DE2644501A1

DE2644501A1 - Pruefmittel zur bestimmung von bilirubin in urin

Info

Publication number: DE2644501A1
Application number: DE19762644501
Authority: DE
Inventors: Charles T W Lam
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1975-10-02
Filing date: 1976-10-01
Publication date: 1977-04-07
Also published as: GB1530207A; AU1754276A; AU501591B2; DE2644501C3; FR2326706B1; US4038031A; DE2644501B2; JPS5243493A; JPS5751904B2; IN143345B; CA1068585A; FR2326706A1; IT1066300B

Description

betreffend
Prüfmittel zur Bestimmung von Bilirubin in Urin

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Prüfmittel, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis von Bilirubin in Urin. Das Mittel umfaßt eine Diazoniumverbindung, die mit Urin-Bilirubin unter Farbänderung reagiert,und einen einen sauren pH-Wert einstellenden Bestandteil sowie ein neues Verstärkungsmittel für die Testreaktion. Das Verstärkungsmittel ist ein Addukt aus einer' Ureidoverbindung und einer organischen Sulfonsäure oder einem Salz davon. Besonders geeignet als Ureidobestandteil des Adduktes sind Harnstoff und substituierte und unsubstituierte cyclische Ureidoverbindungen, besonders solche der Xanthangruppe. Die Prüfvorrichtung umfaßt einen Träger, wie eine absorbierende Matrix, in den das Prüfmittel eingebaut ist. Das Testverfahren wird durchgeführt, indem man eine Urinprobe mit dem Prüfmittel zusammenbringt und eine auftretende Farbreaktion beobachtet.

Der diagnostische Wert der BilirubinbeStimmung in Urin ist bekannt. Urin von einer gesunden Person enthält keine nennenswerte Menge Bilirubin (weniger als 0,05 mg/100 ml). Verschiedene Krankheitszustände, wie Gallenstauung und hämolytische und hepatische Erkrankungen, führen jedoch dazu, daß Bilirubin im Urin in einer abnorm hohen Konzentration auftritt. Es ist allgemein anerkannt, daß das Vorhandensein von

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Bilirubin im Urin in einer Konzentration über 0,05 mg/100 ml ein Anzeichen ist für einen abnormen klinischen Zustand* der die Durchführung umfangreicherer diagnostischer Verfahren erforderlich macht, um die spezifische verursachende Erkrankung festzustellen.

Es ist allgemein anerkannt, daß im wesentlichen das gesamte Bilirubin, das in pathologischem Urin vorkommt, in konjugierter Form vorliegt. Bilirubin ist ein Abbauprodukt der Hämgruppe von Hämoglobin und wird, wenn es erst im Blutstrom .entstanden ist, von der Leber aufgenommen, wo es durch Veresterung mit Glucuronsäure konjugiert wird. Die entstehenden Bilirubinglucuronide sind außerordentlich gut wasserlöslich im Gegensatz zu freiem Bilirubin, das in Wasser sehr wenig löslich ist. Die konjugierten Bilirubine können dadurch frei von der Leber in die Nieren gehen, wo,unter normalen Umständen, im wesentlichen das gesamte konjugierte Bilirubin in Urobilinogen umgewandelt und als Bestandteil des Urins ausgeschieden wird. Bei verschiedenen pathologischen Zuständen wird konjugiertes Bilirubin selbst im Urin ausgeschieden.

Bilirubin wird üblicherweise bei Routine-Urinuntersuchungen nachgewiesen, aufgrund seiner Reaktion mit verschiedenen Diazoniumverbindungen in saurem Medium unter Bildung eines gefärbten Azobilirubinkomplexes. Während in der Literatur verschiedene Testverfahren angegeben sind, ist das im klinischen Labor im allgemeinen bevorzugte Mittel ein Teststreifen. Die Diazoniumverbindung ist in einem Träger absorbiert, der eine vorbestimmte Menge Urin absorbieren kann, wenn er augenblicklich in eine Urinprobe getaucht wird. Eine etwaige Farbreaktion kann in weniger als einer Minute abgelesen v/erden. Die Herstellung und Anwendung von BiIirubinteststreifen ist im einzelnen in der US-PS 3 585 001 beschrieben. Während die bekannten Teststreifen ein schnelles und bequemes Verfahren zur Bestimmung von Urinbilirubin ermöglichen, ist es allgemein bekannt, daß die zur Verfügung stehenden Teststreifen nicht ausreichend empfindlich sind, um Bilirubingehalte nachzuweisen, die nur leicht gegenüber

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dem normalen Gehalt erhöht sind, d.h. zwischen 0,05 und 0,8 mg ' Bilirubin pro 100 ml.

Es werden einige Versuche berichtet, die Empfindlichkeit der Reaktion zwischen Diazoniumverbindungen und Harnbilirubin zu erhöhen. Die bekannten Testsysteme besitzen jedoch bestimmte Nachteile.

