DE2724757C2 - Mittel zur Beseitigung von Trübungen in Serum und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Mittel zur Beseitigung von Trübungen in Serum und Verfahren zu seiner Herstellung

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Description

Die !'Windung betrifft ein Mittel /ur Beseitigung von hoKuiifüiscnc Messungen Storci
Seren, enthaltend einen Polyäthylenglykol-fettsäureester, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung.
Photometrische klinisch-cherr.ische oder sonstige analytische Tests sind bei stark getrübten Lösungen oft erschwert oder unmöglich. Bei stark getrübten Lösungen war man bisher auf andere Verfahren angewiesen. Dies trifft insbesondere für getrübte Seren zu.
Aus der DE-AS 23 27 894 ist ein Mittel zur Aufhellung trüber Seren bekannt, welches aus Polyäthylenglykollauraten mit 9 bis 20 Äthylenoxideinheiten besteht. Hierbei handelt es sich um klar wasserlösliche Substanzen mit HLB-(hydrophilic-lipophilic-balance)-Werten über 13,3. Es hat sich jedoch gezeigt, daß mit einem derartigen Mittel nur bei durch Seren schwach getrübten Lösungen eine geringe Aufhellung zu erzielen ist. Eine vollständige Beseitigung der Trübung gelingt damit nicht
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Mittel der oben beschriebenen Art zu schaffen, welches auch bei stark getrübten Seren eine vollständige oder doch für eine photometrische Messung ausreichende Trübungsbeseitigung ermöglicht Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, ein Mittel zu schaffen, mit welchem photometrische klinisch-chemische Tests mit Trübungen bildenden Seren auch in kontinuierlich arbeitenden Testautomaten durchgeführt werden können.
Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß mit Polyäthylenglykolestern, die nicht mehr klar wasserlöslich sind, also selbst zu Trübungen führen, eine weitaus bessere Trübungsbeseitigung erzielbar ist, als mit den bekannten, klar wasserlöslichen Mitteln.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Beseitigung von photometrische Messungen störenden Trübungen in Seren, enthaltend einen Polyäthylenglykol-fettsäureester ist daher dadurch gekennzeichnet, daß es einen oder mehrere Mono- oder Diester von Polyäthylenglykol und Fettsäuren von 9 bis 14 C-Atomen mit höchstens 8 Äthylenoxideinheiten je Fettsäurerest im Molekül enthält, wobei der Ester oder das Estergemisch einen HLB-Wert zwischen 8 und 12,8 aufweist.
Als Säureanteil wird im Rahmen der Erfindung Laurinsäure bevorzugt Gute Ergebnisse werden jedoch auch mit Pelargonsäure, Caprinsäure, Undecylsäure, Tridecylsäure und Myristinsäure erhalten.
Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erzielt, wenn der Anteil an Estern mit weniger als 5, insbesondere mit 3 bis 4, Äthylenoxideinheiten im
so Molekül 10 bis 40 Gew.-% des gesamten Mittels ausmacht.
Die Esterkomponente des erfindungsgemäßen Mittels ist selbst in den Serumbestimmungsansätzen nicht klar löslich und führt daher zum Auftreten weiterer Trübungen, wenn es einem Serum zugesetzt wird. Je nach der Zusammensetzung des Serums verschwindet jedoch sowohl die durch den Zusatz des erfindungsgemäßen Mittel hervorgerufene Trübung als auch die ursprüngliche Trübung innerhalb einiger Minuten und
w) man erhält in vielen Fällen bereits ein völlig klares Serum. In anderen Fällen ist es jedoch erforderlich, zusätzlich noch einen Löslichkeitsverbesserer zuzugeben. Als Löslichkeitsverbesserer eignen sieh solche Substanzen, welche das erfindungsgemäße Mittel klar
■ ■ aufzulösen vermögen ohne selbst die photometrische Messung zu stören. Vorzugsweise werden niedrige Alkenole, insbesondere Äthanol mit 1 bis 3 C-Atomen, QNK.olc mit hU 7ij fi C-AtO1TlCP. ^nlvtrlvkolf' mit his 7Ii 8
Äthylenoxideinheiten oder/und Tenside, die selbst die Trübungen im Serum nicht aufzuhellen vermögen, als Löslichkeitsverbesserer verwendet. Unter den Tensiden werden wiederum die Polyäthylenglykoläiher bevorzugt. Als besonders geeignet erwiesen sich Polyäthylenglykoläther von Alkanolen mit 8 bis 16 C-Atomen im Molekül, welche 8 bis 14 Äthylenoxideinheiten enthalten.
