DE2644501B2

DE2644501B2 - Prüfmittel zur Bestimmung von Bilirubin in Urin

Info

Publication number: DE2644501B2
Application number: DE2644501A
Authority: DE
Inventors: Charles T.W. Elkhart Ind. Lam (V.St.A.)
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1975-10-02
Filing date: 1976-10-01
Publication date: 1979-04-12
Also published as: JPS5751904B2; DE2644501C3; IT1066300B; DE2644501A1; CA1068585A; IN143345B; FR2326706A1; AU1754276A; FR2326706B1; US4038031A; GB1530207A; JPS5243493A; AU501591B2

Description

oder eine tautomere Form davon besitzt, wobei R eine verbindende Gruppe darstellt, die zur Bildung eines 5- oder 6-gliedrigen Ringes beiträgt der noch zusätzliche Substituenten enthalten kann.

5. Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat 2,6-Dioxopyrimidin oder ein Derivat davon ist.

6. Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat die Formel

oder eine tautomere Form davon besitzt, wobei R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Älkylgruppe und R³ und R⁴ jeweils ein Wasserstoffatom oder Halogenatom oder eine niedere Älkylgruppe bedeuten oder R³ und R⁴ zusammen mit der Äthylengruppe in dem heterocyclischen Ring ein isocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem bilden.

7. Mittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat die Formel

R¹

R³

60

ONN

R²
oder eine tautomere Form davon besitzt, wobei R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Älkylgruppe und R³ ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe oder eine hydroxysubstituierte niedere Alkylgruppe bedeuten.

8. Mittel nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat Coffein, Dyphyllin, Uridin, Urazol, 2-lmidazolidon und/oder Parabansäure ist.

9. Mittel nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Sulfonsäure oder deren Salz eine aromatische Sulfonsäure oder ein Salz davon sind.

10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die aromatische Sulfonsäure Sulfosalicylsäure, Naphthalindisulfonsäure und/oder Biphenyldisulfonsäure ist.

Der diagnostische Wert der Bilirubinbestimmung in Urin ist bekannt. Urin von einer gesunden Person enthält keine nennenswerte Menge Bilirubin (weniger als 0,05 mg/100 ml). Verschiedene Krankheitszustände, wie Gallenstauung und hämolytische und hepatische Erkrankungen, führen jedoch dazu, daß Bilirubin im Urin in einer abnorm hohen Konzentration auftritt. Es ist allgemein anerkannt, daß das Vorhandensein von Bilirubin im Urin in einer Konzentration über 0,05 mg/ 100 ml ein Anzeichen ist für einen abnormen klinischen Zustand, der die Durchführung umfangereicherer diagnostischer Verfahren erforderlich mach', um die spezifische verursachende Erkrankung fef*iustellen.

Es ist ferner bekannt, daß im wesentlichen das gesamte Bilirubin, das in pathologischem Urin vorkommt, in konjugierter Form vorliegt. Bilirubin ist ein Abbauprodukt der Hämgruppe von Hämoglobin und wird, wenn es erst im Blutstrom entstanden ist, von der Leber aufgenommen, wo es durch Veresterung mit Glucuronsäure konjugiert wird. Die entstehenden BiIirubinglucuronide sind außerordentlich gut wasserlöslich im Gegensatz zu freiem Bilirubin, das in Wasser sehr wenig löslich ist. Die konjugierten Bilirubine können dadurch frei von der Leber in die Nieren gehen, wo, unter normalen Umständen, im wesentlichen das gesamte konjugierte Bilirubin in Urobilinogen umgewandelt und als Bestandteil des Urins ausgeschieden wird. Bei verschiedenen pathologischen Zuständen wird konjugiertes Bilirubin selbst im Urin ausgeschieden.