In der US-PS 3 880 588 ist eine Gruppe von Diazoniumverbindungen beschrieben, die die Farbreaktion des Azobilirubinkomplexes erhöhen und die störenden Farbreaktionen mit Urobilinogen, das dem Bilirubin strukturell und chemisch nahe verwandt ist, verringern sollen. Die angegebenen Diazoniumverbindungen bilden jedoch im Gegensatz zu den üblichen Verbindungen störende gefärbte Produkte mit Bestandteilen von Urin, wie Homogentisinsäure (2,5-Dihydroxyphenylessigsäure) und 5-Hydroxyindol-3-essigsäure. Die zuletzt genannte Verbindung ist ein normaler Bestandteil von Urin und so geringe Mengen wie 1 mg/100 ml dieses Bestandteils in Urin führen zu falschen positiven Ergebnissen, wenn die in der genannten Druckschrift erwähnten Diazoniumverbindungen angewandt v/erden.

Ein weiterer Versuch, die Empfindlichkeit der in Teststreifen eingebauten Diazoniumreagentien zu verbessern, ist in der US-PS 3 853 476 beschrieben, die die Anwendung bestimmter Phosphorsäurediester als Mittel zur Verbesserung der.Empfindlichkeit und Verstärkungsmittel für die Reaktion zwischen der Diazoniumverbindung und Bilirubin offenbart. Aufgrund der Unverträglichkeit dieser Phosphorsäurediester· mit einem wäßrigen Medium, müssen jedoch Teststreifen entsprechend dieser Druckschrift durch ein Doppelimprägnier-■verfahren hergestellt werden.

Es ist zu bemerken, daß verschiedene so genannte "Beschleunigungsmittel" beschrieben worden sind im Zusammenhang mit dem Nachweis von Bilirubin in Serum mit Hilfe einer Diazokupplungsreaktion. Derartige Mittel umfassen Coffein,

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Dyphyllin, Natriumacetat, Natriumbenzoat, Gummiarabikum und verschiedene andere chemisch nicht verwandte Verbindungen. Die Anwendung derartiger Beschleunigungsmittel bei BiIirubinuntersuchungen in Serum wurde bereits um 1920 in der Literatur beschrieben, aber niemals auf Bilirubinuntersuchungen im Harn angewandt. Das liegt an der allgemein bekannten Tatsache, daß solche Beschleunigungsmittel auf eine Form von Bilirubin wirken, die im Urin nicht in nennenswerten Mengen vorhanden ist.. Derartige Beschleunigungsmittel sollen die Diazokupplung von freiem Bilirubin beschleunigen. Es wird über keine Wirkung auf die Kupplung von konjugiertem Bilirubin berichtet, da bei Bilirubinuntersuchungen in Serum die konjugierten Formen von Bilirubin verhältnismäßig schnell mit den Diazoniumverbindungen reagieren, ohne daß Beschleuniger erforderlich sind. Daher werden die konjugierten Formen von Bilirubin in Serum als direkt reagierendes Bilirubin bezeichnet, während freies Bilirubin, das das Vorhandensein von Beschleunigern erforderlich macht, um zu einer schnellen Reaktion zu führen, als indirekt bindendes Bilirubin bezeichnet wird. Die Tatsache, daß die Wissenschaft die Wirkung der angegebenen Beschleunigungsmittel auf die Diazokupplungsreaktion von freiem Bilirubin beschränkt sieht und diese Beschleunigungsmittel für auf die Reaktion mit konjugiertem Bilirubin nicht anwendbar hält, wird gestützt durch die ersten zusammenfassenden Veröffentlichungen auf diesem Gebiet (z.B. Henry, R.J., Clinical Chemistry, Principles and Technics, Harper und Row (1964), Seite 577-583; With. T.K., Bile Pigments, Academic Press (1968), Seite 324-327; und Journal of American Medical· Technologists, Band 31 (1969), Seite 707-710).

Ein einziger Forscher hat über die Anwendung von Dyphylin zur Bestimmung von Bilirubin in Urin berichtet (Scandanavian Journal of Clinical Laboratory Investigation, Supplement 56 (1961)}, In diesem Falle war die Anwendung jedoch speziell dafür vorgesehen, um die gleiche Wirkung zu erreichen, wie sie in der Literatur in Beziehung auf Bilirubinuntersuchungen in Serum angegeben ist, nämlich die

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Diazokupplung von freiem Bilirubin zu beschleunigen, das, wie bekannt ist, in dem untersuchten Urin nur in sehr geringen Mengen vorhanden sein kann,, Das dort beschriebene Verfahren umfaßt ein mühsames flüssiges Testsystem und es findet sich kein Hinweis auf die Anwendung einfacher Teststreifen. Das dort beschriebene Verfahren hat auch in der Fachwelt wenig Beachtung gefunden zur Entwicklung empfindlicherer Bilirubinteststreifen, wie daraus hervorgeht, daß man zu den in den oben erwähnten US-PS 3 853 476 und 3 880 588 angegebenen, mit Nachteilen behafteten Testsystemen Zuflucht genommen hat.

Es hat sich nun gezeigt, daß Addukte von Ureidoverbindungen mit organischen Sulfonsäuren oder deren Salzen eine Verstärkungswirkung auf die Testreaktion zwischen einer Diazoniumverbindung und Harnbilirubin in saurer Umgebung besitzen. Der Ureidobestandteil des Adduktes kann Harnstoff, ein acyclisches niederes Alkylderivat von Harnstoff oder eine cyclische Ureidoverbindung oder ein Derivat davon sein. Eine cyclische Ureidoverbindung oder ein Derivat davon ist bevorzugt und besonders eine solche, die zur Gruppe der Xanthine gehört.

