DE2364844A1

DE2364844A1 - Mittel zur bestimmung von bilirubin und urobilinogen

Info

Publication number: DE2364844A1
Application number: DE2364844A
Authority: DE
Inventors: Jun Joseph Wilfred Fraser; Charles T W Lam; Raymond L Mast
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1973-01-02
Filing date: 1973-12-28
Publication date: 1974-07-18
Also published as: US3814586A; CA1025337A; GB1450540A; JPS4999091A

Description

"Mittel zur Bestimmimg γοη bilirubin und ürobilinogeii"

Die Erfindung betrifft eine neue Anwendung von 4-,V-Biphenyldiazcäiiiumsalzen in Testreageiit-ieri. und Mittel, die zifflia gemeinsamem aber uatfrscfeeideBiaeaai Sacltareis %zw* Be von Bilirubin, und Urobilinogen in wäßriger Lösung oder Körperflüssigkeiten, wie Urin, fähig ist.

Heben dem ^,V-Biphenyldiazoriiumsalz umfaßt das CCeStreagens vorzugsweise einen sauren Bestandteil, der bei B&rührung mit der zu untersuchenden wäßrigen Flüssigkeit einen sauren pH-Vert einstellt. Das Prüfmittel umfaßt einen sa'agfähigen Präger_T wie Papiei?, in oder auf dem das Testreagens in trockener Form enthalten ist. Das Verfahren sum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Bilirubin und urobilinogen besteht darin, daß man die zu untersuchende wäßrige Flüssigkeit mit dem lesbreagens zusammenbringt und visuell oder spektrophotometrisch die Färb-

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ORIGINAL INSPECTED

reaktion beobachtet.

Bilirubin ist ein Abbauprodukt der Hämgruppe des Hämoglobinmoleküls. Im Plasma ist Bilirubin üblicherweise unkonjugiert und an verschiedene Proteine gebunden. Die Konjugation tritt in der Lsber ein und möglicherweise an anderen Stellen und das konjugierte Bilirubin wird in das Duodenum (Zwölffingerdarm) als Bestandteil der Galle ausgeschieden. Die Wirkung von Bakterien, die üblicherweise in dem Intestinaltrakt vorhanden sind, führt zu einer Bedukbion des Bilirubins zu anderen Verbindungen, von denen eine_/ürobilinogen_/sich üblicherweise- im Urin findet, !formaler Urin enthält keine nennenswerte Menge (üblicherweise weniger als 0,05 mg/100 cm^) von konjugierten! oder unkonjiigierfejji Bilirubin.

Der diagnostische Wert von Bilirubin-und UrobilinogenbeStimmungen in Körperflüssigkeiten ist bekannt. Verschiedene Krankheitszustände führen zu abnormalen Mengen von beiden Verbindungen im Urin. Solche Krankheitszustände umfassen hämolytische und hepatische bzw., Lebererkrankungen,Gallen.verGchluß und andere JOnkt ions störungen des Leber- und Galletrakts.'." Es ist jedoch nicht möglich, einen häinoly tischen Zustand, einen hepatischen Zustand und einen Gallenverschluß durch Durchführung eines Tests auf nur eine dieser beiden Verbindungen im Urin zu 'diagnostizieren. Isolierte Bestimmungen sind kein Einweis auf Spezielle Krankheitszustände, Z.B. zeigt eine negative Bilirubinbestimmung, d.h. von weniger als 0_v05 Big/ 100 cia^ entweder einen normalen oder einen hä molytiseheii Zustand an. Andererseits zeigen abnorm hohe Urobilinogengehalte im Urin entweder einen hämolytischen oder hepatischen Zustand an, während abnorm niedrige Mengen für einen Gallen-

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Verschluß sprechen.