Bilirubin wird üblicherweise bei Routine-Urinuntersuchungen nachgewiesen, aufgrund seiner Reaktion mit verschiedenen Diazoniumverbindungen in saurem Medium unter Bildung eines gefärbten Azobilirubinkomplexes. Während in der Literatur verschiedene Testverfahren angegeben sind, ist das im klinischen Labor im allgemeinen bevorzugte Mittel ein Teststreifen. Die Diazoniumverbindung ist in einem Träger absorbiert, der eine vorbestimmte Menge Urin absorbieren kann, wenn er augenblicklich in eine Urinprobe getaucht wird. Eine etwaige Farbreaktion kann in weniger als einer Minute abgelesen werden. Die Herstellung und Anwendung von Bilirubinteststreifen ist im einzelnen in der US-PS 35 85 001 beschrieben. Während die bekannten Teststreifen ein schnelles und bequemes Verfahren zur Bestimmung von Urinbilirubin ermöglichen, ist es allgemein bekannt, daß die zur Verfügung stehenden Teststreifen nicht ausreichend empfindlich sind, um Bilirubingehalte nachzuweisen, die nur

leicht gegenüber dem normalen Gehalt erhöht sind, d. h. zwischen 0,05 und 0,8 mg Bilirubin pro 100 ml.

Es werden einige Versuche berichtet, die Empfindlichkeit der Reaktion zwischen Diazoniumverbindungen und Harnbilirubin zu erhöhen. Die bekannten Testsysteme besitzen jedoch bestimmte Nachteile.

In der US-PS 38 80 588 ist eine Gruppe von Diazoniumverbindungen beschrieben, die die Farbreaktion des Azobilirubinkomplexes erhöhen und die störenden Farbreaktionen mit Urobilinogen, das dem Bilirubin strukturell und chemisch nahe verwandt ist, verringern sollen. Die angegebenen Diazoniumverbindungen bilden jedoch im Gegensatz zu den üblichen Verbindungen störende gefärbte Produkte mit Bestandteilen von Urin, wie Homogentisinsäure (2,5-Dihydroxyphe- ι j nylessigsäure) und S-Hydroxyindol-S-essigsäure. Die zuletzt genannte Verbindung ist ein normaler Bestandteil von Urin und so geringe Mengen wie 1 mg/100 ml dieses Bestandteils in Urin führen zu falschen positiven Ergebnissen, wenn die in der genannten Druckschrift erwähnten Diazoniumverbindungen angewandt werden.

Ein weiterer Versuch, die Empfindlichkeit der in Teststreifen eingebauten Diazoniumreagenlien zu verbessern, ist in der US-PS 38 53 476 beschrieben, die die 2> Anwendung bestimmter Phosphorsäurediester als Mittel zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Verstärkungsmittel für die Reaktion zwischen der Diazoniumverbindung und Bilirubin offenbart. Aufgrund der Unverträglichkeit dieser Phosphorsäurediester mit jii einem wäßrigen Medium, müssen jedoch Teststreifen entsprechend dieser Druckschrift durch ein Doppelimprägnierverfahren hergestellt werden.

Es ist zu bemerken, daß verschiedene sogenannte »Beschleunigungsmittel« beschrieben worden sind im j^r> Zusammenhang mit dem Nachweis von Bilirubin in Serum mit Hilfe einer Diazokupplungsreaktion. Derartige Mittel umfassen Coffein, Dyphillin, Natriumacetat, Natriumbenzoat, Gummiarabikum und verschiedene andere chemisch nicht verwandte Verbindungen. Die Anwendung derartiger Beschleunigungsmittel bei Bilirubinuntersuchungen in Serum wurde bereits um 1920 in der Literatur beschrieben, aber niemals auf Bilirubinuntersuchungen im Harn angewandt. Das liegt an der allgemein bekannten Tatsache, daß solche Be- 4^r> schleunigungsmittel auf eine Form von Bilirubin wirken, die im Urin nicht in nennenswerten Mengen vorhanden ist. Derartige Beschleunigungsmittel sollen die Diazokupplung von freiem Bilirubin beschleunigen. Es wird über keine Wirkung auf die Kupplung von konjugiertem w Bilirubin berichtet, da bei Bilirubinuntersuchungen in Serum die konjugierten Formen von Bilirubin verhältnismäßig schnell mit den Diazoniumverbindungen reagieren, ohne daß Beschleuniger erforderlich sind. Daher werden die konjugierten Formen von Bilirubin in Serum y, als direkt reagierendes Bilirubin bezeichnet, während freies Bilirubin, das das Vorhandensein von Beschleunigern erforderlich macht, um zu einer schnellen Reaktion zu führen, als indirekt bindendes Bilirubin bezeichnet wird. bo