Das erfindungsgemäße Prüfmittel umfaßt daher eine Diazoniumverbindung j, die mit Harnbilirubin unter Auftritt einer Farbänderung reagiert, einen Bestandteil der imstande ist, in der Urinprobe einen sauren pH-Wert einzustellen und das Verstärkungsmittel. Das Prüfmittel kann in trockener oder flüssiger Form vorliegen und ist vorzugsweise in einen Träger^ wie eine absorbierende Matrix in Form eines Teststreif ens£,eingebaut» Das Prüfverfahren kann durchgeführt werden ₉ indem man eine zu untersuchende Urinprobe mit den Be= standteilen des Prüfmittels einzeln oder in Kombination zusammenbringt j, ZcBc mit dem bevorzugten Teststreifen und eine etwa auftretende Farbreaktion beobachtete

Das Vorhandensein des erfindungsgemäßen Adduktes ₉ das im folgenden teilweise als Verstärkungsmittel bezeichnet wirdj führt zur Bildung von intensiver gefärbten A

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komplexen, wodurch die Empfindlichkeit der Testreaktion wesent lich erhöht wird. Außerdem hat es sich gezeigt, daß das Verstärkungsmittel eine bathochrome Wirkung auf die Testreaktion besitzt, indem die in seiner Gegenwart entstehenden Azobilirubinkomplexe im allgemeinen veränderte Absorptionsspektren be sitzen, wodurch Farben auftreten, die leichter von denen durch erwartete Störreaktionen verursachten Farben zu unterscheiden sind. Ferner hat es sich gezeigt, daß das Verstärkungsmittel auch als Stabilisator für die Diazoniumverbindung wirkt, besonders, wenn das Prüfmittel in trockenem Zustand in einen Träger eingebaut ist.

Diese Vorteile bei der Durchführung des Testverfahrens werden ergänzt durch Vorteile bei der Herstellung des Prüfmittels bzw. der Prüfvorrichtung. Bei der Herstellung des bevorzugten Teststreifens wird das Prüfmittel üblicherweise entweder durch Sättigung des Trägers mit einer Lösung des Prüfmittels und anschließendes Trocknen oder durch Herstellung des Trägers in Gegenwart einer Lösung des Prüfmittels und anschließendes Härten in den Träger eingebaut. Bisher waren,um einen Teststreifen nach dem ersten Verfahren herzustellen, verschiedene Sättigungs- und Trocknungsstufen erforderlich. Wie im einzelnen in der US-PS 3 585 004 angegeben, mußte, um eine ausreichende Menge eines sauren Bestandteils in den Träger nach bekannten Verfahren einzubauen ₉ eine speziell gebaute eine Säure freisetzende Verbindung angewandt werden. Da eine derartige Verbindung bei Berührung mit einem wäßrigen Medium eine Mineralsäure freisetzt® _Ώ konnte sie nicht zu der ursprünglichen Blazoniumsalzlösung zugesetzt werden, mit der der Träger Imprägniert wurde« Die verschiedenen Sättigungsverfahren oei der Herstellung sind nicht; nötig₉ wenn das erfindmigsgemäße Yerstärkungsmittel zu der ursprünglichen DiazoniiMsalzlösTang zugegeben wird., da weniger Säure erforderlich Istp V^b empfindliche TScStergebnisse zu erhalten,und die erforderliche Menge an Säur© kann mit Hilfe einer festen Säure zur ¥©rfügnEsg gestallt werden^ wl@ einer organischen Säur@_o

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Die vorliegende Erfindung betrifft daher verbesserte Prüfmittel· orrichtungen und Verfahren zum Nachweis von Bilirubin in einer Urinprobe und ist gekennzeichnet durch eine erhöhte Empfindlichkeit der Diazokupplungsreaktion, erhöhte Stabilität der trockenen Formen des Prüf mittels, verringerte Störung durch zusätzliche Bestandteile des Urins und Vereinfachung des Herstellungsverfahrens der bevorzugten Teststreifen.

Verschiedene Ureidoverbindungen haben sich als zur Herstellung des erfindungsgemäßen Verstärkungsmittels geeignet erwiesen. Im Zusammenhang dieser Beschreibung umfassen Ureidoverbindungen solche Verbindungen, die die Gruppe

N —

enthalten, die im folgenden als Ureidogruppe bezeichnet wird. Ureidoverbindungen umfassen als Gruppe Harnstoff und verschiedene Harnstoffderivate. Cyclische Ureidoverbindungen, die durch einen heterocyclischen Ring charakterisiert sind, der eine Ureidogruppe enthält, sind besonders geeignet. Beispiele für derartige cyclische Ureidoverbindungen sind Cytosin, das ein aminosubstituiertes 2-0xopyrimidin ist, und 2-Imidazolidonsowie andere 5- und 6-gliedrige oxoheterocyclische Verbindungen. Besonders geeignete cyclische Ureidoverbindungen sind solche mit einer dioxoheterocyclischen Ringstruktur der Formel

oder einer tautomeren Form davon, wobei R eine verbindende Gruppe ist, die zur Bildung eines 5- oder 6-gliedrigen Ringes beiträgt,und wobei der heterocyclische Ring Substituenten enthalten kann, die die gewünschte Verstärkungswirkung nicht wesentlich verschlechtern. Andere Substituenten als Wasserstoffatome können an den Stickstoffatomen in dem heterocyclischen Ring vorhanden sein und sind üblicherweise substituierte oder unsubstituierte niedere Alkylgruppen,