Für das erfindungsgemäße Mittel ist es wichtig, daß Verunreinigungen möglichst gering sind. Insbesondere sollte das Mittel frei sein von Spuren von Alkohol und Säure. Handelsübliche Polyäthylenglykolester eignen sich daher in der Regel nicht ohne zusätzliche Reinigungsschritte für das erfindungsgemäße Mittel. Bei diesem Reinigungsverfahren müssen auch darin enthaltene Polyglykole abgetrennt werden. Dies ist beispielsweise möglich durch Ausschütteln der wäßrigen Lösungen mit halogenierten Kohlenwasserstoffen, wie z. B. Trichloräthylen.
Bevorzugt werden jedoch die Ester des erfindungsgemäßen Mittels direkt hergestellt nach einem Verfahren, welches störende Verunreinigungen ausschließt und von vorneherein die gewünschte Zusammensetzung hinsichtlich der Häufigkeitsverteilung der Äthylenoxidgruppen ergibt. Erfindungsgemäß ist daher ein Verfahren zur Herstellung des genannten Mittels dadurch gekennzeichnet, daß man Polyäthylenglykole mit 3 bis 8 Äthylenoxideinheiten im Molekül mit Borsäure im Molverhältnis 3 :1 umsetzt, das erhaltene Produkt mit Fettsäure von 9 bis 14 C-Atomen erhitzt, danach durch Zusatz von Wasser hydrolysiert, mit einem polaren organischen, mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel extrahiert, die organische Phase abtrennt, trocknet, mit Aluminiumoxid behandelt und schließlich Aluminiumoxid und Lösungsmittel abtrennt.
Die Veresterung von Polyäthylenglykolen mit einer Fettsäure über den Trisäthylenglykolorthoborsäureester ist an sich bekannt aus »Tenside«, ^2, 313 bis 315 (1975). Das bekannte Verfahren führt jedoch immer noch zu einem Produkt mit unerwünschten Verunreinigungen. Durch die erfindungsgemäße Verfahrensweise wird dagegen ein Produkt von ausreichender Reinheit direkt erhalten. Die Lösungsmittelextraktion erfolgt vorzugsweise aus mit Salz gesättigter wäßriger Lösung. Als Extraktionsmittel eignen sich insbesondere halogenierte Lösungsmittel, wie Chloroform.
Die Umsetzung mit Borsäure erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 80 und 100°C während mindestens 7 Stunden im Wasserstrahlvakuum.
Nach dem beschriebenen Verfahren über die Borsäureester hergestellte Fettsäure-Polyäthylenglykolester sind für das erfindungsgemäße Mittel nicht nur auf Grund ihrer überlegenen Reinheit besonders geeignet, sondern auch auf Grund ihrer Molrkulargewichtsverteilung. Die niedermolekularen Anteile mit bis zu 5 Äthylenoxideinheiten im Molekül reagieren hierbei nämlich bevorzugt, so daß sich das Optimum zu den niedriger kondensierten Produkten hin verschiebt.
Es ist aber auch möglich, gereinigte handelsübliche Ester der genannten Art zur Herstellung des Mittels zu verwenden. In letzterem Fall werden vorzugsweise niedermolekulare Ester, also solche mit 3 und 4 Äthylenoxideinheiten im Molekül zugesetzt. Geeignete Mengen liegen zwischen etwa 5 und etwa 20 Gew.-%.
