DE2503993A1

DE2503993A1 - Verfahren zur gleichzeitigen bestimmung von triglyceriden, cholesterin und phospholipiden

Info

Publication number: DE2503993A1
Application number: DE19752503993
Authority: DE
Inventors: Stephen Ian Hilburg; Joseph Diago Pinto
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1974-01-31
Filing date: 1975-01-31
Publication date: 1975-08-07
Also published as: FR2260111A1; JPS50109794A; FR2260111B3; US3894844A

Description

American Cyanamid Company Wayne, New Jersey, USA

Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden

Die Erfindung betrifft die Diagnose von Lipidstörungen und die Abspaltung, Auftrennung und quantitative Bestimmung der drei Hauptlipidbestandteile des Humanserums oder -plasmas, d. h. der Triglyceride, des Cholesterins und der Phosphorlipide und deren gleichzeitige Bestimmung.

Die Trigylceride, die Phospholipide und Cholesterin stellen wertvolle Diagnosehilfen für die Bestimmung des Lipopuoteinphänotyps, für die Untersuchung des Fettstoffwechseis, der Zellwandsynthese und der Bestimmung der Anfälligkeit der Arteriosklerose dar. Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die genannten Bestimmungen in klinischen Laboratorien und Krankenhäusern und bei der Vergleichsforschung, der technischen Forschung und der Industrieforschung angewandt werden.

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Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die Frühdiagnose von Herzkoronargefäßerkrankungen eingesetzt werden und kann als diagnostisches Hilfsmittel bei Herzpatienten angewandt werden.

Das erfindungsgemäße vereinfachte Verfahren stellt ein schnelles und gleichzeitig arbeitendes Werkzeug für die Abspaltung, Abtrennung und quantitative Bestimmung der erwähnten drei Hauptlipidbestandteile des Blutes dar, das mit einem hohen Maß der Genauigkeit, der Präzision und der Reproduzierbarkeit eingesetzt werden kann.

Cholesterin, Triglyceride und Phospholipide werden überwiegend als Lipoproteinmoleküle transportiert. Die vielfältig angewandte Bestimmung dieser Serumlipide bestätigt ihre Bedeutung als diagnostisches Indiz für Koronarerkrankungen. Es ist postuliert worden, daß eine Störung des Triglyceridstoffwechsels, der eine entsprechende Ansammlung dieses Materials in dem Plasma bewirkt, die häufigste Stoffwechselstörung von Patienten mit Herzkranzgefäßerkrankungen ist. Die Östrogenverabreichung an Frauen führt zu einer Steigerung des Phospholipidspiegels im Serum und zu einer Abnahme des Cholesterinspiegels im Serum und zu einer entsprechenden Verminderung des Cholesterin/Phospholipidverhältnisses, das überwacht werden sollte. Schließlich wird durch das Auftreten von plattenförmigen Cholesterinabscheidungen bei athereosklerotischen Patienten die Bedeutung der Bestimmung dieser drei Lipidparameter gesteigert.

Alle bekannten chemischen Analysen für Triglyceride und Cholesterin umfassen:

1) die Abspaltung oder Dissoziation der Triglyceride und/oder des Cholesterins von den Lipoproteinen,

2) die Abtrennung der Triglyceride und/oder des Cholesterins von störenden Bestandteilen und

3) die quantitative Bestimmung.

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Die Abspaltung wird mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Isopropylalkohol etc., bewirkt, vgl. auch G. Kessler et al., Technicon Symposium, "Automation in Analytical Chemistry", New York, 1965, S. 341-344; H.B. Lofland, Anal. Biochem., 9: 393 (1964); H.B. Lofland; Addendum, Anal. Biochem., 10: 178 (1965); H.H. Leffler, Amerl. J. Clin. Path. , 31: 310-313 (1959); H.V. Connerty et al., Clin. Chem. 7: 37 (1961); und F. Gallentti, Clin. Chim. Acta., 6: 749 (1961).

Die Abtrennung der Trigylceride und des Cholesterins von Bestandteilen des Serums und des Plasmas, die mit den bei dem Analysenverfahren verwendeten Reagenzien reagieren würden, erfolgt mit Hilfe von Absorbentien. Bestandteile dieser Art sind beispielsweise Glucose, Glycerin, Phospholipide, Kreatinin, Ammoniak, Bilirubin und Hämoglobin. Die Beseitigung dieser störenden Bestandteile ist mit Absorbentien, wie Kieselsäure, Zeolith, Florisil (ein Magnesiumsilikatgel), Aluminiumoxid und Mischungen davon erreicht worden (vgl. auch Handrei et al., J. Lab. Clin. Med., 50: 152-157 (1957); Borgstrom, Acta Physiol. Scandinav., 25: .101-110 (1952); Royer, et al., Analytical Biochemistry, 29: 405-416 (1969); Jagannathan, Canadian Journ. Biochemistry, 42: 556-570 (1964); Lofland, Analytical Biochemistry, 9: 393-400 (1964); und Schon, et al., Physiological Chem. 303: 81-90 (1956). Die störenden Bestandteile, wie die Phospholipide, werden von den obigen Absorbentien absorbiert, während die Trigylceride und das Cholesterin nicht absorbiert werden.

Von W. Trappe (Biochem. Z. 306 (1940), S. 316-336) wurden frühe Untersuchungen über die Chromatographie von Lipiden auf Aluminiumoxid durchgeführt. Es scheint auch so zu sein, daß W. Trappe auf Seite 334 der genannten Literaturstelle ein Absorbens beschreibt, das Aluminiumoxid und Kieselsäure enthält. I. Smith (Chromatographie and Electrophoretic Techniques, Vol. 1, Chromatography, 2. Aufl. , Interscience 1960) gibt auf Seite 368 an, daß die komplementären Eigen-

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schäften von Kieselsäure und Aluminiumoxid sich als äußerst wertvoll für die Behandlung von Phospholipiden erwiesen haben.D. N. Rhodes et al (Biochem. Journal, Vol. 65 (1957), S. 526) beschreiben auf Seite 532, daß Aluminiumoxid die schnelle und vollständige Abtrennung der Phospholipide ermöglicht, wobei im Anschluß daran jedoch eine mit Kieselsäure gefüllte Säure durchlaufen werden muß, wenn reines Phosphatidylcholin benötigt wird. Die Abtrennung und Bestimmung der Phospholipide unter Verwendung von Aluminiumoxid und Kieselsäure wird genauer in Chromatographie and Electrophoretic Techniques, Vol. 1, Chromatography, 3. Aufl., Interscience (1969), S. 450-493, in der 2. Aufl. dieser Veröffentlichung auf den Seiten 363-373 diskutiert. Es ergibt sich jedoch kein Hinweis auf die erfindungsgemäß angewandten Mengenverhältnisse, in denen Aluminiumoxid und Kieselsäure für die gleichzeitige Bestimmung von Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden verwendet werden sollen.