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d.h. solche mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen. Eine große Vielzahl von Substituenten kann an die Verbindungsgruppe R gebunden sein, da angenommen wird, daß die Verstärkungswirkung in erster Linie auf das Vorhandensein der Ureidogruppe ■ zurückzuführen ist. Derartige Substituenten sind üblicherweise Wasserstoff- oder Halogenatome, Alkylgruppen, substituierte oder nicht substituierte kondensierte isocyclische oder heterocyclische aliphatische oder aromatische Ringsysteme. Beispiele für geeignete Verbindungen der Formel I sind die substituierten und nicht substituierten 3,5-Dioxo-1,2,4-triazole, wie Urazol, die substituierten und nicht substituierten 2,4,5-Trioxoimidazole, wie Parabansäure und die substituierten und nicht substituierten 2,5-Dioxoimidazole, wie 1-Methylhydantoin und 7,8-Benzo-1,3-diazaspiro/4",£7-decan-2,3-dion.

Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind 2,6-Dioxopyrimidine und Derivate davon, wie Uridin. Von den 2,6-Dioxopyrimidinen sind besonders bevorzugt solche Verbindungen der Formel

1 2 oder einer tautomeren Form davon, wobei R und R jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten, und R^ und R (1.) jeweils Wasserstoff- oder Halogenatome oder eine niedere Alkylgruppe oder (2.) zusammen mit der Äthylengruppe in dem heterocyclischen Ringsystem ein substituiertes oder unsubstituiertes isocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem bilden, das die gewünschten Verstärkungseigenschaften nicht wesentlich verschlechtert. Verbindungen der Formel II umfassen 5-Bromuracil, 1,3-Dimethyl-6,7-diphenyllumazin und Xanthin und Derivate davon.

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Von den cyclischen Ureidoverbindungen sind die am meisten bevorzugten Xanthin und dessen Derivate der FQrmel

(III)

1 2 oder einer tautomeren Form davon, wobei R und R jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten und R^ ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe oder eine hydroxysubstituierte niedere Alkylgruppe ist. Diese Verbindungen sind bevorzugt aufgrund ihrer besonders deutlichen zusätzlichen Stabilisierungswirkung auf die Diazoniumverbindung. Diese Verbindungen umfassen Coffein, Dyphyllin und 3-Isobutyl-i-methylxanthin.

Andere Ureidoverbindungen können ebenfalls geeignet sein, solange die gewünschte Verstärkungswirkung durch die Addukte hervorgerufen wird, die sie mit organischen Sulfonsäuren oder deren Salzen bilden. Neben Harnstoff selbst

/acyclischen

haben sich die/niederen Alkylderivate von Harnstoff als geeignet erwiesen als Bestandteil der Verstärkungsmittel. Ein Beispiel für acyclische niedere Alkylderivate von Harnstoff ist Tetramethy!harnstoff,. Der Fachmann erkennt, daß verschiedene andere Ureidoverbindungen ,als die speziell in der Beschreibung angegebenen ,geeignet sind als Bestandteil der Verstärkungsmittel im Rahmen der Erfindung.

Der andere Bestandteil des Adduktes neben dem Ureidobestandteil in dem Verstärkungsmittel kann irgendeine Verbindung umfassen , die eine oder mehrere Sulfonsäuregruppen enthält oder ein Salz davon oder Formen, die mit der jeweiligen Ureideverbindung unter Bildung eines wasserlöslichen Adduktes mit der gewünschten Verstärkungsexgenschaft reagieren» Derartige Verbindungen besitzen die allgemeine Formel

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R¹-

1 2

in der R ein organischer Rest ist und R ein Wasserstoffatom, wobei eine Sulfonsäuregruppe entsteht^ oder ein salzbildender Bestandteil üblicherweise ein anorganisches Kation, wie ein Alkali"; z.B. Natrium-oder Kaliumion usw. Die aromatischen Sulfonsäuren und deren Salze sind bevorzugt, da sie zusätzlich dazu beitragen, die Diazoniumkomponente sowohl in trockener Form, wenn sie mit dem Verstärkungsmittel zusammen ist, als auch in Lösung, wie sie während des Herstellungsverfahrens auftritt, zu stabilisieren. Aromatische Sulfonsäuren und ihre Salze sind bekannte Stabilisatoren für Diazoniumsalzlösungen. Besonders geeignete aromatische Sulfonsäuren und Salze davon sind Sulfosalicylsäure, die Naphthalindisulfonsäuren, wie 1,5-Naphthalindisulfonsäure, und die Biphenyldisulfonsäuren, wie 4,4'-Biphenyldisulfonsäure und deren Salze.