Neben den genannten wesentlichen Bestandteilen kann das erfindungsgemäße Mittel auch noch Pufferlösung und andere gegenüber Serumbestandteilen inerte und in Analvsensystemen geläufige Zusätze enthalten, soweit durch Proben sichergestellt ist, daß sie die Wirkung des Mittels nicht beeinträchtigen.
Das erfindungsgemäße Mittel wird in solchen Mengen zugesetzt, daß man die gewünschte Klärungswirkung erzielt. Im allgemeinen liegen diese Mengen zwischen etwa 0,1 und 5% je nach Zusammensetzung des aufzuhellenden Serums und der sonstigen, dem Serum zugesetzten Reagentien. Es können jedoch auch kleinere Mengen ausreichen oder größere Zusätze
ίο erforderlich sein, letzteres insbesondere bei stark lipämischen Seren.
Sind größere Mengen nötig, so ist es vielfach zweckmäßig, einen niedrigen Alkanol (1 bis 3 C-Atome) oder einen Glykol mit bis zu 7 C-Atomen oder Polyglykol mit bis zu 8 Äthylenoxideinheiten im Molekül als Löslichkeitsverbesserer zuzusetzen.
Hierbei muß die Alkoholempfindlichkeit der Bestandteile in der Lösung berücksichtigt werden. Insbesondere wenn alkoholempfindliche Enzyme vorhanden sind, ist es oft zweckmäßiger, stattdessen ein Tensid als Lösungsvermittler zuzusetzen.
Wird beispielsweise Glukose nach der Glukoseoxidasemethode bestimmt, so genügt erfahrungsgemäß ein Zusatz, der 0,4% des Esters und 0,1 bis 0,4% des Lösungsvermittlers entspricht, auch wenn im nichtenteiweißten Serum die optische Bestimmung durchgeführt werden soii. Wird andererseits in einer trüben Serumprobe Harnsäure mittels Katalase und Aldehydciehydrogenase bestimmt, so ist ein Zusatz des Mittels, der 3 Gew.-% Ester entspricht, erforderlich.
Falls als Löslichkeitsverbesserer ein Tensid verwendet wird, so soll dessen Zusatz so gerinp als möglich gehalten werden. Denn durch einen solchen Zusatz wird zwar die Löslichkeit des erfindungsgemäßen Mittels heraufgesetzt, gleichzeitig wird aber auch die trübungsbeseitigende Wirksamkeit verschlechtert.
Wie bereits erwähnt, ermöglicht das erfindungsgemäße Mittel die Beseitigung von Trübungen in Serum, wobei dies auch dann gelingt, wenn eine sehr starke Trübung vorliegt. In vielen Fällen ermöglicht erst der Zusatz des erfindungsgemäßen Mittels auch das Durchführen von optischen Bestimmungen in nichtenteiweißten Serumproben. Das Mittel eignet sich dabei sowohl für Substrat als auch für Enzymbestimmungen
;' Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Mittel wertvoll auch bei Bestimmungen, bei denen wegen des geringen Serumzusatzes auch bei an sich stark trüben Seren meßtechnisch keine besonderen Schwierigkeiten vorliegen. Bei Zusatz des erfindungsgemäßen Mittels kann häufig auf das Mitführen einer Eichmeßreihe verzichtet werden und die Messung nur gegen den Reagentienleerwert erfolgen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
Herstellung des Mittels
Je 2 Mol eines Polyäthylenglykols mit 3 bis 8
w. Äthylenoxideinheiten werden mit 0,66 Mol Borsäure unter Wasserstrahlvakuum innerhalb von 2 Stunden bis auf 900C erhitzt. Der Ansatz wird dann weitere 6 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Nach dem Abkühlen werden 0,2 Mol Laurinsaure und 7 y p-Toluol-
■ . sulfonsäure zugesetzt. Daiir. wird innerhalb von 2 Stunden auf 1000C erhitzt und weitere 2 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Dann wird zur Hydrolyse ein gleiches Volumen Wasser zugesei/i und 1 Stunde
gerührt. Anschließend wird die Lösung mit Kochsalz gesättigt und dreimal mit Tisigestcr ausgeschüttelt. Die vereinigten Fsterphaser. werden über Natriumsulfat getrocknet und dan,] dui etwa 100 ml eingeengt. Dann wird d\: I ösnng mit 50 g basischem Aluminiumoxid geschüttelt. Im üünnschichtchromatogranini wird Fettsäurefreiheit geprüft. Falls noch Fettsäurespuren vorhanden sind, wird die Aluminkimoxidbehanrihing wiederholt. Anschließend wird das Aluminiumoxid abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen, zuletzt im ölpumpenvakuum.
