CH635437A5 - Verfahren zur beseitigung von photometrische messungen stoerenden truebungen in seren. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beseitigung von photometrische Messungen störenden Trübungen in Seren sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens.
Photometrische klinisch-chemische oder sonstige analytische Tests sind bei stark getrübten Lösungen oft erschwert oder unmöglich. Bei stark getrübten Lösungen war man bisher auf andere Verfahren angewiesen. Dies trifft insbesondere für getrübte Seren zu.
Aus der DE-AS 23 27 894 ist ein Mittel zur Aufhellung trüber Seren bekannt, welches aus Polyäthylenglykollauraten mit 9 bis 20 Äthylenoxideinheiten besteht. Hierbei handelt es sich um klar wasserlösliche Substanzen mit HLB-(hydrophilic-lipophilic-balance)-Werten über 13,3. Es hat sich jedoch gezeigt, dass mit einem derartigen Mittel nur bei durch Seren schwach getrübten Lösungen eine geringe Aufhellung zu erzielen ist. Eine vollständige Beseitigung der Trübung gelingt damit nicht.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art sowie ein Mittel zu dessen Durchführung zu schaffen, welches auch bei stark getrübten Seren nicht nur eine vollständige sondern für eine photometrische Messung ausreichende Trübungsbeseitigung ermöglicht, so dass photometrische klinisch-chemische Tests mit Trübungen bildenden Seren auch in kontinuierlich arbeitenden Testautomaten durchgeführt werden können.
Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrun-5 de, dass mit Polyäthylenglykolestern, die nicht mehr klar wasserlöslich sind, also selbst zu Trübungen führen, eine weitaus bessere Trübungsbeseitigung erzielbar ist, als mit den bekannten, klar wasserlöslichen Mitteln.
Die Aufgabe wird für das eingangs genannte Verfahren er-10 findungsgemäss durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens nach der Erfindung sowie das Mittel zu dessen Durchführung können mit den Massnahmen der Ansprüche 2 bis 9 bzw. 10 erreicht i5 werden.
Als Säureanteil wird im Rahmen der Erfindung Laurinsäure bevorzugt. Gute Ergebnisse können jedoch auch mit Pelargon-säure, Caprinsäure, Undecylsäure, Tridecylsäure und Myristin-säure erhalten werden.
20 Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erzielt, wenn z.B. der Anteil an Estern mit weniger als 5, insbesondere mit 3 bis 4, Äthylenoxideinheiten im Molekül 10 bis 40 Gew.-% des gesamten Mittels ausmacht.
Die Esterkomponente des im erfindungsgemässen Verfah-25 ren eingesetzten Mittels ist z.B. selbst in den Serumbestimmungsansätzen nicht klar löslich und führt daher zum Auftreten weiterer Trübungen, wenn es einem Serum zugesetzt wird. Je z.B. nach der Zusammensetzung des Serums verschwindet jedoch sowohl die durch den Zusatz des Mittels hervorgerufene 30 Trübung als auch die ursprüngliche Trübung innerhalb einiger Minuten und man erhält in vielen Fällen bereits ein völlig klares Serum. In anderen Fällen ist es jedoch erforderlich, z.B. zusätzlich noch einen Löslichkeitsverbesserer zuzugeben. Als Löslichkeitsverbesserer eignen sich z.B. solche Substanzen, welche das 35 Mittel klar aufzulösen vermögen ohne selbst die photometrische Messung zu stören. Vorzugsweise werden niedrige Alkanole, insbesondere Äthanol mit 1 bis 3 C-Atomen, Glycole mit bis zu 6 C-Atomen, Polyglycole mit bis zu 8 Äthylenoxideinheiten oder/und Tenside, die selbst die Trübungen im Serum nicht 40 aufzuhellen vermögen, als Löslichkeitsverbesserer verwendet. Unter den Tensiden werden wiederum z.B. die Polyäthylengly-koläther bevorzugt. Als besonders geeignet erwiesen sich z.B. Polyäthylenglykoläther von Alkanolen mit 8 bis 16 C-Atomen im Molekül, welche 8 bis 14 Äthylenoxideinheiten enthalten. 45 Für das im erfindungsgemässen Verfahren verwendete Mittel ist es wichtig, dass z.B. Verunreinigungen möglichst gering sind. Insbesondere sollte das Mittel vorzugsweise frei sein von Spuren von Alkohol und Säure. Handelsübliche Polyäthylenglykolester eignen sich daher z.B. in der Regel nicht ohne zusätzli-50 che Reinigungsschritte für das erfindungsgemässe Mittel. Bei diesem Reinigungsverfahren müssen z.B. auch darin enthaltene Polyglykole abgetrennt werden. Dies ist beispielsweise möglich durch Ausschütteln der wässrigen Lösungen mit halogenierten Kohlenwasserstoffen, wie z.B. Trichloräthylen.