Die quantitative Bestimmung der Triglyceride und/oder des Cholesterins ist mit Hilfe einer großen Vielzahl von chemischen Methoden erreicht worden. Nachdem die Triglyceride und Cholesterin von Lipoproteinen abgespalten und von anderen Bestandteilen des Serums angetrennt worden sind, werden sie chemischen Methoden unterzogen. Diese Methoden bestehen darin, daß man die Triglyceride mit einer alkoholischen Base (Isopropanol/KOH) zu Glycerin hydrolysiert oder verseift und das gebildete Glycerin mit Hilfe von Perjodat zu Formaldehyd oxidiert. Anschließend wird das Formaldehyd mit Ammoniak und Acetylaceton umgesetzt, wobei sich eine gelbe Lutidin-Verbindung bildet (Kessler et al., s. oben; Van Handel et al., J. Lab. Clin. Med., 50: 152 (1957); Carlson et al., Clin, Chim. Acta, 4: 197 (1959); Nash, T., Biochem., 55: (1953); Belman, S., Anal. Chim. Acta, 49: 120 (1963); Fletcher, M.J., Clin. Chim. Acta, 22: 393-397 (1968). Die

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Intensität der gelben Färbung ist ein Maß für die Konzentration des gebildeten Formaldehyds und damit für die Menge des vorhandenen Triglycerids. Glucose, Glycerin und Phospholipide ergeben unter diesen Bedingungen ebenfalls Formaldehyd, und man erhält künstlich höhere Werte, wenn man diese Materialien nur unvollständig abtrennt. Cholesterin wird durch Behandeln mit Eisen-(III)-chlorid in Essigsäure bestimmt. Ein Verfahren dieser Art ist von Leffler et al (Amer. J. Clin. Path. 39: (1963), S. 311-315), von Leffler (Amer. J. Clin. Path. 31 (1959) 310-313) und von Zlatkis et al (J. Lab. Clin. Med. , 41 (1953) , S. 486-492) beschrieben worden.

Bislang umfassen die zur Phospholipidbestimmung im Serum oder im Plasma angewandten chemischen Verfahrensweisen überwiegend eine Umwandlung des organischen Phosphors in anorganisches Phosphat durch Veraschen mit Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid (R. J. Henry, Clinical Chemistry Principles and Techniques, (1964), S. 841-843). Neben des Zeitaufwands, der für dieses Verfahren notwendig ist, ergibt sich eine starke Gefährdung durch die angewandten Lösungsmittel. Ein Vorteil der Erfindung ist darin zu sehen, daß die Phospholipide von dem Aluminiumoxid/Kieselsäure-Adsorptionsmittel mit einer Isopropanol/Ammoniumhydroxid-Mischung eluiert und chemisch in gleicher Weise wie die Triglyceride bestimmt werden. Die erfindungsgemäße Methode besteht darin, die Phospholipide zu Glycerin zu hydrolysieren und dieses mit Perjodat zu oxidieren, wozu man die Maßnahmen und Reagentien anwendet, die für die Triglyceridbestimmung verwendet werden. Der gebildete Formaldehyd wird dann kolorimetrisch und/oder fluorimetrisch wie im Fall der Triglyceride bestimmt, wobei die Hantzsch-Reaktion angewandt wird, die auf der Reaktion eines Amins, eines ß-Diketons und eines Aldehyds beruht (T. Nash, Biochem. J. 55: 416 (1953) und S. Belman, Anal. Chim. Acta, 29: 120 (1963).

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Es sind handelsübliche Analysensätze zur Bestimmung von Trigylceriden und/oder Cholesterin bekannt, die als Absorbentien Zeolith,Kieselgel und Aluminiumoxid verwenden, beispielsweise die von den Firmen Harleco, Wood Scientific, In. und den Oxford Laboratories vertriebenen Produkte. Es ist auch ein handelsüblicher Reagenssatz für die PhospholipidbeStimmung bekannt, der auf dem Prinzip basiert, daß zunächst eine Extraktion durchgeführt, wonach der organische Phosphor in anorganischen Phosphor überführt und dieser bestimmt wird (Boehringer Mannheim GmbH). Es ist jedoch kein Reagenssatz bekannt, der eine Aluminiumoxid/Kieselsäure-Mischung als Absorbens in den erfindungsgemäß angegebenen Mengen enthält und für*die gleichzeitige Bestimmung von Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden verwendet wird.

In der US-PS 3 645 688 ist ein Verfahren zur Bestimmung der Triglycerid- und Cholesterin-Spiegel in Blutplasma oder -serum beschrieben, bei dem die störenden Bestandteile in dem Plasma oder dem Serum, wie die Phospholipide, mit Hilfe von Aluminiumoxid oder einer Aluminiumoxidmischung extrahiert werden. In diesem Patent dient Isopropanol zur Ausfällung der dann von dem Aluminiumoxid absorbierten Proteine und zur Auflösung der abzutrennenden Lipide. Diese US-Patentschrift betrifft jedoch nicht die Bestimmung von Phospholipiden, die gleichzeitige Bestimmung von Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden oder die Verwendung von Adsorbentien auf der Grundlage von Aluminiumoxid/Kieselsäure-Mischungen. Es wurde eine Vergleichsuntersuchung zwischen der erfindungsgemäßen Lipidbestimmungsmethode und der in der US-PS 3 645 688 beschriebenen Methode durchgeführt. Nach der in dieser Patentschrift angegebenen Weise wird ein Adsorbens (Aluminiumoxid plus Zeolith,CuSO. und Ca(OH)₂) hergestellt. Bei dem Vergleichstest hatte sich gezeigt, daß die in der US-PS 3 645 688 beschriebene Methode TriglyceridundCholesterin-Werte ergibt, die entweder zu hoch oder zu

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niedrig liegen, wenn die Methode zur Bestimmung von handelsüblichen gefriergetrockneten Kontrollproben angewandt wird.

Die Erfindung betrifft nun die Lipidanalyse und insbesondere die gleichzeitige Bestimmung der Mengen von Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden in einer einzigen Probe Humanplasmas oder -serums unter Verwendung von Isopropanol zur Abspaltung der Triglyceride und des Cholesterins von den Lipoproteinen und als Lösungsmittel dafür, eines Aluminiumoxid/Kieselsäure-Adsorbens zur Adsorption der Phosphoriipide und anderer unerwünschter Plasma- oder Serumbestandteile und chemischer Methoden, zusammen mit kolorimetrischen oder fluorometrischen Bestimmungen, für die quantitative Bestimmung der Triglyceride, des Cholesterins und der Phospholipide. Das erfindungsgemäße Verfahren vereinfacht in erheblicher Weise das Problem der Abtrennung der störenden Bestandteile des Blutes und führt in einfacher und bequemer Weise zu einer Trennung der Lipidbestandteile, die dann schnell analysiert werden können.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden in einer einzigen Probe Humanplasma oder -serum, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Plasma oder das Serum mit Isopropanol versetzt, um die Triglyceride, Cholesterin und die Phospholipide von den in dem Plasma oder dem Serum enthaltenen Lipoproteinen abzuspalten; daß das Isopropanol enthaltende Plasma oder Serum mit einem Adsorbens vermischt, das Aluminiumoxid und Kieselsäure in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1 g bis etwa 0,70g Aluminiumoxid, vorzugsweise etwa 0,75 g Aluminiumoxid, zu etwa 0,25 g Kieselsäure enthält, um die Triglyceride und das Cholesterin von den Phospholipiden abzutrennen, wobei die Triglyceride

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und das Cholesterin in dem Isopropylalkohol verbleiben und die Phospholipide von dem Adsorbens adsorbiert werden; den die Triglyceride und das Cholesterin enthaltenden Isopropylalkohol von dem die Phospholipide enthaltenden Adsorbens abtrennt; die Phospholipide mit einer Isopropanol/Ammoniak-Lösung von dem Adsorbens eluiert; das die Triglyceride und das Cholesterin enthaltende Isopropanol und das die Phospholipide enthaltende Isopropanol/Ammoniak-Eluat chemisch behandelt; und das behandelte, die Phospholipide enthaltende Isopropanol/Ammoniak-Eluat und die die Triglyceride und das Cholesterin enthaltende Isopropanollösung kolorimetrisch oder fluorometrisch bestimmt, um in dieser Weise die Mengen an Triglyceriden, Cholesterin und Phosphospholipiden zu bestimmen, die in einer einzigen Serum- oder Plasmaprobe vorhanden sind. Die zur Behandlung des die Triglyceride enthaltenden Isopropanols angewandten chemischen Methoden umfassen in der angegebenen Reihenfolge die Behandlung der Isopropanol/ Triglycerid-Lösung mit einem Verseifungsmittel (Kaliumhydroxid/ Isopropanol/Wasser), einem Oxidationsmittel (Natriumperjodat/ Essigsäure) und einem Triglyceridfarbreagens (2,4-Acetylaceton/Isopropanol/Ammoniumacetat, pH-Wert 6,0 Puffer). Die chemische Methode, die angewandt wird, um das das Cholesterin enthaltende Isopropanol zu behandeln, umfaßt die Behandlung der Isopropanol/Cholesterin-Lösung mit einem Cholesterinfarbreagens (Eisen(III)-chlorid/Essigsäure/Schwefelsäure als Katalysator). Die zur Behandlung der die Phospholipide enthaltenden Isopropanol/Ammoniak-Lösung verwendete chemische Methode besteht darin, die Phospholipid/Isopropanol/Ammoniak-Lösung mit dem gleichen Verseifungsmittel, Oxidationsmittel und Farbreagens zu behandeln, wie sie für die chemische Behandlung der Triglyceride verwendet wurden. Die Methode für Cholesterin basiert auf dem verlässlichen Verfahren von Leffler (s. oben) unter Verwendung eines Farbreagens, das aus Eisen(III)-chlorid in Eisessig/steht und das gegenüber