Die in dem Prüfmittel enthaltene Diazoniumverbindung kann irgendeine der bekannten Diazoniumverbindungen sein, üblicherweise in Form von Salzen, die mit Harnbilirubin unter Bildung eines gefärbten Komplexex kuppeln, wodurch eine Farbänderung auftritt. Allgemein sind die am meisten bevorzugten Diazoniumverbindungen, die Aryldiazoniumverbindungen, die die diazotierten Formen von 2,4-Dichloranilin, p-Nitroanilin, p-Chloranilin, 2,5-Dichloranilin, 4-Chlor-o-anisidin, 3,3'-Dirne thoxybenzidin und 2-Methoxy-5-nitroanilin umfassen. Andere Verbindungen,von denen angegeben ist, daß sie imstande sind mit Harnbilirubin zu kuppeln, können ebenfalls angewandt werdenc

Das Prüfmittel kann auch einen zusätzlichen Stabilisator für die Diazoniumverbindung enthalten. Ein derartiger Stabilisator dient dasu_s störende Diazokupplungsreaktionen zu hemmen, indem er den anionischen Teil der Diazoniumverbindung blockiert (occupying), wie in der US-PS 3 814 586 näher angegeben ist. Ferner dient ein derartiger Stabilisator mit dazuj, die Diazoniumverbindung

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während der Herstellung des Prüfmittels und der Prüfvorrich tung und während der Testreaktion in gelöstem Zustand zu halten. Der Stabilisator kann aus einer großen Gruppe von Verbindungen ausgewählt werden, wie Fluoroboraten, Übergangsmetallhalogenverbindungen, wie Zink- und Kobaltchloriden, und aromatischen und aliphatischen Sulfonsäuren und Salzen, einschließlich der oben als bevorzugte Bestandteile der Verstärkungsmittel erwähnten.

Der den sauren pH-Wert einstellende Bestandteil des Prüfmittels kann aus einer Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen bestehen, die imstande sind, einen sauren pH-Wert in der zu untersuchenden Urinprobe einzustellen. Es ist bekannt, daß eine saure Umgebung bei der Testreaktion die Störung durch Ascorbinsäure verringert, den gefärbten Azobilirubinkomplex stabilisiert und den molaren Extinktionskoeffizienten des Komplexes erhöht und dadurch die cholorimetrische Reaktion verstärkt. Eine bevorzugte stark saure Umgebung wird erreicht, wenn der den pH-Wert einstellende Bestandteil einen pH-Wert von weniger als 3 ergibt bei einer Konzentration von 0,1 n.Während ein den sauren pH-Wert einstellender Bestandteil in Form einer festen Säure, wie einer organischen Säure, bevorzugt ist, besitzt eine derartige Säure vorzugsweise einen pK_a-Wert von weniger als ungefähr 4. Beispiele für geeignete organische Säuren sind Citronensäure, Sulfosalicylsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Cyclohexansulfaminsäure und Maleinsäure. Wenn der saure Bestandteil eine Sulfonsäuregruppe enthält, wie im Falle von Sulfosalicylsäure, kann diese Verbindung auch gleichzeitig als Bestandteil des Verstärkungsmittels und/oder als Stabilisator für die Diazoniumverbindung dienen. So würde, wenn das Prüf mittel hergestellt würde aus einer Lösung der Diazoniumverbindung des den sauren pH-Wert einstellenden Bestandteils und des Verstärkungsmittels,ein ausreichend großer Überschuß an einer organischen SuIfonsäure oder einem Salz davon als Quelle für das Material, das als pH-Wert einstellender Bestandteil wirkt, als Diezoniumstabilisator und als Bestandteil des Verstärkungsmittels dienen

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In dem Prüfmittel können gegebenenfalls noch zusätzliche Substanzen enthalten sein. Oberflächenaktive Mittel können enthalten sein, um die Benetzbarkeit des Prüfmittels mit der Urinprobe zu erhöhen. Das Prüfmittel kann in Form einer wäßrigen Lösung oder in trockener Form, z.B. als Pulver oder Tablette vorliegen. Wenn es in Tablettenform vorliegt, enthält das Prüfmittel vorzugsweise ein schäumendes Paar, um den Zerfall der Tablette bei Berührung mit der Probe zu erleich- · tern. Inerte Füllstoffe, die die Herstellung der Tablette erleichtern, können ebenfalls in dem Prüfmittel vorhanden sein. Löslichmachende Mittel können in dem Prüfmittel in flüssiger Form oder wenn es in einen Träger eingebaut ist vorhanden sein. Derartige löslichmachende Mittel verhindern die Ausfällung der wirksamen Bestandteile des Prüfmittels während der Herstellung der rufvorrichtung und während der Testreaktion. Ein Beispiel für ein löslichmachendes Mittel ist die unter dem Namen Gantrez (General Aniline and Film Corporation, New York) in den Handel gebrachte Verbindung. Diese Verbindung ist ein äquimolares Copolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid und besitzt in Lösung eine löslichmachende (solubilisierende) Wirkung, besonders in Beziehung auf das Verstärkungsmittel.

Der Anteil der Bestandteile in dem Prüfmittel kann in weiten Grenzen variieren, je nach der angewandten Form und dem angewandten Testverfahren. Die folgende Tabelle gibt die möglichen und bevorzugten Mengenverhältnisse der Bestandteile des Prüfmittels in trockener Form an, wie es in einer Prüfvorrichtung vorliegt, ausgedrückt als Gewichtsprozent.