55 Bevorzugt werden jedoch die Ester des Mittels z.B. direkt hergestellt nach einem Verfahren, welches störende Verunreinigungen ausschliesst und von vorneherein die gewünschte Zusammensetzung hinsichtlich der Häufigkeitsverteilung der Äthylenoxidgruppen ergibt. Zur Herstellung des genannten 60 Mittels setzt man vorzugsweise Polyäthylenglykole mit 3 bis 8 Polyäthylenoxideinheiten im Molekül mit Borsäure im Molverhältnis 3 :1 um. Das erhaltene Produkt wird z.B. mit Fettsäure von 9 bis 14 C-Atomen erhitzt, danach durch Zusatz von Wasser hydrolysiert, mit einem polaren organischen, mit Wasser 65 unmischbaren Lösungsmittel extrahiert, es werden dann z.B. die organische Phase abgetrennt, getrocknet, mit Aluminiumoxid behandelt und schliesslich Aluminiumoxid und Lösungsmittel abgetrennt.
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Die Veresterung von Polyäthylenglykolen mit einer Fettsäure über den Trisäthylenglykolorthoporsäureester ist an sich bekannt aus «Tenside», 12,313 bis 315 (1975). Das bekannte Verfahren führt jedoch immer noch zu einem Produkt mit unerwünschten Verunreinigungen. Durch die vorstehend beschriebene Verfahrensweise kann dagegen ein Produkt von ausreichender Reinheit direkt erhalten werden. Die Lösungsmittelextraktion erfolgt vorzugsweise aus mit Salz gesättigter wässriger Lösung. Als Extraktionsmittel eignen sich z.B. insbesondere ha-logenierte Lösungsmittel, wie Chloroform.
Die Umsetzung mit Borsäure erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 80 und 100 °C während mindestens 7 Stunden im Wasserstrahlvakuum.
Nach dem beschriebenen Verfahren über die Borsäureester hergestellte Fettsäure-Polyäthylenglykolester sind z.B. für das erfindungsgemäss eingesetzte Mittel nicht nur aufgrund ihrer überlegenen Reinheit besonders geeignet, sondern auch aufgrund ihrer Molekulargewichtsverteilung. Die niedermolekularen Anteile mit bis zu 5 Äthylenoxideinheiten im Molekül reagieren hierbei nämlich bevorzugt, so dass sich das Optimum zu den niedriger kondensierten Produkten hin verschieben kann.
Es ist aber auch möglich, z.B. gereinigte handelsübliche Ester der genannten Art zur Herstellung des Mittels zu verwenden. In letzterem Fall werden vorzugsweise niedermolekulare Ester, also solche mit 3 und 4 Äthylenoxideinheiten im Molekül zugesetzt. Geeignete Mengen liegen z.B. zwischen etwa 5 und etwa 20 Gew.-%.
Neben den genannten wesentlichen Bestandteilen kann das erfindungsgemäss eingesetzte Mittel auch noch Pufferlösung und andere gegenüber Serumbestandteilen inerte und in Analysensystemen geläufige Zusätze enthalten, soweit durch Proben sichergestellt ist, dass sie z.B. die Wirkung des Mittels nicht beeinträchtigen.
Das erfindungsgemäss eingesetzte Mittel wird z.B. in solchen Mengen zugesetzt, dass man die gewünschte Klärungswirkung erzielt. Im allgemeinen liegen diese Mengen z.B. zwischen etwa 0,1 und 5 % je nach Zusammensetzung des aufzuhellenden Serums und der sonstigen, dem Serum zugesetzten Reagen-tien. Es können jedoch auch kleinere Mengen ausreichen oder grössere Zusätze erforderlich sein, letzteres insbesondere bei stark lipämischen Seren.
Sind z.B. grössere Mengen nötig, so ist es vielfach zweckmässig, z.B. einen niedrigen Alkanol (1 bis 3 C-Atome) oder einen Glycol mit bis zu 7 C-Atomen oder Polyglycol mit bis zu 8 Äthylenoxideinheiten im Molekül als Löslichkeitsverbesserer zuzusetzen.
Hierbei muss z.B. die Alkoholempfindlichkeit der Bestandteile in der Lösung berücksichtigt werden. Insbesondere wenn z.B. alkoholempfindliche Enzyme vorhanden sind, ist es oft zweckmässiger, stattdessen z.B. ein Tensid als Lösungsvermittler zuzusetzen.
Wird beispielsweise Glukose nach der Glukoseoxidaseme-thode bestimmt, so genügt erfahrungsgemäss z.B. ein Zusatz, der 0,4 % des Esters und 0,1 bis 0,4 % des Lösungsvermittlers entspricht, auch wenn im nichtenteiweissten Serum die optische Bestimmung durchgeführt werden soll. Wird andererseits z.B. in einer trüben Serumprobe Harnsäure mittels Katalase und Alde-hyddehydrogenase bestimmt, so ist ein Zusatz des Mittels, der 3 Gew.-% Ester entspricht, erforderlich.