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dem von Zlatkis (s. oben) vorgeschlagenen modifiziert ist. Die Methode für die Triglyceride basiert auf der Hantzschen Kondensationsreaktion zwischen einem Aldehyd, einem Amin und einem ß-Diketon, wozu auf die oben angegebenen Veröffentlichungen von T. Nash und von S. Belman hingewiesen sei.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Diagnosereagenssatz für die gleichzeitige Bestimmung von Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden in einer einzigen Probe Humanplasma oder -serum, der im wesentlichen ein Adsorbens aus einer Aluminiumoxid/Kieselsäure-Mischung, die etwa 1 g bis etwa 0,70 g Aluminiumoxid, vorzugsweise etwa 0,75 g Aluminiumoxid und etwa 0,25 g Kieselsäure enthält; ein Verseifungsreagens (eine 75/25-Mischung aus Isopropanol und einer 2%igen Kaliumhydroxidlösung), zur Freisetzung der Fettsäurebestandteile aus den Triglyceriden und den Phospholipiden; ein Oxidationsmittel (0,25 m Natriumperjodatlösung in 2 m Essigsäure) zur Oxidation des beim Verseifen gebildeten Glycerins zu Formaldehyd) ein Cholesterinfarbreagens zur Ausbildung einer Cholesterinfarbreaktion (Eisen(III)-chlorid in Eisessig), die kolorimetrisch oder fluorometrisch bestimmt werden kann; ein Triglycerid- und Phospholipid-Farbreagens zur Verursachung einer Triglycerid- und Phospholipid-Farbreaktion, das mit dem Formaldehyd unter Bildung einer gelben Lutidinverbindung reagiert, die kolorimetrisch oder fluorometrisch bestimmt werden kann (2,4-Pentandion); eine Isopropanol/ Ammoniakmischung (80 % Isopropanol, 20 % Ammoniumhydroxid) zum Extrahieren der Phospholipide aus der Adsorbensmischung; und eine kombinierte Standardlösung umfaßt, die in Propylalkohol jeweils 300 mg % Triglyceride, 300 mg % Cholesterin und 300 mg % Phospholipide enthält.

Es hat sich gezeigt, daß bei einer gegebenen Serumprobe der gleiche Triglyceridwert erhalten wird, ob Kieselsäure vorhanden ist oder nicht. Doch stellt die Kieselsäure einen

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notwendigen und wichtigen Teil des erfindungsgemäß verwendeten Adsorbens dar, und es hat sich gezeigt, daß die Phospholipide nicht von dem als solchen verwendeten Aluminiumoxid abgetrennt werden können, wenn sie an das Aluminiumoxid gebunden sind. Im Gegensatz dazu können die Phospholipide von der Kieselsäure abgespalten werden, wodurch eine Bestimmung der Phospholipide möglich wird. Der erfindungsgemäß durch das Aluminiumoxid/Kieselsäure-Adsorbens erzielte doppelte Zweck besteht darin, Aluminiumoxid zur Beseitigung von Glucose, Creatinin und anderen störenden Blutbestandteilen bereitzustellen, so daß eine genaue Triglycerid-und Cholesterinbestimmung erfolgen kann und Kieselsäure" für die Adsorption von Phospholipiden bereitzustellen, die zur Phospholipidbestimmung davon wieder abgelöst werden können. Die

um
bevorzugte KieselsäureNfaßt ein aus ausgefällter Kieselsäure gebildetes Kieselgel (Merck Index, 8. Aufl., Seite 945).

Das bevorzugte Aluminiumoxid ist ein Aluminiumoxid enthalten-

des Produkt, das von der Firma M. Woelm, Eschwege, Bundesrepublik Deutschland, vertrieben wird (Merck Index, 8. Aufl., Seite 46). Das bevorzugte Aluminium/Kieselsäure-verhältnis ergibt sich mit 0,75 g Aluminiumoxid zu 0,25 g Kieselsäure.

Die chemische Methode zur erfindungsgemäßen Behandlung von Cholesterin basiert auf der bestätigten und verläßlichen Leffler-Methode (H.H. Leffler, Amer. J. Path., 31 (1959), S. 310). Die chemische Methode zur Behandlung der Serumtriglyceride basiert auf der Hantzschen-Kondensationsreaktion zwischen einem Aldehyd, einem Amin und einem ß-Diketon (T. Nash, Biochem. J., 55 (1953), S-. 416). Die chemische Methode zur Behandlung der Phospholipide basiert auf der bislang nicht angewandten chemischen Methode zur Behandlung der Triglyceride. Bislang erforderten die herkömmlichen Phospholipidanalysenmethoden eine Behandlungszeit von etwa sechs Stunden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Phospholipidanalyse in etwa 30 Minuten. Die Phospholipide werden mit einer Isopropanol/Kaliumhydroxid-Mischung zu

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Glycerin hydrolysiert oder verseift, das dann mit Natriummetaperjodat zu Formaldehyd oxidiert werden kann. Der gebildete Formaldehyd kann in gleicher Weise wie im Fall der Triglyceride über die Hantzsche Kondensationsreaktion bestimmt werden. Erfindungsgemäß ist die chemische Methode zur Bestimmung der Triglyceride und der Phosphoriipide im Prinzip identisch. Die Menge der gelben Färbung und/oder der Fluoreszenz des Dimethyldihydroltitidins ist direkt proportional der Phospholipidkonzentration in der Serumprobe.

Weitere Ausführungsformen, Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, den Beispielen und den beigefügten Zeichnungen.

Die Fig. 1 zeigt ein Fließschema, das die gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, nämlich dem Teströhrchenverfahren, durchzuführenden Schritte erläutert.

Die Fig. 2 zeigt ein Fließschema, das die Schritte zur Durchführung einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, nämlich der Säulenmethode, verdeutlicht.

Die Fig. 1 verdeutlicht eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens für die gleichzeitige Bestimmung der Triglycerid-iCholesterin- und Phospholipid-Werte einer einzigen Probe des Plasmas oder des Serums des Patienten unter Verwendung der Teströhrchenmethode. In der Stufe 11 wird Isopropanol zu einer Probe des Plasmas oder des Serums zugegeben, das in einem Teströhrchen oder dergleichen vorliegt. Dann wird die Mischung geschüttelt, wobei das Isopropanol dazu dient, die Proteine auszufällen, die Triglyceride, das Cholesterin und die Phospholipide von den Lipoproteine]! abzuspalten und die Extraktion der Triglyceride und des Cholesterins zu unterstützen. Die Reihenfole der Einführung des Isopropanols und des Plasmas oder des Serums ist nicht von

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Bedeutung , so daß es auch möglich ist, das Plasma oder das Serum zu dem Isopropanol zuzusetzen.