Über die Anwendung von Dyphylin zur Bestimmung von Bilirubin in Urin wird nur einmal berichtet (Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation, Supplement 56 [1961]). In diesem Falle war die Anwendung jedoch speziell dafür vorgesehen, um die gleiche b^ri Wirkung zu erreichen, wie sie in der Literatur in Beziehung auf Bilirubinuntersuchungen in Serum angegeben ist, nämlich die Diazokupplung von freiem Bilirubin zu beschleunigen, das, wie bekannt ist, in dem untersuchten Urin nur in sehr geringen Mengen vorhanden sein kann. Das dort beschriebene Verfahren umfaßt ein mühsames flüssiges Testsystem und es findet sich kein Hinweis auf die Anwendung einfacher Teststreifen. Das dort beschriebene Verfahren hat auch in der Fachwelt wenig Beachtung gefunden zur Entwicklung empfindlicherer Bilirubintsststreifen, wie daraus hervorgeht, daß man zu den in den oben erwähnten US-PS 38 53 476 und 38 80 538 angegebenen, mit Nachteilen behafteten Testsystemen Zuflucht genommen hat.

Es ist Aufgabe der Erfindung ein Prüfmittel zu entwickeln, mit dessen Hilfe es durch einfaches Eintauchen und Ablesen möglich ist, auch gering erhöhte Bilirubingehalle im Urin nachzuweisen.

Diese Aufgabe wird ausgehend von einem Prüfmittel zum Nachweis von Bilirubin in einer Urinprobe, bestehend aus einer Trägermatrix, enthaltend eine Diazoniumverbindung, die mit Harnbilirubin unter Auftritt einer Farbänderung reagiert, einen Bestandteil, der imstande ist, in der Urinprobe einen sauren pH-Wert zu erzeugen und ein Verstärkungsmittel, dadurch gelöst, daß das Verstärkungsmittel ein Addukt aus Harnstoff oder einem Harnstoffderivat und einer organischen Sulfonsäure oder einem Salz davon ist.

Das Harnstoffderivat kann ein acyclisches niederes Alkylderivat von Harnstoff oder eine cyclische Ureidoverbindung oder ein Derivat davon sein. Eine cyclische Ureidoverbindung oder ein Derivat davon ist bevorzugt und besonders eine solche, die zur Gruppe der Xanthine gehört.

Das Vorhandensein des speziellen erfindungsgemäßen Verstärkungsmittels führt zur Bildung von intensiver gefärbten Azobilirubinkomplexen, wodurch die Empfindlichkeit der Testreaktion wesentlich erhöht wird. Außerdem hat es sich gezeigt, daß das spezielle Verstärkungsmittel eine bathochrome Wirkung auf die Testreaktion besitzt, indem die in seiner Gegenwart entstehenden Azobilirubinkomplexe im allgemeinen veränderte Absorptionsspektren besitzen, wodurch Farben auftreten, die leichter von denen durch erwartete Störreaktionen verursachten Farben zu unterscheiden sind. Ferner hat es sich gezeigt, daß das spezielle Verstärkungsmittel auch als Stabilisator für die Diazoniumverbindung wirkt, wenn das Prüfmittel in trockenem Zustand in einen Träger eingebaut ist.

Diese Vorteile bei der Durchführung des Testverfahrens werden ergänzt durch Vorteile bei der Herstellung des Prüfmittels. Bei der Herstellung des bevorzugten Teststreifens wird das Prüfmittel üblicherweise entweder durch Sättigung des Trägers mit einer Lösung der Reagentien und anschließendes Trocknen oder durch Herstellung des Trägers in Gegenwart einer Lösung der Reagentien und anschließendes Härten in den Träger eingebaut. Bisher waren, um einen Teststreifen nach dem ersten Verfahren herzustellen, verschiedene Sättigungs- und Trocknungsstufen erforderlich. Wie im einzelnen in der US-PS 35 85 004 angegeben, mußte, um eine ausreichende Menge eines sauren Bestandteils in den Träger nach bekannten Verfahren einzubauen, eine speziell gebaute, eine Säure freisetzende Verbindung angewandt werden. Da eine derartige Verbindung bei Berührung mit einem wäßrigen Medium eine Mineralsäure freisetzte, konnte sie nicht zu der ursprünglichen Diazoniumsalzlösung zugesetzt werden, mit der der Träger imprägniert wurde. Die verschieuenen Sättigun^overfahren bei der Herstellung

sind nicht nötig, wenn das erfindungsgemäß verwendete Verstärkungsmittel zu der ursprünglichen Diazoniumsalziösung zugegeben wird, da weniger Säure erforderlich ist, um empfindliche Testergebnisse zu erhalten, und die erforderliche Menge an Säuje kann in Form einer festen Säure zur Verfügung gestellt werden, wie einer organischen Säure.