Diazoniumverbindung saurer Bestandteil Ve rs ta rkung smi 11 e1 Stabilisierungsmittel löslichmachendes Mittel

zulässiger	bevorzugter
Bereich	Bereich
0,05-10	0,2-2
1-80	20-50
5-80	30-60
0-50	1-15
0-30	2-10

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Die bevorzugte Form des Prüfmittels ist eine Prüfvorrichtung. Der Einbau des Prüfmittels in einen Träger ergibt eine bequeme Vorrichtung, besonders in Form eines Teststreifens, um die Probe mit dem Prüfmittel zusammenzubringen und das Ergebnis abzulesen. Der Träger liegt üblicherweise in Form einer Matrix vor, die imstande ist, ein vorher bestimmtes Volumen der Urinprobe aufzunehmen zu festzuhalten. Eine derartige Matrix kann aus saugfähigem Papier, einer porösen polymeren Membran, einem in Wasser quellbaren Gel, einem Absorptionsmittel, einem inerten gewebten oder nicht gewebten Stoff usw. bestehen. Das Prüfmittel kann in den Träger eingebaut werden durch Imprägnieren oder durch chemische oder physikalische Bindung oder aufgrund der Herstellung des Trägers in Gegenwart einer Lösung des Prüfmittels. Der Träger ist üblicherweise an einem Halter oder Griff befestigt oder auf andere Weise mit ihm verbunden, wie einem inerten Kunststoffstreifen j, wobei eine Prüfvorrichtung entsteht, die ein bequemes Mittel darstellt zur Handhabung des Trägers bei der Analyse einer Urinprobe.

Das Prüfverfahren besteht in der allgemeinsten Form darin, daß man die Testprobe mit dem Prüfmittel,vorzugsweise unter Anwendung der Prüfvorrichtung zusammenbringt und eine etwa auftretende Farbreaktion entweder visuell oder mit Hilfe eines Gerätes beobachtete Die Probe besteht üblicherweise aus rohem Urin_p kann jedoch unter bestimmten Umständen verdünnter oder auf andere Weise behandelter Urin seinο

Die Erfindung ρ wie sie hier beschrieben istj, liefert ein Prüfmittel^ eine Vorrichtung und ein Verfahren„ die geeignet sind zum Nachweis von Hambilirubin mit einer Empfindlichkeit von 0,1 mg/100 ml in weniger als 1 Minute» Das Prüfmittel behält seine Empfindlichkeit bis zu drei Monaten bei 4O⁰C in trockener Form bei» Es hat sich durch analytische Verfahren gezeigt, daß die Zersetzung der Diazoniumverbindung in dem trockenen Prüfmittel nach der Erfindung wesentlich geringer ist, als in Prüfmitteln,

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die das Verstärkungsmittel nicht enthalten. Die Anwendung des Verstärkungsmittels erlaubt die Verwendung üblicher Diazoniumverbindungen, die weniger der Störung ι fremde Bestandteile' des Urins unterliegen, ohne daß die Empfindlichkeit leidet. Ferner wird es durch die Anwendung des Verstärkungsmittels möglich, die erfindungsgemäße Prüfvorrichtung auf bequemere Weise herzustellen, als es bei bekannten Prüfvorrichtungen, die Phosphorsäurediester als Mittel zur Erhöhung der Empfindlichkeit enthalten, möglich ist.

Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Tüpfelanalyse zum Nachweis der Wirkung der erfindungsgemäßen Verstärkungsmittel auf die Reaktion zwischen einer Diazoniumverbindung und Harnbilirubin.

In 14 Vertiefungen in einer Tüpfelplatte wurden drei Tropfen einer wäßrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung gegebens

2,4-Dichloranilin	0,075 g	g
1,5-Naphthalindisulfonsäure-	0,6
natriumsalz
SuIfosalicylsäure	7 g	g
Natriumnitrit	0,1	ml
destilliertes Wasser	100

In 13 der -Vertiefungen i'jurden dann getrennt Harnstoff und die verschiedenen in Tabelle I angegebenen Harnstoffderivate gegeben, wobei deren Sulfonsäureaddukte entstanden. Die entstehenden Testlösungen besaßen eine gelbliche Farbe und bildeten bei Zugabe τοη Hambilirubin purpurne Farbtöne, Ein Tropfen einer Urinprobe _s enthaltend eine pathologische Menge an Harnbilirubin wurde in jede der 14 Vertiefungen gegeben und die Intensität der Farbänderung in jeder Vertiefung mit Hilfe willkürlicher Einheiten bewertet, wobei 0 keine Farbänderung anzeigte. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben;

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	Ureid verbindung	2644501	I	Intensität der
43			Farbänderung
Tabelle	keine:	VJl
Harnstoff	20
Tetramethylharnstoff	10
Urazol	20
2-Imidazolidon	25
Coffein	10
Dyphyllin	8
Uridin	8
1 ,3-Dimethyl-6,7-diphenyllumazin	8
5-Bromuracil	8
7,8-Benzo-1,3-diazaspiro/5,5_7-
decan-2,4-dion	8
Parabansäure	8
1-Methylhydantoin	6
Uracil	6
Beispiel 2

Herstellung und Anwendung von erfindungsgemäßen Prüfvorrichtungen und Nachweis der Wirkung der erfindungsgemäßen Verstärkungsmittel auf die Reaktion zwischen einer Diazoniumverbindung und Harnbilirubin.