Nach dem Vermischen des Plasmas oder des Serums mit dem Isopropanol besteht der nächste Schritt 12 darin, diese Mischung in ein Teströhrchen einzuführen, das das Aluminiumoxid/Kieseläsure-Adsorbens oder die entsprechende Extraktionsmischung enthält. Die das Plasma oder das Serum, das Isopropanol und das Adsorbens enthaltende Mischung wird dann geschüttelt, beispielsweise durch Umstürzen des Röhrchens, um eine Adsorption oder Extraktion sicherzustellen. Durch den Schritt 12 werden die Phospholioide, Glucose, Bilirubin, Gammaglobulin, Ammoniak, Creatinin und andere unerwünschte Bestandteile des Plasmas oder des Serums, die die Triglycerid- und Cholesterin-Bestimmung stören, von dem Adsorbens adsorbiert, während die Triglyceride und das Cholesterin in der Isopropanollösung verbleiben. Das Adsorbens ermöglicht eine genaue Triglycerid- und Cholesterin-Bestimmung durch Entfernen der Blutbestandteile, die die Triglycerid- und Cholesterin-Bestimmung stören. Die Anwesenheit der Kieselsäure wirkt neben der Tatsache, daß sie eine leichte Wiederablösung und Bestimmung der Phospholipide ermöglicht, auch dahingehend, daß das Aluminiumoxid während des Abpipettierens der überstehenden Flüssigkeit am Boden des Reagenzglaschens gehalten wird, wodurch falsche Werte vermieden werden, die durch die Mitnahme von Aluminiumoxidteilchen in die Pipette verursacht werden. Die Kieselsäure bildet ferner nach der Zentrifugierungsstufe 13 eine gelatinöse Schicht über dem Aluminiumoxid, wodurch die Aluminiumteilchen auf dem Boden des Röhrchens festgehalten werden. Bei dem Schritt 13 wird das Isopropanol, die Plasma- oder Serumprobe und die Aluminiumoxid/ Kieselsäure-Adsorbensmischung enthaltende Reagenzglas zentrifugiert, wodurch der Feststoff und die darüberstehende Phase voneinander getrennt werden. Bei dem Schritt 13 werden

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die Aluminiumoxid/Kieselsäure-Feststoffe, auf denen die
Phospholipide adsorbiert worden sind, von dem überstehenden Isopropanolextrakt abgetrennt, der die Triglyceride und das Cholesterin enthält.

In der Stufe 14 wird eine Isopropanolwaschflüssigkeit zu
den Aluminiumoxid/Kieselsäure-Feststoffen, auf denen die
Phospholipide adsorbiert sind, zugesetzt, wonach die Mischung gut vermischt wird, um irgendwelche vorhandenen Verunreinigungen auszuwaschen. Die Waschmischung wird dann in der Stufe 15 zentrifugiert, um die Verunreinigungen in der Isopropanolwaschflüssigkeit von den gewünschten Feststoffen abzutrennen. Die Isopropanolwaschflüssigkeit oder die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Vorzugsweise werden die
Schritte 14 und 15 mindestens zweimal durchgeführt, d. h. die Feststoffe werden mindestens zweimal mit Isopropanol gewaschen und zentrifugiert. Nach dem Waschen mit Isopropanol
in der Stufe 14 und dem Zentrifugieren in der Stufe 15 werden die Feststoffe dann in der Stufe 16 mit einer Isopropanol/Ammoniak-Extraktionslösung (Isopropanol und Ammoniumhydroxid in einem Verhältnis von 8:2) behandelt oder eluiert, wozu die Feststoffe und die Extraktionsmischung gut miteinander vermischt werden. In der Stufe 16 werden die Phospholipide von den Aluminiumoxid/Kieselsäure-Feststoffen abgelöst. Nach der Extraktionsstufe 16 werden die extrahierende Mischung und die Feststoffe in der Stufe 17 zentrifugiert,
wonach die Feststoffe verworfen und die überstehende Flüssigkeit oder das Eluat, d. h. die extrahierten Phospholipide enthaltende Isopropanol/Ammoniak-Extraktionsmischung, abdekantiert wird. Die Stufe 17 kann natürlich gewünschtenfalls wiederholt werden. In der Stufe 18 wird ein Teil der in der Stufe 17 gewonnenen überstehenden Flüssigkeit in ein Teströhrchen überführt, mit einem Verseifungsreagens (Isopropanol/ KOH) versetzt, geschüttelt, durchmischt und inkubiert. Das
Verseifungsreagens umfaßt Kaliumhydroxid in Wasser und

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Isopropanol und wird zur Hydrolyse der Phospholipide zu Glycerin verwendet. Nach der Verseifungsstufe 18 wird das durch die Hydrolyse der Phospholipide gebildete Glycerin in der Stufe 19 durch die Zugabe eines Oxidationsmittels (eine 0,25 m Lösung von Natriumperjodat in 2 m Essigsäure, die mit 1 m Essigsäure verdünnt ist), Schütteln, Mischen und Erhitzen auf einem Wasserbad zu Formaldehyd oxidiert. Nach der Oxidation wird ein Phospholipid-Farbreagens (2,4-Pentandion oder Acetylaceton in einem Ammoniumacetat-Puffer) in der Stufe 20 zugesetzt, der nach dem bekannten Hantzschen Kondensationsreaktion mit dem Formaldehyd reagiert und eine charakteristische gelbe Färbung hervorruft. Das Ausmaß der gelben Färbung ist direkt proportional der Konzentration der in der analysierten Plasma- oder Serum-Probe vorhandenen Phospholipide. Die kolorimetrische Bestimmung und die Ermittlung des Phospholipidwertes erfolgen in üblicher Weise.

Wie bereits erwähnt, werden in der Zentrifugierstufe 13 die die Phospholipide enthaltenden Feststoffe von dem überstehenden Isopropanol abgetrennt, das die Triglyceride und das Cholesterin enthält. In der Stufe 21 werden getrennte Anteile des überstehenden, die Triglyceride und das Cholesterin enthaltenden Isopropanolextrakts zur Bestimmung der Triglyceride und des Cholesterins abgeteilt. In der Stufe 22 wird ein Teil der überstehenden Flüssigkeit der Stufe in ein Teströhrchen überführt und mit einem Cholesterinfarbreagens (FeCl₃ · 6H„0 in Eisessig) versetzt. Dann wird das Cholesterin unter Verwendung eines modifizierten Zlatkis-Farbreagens, das Eisen(III)-Chlorid in Eisessig umfaßt, bestimmt. Das Eisen(III)-ion reagiert mit Cholesterin in Gegenwart der Essigsäure in Gegenwart von Schwefelsäure als Katalysator und ergibt eine violette Färbung (vgl. Leffler et al, Amer. J. Path., 39 (1963), S. 311). Die kolorimetrische Bestimmung und die Errechnung des Cholesterinwertes erfolgen in üblicher Weise.

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In der Stufe 23 wird ein Teil des überstehenden Isopropanols der Stufe 21 in ein Teströhrchen überführt und mit einem Verseifungsreagens (Kaliumhydroxid in Wasser und Isopropanol) versetzt, wonach die Mischung geschüttelt, durchmischt und inkubiert wird. Das hierzu verwendete Verseifungsreagens ist das gleiche Reagens, wie es für die Phospholipidbestimmung verwendet wird. Nach der Durchführung der Verseifungsstufe wird ein Oxidationsmittel (Natriummetaperjodat gelöst in Essigsäure) in der Stufe 24 zugesetzt, wonach die Mischung durchmischt wird. Auch in diesem Fall handelt es sich um das gleiche Oxidationsmittel, wie es auch für die Phospholipidbestimmung verwendet wird. Anschließend wird ein Triglyceridfarbreagens (2,4-Pentandion in Ammoniumacetat-Puffer) in der Stufe 25 zugesetzt, wonach die Mischung geschüttelt und durchmischt wird. Auch in diesem Fall wird das gleiche Farbreagens verwendet, wie es bei der Phospholipidbestimmung eingesetzt wird. Das Teströhrchen v/ird in dem Wasserbad in— kubiert. Wie im Fall der Phospholipidbestimmung beruht die Triglyceridbestimmung auf der Hantzschen Kondensationsreaktion zwischen einem Aldehyd, einem Amin und einem ß-Diketon. Die chemischen Methoden zur Bestimmung der Triglycerid- und Phospholipid-Werte sind im Prinzip identisch. Das Ausmaß der gelben Färbung ist direkt proportional der Triglyceridkonzentration in der analysierten Plasma- oder Serumprobe. Die kolorimetrische Bestimmung und die Errechnung des Triglyceridwerts erfolgen in üblicher Weise.