Falls z.B. als Löslichkeitsverbesserer ein Tensid verwendet wird, so soll dessen Zusatz vorzugsweise so gering als möglich gehalten werden. Denn durch einen solchen Zusatz kann zwar die Löslichkeit des Mittels heraufgesetzt werden, gleichzeitig wird z.B. aber auch die trübungsbeseitigende Wirksamkeit verschlechtert.
Wie bereits erwähnt, ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren die Beseitigung von Trübungen in Serum, wobei dies auch dann gelingt, wenn eine z.B. sehr starke Trübung vorliegt.
In vielen Fällen ermöglicht erst der Zusatz des Mittels auch das Durchführen von optischen Bestimmungen z.B. in nichtenteiweissten Serumproben. Das Verfahren eignet sich dabei z.B. sowohl für Substrat als auch für Enzymbestimmungen.
5 Darüber hinaus ist das erfindungsgemässe Verfahren z.B. wertvoll auch bei Bestimmungen, bei denen z.B. wegen des geringen Serumzusatzes auch bei an sich stark trüben Seren messtechnisch keine besonderen Schwierigkeiten vorliegen. Bei Zusatz des Mittels kann häufig auf das Mitführen einer Eichmess-io reihe verzichtet werden und die Messung nur gegen den Rea-gentienleerwert erfolgen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
15 Herstellung des Mittels
Je 2 Mol eines Polyäthylenglykols mit 3 bis 8 Äthylenoxideinheiten werden mit 0,66 Mol Borsäure unter Wasserstrahlvakuum innerhalb von 2 Stunden bis auf 90 °C erhitzt. Der Ansatz wird dann weitere 6 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. 20 Nach dem Abkühlen werden 0,2 Mol Laurinsäure und 2 g p-To-luolsulfonsäure zugesetzt. Dann wird innerhalb von 2 Stunden auf 100 °C erhitzt und weitere 2 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Dann wird zur Hydrolyse ein gleiches Volumen Wasser zugesetzt und 1 Stunde gerührt. Anschliessend wird die Lö-25 sung mit Kochsalz gesättigt und dreimal mit Essigester ausgeschüttelt. Die vereinigten Esterphasen werden über Natriumsulfat getrocknet und dann auf etwa 100 ml eingeengt. Dann wird die Lösung mit 50 g basischem Aluminiumoxid geschüttelt. Im Dünnschichtchromatogramm wird Fettsäurefreiheit geprüft. 30 Falls noch Fettsäurespuren vorhanden sind, wird die Aluminiumoxidbehandlung wiederholt. Anschliessend wird das Aluminiumoxid abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen, zuletzt im Ölpumpenvakuum.
Ausbeute 60 bis 90 % je nach Kettenlänge des Polyäthy-35 lenglykols.
Durch Mischen von je 15 Gew.-Teilen der wie oben beschrieben erhaltenen Laurinsäureester von Polyäthylenglykolen mit 3,4 bzw. 5 Äthylenoxideinheiten mit je 20 Gew. -Teilen der Ester mit 6 bzw. 7 Äthylenoxideinheiten und etwa 5 % Ester 40 mit 8 Äthylenoxideinheiten wird ein erfindungsgemässes Mittel hergestellt.
Beispiel 2
Ein im Handel erhältliches Polyäthylenoxid-Laurinsäure-45 estergemisch mit etwa 4% Triäthylenglykolester, etwa 10 % Tetraäthylenglykolester, etwa 15 % Pentaäthylenglykolester und etwa 60 % Hexa-, Hepta- und Octaäthylenglykolester wird von der wässrigen Lösung mit Trichloräthylen extrahiert und dann getrocknet. Dem so erhaltenen Produkt werden 8 % eines 50 gemäss Beispiel 1 erhaltenen Triäthylenglykolesters zugesetzt.
Beispiel 3
Harnsäurebestimmung 55 0,1 ml einer stark trüben Serumprobe wird mit 1 ml einer Reagentienlösung folgender Zusammensetzung vermischt:
45 mM K4P207, pH 8,5 ; NAD+ ; Katalase; Aldehyddehy-drogenase; 5 Vol.-% Äthanol; 3 Vol.-% des Mittels von Beispiel 2.
60 Nach 5-minütigem Stehen bei Raumtemperatur war die Probe aufgeklart.
Nach Serumzugabe betrug die Extinktion ohne Zusatz des erfindungsgemässen Mittels AE334nnl = 2,239.
Mit Zusatz des Mittels AE334nin= 0,777 65 Reagentienleerwert:AE= 0,570
Die Bestimmung der Harnsäure in der aufgeklärten Probe erfolgt durch Zusatz von Uricase und Messung der Extionk-tionsänderung (AE) bei 334 nm.
