwa 0,5 M ist und der pH -Wert der erhaltenen Zusammensetzung bei etwa 5,0 bis etwa 7,0 liegt.
    8. Reagens gemäß Anspruch 6,
    dadurch gekennzeichnet,
    daß es ein Mittel zur Erhöhung der Löslichkeit enthält.
    g. Reagens gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Erhöhung der Löslichkeit Natriumcholat oder Natriumdesoxycholat in einer Menge ist, daß eine Konzentration von etwa 0,25 g/dl der gesamten Zusammensetzung erreicht werden.
    10. Reagens gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oberflächenaktives Mittel der in Anspruch angegebenen Formel enthält, in der R eine Alkylgruppe bedeutet.
    11. Reagens gemäß Anspruch 10,
    dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktives Mittel Laurinsäure-diäthandL-amid enthält.
    12. Reagens gemäß Anspruch 1,
    dadurch gekennzeichnet, daß es ein Enzym enthält, das tierischen Ursprungs ist oder von einem Mikroorganismus stammt.
    13. Reagens gemäß Anspruch 12,
    dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Cholesterin-Esterase aus tierischem Pankreasgewebe enthält.
    14. Verfahren zur wirksamen Beseitigung einer Trübung in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die biologische Probe mit einem Reagens gemäß Anspruch 1 vereinigt.
    15. Verfahren gemäß Anspruch 14,
    £ j--. dadurch gekennzeichnet,
    Mi&: daß man das Reagens in wäßriger,gepufferter Form
    *-·■■' verwendet.
    ff. 5
    £&■/ 16. Verfahren gemäß Anspruch 15,
    :. ; dadurch gekennzeichnet,
    daß man als biologische Probe eine Serumprobe vom
    I1-V1 Menschen verwendet.
    IC 10
    £ 17. Reagens zur Trübungsbeseitigung in einer biologi-
    vf } ^ sehen Probe zur Verwendung bei einer photometrischen
    ;> Analyse der Probe,
    - dadurch gekennzeichnet,
    Ijn. »J 15 daß es mindestens ein oberflächenaktives Mittel der
    ff': ; Formel
    (CH2CH2O)xH -"^ (CH2CH2O)7H ,
    worin R eine Alkyl- oder Alkeny!gruppe mit 5 bis 17 Kohlenstoffatomen bedeutet und χ und y ganze Zahlen sind, deren Summe nicht größer als 11 ist, sowie ein Enzym enthält, das aus Cholesterin-Esterase, Lipase oder einem Gemisch daraus besteht.
    18. Reagens gemäß Anspruch 17,
    dadurch gekennzeichnet, daß es in wäßriger, gepufferter Form vorliegt, daß das oberflächenaktive Mittel der in Anspruch 17 angegebenen Formel, in der χ + y nicht größer als 5 ist, in einer Konzentration von etwa 0,05 bis etwa 2,5 g/dl und das Enzym als Cholesterin-Esterase und in einer Konzentration von mindestens etwa 0,025 Einheiten je ml der erhaltenen Zusammensetzung vorliegen und die Zusammensetzung einen pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 8,0 besitzt.
    JZ.
    19. Reagens gemäß Anspruch 18,
    dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ein Maleat ist und in einer Konzentration von etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M verwendet wird und der pH-Wert der erhaltenen Zusammensetzung etwa 5,0 bis etwa 7,0 beträgt.
    20. Reagens gemäß Anspruch 17,
    dadurch gekennzeichnet, daß es in wäßriger,gepufferter Form vorliegt, daS das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von etwa 0,05 bis etwa 0,5 g/dl und das Enzym als Lipase und in einer Konzentration von mindestens etwa 1,0 Einheiten pro ml der erhaltenen Zusammensetzung vorliegen und die Zusammensetzung einen pH-Wert im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 10,0 besitzt.
    21. Reagens gemäß Anspruch 20,
    dadurch gekennzeichnet, daß als Puffer ein Maleat, Zitrat, Succinat, Trispuffer oder ein Borat in einer Konzentration von etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M verwendet wird und der pH-Wert der · erhaltenen Zusammensetzung etwa 2,0 bis etwa 10,0 beträgt.
    22. Reagens gemäß Anspruch 17,
    dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel ein solches der in Anspruch 1 angegebenen Formel ist, in der R eine Alkylgruppe bedeutet und χ und y jeweils 1 sind.
    23. Reagens gemäß Anspruch 22,
    dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel Laurinsäure-diäthanolamid, Myristinsäure-diäthanolamid oder Caprinsäure-diäthanolamid ist.
    -6-
    24. Reagens gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel ein solches der im Anspruch 1 angegebenen Formel ist, in der R eine Alkenylgruppe bedeutet und χ und y jeweils gleich 1 sind.
    10
    25. Reagens gemäß Anspruch.24,
    dadurch gekennzeichnet,
    daß das oberflächenaktive Mittel Ölsäure-diäthanolamid
    oder Kokossäure-diäthanolamid ist.
    26. Reagens gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym tierischen Ursprungs ist oder von einem Mikroorganismus stammt.
    20
    27· Reagens gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Cholesterin-Esterase ist, die aus tierischem Pankreasgewebe stammt.
    25
    28. Reagens gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel ein solches der Formel gemäß Anspruch 17 ist, in der R eine Alkylgruppe bedeutet und die Summe von χ und y 5 ist, und daß das Enzym eine Lipase ist .
    29. Reagens gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet,
    daß es außerdem Polyäthylenglykol-p-isooctyl-phenyläther (Triton X-100) enthält.
    30. Verfahren zur wirksamen Beseitigung einer Trübung in einer biologischen Probe, die photometrisch analysiert werden soll,
    dadurch gekennzeichnet, daß man .die Probe mit einem Reagens gemäß Anspruch 17 vereinigt.
    31. Verfahren gemäß Anspruch 30,
    dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagens verwendet, das in wäßriger,gepufferter Form vorliegt.
    32. Verfahren gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß. .man als biologische Probe eine Probe menschlichen Serums verwendet.
    33. Verfahren gemäß Anspruch 30,
    dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe photometrisch auf Cholesterin analysiert.
    3A-. Reagens gemäß Anspruch 17»
    dadurch gekennzeichnet, daß es in wäßriger,gepufferter Form vorliegt, daß das oberflächenaktive Mittel aus einem Gemisch aus Laurinsäure-diäthanolamid und äthoxylierter Laurinsäure (x + y = 5 gemäß Formel aus Anspruch 17) besteht und daß das Gemisch in einer Konzentration von etwa 0,05 bis etwa 2,0 g/dl der erhaltenen Zusammensetzung vorliegt und die Zusammensetzung einen pH-Wert im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 10,0 aufweist.
    35. Reagens gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 0,5 g/dl der erhaltenen Zusammensetzung vorliegt.
    36. Reagens gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 0,5 g /dl der erhaltenen Zusammensetzung vorliegt.
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