Die Fig. 2 verdeutlicht eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der eine gefüllte Säule verwendet wird. In der Stufe llA wird Isopropanol zu der Plasma- oder Serumprobe zugesetzt und/oder umgekehrt, wonach die Mischung geschüttelt wird. Die Isopropanollösung wird dann in der Stufe 12A durch eine mit dem Aluminiumoxid/

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Kieselsäure-Adsorptionsmittel oder einer oben beschriebenen Extraktionsmischung gefüllten Säule geführt, worauf die extrahierte Flüssigkeit aufgefangen wird. Teile der extrahierten Flüssigkeit werden dann, wie oben in Bezug auf die Fig. 1 beschrieben, für die Bestimmung der Triglyceride und des Cholesterins verwendet. In der Stufe 14A wird die gefüllte Säule ein oder mehrfach mit Isopropanol gewaschen, wobei die Waschflüssigkeiten verworfen werden. In der Stufe 16A wird das in der Säule vorhandene Adsorptionsmittel mit einer Isopropanol/Ammoniak-Lösung eluiert, wonach das Eluat aufgefangen und in Bezug auf die Phospholipide analysiert wird, wie es oben für den Fall der Fig. 1 beschrieben wurde. Die durch die Fig. 2 dargestellte vereinfachte Säulenmethode ist besonders gut für den Praktiker und für kleine Kliniken geeignet. Bei dieser Ausführungsform werden vorher bestimmte Mengen von Aluminiumoxid/Kieselgel-Ilischungen (75:25 Gewicht/Gewicht) in kleinen Kunststoffsäulen geliefert, die vorzugsweise ein Filter enthalten, wodurch die Extraktionszeit verkürzt wird und Aluminiumoxidteilchen zurückgehalten werden, an die die störenden Materialien gebunden sind. Die Säulenmethode ist besonders geeignet für den Diagnose-Reagens satz.

Beispiel 1 Tes tröhrchenmethode

Man vermischt 0,3 ml einer Serumprobe mit 9,7 ml Isopropanol. Diese Mischung bringt man in ein Reagenzglas ein, das ein Adsorbens enthält, das aus einer Mischung (75:25 Gewicht/ Gewicht) aus Aluminiumoxid (gewaschenes, neutrales Woelm-

schüttelt Aluminium) und (gewaschenem) Kieselgel besteht undrdurch

Umdrehen des Reagenzglases. Das Röhrchen wird

dann während etwa 10 min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Abdekantieren von den Feststoffen abgetrennt, wobei beide Bestandteile weiterverwendet werden.

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Cholesterinanalyse

Man überführt 1,0 ml der überstehenden Flüssigkeit in ein Teströhrchen. Dann gibt man 2,0 ml des Eisen(III)-chlorid-Farbreagens (500 mg FeCl₃ · 6H₂O in 500 ml Eisessig) zu und mischt die Lösung durch. Dann setzt man 2,0 ml konz. Schwefelsäure zu, indem man sie, um ein Mischen zu vermeiden, am Rand des Röhrchens herablaufen läßt,wonach man den Inhalt des Röhrchens durch etwa sechsmaliges Umstürzen des Röhrchens vermischt. Die Lösung wird dann sofort in eine 10 ram- oder 12mm-Küvette überführt, wonach man sie sich während 10 min abkühlen läßt. Die Küvette wird dann in einen üblichen Kolorimeter eingeführt und es wird die Adsorption bei 540 mu gegen eine Reagensblindprobe gemessen. Der Cholesteringehalt des Blutes wird durch einen Vergleich dieses Adsorptionswertes mit dem Adsorptionswert eines Cholesterinstandarts oder einer Eichkurve ermittelt.

Triglyceridanalyse

Man überführt 2,0 ml obiger überstehenden Flüssigkeit der Probe in ein Teströhrchen. Dann gibt man 0,6 ml eines Verseif ungs reagens (5,0 g Kaiiumhydroxid in 250 ml Wasser und 750 ml Isopropanol) zu und vermischt. Das Röhrchen wird während 15 min in einem Wasserbad bei 6O-7O°C inkubiert. Dann gibt man 1,0 ml eines Oxidationsmittels zu und vermischt. (Das Oxidationsmittel erhält man aus 5,4 g Natriummetaperjodat in 1 η Essigsäure und Verdünnen auf 1 Liter mit 1 η Essigsäure, wonach man 12 ml dieser Stammlösung und 20 ml Isopropanol

auf
mit 1 η Essigsäure ( 100 ml auffüllt). Dann gibt man 0,5 ml eines Acetylaceton-Farbreagens (0,75 ml 2,4-Pentandion und 2,5 ml Isopropanol in 100 ml 2n Ammoniumacetat, pH 6,0 Puffer) zu und mischt durch. Das Röhrchen wird dann während 15 min bei 60-7O⁰C in einem Wasserbad inkubiert. Dann läßt man den Inhalt des Röhrchens sich während 5 min abkühlen und bestimmt dann die Adsorption in einem üblichen Kolorimeter bei 405 mu

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gegen eine Reagensblindprobe. Der Triglyceridgehalt des Serums wird durch Vergleich dieses Adsorptionswertes mit dem Adsorptionswert eines Triglyceridstandards oder mit einer Eichkurve ermittelt.

Phospholipidanalyse

Man gibt 10,O ml Isopropanol zu den Feststoffen zu, die die aus der Serumprobe sorbierten Materialien aufweisen, mischt gut durch und zentrifugiert während 5 Minuten. Dann wird die überstehende Flüssigkeit verworfen. Man setzt 5,0 ml einer Ammoniak-Isopropanol-Extraktionslösung (Isopropanol und konzentrierte Ammoniumhydroxidlösung in einem Verhältnis von 8:2) zu den Feststoffen zu und mischt durch. Die Mischung wird während 5 Minuten zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert. Man überführt 2,0 ml dieser überstehenden Flüssigkeit in ein Teströhrchen. Dann setzt man 1,0 ml des Verseifungsreagens (das gleiche Reagens wie es für die Triglyceridanalyse dieses Beispielsjverwendet wurde) zu und mischt durch. Das Röhrchen wird während 15 min in einem Wasserbad bei 6O-7O°C inkubiert. Dann gibt man 1,0 ml des Oxidationsmittels (wie es bei der Triglyceridanalyse dieses Beispiels verwendet wurde) zu, mischt durch und erhitzt während 5 Minuten in einem Wasserbad bei 6O-7O°C. Anschliessend gibt man 1,0 ml des Acetylaceton-Farbreagens (das gleiche wie es für die Triglyceridanalyse dieses Beispiels verwendet wurde) zu, mischt durch und inkubiert in einem Wasserbad bei 6O-7O°C während 15 min. Dann läßt man den Inhalt des Röhrchens sich abkühlen und bestimmt die Absorption mit Hilfe eines üblichen Kolorimeters bei 405 πψ gegen eine Reagensblindprobe. Der Phospholipidgehalt des Serums wird durch einen Vergleich dieses Adsorptionswertes mit dem Adsorptionswert eines Phospholipidstandards oder mit Hilfe einer Eichkurve ermittelt.