Die vorliegende Erfindung führt daher zu verbesserten Prüfmitteln zum Nachweis von Bilirubin in einer Urinprube mit einer erhöhten Empfindlichkeit der Diazokupplungsreaktion, erhöhter Stabilität der trockenen Formen des Prüfmittels, verringerter Störung durch zusätzliche Bestandteile des Urins und Vereinfachung des Herstellungsverfahrens.

Verschiedene Ureidoverbindungen haben sich als zur Herstellung des erfindungsgemäßen Verstärkungsmittels geeignet erwiesen. Im Zusammenhang dieser Beschreibung umfassen Ureidoverbindungen solche Verbindungen, die die Gruppe

N —C —N

enthalten, die im folgenden als Ureidogruppe bezeichnet wird. Ureidoverbindungen umfassen als Gruppe Harnstoff und verschiedene Harnstoffderivate. Cyclische Ureidoverbindungen, die durch einen heterocyclischen Ring charakterisiert sind, der eine Ureidogruppe enthält, sind besonders geeignet. Beispiele für derartige cyclische Ureidoverbindungen sind Cytosin, das ein aminosubstituiertes 2-Oxopyrimidin ist, und 2-lmidazolidon sowie andere 5- und 6-gliedrige oxoheterocyclische Verbindungen. Besonders geeignete cyclische Ureidoverbindungen sind solche mit einer dioxoheterocyclischen Ringstruktur der Formel

\ R

ίο

15 systeme. Beispiele lur geeignete Verbindungen der Formel 1 sind die substituierten und nicht substituierten 3,5-Dioxo-l,2,4-triazole, wie Urazol, die substituierten und nicht substituierten 2,4,5-Trioxoimidazole, wie Parabansäure und die substituierten und nicht substituierten 2,5-Dioxoimidazole, wie 1-Methylhydantoin und 7,8- Benzo-13-diazaspiro[4,5]-decan-2,3-dion.

Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind 2,6-Dioxopyrimidine und Derivate davon, wie Uridin. Von den 2,6-Dioxopyrimidinen sind besonders bevorzugt solche Verbindungen der Formel

oder einer lautomeren Form davon, wobei R¹ und R² 2) jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten, und R³ und R⁴ (1.) jeweils Wasserstoffoder Halogenatome oder eine niedere Alkylgruppe oder (2.) zusammen mit der Äthylengruppe in dem heterocyclischen Ringsystem ein substituiertes oder unsubstituiertes isocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem bilden, das die gewünschten Verstärkungseigenschaften nicht wesentlich verschlechtert. Verbindungen der Formel II umfassen 5-Bromuracil, 1,3-Dimethyl-6,7-diphenyllumazin und Xanthin und Derivate v, davon.

Von den cyclischen Ureidoverbindungen sind die am meisten bevorzugten Xanthin und dessen Derivate der Formel

(I)

(HD

oder einer tautomeren Form davon, wobei R eine verbindende Gruppe ist, die zur Bildung eines 5- oder 6-gliedrigen Ringes beiträgt, und woboi der heterocyclische Ring Substituenten enthalten kann, die die gewünschte Verstärkungswirkung nicht wesentlich verschlechtern. Andere Substituenten als Wasserstoffatome können an den Stickstoffatomen in dem heterocyclischen Ring vorhanden sein und sind üblicherweise substituierte oder unsubstituierte niedere Alkylgruppen, d. h. solche mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen. Eine große t,o Vielzahl von Substituenten kann an die Verbindungsgruppe R gebunden sein, da angenommen wird, daß die Verstärkungswirkung in erster Linie auf das Vorhandensein der Ureidogruppe zurückzuführen ist. Derartige Substituenten sind üblicherweise Wasserstoff- b^r> oder Halogenatome, Alkylgruppen, substituierte oder nicht substituierte kondensierte isocyclische oder heterocyclische aliphatische oder aromatische Ringoder einer tautomeren Form davon, wobei R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten und R³ ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe oder eine hydroxysubstituierte niedere Alkylgruppe ist. Diese Verbindungen sind bevorzugt aufgrund ihrer besonders deutlichen zusätzlichen Stabilisierungswirkung auf die Diazoniumverbindung. Diese Verbindungen umfassen Coffein, Dyphyllin und 3-lsobutyl-l-methylxanthin.