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Beispiel 4
Blutzuckerbestimmung ohne Enteiweissung
0,02 ml einer stark trüben Serumprobe werden mit 2 ml einer Reagentienlösung folgender Zusammensetzung vermischt:
0,2 MTris/Phosphatpuffer, pH 8,0; Phenol; p-Aminoanti-pyrin, Peroxidase (POD), Glukoseoxidase (GOD), 0,4 Vol.-% Polyoxiäthylendodecyläther mit ca. 8 Äthylenoxideinheiten, 0,4 Vol.-% Mittel von Beispiel 2.
Aufklarung der Probe und Farbentwicklung erfolgen gleichzeitig, die Extinktionsänderung ist in Figur 2 der beigefügten Zeichnung dargestellt.
Beispiels
Bestimmung der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT)
0,5 ml einer trüben Serumprobe werden mit 3,1 ml einer Reagentienlösung folgender Zusammensetzung vermischt:
Phosphatpuffer, pH 7,4; Aspartat, NADH, Lactatdehydro-genase (LDH, Malatdehydrogenase (MDH), 2,85 Vol.-% Mittel von Beispiel 2.
Die Ausgangsextinktion des Serums betrug 1,870. Nach 30 Minuten Stehen war die Probe aufgeklärt. Extinktion= 0,820.
Der Start erfolgte durch Zugabe von a-Ketoglutarat und Messung der Extinktionsänderung bei 366 nm. Figur 3 der beigefügten Zeichnung zeigt die Messergebnisse.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn wie in den 5 Beispielen 3 bis 5 beschrieben vorgegangen wird, anstelle des Mittels von Beispiel 2 jedoch ein Mittel verwendet wird, das aus 60 % Polyäthylenglycol-300-Laurat und 40 % Polyäthylengly-col-200-Laurat, hergestellt nach Beispiel 1 aus handelsüblichem Polyäthylenglycol 300 bzw. 200, besteht. Dieses Mittel hat laut .o gaschromatographischer Analyse folgende Zusammensetzung:
Monoglycol-L 1,2 %
Diglycol-L 3,1 %
Triglycol-L 13,1%
Tetraglycol-L 17,9 %
Pentaglycol-L 16,2 %
Hexaglycol-L 15,1 %
Heptaglycol-L 12,4 %
Octoglycol-L 8,6 %
Nonaglycol-L 4,9 %
Decaglycol-L 2,6 %
Undecaglycol-L 1,1 %
Dodecaglycol-L 0,4 %
Verunreinigungen an freiem Polyglycol unter 2 %.
C
2 Blatt Zeichnungen
Claims (10)
1. Verfahren zur Beseitigung von photometrische Messungen störenden Trübungen in Seren, dadurch gekennzeichnet, dass dem Serum ein Mittel zugesetzt wird, das im wesentlichen aus einem oder mehreren Mono- oder Diestern von Polyäthy-lenglykol und Fettsäuren von 9 bis 14 C-Atomen mit höchstens 8 Äthylenoxideinheiten je Fettsäurerest im Molekül besteht, wobei der Ester oder das Estergemisch einen HLB-Wert zwischen 8 und 12,8 aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch' 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ester überwiegend Laurinsäureester verwendet.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Serum ein Mittel zusetzt, das zu 10 bis 40 Gew.-% aus Polyäthylenglykolester mit 3 bis 4 Äthylenoxideinheiten je Fettsäurerest im Molekül besteht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass dem Serum ein Mittel zugesetzt wird, das einen Löslichkeitsverbesserer enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Löslichkeitsverbesserer ein niedriger Alkanol mit 1 bis 3 C-Atomen oder ein Glykol mit bis zu 7 C-Atomen oder Poly-glykol mit bis zu 8 Äthylenoxideinheiten verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Löslichkeitsverbesserer ein oder mehrere Tenside verwendet werden, die alleine die Trübungen nicht zu beseitigen oder wesentlich aufzuhellen vermögen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Tensid einen Polyäthylenoxidäther eines Alkanols mit 8 bis 16 C-Atomen im Molekül, welcher 8 bis 14 Polyäthylenoxideinheiten enthält, verwendet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Mittel verwendet, das frei ist von Säure- und Aldehydspuren.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel in einer Menge von 0,1 bis 5 Gew.-% dem Serum zugesetzt wird.
10. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es im wesentlichen aus einem oder mehreren Mono- oder Diestern von Polyäthylenglykol und Fettsäuren von 9 bis 14 C-Atomen mit höchstens 8 Äthylenoxideinheiten je Fettsäurerest im Molekül besteht, wobei der Ester oder das Estergemisch einen HLB-Wert zwischen 8 und 12,8 aufweist.
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