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Beispiel 2 Säulenmethode

Eine vereinfachte Säulenmethode, die besonders geeignet ist für den praktizierenden Arzt und für kleine Kliniken, kann wie folgt durchgeführt werden. Man überführt eine Probe (0,3 ml Serum + 9,7 m. Isopropanol) durch die Säule, die mit dem Aluminiumoxid/Kieselgel-Adsorbens (75/25) gefüllt ist. Die extrahierte Flüssigkeit wird in einem 10 ml Teströhrchen gesammelt. Die extrahierte Flüssigkeit wird dann zur Bestimmung des Cholesterin- und Triglyceringehalts nach der|in Beispiel 1 angegebenen Weise verwendet. Die Säule wird mit 10 ml Isopropanol gewaschen und mit 5,0 ml einer Ammoniak/ Isopropanol-Mischung extrahiert, wonach der Extrakt zur Bestimmung der Phospholipide nach der Methode des Beispiels verwendet wird.

Beispiel 3

Das folgende Beispiel verdeutlicht die Erfindung und den erfindungsgemäßen Diagnose-Reagenssatz. Der Reagenssatz enthält die hauptsächlichen Reagentien, die zur Durchführung einer Cholesterin- Triglycerid-und Phospholipid-Bestimmung in einer einzigen Serumprobe kleinen Volumens (o,5 ecm) erforderlich sind und ist für die Durchführung dieser Bestimmungen nach einer einzigen Extraktion der störenden Substanzen mit Hilfe der Aluminiumoxid/Kieselgel-Mischung geeignet. Jeder Reagenssatz enthält, mit Ausnahme des Isopropylalkohols, die Reagentien, die für 25 Cholesterin-, Triglycerid- und Phospholipid-Bestimmungen erforderlich sind.

In dem Reagenzsatz enthaltene Reagenzien:

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1. Aluminiumoxid/Kieselsäure-Extraktionsmischung (0,75 g Aluminiumoxid und 0,25 g Kieselgel), 30 g, 25 kleine Kunststoff säulen, die jeweils etwa 1 g der Aluminiumoxid/Kieselsäure-Extraktionsmischung fassen, ein Meßlöffel zum Einfüllen von etwa 1 g. Die vorher abgemessenen Mengen der Aluminiumoxid/Kieselgel-Mischungen werden in kleinen Kunststoffsäulen geliefert, die einen Filter enthalten, wodurch die Extraktionszeit vermindert und Aluminiumoxidteilchen, an die die störenden Materialien gebunden sind, zurückgehalten werden. Das Aluminiumoxid sollte in einer Schale ausgebreitet und über Nacht in einem Ofen bei 110-120 C getrocknet werden. Nach der Entnahme aus dem Ofen sollte es mit Aluminiumfolie bedeckt und auf Raumtemperatur abgekühlt werden. Dann werden das Aluminiumoxid und das Kieselgel in einem Gewichtsverhältnis von 3:1 vermischt, wonach man etwa 1 g dieser Mischung in jede der 25 kleinen Kunststoffsäulen einfüllt, die in jedem Reagenzsatz vorhanden sind.

2. Verseifungsreagens (Isopropanol/KOH -Mischung, 75/25).

Es wird eine Flasche geliefert, die etwa 65 ml einer Mischung aus 25 Teilen einer 2%igen wäßrigen Kaliumhydroxidlösung und 75 Teilen Isopropylalkohol enthält. Man bereitet 1 Liter der Isopropanol/KOH-Lösung wie folgt: Man löst 2 g KOH in 100 ml Wasser oder 20 g in 1 Liter Wasser. Dann entnimmt man 250 ml dieser 2%igen wäßrigen KOH-Lösung und gibt sie zu 750 ml analysenreinem (aldehydfreiem) Isopropylalkohol . Zur Bereitung von 250 1 der Lösung ist es notwendig, 63 1 der 2%igen KOH-lösung herzustellen. Man löst 20 χ 63 = 1360 g KOH in 63 1 destilliertem Wasser. Dann gibt man diese Lösung zu 186 1 Isopropylalkohol. Diese Zugabe sollte langsam und unter gelegentlichem Rühren erfolgen. Es ist angebracht, die KOH-Lösung zu dem Isopropylalkohol zuzusetzen.

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3. Oxidationsmittel (Natriummetaperjodat). Es wird eine Flasche geliefert, die etwa 10 ml einer 0,25 m-Natriumperjodat-Stammlösung in 2 m Essigsäure enthält. In jeder Ampulle mit einem Fassungsvermögen von 10 ml ist ein aliquoter Anteil von 10 ml enthalten. Zur Herstellung löst man 0,535 g Natriumperjodat in 100 ml 2 m Essigsäure. Für 5000 Reagenssätze sind 5000 χ IO ml = 50 000 ml oder 50 1 erforderlich. Man stellt 50 1 2 m Essigsäure wie folgt her. Mit Hilfe eines Meßzylinders mißt man 114 χ 50 = 5700 ml Eisessig ab und gibt 44300 ml destilliertes Wasser zu. Man mischt gut durch, wiegt 267,5 g Natriumperjodat ab, setzt es zu der 2 m Essigsäure zu und rührt, um das Material zu lösen.

4. Ammoniumacetat-Puffer. Es wird eine 2 m Ammoniumacetatlösung mit einem pH-Wert von 6,0 verwendet. Pro Reagenssatz werden in einer 120 ml Flasche 100 ml geliefert. Man stellt den Puffer dadurch her, daß man 154 g Ammoniumacetat in 9OO ml destilliertem Wasser löst und den pH-Wert mit 1 η Essigsäure auf 6,0 einstellt und das Volumen auf 1 Liter bringt. Für 5000 Reagenssätze werden 500 1 dieser 2 m Ammoniumacetatpufferlösung hergestellt. Dies erfolgt durch Einwiegen von 154 χ 500 = 77000 g Ammoniumacetat und Auflösen dieses Materials in etwa 450 1 destillierten Wassers. Man stellt den pH-Wert mit 1 η Essigsäure auf 6 ein und füllt auf ein Volumen von 500 1 auf.

5. Isopropylalkohol (80 %) / Ammoniak (20 %)-Extraktionsmittel zum Extrahieren der Phospholipide (Isopropanol und Ammoniumhydroxid in einem Verhältnis von 8:2). Es wird eine 150 ml Flasche mit dem Extraktionsmittel geliefert.

6. 2,4-Pentanedion. Pro Reagenssatz werden 2,5 ml dieser Verbindung in einer 5 ml-Schraubdeckelflasche geliefert.

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7. Kombinierte Standardlösung, die aus jeweils 300 mg % Triglyceriden, Phospholipiden und Cholesterin in Isopropylalkohol besteht. In einer braunen 5 ml-Schraubdeckelflasche sind 2,5 ml Triolein, Cholesterin und Lecithin vorhanden. Für 5000 Reagenssätze werden 12500 ml der Standardlösung hergestellt. Diese Lösung enthält 300 mg % Triolein, 500 mg % Lecithin und 500 mg % Cholesterin. Zur Herstellung wiegt man 5 g Triolein, 5 g Lecithin und 5 g Cholesterin ab und füllt mit Isopropylalkohol auf ein Volumen von 1000 ecm auf. Für 12500 ml wiegt man 3 χ 12,5 = 37,5 g Triolein, 5 χ 12,5 = 62,5 g Lecithin und 5 χ 12,5 = 62,5 g Cholesterin ab. Man gibt Isopropylalkohol bis zu einem Endvolumen von 12500 ml zu.