Ausbeute 60 bis 90% je nach Kettenlänge des Polyäthylenglykols.
Durch Mischen von je 15 Gew.-Teilen der wie oben beschrieben erhaltenen Laurinsäureester von Polyätbylenglykolen mit 3, 4 bzw. 5 Äthylenoxideinheiten mit je 20 Gew.-Teilen der Ester mit 5 bzw. 7 Äthylenoxideinheiten und etwa 5% Ester mit 8 Äthylenoxideinheiten wird ein erfindungsgemäßes Mittel hergestellt.
Beispiel 2
Ein im Handel erhältliches Polyäthylenglykol-Laurinsäureestergemisch mit etwa 4% Triäthylenglykolester, etwa 10% Tetraäthylenglykolester, etwa 15% Pentaäthylenglykolester und etwa 60% Hexa-, Hepta- und Octaäthylenglykolester wird von der wäßrigen Lösung mit Trichloräthylen extrahiert und dann getrocknet. Dem so erhaltenen Produkt werden 8% eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Triäthylenglykolesters zugesetzt.
Beispiel 3
Harnsäurebestimmung
0,1 ml einer stark trüben Serumprobe wird mit 1 ml einer Reagentienlösung folgender Zusammensetzung vermischt:
45mM ICP2O7, pH 8,5; NAD+; Katalase; Aldehyddehydrogenase; 5 Vol.-% Äthanol; 3 VoI.-% des Mittels von Beispiel 2.
Nach 5minütigem Stehen bei Raumtemperatur war die Probe aufgeklärt.
Nach Serumzugabe betrug die Extinktion ohne Zusatz des erfindungsgemäßen Mittels AEm nm = 2,239.
Mit Zusatz des Mittels AE3M nm = 0,777.
Reagentienleerwert: A E= 0,570.
Die Bestimmung der Harnsäure in der aufgeklärten Probe erfolgt durch Zusatz von Uricase und Messung der Extionktionsänderung (AE) bei 334 nm (Fi g. 1 der Zeichnung).
3 c- i s ρ i c 1 4
Blutzückerbcstimiiiu.'ig ohne Enteiweißung
0.02 ml einer stark trüben Serumprobe werden mil 2 ml einer Reagentienlösung folgender Zusainiüciisei- T'.w-f, vermischt:
0.2 M Tris/Phosphatpuffer, pH 8,0; Phenol; p-Amino antipyrin. Peroxirlase (POD), Glukoseoxidase (GOD) 0,4 Vol.-% !'olyäthylenglykoldodecyläther mit ca Ί iü Äthylenoxideinheiten, 0,4 Vol.-% Mittel von Beispiel 2.
Aufklärung der Probe und Farbentwicklung erfolger gleichzeitig, die Extinktionsänderung ist in Fig.2 dei Zeichnung dargestellt.
B eis piel 5
Bestimmung der
Glutamat-Oxalacetat-TransaminaseiGOT)
0,5 ml einer trüben Serumprobe werden mit 3,1 ml einer Reagentienlösung folgender Zusammensetzung vermischt:
Phosphatpuffer, pH 7,4; Aspartat, NADH, Lactatdehydrogenase (LDH), Malatdehydrogenase (MDH) 2,85 Vol.-% Mittel von Beispiel 2.