Die Durchführung sowohl einer Bilirubinals auch einer Urobilinogenbestimmung führt zu sehr viel spezifischeren Ergebnissen aufgrund des Zusammenhangs zwischen der Menge der beiden Verbindungen im Urin und bestimmten Krankheitszuständen. In normalem Urin kann der Bilirubingehalt als negativ (weniger als 0,05. mg/100 cmO angesehen werden. Bei einem hämolytisehen Zustand wird mehr Bilirubin gebildet als üblich wegen des erhöhten Abbaues der Hämgruppe. Das führt zu einer Zunahme der Bilirubinreduktionsprodukte einschließlich Urobilinogen. Daher werden bei hämolytisehen Zuständen die Urobilinogengehalte im Urin abnorm hoch, während Bilirubin negativ bleibt. Der Gehalt an Bilirubin im Blutstrom nimmt bei hepatischen Zuständen und Gallenverschluß zu, da die Fähigkeit der Leber abnimmt, Galle in den Intestinaltrakt auszuscheiden. So nimmt die von den Hieren als Urinbestandteil ausgeschiedene Menge an Bilirubin zu, was zu positiven Bilirubinbestimmungen im Urin führt. Es hat sich gezeigt, ■daß die Urobilinogenmengen im Urin bei hepatischen Zuständen zunehmen, aber bei Gallenstauung abnehmen«, Aufgrund einer Klassifizierung der Bilirubingehalte im Urin als positiv oder negativ wie oben definiert und der Urobilinogengehalte als niedrig, normal oder hoch, ergeben sich für die Diagnose die folgenden Kombinationen von BiIirubin-und Urobilinogengehalten: negativ-normal, normal; negativ-hoch, hämolytische Erkrankung; positiv-hoch, hepatische Erkrankung und positiv-niedrig, Gallenverschluß bzw.

-Stauung.

Bekannte

Bilirubinbestiiamungen beruhen auf der Reaktion von Bilirubin mit diazotierten Aniliritestreagentien Diese Verbindungen mit einem einzigen Benzolring sind im allgemeinen substituiert durch Chloratome, Nitro-, SuIfon- und/oder Methoxygruppen.

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Die besonders häufig angewandten Testreagenfcien sind diazotiertes 2,4-Dichloranilin und diazotierte SuIfanilsäure. Die Reaktion der Bilirubimnoleküle mit der Diazogruppe des Testreagenses führt zu.einer Konjugation, die das Absorptionsspektrum des Azokomplexes in den sichtbaren. Bereich verschiebt,. Diese kolorimetrisch^ Eeaktion ermöglicht ■ ■ eine' quantitative , Bestimmung in wäßrigen Lösungen aufgrund des Beer'sehen Gesetzes der Lichtabsorption. Der molare Extinktionskoeffizient von 2_S4—Dichloranilin liegt so, daß Bestimmungen von Bilirubin unter Anwendung dieses bevorzugten Testreagenges, das zur Herstellung, eines trockenen Prüfmittels in Papier imprägniert ist, auf eine minimale Konzentration von ungefähr 1 mg/100 cmr empfindlich sind. Daher kann der Bereich von Bilirubingehalten in Urin zwischen dem normalen Gehalt von ungefähr 0,05 mg/100 cm^ bis zu diesem minimalen nachweisbaren Gehalt nicht mit den üblichen Testreagez$ ien in trockenen Prüfmitteln bestimmt werden.

Die bekannten Verfahren zum Nachweis von Urobilinogen wenden Benzaldehydreagent ien an. Das bei weitem am häufigsten angewandte Benzaldehyd-Sestreagens ist p~Dimethylaminobenzaldehyd, das häufig als Ehrlich-Eeagens bezeichnet wird«, Die Eeaktion von Urobilinogen mit Ehrlich- Reagens ergibt einen konjugierten Komplex der im sichtbaren Spektrum absoribert* Die bei dieser Eeaktion auftretende kolorimetrisch^ Reaktion wird interpretiert auf der Grundlage einer Maßeinheit₉ die als Ehrlich-Einheit bekannt ist. und nicht aufgrund des Gehalts an Urobilinogen in mg/100 cm . Das beruht auf der !Tatsache, daß Ehrlich-Reagens bekanntlich mit verschiedenen störenden Substanzen, die manchmal im Urin vorhanden sind_? reagiert₉

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wie p-Aminosalicylsäure, Porphobilinogen und Indol.

Eine Ehrlich-Einheit ist definiert als die kolorimetrisch^ Reaktion, die auftritt bei Reaktion von Ehrlich-Reagens mit 1 mg/100 cnr Urobilinogen. In bestimmten Fällen wird die Eignung derartiger Bestimmungen zur .Diagnose jeäach geschmälert durch die mangelnde Spezifität des Nachweises von urobilinogen,besonders bei Urinbestimmungen.