8. Eisen(III)-chlorid/Essigsäure-Reagens für die Cholesterinfarbreaktion. Pro Reagenssatz werden etwa 62-63 ml geliefert, während für 5000 Reagenssätze 62 χ 5000 = 310 000 ml oder 310 1 erforderlich sind. 0,5 g FeCl₃ · 6H₂O gelöst in 500 ml Eisessig oder 1 g pro Liter Eisessig. Man löst 310 g FeCl₃ · 6H₃O in 310 1 Eisessig.

!Sticht vorhandene Reagenzien

1. Analysenreiner, aldehydfreier Isopropylalkohol zur Abspaltung von Cholesterin, Triglyceriden und Phospholipiden von den Lipoproteinen, die in dem Serum oder dem Plasma vorhanden sind.

2. 1 η Essigsäure. Die Essigsäure wird dadurch hergestellt, daß man 17,6 ml Eisessig mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllt. Diese Lösung wird zur Herstellung des verwendeten Oxidationsmittels verwendet.

3. Konzentrierte Schwefelsäure.

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Reagenzien, die der Benutzer herzustellen hat.

1. Das Triglycerid- und Phospholipid-Farbreagens erhält man durch Vermischen von 0,75 ml 2,4-Pentandion (das obige Reagens 6), 2,5 ml Isopropylalkohol und Auffüllen mit Ammoniumacetatpuffer (obiges Reagens 4) auf 100 ml. Dieses Farbreagens sollte, wenn es nicht gebraucht wird, in einer braunen Flasche im Kühlschrank aufbewahrt werden. Dieses Reagens ist im Kühlschrank während mindestens 6 Wochen stabil.

2. Verwendete Oxidationslösung.

Als Reagens 3 (s. oben) wird eine Perjodat-Stammlösung geliefert. Man verdünnt 2,5 ml dieser Lösung mit 1 η Essigsäure auf 25 ml.

Bedienungsanleitung:

1. Herstellung des Triglycerid-Farbr'eagens. Man öffnet die 2,4-Pentandion enthaltende Flasche ( das obige Reagens 6), pip'ettiert 0,75 ml ab und führt sie in einen 100 ml Meßkolben über.. Dann gibt man 2,5 ml Isopropylalkohol zu und füllt mit dem Ammoniumacetatpuffer auf ein Volumen von 100 ecm auf.

2. Oxidationsmittel. Man stellt eine 1 η Essigsäurelösung her. Dann öffnet man die Flasche mit der Oxidationsstammlösung (s. das obige Reagens 3), entnimmt 2,5 ml dieser Lösung und verdünnt sie mit 1 η Essigsäure auf 25 ml.

geliefert

3. Eichkurve. Es wird eine Standardlösungi, die jeweils 300 mg

% Triglyceride, Cholesterin und Phospholipide in Isopropylalkohol enthält. Unter Verwendung von verstöpselten Reagenzgläsern werden die folgenden Verdünnungen hergestellt:

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	Stamm- lösung	Isopropyl- alkohol	2503993
	1,00	0,0	Konzentration der Standardlösungen
1	1,00	1,00	300 mg %
2	1,00	2,00	150 mg %
3	0,5	4,50	100 mg %
4		50 mg %

Proben

Die Blutprobe sollte von Individuen abgenommen werden, die während mindestens sechs Stunden nüchtern gehalten wurden und keine Hämolyse zeigen. Der Sammelbehälter sollte heparinfrei sein und der Blutkuchen sollte innerhalb 40 I4inuten nach der Bildung abgetrennt werden.

Die Untersuchung kann an Serumproben durchgeführt werden, die bis zu 24 Std bei Raumtemperatur, gekühlt bis zu 2 Tagen und in gefrorenem Zustand beliebig lange aufbewahrt worden sind.

Erforderliche Vorrichtungen

1. allgemeine Laboratoriurasglaswaren.

2. Wasserbad mit einer Temperatur von 60-7O⁰C.

3. Geeignetes Spektrophotometer, das bei 4o5 nm und 540 nm abgelesen werden kann.¹

4. Wirbelmischer.

Bedienungsanleitung Klinische Bestimmung

1. Man beschriftet drei Extraktionssäulen mit B (Blindprobe), S (Standard) und U (unbekannte Probe). Dann entfernt man den oberen großen Deckel.

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2. Man füllt in jede Säule 9,7 ml Isopropylalkohol ein.

3. Man versetzt die Säule B mit 0,3 ml Wasser, die Säule S mit 0,3 ml der Standardstammlösung und die Säule U mit 0,3 ml des Serums des Patienten.

4. Man setzt die Deckel wieder auf die Säulen auf und schüttelt die Säulen während einer Minute von Hand.

5. Dann ordnet man die Säulen über in gleicher Weise markierten Teströhrchen an, nimmt beide Deckel der Säulen ab und

läßt die Lösungen in die Teströhrchen auslaufen. Diese Extrakte werden für die Cholesterin- und Triglyceridbestimmungen verwendet.

6. Man entnimmt die Säulen aus den Teströhrchen, steckt die unteren Deckel wieder auf und füllt jeweils 10 ml Isopropylalkohol in jede Säule ein. Dann befestigt man die oberen Verschlußkappen, schüttelt kurz und entfernt die Deckel wieder. Dann läßt man den Waschalkohol in ein Abwaschflüssigkeit enthaltendes Becherglas auslaufen. Man wiederholt das Waschen mit Isopropylalkohol erneut, wobei man wiederum die Waschflüssigkeit verwirft.

7. Man ordnet die Säulen über entsprechend markierten Teströhrchen an, führt in jede Säule 5 ml der Isopropylalkohol/ Ammoniak-Mischung (das obige Reagens 5) ein, schüttelt während einer Minute und läßt den Inhalt der Säule in die Röhrchen laufen. Diese Extrakte werden für die Phospholipid-Bestimmungen verwendet.

Triglyceridbestimmung

1. Man füllt in mit B, S und U bezeichnete Teströhrchen 2,0 ml der Flüssigkeit ein, die in den in Stufe 5 erhaltenen Röhrchen vorhanden sind.

2. Man gibt 0,6 ml des Verseifungsreagens (s. das obige Reagens 2) in jedes Röhrchen ein, vermischt während 5 bis 10 min in dem Wirbelmischer und erhitzt während 15 min in einem Viasserbad auf 6O-7O°C.

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3. Man entfernt die Röhrchen aus dem Bad,versetzt jedes

mit 1,0 ml der Oxidationslöeung (die man entsprechend Punkt der obigen Bedienungsanleitung hergestellt hat) und mischt kurz durch.

4. Dann gibt man in jedes Röhrchen 0,5 ml des Farbreagens (das man entsprechend Punkt 1 der Bedienungsanleitung hergestellt hat), mischt mit Hilfe des Wirbelmischers und inkubiert während 15 min in einem Wasserbad bei 60-70 C.

5. Man entnimmt die Röhrchen aus dem Bad und läßt sie während 5 min abkühlen.

Dann bestimmt man die optische Dichte bei 405 nm, wobei man das Instrument mit der Reagensblindprobe auf 0 einstellt. Die Färbung ist während 30 min stabil. Wenn die optische Dichte des Serums des Patienten zu hoch ist, kann die Prozedur wiederholt v/erden, wobei man den Ausgangsextrakt mit einer gleich großen Menge Isopropylalkohol verdünnt.

Cholesterinbestimmung

1. Man beschickt Teströhrchen, die man mit B, S und U markiert hat, mit jeweils 1,0 ml der Lösungen, die in den Teströhrchen der Stufe 5 vorhanden sind.

2. Man versetzt jedes Röhrchen mit 2,0 ml Eisen(III)-chlorid-Reagens (s. das obige Reagens 8) und mischt gut durch.

3. Man gibt 0,2 ml konz. Schwefelsäure zu jedem Röhrchen und mischt vorsichtig durch Vor- und Zurückneigen der Röhrchen.

4. Man läßt die Röhrchen während 10 Minuten abkühlen.

5. Man bestimmt die optische Dichte bei 540 nm, wobei man das Instrument mit der Reagensblindprobe auf 0 einstellt. Die Färbung ist während 10 min stabil.