Andere Ureidoverbindungen können ebenfalls geeignet sein, solange die gewünschte Verstärkungswirkung durch die Addukte hervorgerufen wird, die sie mit organischen Sulfonsäuren oder deren Salzen bilden. Neben Harnstoff selbst haben sich die acyclischen niederen Alkylderivate von Harnstoff als geeignet erwiesen als Bestandteil der Verstärkungsmittel. Ein Beispiel für acyclische niedere Alkylderivate von Harnstoff ist Tetramethylharnstoff.

Der andere Bestandteil des Adduktes neben dem Ureidobestandteil in dem Verstärkungsmittel kann irgendeine Verbindung umfassen, die eine oder mehrere Sulfonsäuregruppen enthält oder ein Salz davon oder Formen, die mit der jeweiligen Ureidoverbindung unter ·> Bildung eines wasserlöslichen Adduktes mit der gewünschten Verstärkungseigenschafl reagieren. Derartige Verbindungen besitzen die allgemeine Formel

Ri-SO₁-R? _|()

in der R¹ ein organischer Rest ist und R² ein Wasserstoffatom, wobei eine Sulfonsäuregruppe entsteht, oder ein salzbildender Bestandteil, üblicherweise ein anorganisches Kation, wie ein Alkali-, z. B. Natrium- oder Kaliumion usw. Die aromatischen Sulfonsäuren und i> deren Salze sind bevorzugt, da sie zusätzlich dazu beitragen, die Diazoniumkomponente sowohl in trockener Form, wenn sie mit dem Verstärkungsmittel zusammen ist, als auch in Lösung, wie sie während des Herstellungsverfahrens auftritt, zu stabilisieren. Aromatische Sulfonsäuren und ihre Salze sind bekannte Stabilisatoren für Diazoniumsalzlösungen. Besonders geeignete aromatische Sulfonsäuren und Salze davon sind Sulfosalicylsäure. die Naphthalindisulfonsäuren, wie 1,5-Naphthalindisulfonsäure, und die Biphenyldisulfon- :?"> säuren, wie 4,4'-BiphenyIdisulfonsäure und deren Salze.

Die in dem Prüfmittel enthaltene Diazoniumverbindung kann irgendeine der bekannten Diazoniumverbindungen sein, üblicherweise in Form von Salzen, die mit Harnbilirubin unter Bildung eines gefärbten Komplexes kuppeln, wodurch eine Farbänderung auftritt. Allgemein sind die am meisten bevorzugten Diazoniumverbindungen, die Aryldiazoniumverbindungen. die die diazotierten Formen von 2,4-Dichloranilin, p-Nitroanilin, p-Chloranilin, 2,5-Dichloranilin, 4-Chlor- r> o-anisidin, 3,3'-Dimethoxybenzidin und 2-Methoxy-5-nitroanilin umlassen. Andere Verbindungen, von denen angegeben ist, daß sie imstande sind mit Harnbilirubin zu kuppeln, können ebenfalls angewandt werden.

Das Prüfmittel kann auch einen zusätzlichen Stabilisator für die Diazoniumverbindung enthalten. Ein derartiger Stabilisator dient, wie bekannt, dazu, störende Diazokupplungsreaktionen zu hemmen, indem er den anionischen Teil der Diazoniumverbindung blockiert. Ferner dient ein derartiger Stabilisator rnii dazu, die Diazoniumverbindung während der Herstellung des Prüfmittels und während der Testreaktion in gelöstem Zustand zu halten. Der Stabilisator kann aus einer großen Gruppe von Verbindungen ausgewählt werden, wie Fluoroboraten, Übergangsmetalihalogenverbindungen, wie Zink- und Kobaltchioriden, und aromatischen und aliphatischen Sulfonsäuren und Salzen, einschließlich der oben als bevorzugte Bestandteile der Verstärkungsmittel erwähnten.