Die Anwendung von Diazonium sal ζ en zum !color !metrischen ^ Nachweis von Urobilinogen wird nicht berichtet. Urobilinogen bestimmungen beruhen daher zur Zeit fast ausschließlich auf der Anwendung des nicht spezifischen Ehrlich-ReagenseSu

Aufgrund dieser Beschränkungen nach dem Stand der Technik müssen Bilirubin-und Urobilinogenbestimmungen immer getrennt durchgeführt werden. Außerdem sind bekannte Verfahren, bei denen mit Reagentien imprägniertes Papier zum Nachweis von Bilirubin angewandt wird, nur zum Nachweis von Bilirubin in Konzentrationen von mehr als 1 iag/100 geeignet.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testmittel zu entwickeln, mit Hilfe dessen der Nachweis von Bilirubin und Urobilinogen möglich ist. Ein solches Mittel müßte unterschiedliche Parbreaktionen für die beiden Verbindungen zeigen. Mit Hilfe eines solchen Mittels wäre eine unterscheidende Diagnose möglich zwischen normalen hämolytischen und hepatischen Zuständen und Gallenverschluß mit Hilfe eines einzigen Tests. Das Testmittel soll bezüglich des Nachweises von Urobilinogen stärker spezifisch sein und dadurch die bei der Anwendung von Ehrlich-Reagens auftretende Ungenauigkeit eliminieren. Erfindungsgemäß soll ein Diagnostiziermittel

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hergestellt v/erden unter Anwendung eines empfindlichen und spezifischen Testreagenses zur Bestimmung von sowohl Bilirubin als auch Urobilinogen. Ein solches Prüfmittel soll einfach anzuwenden sein und schnelle zuverlässige Ergebnisse liefern, die leicht interpretiert werden können. Ein solches Prüfmittel v/ürde verbreitete Anwendung finden in Labors und klinischen Untersuchungen sowie bei Ärzten«, Das Diagnostiziermittel zum Nachweis von Bilirubin soll empfindlicher sein als die bekannten Prüfmittel, die mit üblichen Testreagentien imprägniert sind. Ein solches Testmittel würde den Nachweis erhöhter BiIirubingehalte zu einem früheren Krankheitszeitpunkt ermöglichen. Außerdem soll mit diesem Prüfmittel die Bestimmung von sowohl Bilirubin als auch Urobilinogen möglich sein.

Ein Testreagens, Prüfmittel und Verfahren zur Bestimmung dieser Verbindungen, das die oben angegebenen Bedingungen erfüllt, würde einen Leberfunktionstest ermöglichen zur Amirendung 1. zur Verfolgung des Fortschritts von Patienten mit infektiöser und Serumhepatitds' durch Reihenversuche, 2. Überwachung von Alkoholikern auf die Entwicklung, das Fortschreiten, und die Besserung von Leberzirrhose,

3. Untersuchung von Patienten, von denen vermutet xidrd, daß sie einen Anfall von hämolytischer Erkrankung haben,

4. Untersuchung von Patienten, von denen angenommen wird, daß sie einen Gallenverschluß haben, 5· Überwachung von . Arbeitern, die Lebertoxinen ausgesetzt sind und 6. Unterscheidungsdia.gnose von Gelbsuchtszustanden.

Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, daß Testreagentien, Testverfahren und Diagnostiziermittel,die geeignet sind zum Nachweis von sowohl Bilirubin als auch Urobilinogen in einer wäßrigen Lösung erhalten werden können

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aufgrund der Reaktion dieser beiden Verbindungen mit einem 4-, 4-'-Biphenyl diazonium salz. Die Erfindung bezieht sich daher auf ein neues Anwendungsgebiet von ^V-i diazoniumsalzen und Testreagentien bzw. Prüfmittel, enthaltend 4,4'~Biphenyldiazoniumsalz. Ein 4,4-Biphenyldiazoniuittsalz ist hier definiert als eine Verbindung der For mel:

CR')

Ν—Ν

in der E¹ und E",die gleich oder verschieden sein können, Anionen bedeuten, und die Benzolringe-weitere Substituenten. enthalten können. Die durch die Reaktion der 4-,4-'-Biphen;yldiazoniumsalze mit Bilirubin und ürobilinogen entstehenden Komplexe zeigen unterschiedliche Reaktionen und führen damit sowohl zu qualitativen als auch zu quantitativen Ergebnissen» Im Zusammenhang dieser Beschreibung bedeutet der Ausdruck Bestimmung sowohl den,qualitativen Nachweis als auch eine halbquantitative oder quantitative Bestimmung, -soweit es nicht anders angegeben ist. Die vorzugsweise angewandten 4-,4'~Biphenyldiazoniumsalze besitzen die lOrmel:

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ι_Λ-

N=N

+ 2

(R²)"

Ί 2
in der E und-H- Anionen bedeuten und

10 bis E¹ jeweils

ein Wasserstoff- oder Chloratom oder eine OH-,-, OCH₇-

D 3

oder SO,H-G-iuppe bedeuten. Die am meisten bevorzugten 4,4'«Biphenyldiazoniuinsalze sind'die Salze von 4,4'-DiazobipJienyl, 4₅4'-Diazo~3}3'-dimethoxybiphenyl und 4,4'-Diazo-5,3' -dimethylbiplienyl.