Die Ausgangsextinktion des Serums betrug 1,870 Nach 30 Minuten Stehen war die Probe aufgeklärt Extinktion = 0,820. Der Start erfolgte durch Zugabe von Λ-Ketoglutarat und Messung der Extinktionsände-
Meßergebnisse.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn wie in den Beispielen 3 bis 5 beschrieben vorgegangen wird an Stelle des Mittels von Beispiel 2 jedoch ein Mittel verwendet wird, das aus 60% Polyäthylenglykol-300-Laurat und 40% Polyäthylenglykol-200-Laurat hergestellt nach Beispiel 1 aus handelsüblichem Polyäthylenglykol 300 bzw. 200, besteht. Dieses Mittel hat laut gaschromatographischer Analyse folgende Zusammensetzung:
Monoglykol-L 1,2%
Diglykol-L 3,1 %
Triglykol-L 13,1 %
Tetraglykol-L 17,9%
Pentaglykol-L 16,2%
Hexaglykol-L 15,1 %
Heptaglykol-L 12,4%
Octoglykol-L 8,6 %
Nonaglykol-L 4,9 %
Decaglykol-L 2,6 %
Undecaglykol-L 1,1 %
Dodecaglykol-L 0,4 %
Verunreinigungen an freiem Polyglykol untei 2%.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (12)

Patentansprüche:
1. Mittel zur Beseitigung von photometrische Messungen störenden Trübungen in Seren, enthaltend einen Polyäthylenglykol-fettsäureester, dadurch gekennzeichnet, daß es einen oder mehrere Mono- oder Diester von Polyäthylenglykol und Fettsäuren von 9 bis 14 C-Atomen mit höchstens 8 Äthylenoxideinheiten je Fettsäurerest im Molekül enthält, wobei der Ester oder das Estergemisch einen HLB-Wert zwischen 8 und 12,8 aufweist.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es überwiegend aus Laurinsäureestern besteht.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder ?, dadurch gekennzeichnet, daß es 10 bis 40 Gew.-% Polyäthylenglykolester mit 3 bis 4 Äthylenoxideinheiten je Fettsäurerest im Molekül enthält.
4. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen oder mehrere Löslichkeitsverbesssrer enthält
5. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Löslichkeitsverbesserer einen niedrigen Alkanol mit 1 bis 3 C-Atomen oder einen Glykol mit bis zu 7 C-Atomen oder Polyglykol mit bis zu 8 Äthylenoxideinheiten enthält.
6. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Löslichkeitsverbesserer ein oder mehrere Tenside enthält, die aiieine die Trübungen nicht zu beseitigen oder wesentlich aufzuhellen vermögen.
7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Tensid ein Polyäthylenglykoläther eines Alkanols mit 8 bis 16 C-Atomen im Molekül ist, welcher 8 bis 14 Äthylenoxideinheiten enthält.
8. Mittel nach einem der vorhergeherden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es frei von Säure- und Aldehydspuren ist.
9. Verfahren zur Herstellung des Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Polyäthylenglykole mit 3 bis 8 Äthylenoxideinheiten im Molekül mit Borsäure im Molverhältnis 3 :1 umsetzt, das erhaltene Produkt mit Fettsäure von 9 bis 14 C-Atomen erhitzt, danach durch Zusatz von Wasser hydrolysiert, mit einem polaren organischen, mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel extrahiert, die organische Phase abtrennt, trocknet, mit Aluminiumoxid behandelt und schließlich Aluminiumoxid und Lösungsmittel abtrennt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion aus salzgesättigter wäßriger Lösung durchführt.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet,daß man als Extraktionsmittel einen Halogenkohlenwasserstoff verwendet.
12. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1 bis 8 in einer Menge von 0,1 bis 5 Gew.-% zur Trübungsbeseitigung in Serum.
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