Der den sauren pH-Wert einstellende Bestandteil des Prüfmittels kann aus einer Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen bestehen, die imstande sind, einen sauren pH-Wert in der zu untersuchenden Urinprobe einzustellen. Es ist bekannt, daß eine saure Umgebung bei der Testreaktion die Störung durch Ascorbinsäure verringert, den gefärbten Azobilirubinkomplex stabilisiert und den molaren Extinktionskoeffizienten des Komplexes erhöht und dadurch die kolorimetrische Reaktion verstärkt. Eine bevorzugte stark saure Umgebung wird erreicht wenn der den pH-Wert einstellende Bestandteil einen pH-Wert von weniger als 3 ergibt bei einer Konzentration von 0,1 n. Während ein den sauren pH-Wert einstellender Bestandteil in Form einer festen Säure, wie einer organischen Säure, bevorzugt ist, besitzt eine derartige Säure vorzugsweise einen pK_a-Wert von weniger als ungefähr 4. Beispiele für geeignete organische Säuren sind Citronensäure, Sulfosalicylsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Cyclohexansulfaminsäure und Maleinsäure. Wenn der saure Bestandteil eine Sulfonsäuregruppe enthält, wie im Falle von Sulfosalicylsäure, kann diese Verbindung auch gleichzeitig als Bestandteil des Verstärkungsmittels und/oder als Stabilisator für die Diazoniumverbindung dienen. So würde, wenn das Prüfmittel hergestellt würde aus einer Lösung der Diazoniumverbindung, des den sauren pH-Wert einstellenden Bestandteils und des Verstärkungsmittels, ein ausreichend großer Überschuß an einer organischen Sulfonsäure oder einem Salz davon als Quelle für das Material, das als pH-Wert einstellender Bestandteil wirkt, als Diazoniumstabilisator und als Bestandteil des Verstärkungsmittels dienen.

In dem Prüfmittel können gegebenenfalls noch zusätzliche Substanzen enthalten sein. Oberflächenaktive Mittel können enthalten sein, um die Benetzbarkeit des Prüfmittels mit der Urinprobe zu erhöhen. Löslichmachende Mittel können in dem Prüfmittel vorhanden sein. Derartige löslichmachende Mittel verhindern die Ausfällung der wirksamen Bestandteile des Prüfmittels während der Herstellung und während der Testreaktion. Ein Beispiel für ein löslichmachendes Mittel ist ein äquimolares Copolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid und besitzt in Lösung eine löslichmachende (solubilisierende) Wirkung, besonders in Beziehung auf das Verstärkungsmittel.

Der Anteil der Bestandteile in dem Prüfmittel kann in weiten Grenzen variieren, je nach der angewandten Form und dem angewandten Testverfahren. Die folgende Tabelle gibt die möglichen und bevorzugten Mengenverhältnisse der Bestandteile des Prüfmittels in trockener Form an, wie es in einer Prüfvorrichtung vorliegt, ausgedrückt als Gewichtsprozent.

	Zulässiger	Bevorzugter
	Bereich	Bereich
Diazoniumverbindung	0,05-10	0,2-2
Saurer Bestandteil	!—80	20-50
Verstärkungsmittel	5-80	30-60
Stabilisierungsmittel	0-50	1-15
Löslichmachendes Mittel	0-30	2-10

Der Träger liegt üblicherweise in Form einer Matrix vor, die imstande ist, ein vorher bestimmtes Volumen der Urinprobe aufzunehmen und festzuhalten. Eine derartige Matrix kann aus saugfähigem Papier, einer porösen polymeren Membran, einem in Wasser quellbaren Gel, einem Absorptionsmittel, einem inerten gewebten oder nicht gewebten Stoff usw. bestehen. Die Reagentien können in den Träger eingebaut werden durch Imprägnieren oder durch chemische oder physikalische Bindung oder aufgrund der Herstellung des Trägers in Gegenwart einer Lösung des Prüfmittels. Der Träger ist üblicherweise an einem Halter oder Griff befestigt oder auf andere Weise mit ihm verbunden, wie einem inerten Kunststoffstreifen, wobei eine Prüfvorrichtung entsteht die ein bequemes Mittel darstellt zur Handhabung des Trägers bei der Analyse einer Urinprobe.

909 515/379

Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Prüfmittels bringt man die Testprobe mit dem Prüfmittel zusammen und beobachtet eine etwa auftretende Farbreaktion entweder visuell oder mit Hilfe eines Gerätes. Die Probe besteht üblicherweise aus rohem Urin, kann jedoch unter bestimmten Umständen verdünnter oder auf andere Weise behandelter Urin sein.