Eine Standard-Diazoniumsalzlösung wurde hergestellt durch Zusammengehen der folgenden Bestandteile:

2,4-Dichloranilin 1,125 g

1,5-Naphthalin-disulfonsäure-natriumsalz 9 g

Sulfosalicylsäure 105 g Natriumnitrit 1,5 g

Gantrez* (10 % wäßrige Lösung) 150 ml

Methanol . 750 ml

destilliertes ¥asser 600 ml

../16 7098U/0815

*o

* äquimolares Copolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid der General Aniline and Film Corporation, New York

10 50-ml-Anteile der Standard-Diazoniumsalzlösung wurden in getrennte Bechergläser gegeben. Zu 9 der Bechergläser wurden dann getrennt die verschiedenen in Tabelle II angegebenen Ureidoverbindungen zugegeben, wobei deren Sulfonsäureaddukte entstanden. Getrennte Abschnitte von S&S 470 Papier (Schleicher und Schuell, Inc., Keene, New Hampshire) wurden jeweils mit einer der 10 Lösungen gesättigt und getrocknet. Die jeweiligen mit dem Reagens imprägnierten Papierstücke, die eine leicht gelbliche Farbe besaßen, wurden in etwa quadratische Kissen von 5 mm geschnitten, die an Kunststoffstreifen mit einem Doppelklebeband befestigt wurden. Je

/Kissen

3/der entstehenden 10 Reihen von Reagensstreifen wurden getrennt augenblicklich in 3 Urinproben getaucht, enthaltend 0,0, 0,4 und 1,6 mg Harnbilirubin pro 100 ml. Die Intensität der Farbänderung in den Kissen wurde mit Hilfe willkürlicher Einheiten notiert, wobei 0 keine Farbänderung andeutete. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

../Tabelle II

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- 17 -

Ureidoverbindung

keine; Coffein 5«=Bromuracil

7,8-Benzo-1,4-diazaspiro=
iF t^7-decan-2,4-dion

1,3-Dimethyl-6,7-diphenyllumazin 1-Methylhydantoin Parabansäure Uridin Harnstoff

3»Isobutyl-=1 <=me thylxanthin

	Tabelle II	Intensität der Farbänderung bei der entsprechenden Bilirubin- konzentration (mg/100 ml) 0,0 0,4 1,6	5	25
zu 50 ml Standard lösung zugesetzte Menge (g)	beobachtete Farbreaktion	0	10	30
	purpur	0	10	30
5	purpur	0	10	30
4	purpur	0	12	>30
Ui	blau	0	8	28
1	blau	0	10	>30
Ui	blau	0	13	>30
VJl	purpur	0	9	30
VJl	purpur	2
5	blau

blau

>30

../18

Beispiel 3

Herstellung und Anwendung von Prüfmitteln zum Nachweis der Wirkung der erfindungsgemäßen Verstärkungsmittel auf die Reaktion zwischen einer Diazoniumverbindung und Harnbilirubin,

Eine Standard-Diazoniumsalzlösung wurde hergestellt durch Zusammengeben der folgenden Bestandteile:

p-Nitroanilin 0,75 g

1,5-Naphthalindisulfonsäure-natriumsalz 6 g

Sulfosalicylsäure 70 g

Natriumnitrit 1,0 g

Gantrez*(5 % wäßrige Lösung) 200 ml

Methanol 500 ml

destilliertes Wasser 300 ml

*äquimolares Copolymer aus Methylvinyläther
und Maleinsäureanhydrid der General Aniline
and Film Corporation, New York

4 50-ml-Anteile der Standard-Diazoniumsalzlösung wurden in getrennte Bechergläser gegeben. Zu 3 der Bechergläser wurden 5 g der in Tabelle III angegebenen verschiedenen Ureüoverbindungen gegeben, wodurch deren Sulfonsäureaddukte entstanden. Getrennte Abschnitte von S&S 470 Filterpapier (Schleicher und Schuell, Inc., Keene, New Hampshire) wurden jeweils mit einer der vier Lösungen gesättigt und getrocknet. Die jeweiligen mit Reagens imprägnierten Papierabschnitte besaßen eine gelbliche Farbe und wurden in etwa quadratische Stücke von 5 mm geschnitten, die mit Doppelklebeband an Kunststoffstreifen befestigt wurden. Jeweils 5 der entstehenden 4 Gruppen von Streifen wurden getrennt augenblicklich in 5 Urinproben, enthaltend 0,0_s 0,2» 0,4, 0,8 und 1,6 mg Harnbilirubin auf 100 ml eingetaucht. Die Intensität der Farbänderung auf den Kissen wurde ₉ wie in Beispiel 2,■beobachtet. Die Farbe der Kissen nach der Reaktion war purpur. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

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O	O	O	5	10
O	2	10	15	20
O	2	10	15	20
O	2	10	15	20

Tabelle III

UreidoverMndung Intensität der Farbänderung

———————— bei der entsprechenden

Bilirubinkonzentration

(mg/100 ml)

0,0 0,2 0,4 0,8 1,6

keine. Coffein Parabansäure Uridin

Beispiel 4

Nachweis der Wichtigkeit,eine organische Säure oder ein Salz davon zu verwenden, das Sulfonsäuregruppen enthält, zur Herstellung des Adduktes mit Verstärkungswirkung auf die Reaktion zwischen einer Diazoniumverbindung und Harnbilirubin.