Phospholipidbestimmung

1. Man beschickt mit B, S und U markierte Teströhrchen mit jeweils 2,0 ml der in Stufe 7 in jedem Röhrchen vorhandenen Flüssigkeit.

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2. Han führt in jedes Röhrchen 1,0 ml Verseifungsreagens (wie das obige Reagens 2) ein.

3. Man inkubiert die Röhrchen während 15 Minuten in einem Wasserbad bei 6O-7O°C.

4. Man entnimmt die Röhrchen aus dem Bad, versetzt jedes mit 1,0 ml der Oxidationslösung (die man entsprechend Punkt 2 der Bedienungsanleitung hergestellt hat) und mischt kurz durch.

5. Man versetzt jedes Röhrchen mit 0,5 ml des Farbreagens (das man entsprechend Punkt 1 der Bedienungsanleitung hergestellt hat), vermischt mit dem Wirbelmischer und inkubiert während 15 min in einem Wasserbad bei 6O-7O°C.

6. Dann entnimmt man die Röhrchen aus dem Bad undläßt sie während 5 min abkühlen.

7. Man bestimmt die optische Dichte bei 405 ran, wobei man das Instrument mit der Reagensblindprobe auf 0 stellt. Die Färbung ist während 15 min stabil.

Berechnungen

Die Konzentrationen der Triglyceride, des Cholesterins und der Phospholipide können dadurch bestimmt v/erden, daß man die oben beschriebene Methode mit jeder der Standardlösungen durchführt. Dann wird eine Eichkurve aufgetragen, indem man die optische Dichte gegen die Konzentration aufträgt. Wenn die optischen Dichten der Extrakte eines Serums eines Patienten 0,100 für die Triglyceride, 0,140 für das Cholesterin und 0,090 für die Phospholipide betragen, ergibt sich die Konzentration in mg % für jeden Bestandteil, die aus den Eichkurven abgelesen werden kann, mit 75 mg % Triglycerid, 175 mg % Cholesterin und 200 mg % Phospholipiden.

Alternativ können die Konzentrationen direkt aus der klinischen Bestimmung, wie sie in der Bedienungsvorschrift angegeben ist, ermittelt v/erden. Wenn die Untersuchungen unter Verwendung eines 100 mg %-Standards für die Triglyceride eine optische Dichte von 0,135, für Cholesterin eine optische Dichte von 0,080 und für die Phospholipide eine optische Dichte

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von 0,045 ergeben, und die optischen Dichten, die an Extrakten eines Serums ein»s Patienten ermittelt wurden, die oben angegebenen sind, können die Konzentrationen der Bestandteile wie folgt berechnet werden:

Triglyceridkonzentration =

Optische Dichte bei 405 nm des nicht bekannten Materials Optische Dichte bei 405 nm des Standards Konzentration des Standards (mg %) = χ 100 = 74 mg %

Phospholipidkonzentration =

Optische Dichte bei 405 nm des unbekannten Materials Optische Dichte bei 405 nm des Standards ^x

Konzentration des Standards (mg %) = x 100 = 200 mg %

Cholesterinkonzentration =

Optische Dichte bei 540 nm des unbekannten Materials Optische Dichte bei 540 nm des Standards ^x

Konzentration des Standards (mg %) = x 100 = 175 mg %

Störungen durch Serumbestandteile

Es hat sich gezeigt, daß die im folgenden angegebenen Substanzen die Bestimmung der drei Lipide unter Anwendung der obigen Verfahrensweise nicht stören:

Glucose bis zu 300 mg %, Bilirubin bis zu 12 mg %, Creatinin bis zu 18 mg %, Glycerin bis zu 15 mg %, Threonin bis zu 9 mg %, Serin bis zu 9 mg %, Tryptophan bis zu 9 mg % und Kaliumbromid bis zu 15 mg %. Wenn man Salicylat zu normalem Serum zusetzt, soergibt sich keine Beeinträchtigung der Triglycerid- und Phospholipid-Bestimmungen bis zu 15 mg %, während bei dieser Konzentration die Cholesterinwerte um etwa 12 % höher liegen.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

' 1.! Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von Triglyceriden, - -' Cholesterin und Phospholipiden in einer einzigen Probe Humanplasma oder -serum, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) zu der Probe Isopropy!alkohol zusetzt, um die Triglyceride, das Cholesterin und die Phospholipide von den in der Probe enthaltenen Lipoproteinen abzuspalten;

b) die die Isopropylalkohollösung enthaltende Probe mit einem Adsorbens, das etwa 1 g bis etwa 0,70 g Aluminiumoxid und etwa 0,25 g Kieselsäure umfaßt, vermischt, um die Triglyceride und das Cholesterin von den Phospholipiden abzutrennen, wobei die Triglyceride und das Cholesterin in der Isopropylalkohollösung verbleiben und die Phospholipide von dem Adsorbens adsorbiert werden;

c) die die Triglyceride und das Cholesterin enthaltende Isopropylalkohollösung von dem die Phospholipide enthaltenden Adsorbens abtrennt;

d) die Phospholipide mit einer Isopropylalkohol/Ammoniak-Lösung von dem Adsorbens eluiert;

e) einen Teil der die Triglyceride enthaltenden Isopropylalkohollösung und einen Teil des die Phospholipide enthaltenden Isopropylalkohol/Ammoniak-Eluats mit dem gleichen Verseif ungsmittel behandelt, um die Triglyceride und die Phospholipide zu Glycerin zu hydrolysieren;

f) zu beiden verseiften Lösungen das gleiche Oxidationsmittel zusetzt, um Glycerin zu Formaldehyd zu oxidieren;

g) zu beiden oxidierten Lösungen das gleiche Farbreagens zusetzt, um eine Triglycerid-und Phospholipid-Farbreaktion hervorzurufen;

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h) einen Teil der das Cholesterin enthaltenden Isopropylalkohollösung mit einem anderen Farbreagens behandelt, um eine Cholesterin-Farbreaktion hervorzurufen; und i) für jede der drei Lösungen einen Kolorimeterwert für Tr iglyceride, Phospholipide bzw. Cholesterin abliest und daraus die Triglycerid-, Phospholipid- und Cholesterin-Werte errechnet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Serumprobe verwendet, als Adsorbens 0,75 g Aluminiumhydroxid und 0,25 g Kieselgel verwendet, als Verseifungsreagens wäßriges Kaliumhydroxid in Isopropanol einsetzt, als Oxidationsmittel Natriumperjodat in Essigsäure benützt, als Triglycerid- und Phospholipid-Farbreagens 2,4-Pentandion in Ammoniumacetat-Puffer und Isopropanol benützt und als Cholesterin-Farbreagens Eisen(III)-chlorid in Eisessig verwendet.
3. Diagnose-Reagenssatz für die gleichzeitige Bestimmung von Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden in Humanplasma oder -serum, dadurch gekennzeichnet, daß er im wesentlichen folgendes umfaßt: eine Aluminiumoxid/Kieselgel-Adsorbensmischung, die 0,75 g Aluminiumoxid, 0,25 g Kieselgel enthält? ein Verseifungsreagens, das wäßriges Kaliumhydroxid in Isopropanol umfaßt; ein Oxidationsmittel, das Natriummetaperjodat in Essigsäure umfaßt; ein Cholesterin-Farbreagens, das Eisen(III)-chlorid in Essigsäure umfaßt; einen Ammoniumacetatpuffer; 2,4-Pentandion als Triglycerid- und Phospholipid-Farbreagens; eine Isopropylalkohol/Ammoniakmischung zur Extraktion der Phospholipide von der Adsorbensmischung; und eine Standardlösung von Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden in Isopropy!alkohol.

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