Die Erfindung liefert ein Prüfmittel das geeignet ist zum Nachweis von Harnbilirubin mit einer Empfindlichkeit von 0,1 mg/100 ml in weniger als 1 Minute. Das Prüfmittel behält seine Empfindlichkeit bis zu drei Monaten bei 4O⁰C in trockener Form bei. Es hat sich durch analytische Verfahren gezeigt, daß die Zersetzung der Diazoniumverbindung in dem trockenen Prüfmittel nach der Erfindung wesentlich geringer ist, als in r> bekannten Prüfmittein.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

20

Herstellung und Anwendung von Prüfmitteln zum
Nachweis von Bilirubin und Nachweis der Wirkung der Verstärkungsmittel auf die Reaktion zwischen einer

Diazoniumverbindung und Harnbilirubin 2>

Eine Standard-Diazoniumsalzlösung wurde hergestellt durch Zusammengeben der folgenden Bestandteile:

2,4-Dichloranilin	1,125 g
1,5-Naphthalin-disulfonsäure-	9g
natriumsalz
Sulfosalicylsäure	105 g
Natriumnitrit	1,5 g
Copolymer aus Methylvinyläther	150 ml
und Maleinsäureanhydrid
(10% wäßrige Lösung)
Methanol	750 ml
Destilliertes Wasser	600 ml

10 50-ml-Anteile der Standard-Diazoniumsalzlösung wurden in getrennte Bechergläser gegeben. Zu 9 der Bechergläser wurden dann getrennt die verschiedenen in Tabelle Il angegebenen Ureidoverbindungen zugegeben, wobei deren Suifonsäureaddukte entstanden. Getrennte Abschnitte Filterpapier wurden jeweils mit einer der 10 Lösungen gesättigt und getrocknet. Die jeweiligen mit dem Reagens imprägnierten Papierstücke, die eine leicht gelbliche Farbe besaßen, wurden in etwa quadratische Kissen von 5 mm geschnitten, die an Kunststoffstreifen mit einem Doppelklebeband befestigt wurden. Je 3 Kissen der entstehenden 10 Reihen von Reagensstreifen wurden getrennt augenblicklich in 3 Urinproben getaucht, enthaltend 0,0, 0,4 und 1,6 mg Harnbilirubin pro 100 ml. Die Intensität der Farbänderung in den Kissen wurde mit Hilfe willkürlicher Einheiten notiert, wobei 0 keine Farbänderung andeutete. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Ureidoverbindung

Zu 50 ml	Beobachtete
Standard	Farbreaktion
lösung
zugesetzte
Menge (g)
—	purpur
(Jl	purpur
4	purpur
(Jl	blau
1	blau
5	blau
(Jl	purpur
(Jl	purpur
(Jl	blau
1	blau

Intensität der Farbänd. .ung bei der
entsprechenden Biiirubinkonzentration (mg/100 ml)

0,0

0,4

1,6

Coffein

5-Bromuracil

7,8-Βεηζο-1,4-diazaspiro-[4,5]-decan-2,4-dion

l,3-Dimethyl-6,7-diphenyllumazin

1-Methylhydantoin

Parabansäure

Uridin

Harnstoff

3-Isobutyl-1-methylxanthin

0
0
0
0
0
0
0
0
2
0

5
10
10
10
12

8
10
13

9
11

>30
28

>30

>30
30

>30

Beispiel 2

Herstellung und Anwendung von Prüfmitteln zum Nachweis der Wirkung der erfindungsgemäßen Verstärkungsmittel auf die Reaktion zwischen einer Diazoniumverbindung und Harnbilirubin

p-Nitroanilin	0,75 g
1,5-Naphthalindisulfonsäure-	6g
natriumsalz
Sulfosalicylsäure	70 g
Natriumnitrit	1,0 g
Copolymer wie in Beispiel 1)	200 ml
(5% wäßrige Lösung)
Methanol	500 ml
Destilliertes Wasser	300 ml