2,4-Dichloranilin 0,5 g

Oxalsäure 35 g

Natriumnitrit " 0,5 g

Methanol 250 ml

destilliertes Wasser 250 ml

4 50-ml-Anteile der Standard-Diazoniumsalzlösung wurden in getrennte Bechergläser gegeben. Zu 3 der Bechergläser wurden jeweils 5 g der verschiedenen in Tabelle IV angegebenen Ureidoverbindungen gegeben, wobei die Oxalsäureaddukte dieser Verbindungen entstanden. Getrennte Abschnitte ovon S&S 470 Papier (Schleicher und Schuell, Inc., Keene, New Hampshire) wurden jeweils mit einer der vier Lösungen gesättigt und getrocknet. Die entstehenden mit Reagens imprägnierten Papierabschnitte, die eine gelbliche Farbe besaßen, wurden in etwa quadratische Stücke von 5 mm geschnitten und mit Doppelklebeband an Kunststoffstreifen be-

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festigt. Jeweils 3 der 4 verschiedenen Reagensstreifen wurden getrennt augenblicklich in 3 Urinproben, enthaltend 0,0, 0,4 und 1,6 mg Bilirubin pro 100 ml, getaucht. Die Intensität der Farbänderung wurde, wie in Beispiel 2, bewertet. Die entstehende Farbe der Kissen war purpur. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Ureido verbindung

keines Coffein 7,8-Benzo-1,3-diazaspiro- [k ,£7-decan-2,4-dion Parabansäure

Intensität der Farbänderung bei der jeweiligen Bilirubinkonzentration (mg/100 ml) 0,0 0Λ 1.6

8	28
8	28
8	28
8	28

Aus diesen Werten kann man sehen, daß die Addukte von Ureidoverbindung und Oxalsäure keine verstärkende Wirkung auf die Reaktion zwischen der Diazoniumverbindung und Harnbilirubin besitzen, während in den Beispielen 2 und 3 gezeigt werden konnte, daß die Addukte von Ureidoverbindung und Sulfonsäuren bei der Testreaktion als Verstärkungsmittel wirken.

../Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

1. Prüfmittel zum Nachweis von Bilirubin in einer Urinprobe, bestehend aus einer Diazoniumverbindung, die mit Harnbilirubin unter Bildung einer Farbänderung reagiert,und einem Bestandteil, der imstande ist, in der Urinprobe einen sauren pH-Wert zu erzeugen, gegebenenfalls in einem Träger, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich ein Verstärkungsmittel in Form eines Adduktes aus Harnstoff oder einem Harnstoffderivat und einer organischen Sulfonsäure oder einem Salz davon enthält.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoff derivat ein acyclisches niederes Alkylderivat von Harnstoff ist.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Harnstoffderivat eine cyclische Ureidoverbindung oder ein Derivat davon ist.

4. Mittel nach Anspruch 1 bis 3_S dadurch gekennzeichnet , daß die cyclische Ureidoverbindung oder'deren Derivat eine dioxoheterocyclische Ringstruktur der Formel

oder eine tautomere Form davon besitzt;, wobei R eine ¥©r·= bindende Gruppe darstellt, die zur Bildung eines 5= oder 6-gliedrig@n Ringes beiträgtj der noch zusätzliche Substi· tuenten

709814/011 i

5. Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekenn

zeichnet, daß das Harnstoffderivat 2,6-Dioxopyrimidin oder ein Derivat davon ist.

Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekenn

zeichnet

daß das Harnstoffderivat die Formel

1 2

oder eine tautomere Form davon besitzt, wobei R und R jeweils ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe und R-^ und R jeweils ein Wasserstoffatom oder Halogenatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten oder R^ und R zusammen mit der Äthylengruppe in dem heterocyclischen Ring ein isocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem bilden.

7. Mittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß die organische Sulfonsäure oder deren Salz eine aromatischeSuIfonsäure oder ein Salz davon sind.

8. Mittel nach Anspruch 1 bis 7₉ dadurch g e k e η η -= zeic-Jhnetj daß das Harnstoff derivat die Formel

1 2 r ©In© taatoasr® Form davon besitzt, wobei R und R ö®~

s ©lsi Wasserstoffatoia odor ©in© nieder® Alkylgruppe und Er sin üSiSs©Fst©ffat©®n ©in® nledep® Alkylgruppe oder eine

SI 4/08

BAD

hydroxysubstituierte niedere Alkylgruppe bedeuten.

9. Mittel nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat Coffein, Dyphyllin, Uridin, Urazol, 2-Imidazolidon und/oder Parabansäure ist.

10. Mittel nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß das Harnstoffderivat Coffein ist.

11. Mittel nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß die organische Sulfonsäure oder das Salz davon Sulfosalicylsäure oder ein Salz davon

12. Mittel nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Diazoniumverbindung ein Aryldiazoniumsalz ist.

13. Mittel nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Diazoniumverbindung 2,4-Dichlorbenzoldiazoniumsalz ist.

14. Mittel nach Anspruch 1 bis 13» dadurch g e kennzeichnet, daß die aromatische Sulfonsäure Sulfosalicylsäure, Naphthalendisulfonsäure und/oder Biphenyldisulfonsäure ist.

15. Mittel nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet , daß der Bestandteil, der einen sauren pH-Wert in der Probe einstellt, eine organische Säure ist.

16. Mittel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß die organische Säure einen pKa-Wert von weniger als ungefähr 4 besitzt.

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17. Mittel nach. Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in einen Träger eingebaut ist und in Form einer Prüfvorrichtung vorliegt.

18. Anwendung des Mittels nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Urinprobe mit dem Prüfmittel zusammenbringt und die Farbreaktion visuell oder instrumenteil mißt.

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