4 50-ml-Anteile der Standard-Diazoniumsalzlösung wurden in getrennte Bechergläser gegeben. Zu 3 der Bechergläser wurden 5 g der in Tabelle 11 angegebenen verschiedenen Ureidoverbindungen gegeben, wodurch deren Suifonsäureaddukte entstanden. Getrennte Abschnitte Filterpapier wurden jeweils mit einer der vier Lösungen gesättigt und getrocknet Die jeweiligen mit Reagens imprägnierten Papierabschnitte besaßen eine gelbliche Farbe und wurden in etwa quadratische Stücke von 5 mm geschnitten, die mit Doppelklebeband an Kunststoffstreifen befestigt wurden. Jeweils 5 der entstehenden 4 Gruppen von Streifen wurden getrennt augenblicklich in 5 Urinproben, enthaltend 0,0, 0,2, 0,4, 0,8 und 1,6 mg Harnbilirubin auf 100 ml eingetaucht Die

b5 Intensität der Farbänderung auf den Kissen wurde, wie in Beispiel 1, beobachtet Die Farbe der Kissen nach der Reaktion war purpur. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle !I

Ureidoverbindung

Intensität der Farbänderung bei der entsprechenden Bilirubinkonzentration (mg/100 ml)

0,0 0,2 0,4 0,8 1,6

Keine
Coffein
Parabansäure
Uridin

0 10 10 10

5 15 15 15

Beispiel 3

Nachweis der Wichtigkeit, eine organische Säure oder ein Salz davon zu verwenden, das Suifonsäuregruppen enthält, zur Herstellung des Adduktes mii Verstärkungswirkung auf die Reaktion zwischen einer Diazoniumverbindung und Harnbilirubin

2,4-Dichloranilin
Oxalsäure
Natriumnitrit
Methanol
Destilliertes Wasser

0,5 g 35 g

0,5 g 250 ml 250 ml

4 50-ml-Anteile der Standard-Diazoniumsalzlösung wurden in getrennte Bechergläser gegeben. Zu 3 der Bechergläser wurden jeweils 5 g der verschiedenen in Tabelle III angegebenen Ureidoverbindungen gegeben, wobei die Oxalsäureaddukte dieser Verbindungen ent-

standen. Getrennte Abschnitte Filterpapier wurden jeweils mit einer der vier Lösungen gesättigt und getrocknet. Die entstehenden mit Reagens imprägnierten Papierabschnitte, die eine gelbliche Farbe besaßen, wurden in etwa quadratische Stücke von 5 mm geschnitten und mit Doppelklebeband an Kunststoffstreifen befestigt. Jeweils 3 der 4 verschiedenen Reagensstreifen wurden getrennt augenblicklich in 3 Urinproben, enthaltend 0,0, 0,4 und 1,6 mg Bilirubin pro 100 ml, getaucht. Die Intensität der Farbänderung wurde, wie in Beispiel 1, bewertet. Die entstehende Farbe der Kissen war purpur. Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben.

Tabelle III

Ureidoverbindung

Intensität der Farbänderung bei der jeweiligen Bilirubinkonzentration
(mg/100 ml)

0,0 0,4 1,6

Keines 0 8 28

Coffein 0 8 28

7,8-Benzo-l,3-diazaspiro- 0 8 28

[4,5]-decan-2,4-dion

Parabansäure 0 8 28

Aus diesen Werten kann man sehen, daß die Addukte von Ureidoverbindung und Oxalsäure keine verstärkende Wirkung auf die Reaktion zwischen der Diazoniumverbindung und Harnbilirubin besitzen, während in den Beispielen 1 und 2 gezeigt werden konnte, daß die Addukte von Ureidoverbindung und Sulfonsäuren bei der Testreaktion als Verstärkungsmittel wirken.

Claims

Patentansprüche:

1. Prüfmittel zum Nachweis von Bilirubin in einer Urinprobe, bestehend aus einer Trägermatrix, enthaltend eine Diazo üumverbindung, die mit Harnbilirubin unter Auftritt einer Farbänderung reagiert, einen Bestandteil, der imstande ist, in der Urinprobe einen sauren pH-Wert zu erzeugen und e^;n Verstärkungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß das Verstärkungsmittel ein Addukt aus Harnstoff oder einem Harnstoffderivat und einer organischen Sulfonsäure oder einem Salz davon ist.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat ein acyclisches niederes Alkylderivat von Harnstoff ist.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat eine cyclische Ureidoverbindung oder ein Derivat davon ist.

4. Mittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclische Ureidoverbindung oder deren Derivat eine dioxoheterocyclische Ringstruktur der Formel