Die Testreagentien umfassen vorzugsweise einen sauren Bestandteil, der imstande ist, wenner mit der zu untersuchenden wäßrigen Lösung_< zusammenkommt, einen sauren pH~V.^rert einzustellen. Der saure Bestandteil wird vorzugsweise aus solchen Verbindungen ausgewählt, die einen pH-Wert von unter 3,0 ergeben, wenn sie in einer Konzentration von 0,1n vorliegen. Eine saure Umgebung ist bevorzugt aufgrund der Tatsache, daß unter sauren Bedingungen die Azoreaktionskomplexe stabiler sind und höhere molare Ibctinktionskoeffizient en besitzen, was zu einer stärkeren kolorimetrischen Eeaktion führt. Es ist auch bevorzugt, daß die Diazoniumsalze in den Testreagentien an ihren Diazokupplungssteilen stabilisiert sind

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durch, ein das Diazoniumsalz stabilisierendes Anion. Das Testreagens kann in JOrm eines trockenen Feststoffs, wie eines Pulvers oder einer Tablette, die ein schäumendes Paar enthält, vorliegen oder in ein trockenes Prüfmittel eingebaut sein usw.

Das er.findungsgeciäß bevorzugte Prüfmittel umfaßt einen

ι ' . ... oder auf,

saugfaingen Trager, wie Papier, m'dem das oben beschriebene Testreagens enthalten ist. Starke »Säuren zerstören häufig die üblicherweise angewandten saugfähigen Trägermaterialien. Aus diesem Grunde ist es bevorzugt, wenn das Testreagens einen stark sau.ren Bestandteil enthalten soll, wie es bevorzugt ist, ein festes Addukt aus einem Friedel-Crafts-SaIz und einer organischen Lewis-Base mit einer anderen Säure, wie einer organischen Säure, zuzusetzen. Ein derartiges Gemisch ermöglicht es, den saugfähigen Träger stabil zu halten, während ein stark saurer Bestandteil angewandt wird.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung von Bilirubin und TJrobilinogen in wäßrigen Lösungen. Dieses Verfahren besteht im wesentlichen darin, daß man das oben angegebene Testreagens"in irgend einer möglichen Form mit der zu untersuchenden wäßrigen Lösung zusammenbringt und die auftretende Reaktion beobachtet. Es ist bevorzugt, daß man die Reaktion eine vorher bestimmte Zeit lang ablaufen läßt, bevor man das Ergebnis beobachtet. Halbquantitative Bestimmungen können durchgeführt werden durch einen visuellen Vergleich der entstehenden kolorimetrischen Reaktion mit einer Standardfarbkarte. Quantitative Bestimmungen können durchgeführt werden durch Beobachtung der entstehenden Reaktion mit Hilfe spektro-

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photometrischer Verfahren.

Die beiliegende Zeichnung ist eine graphische Darstellung der Absorptionsspektren, die erhalten werden, wenn man trockene Prüfmittel, umfassend Papier, das imprägniert ist, mit einem bevorzugten 4,4-'—Biphenyldiazoniuinsalz, einem Salz von 4,4-'-Diazo-3,3'-dimethoxybiphenylj zusammenbringt mit wäßrigen Lösungen von Bilirubin, Urobilinogen und einem Gemisch von Bilirubin und Urobilinogen.

Die schnelle und zuverlässige Bestimmung von Bilirubin und Urobilinogen in wäßrigen Flüssigkeiten ist besonders geeignet zur klinischen Diagnose. Ein Mittel, zum Nachweis, das leicht interpretierbare Ergebnisse liefert, ermöglicht es Hichtfachleuten, das Verfahren durchzuführen. Tests, bei denen Farbänderungen -auftreten, haben sich für derartige Ergebnisse als besonders geeignet erwiesen. Farbänderungen oder kolorimetrisch^ Reaktionen hängen ab von der chemischen Reaktion zwischen einem Testreagens und der zu bestimmenden Substanz, die zur Bildung eines chromophoren Reaktionskoinplexes .führt. Die Liclrfcabsoipticmseigenschaften dieses Komplexes bestimmen die Eignung des Testreagenses als Indikator für die spezielle nachzweisende Substanz. Die Elektronenstruktur des Komplexes ergibt das Absorptionsspektrum des Komplexes und bestimmt damit die Empfindlichkeit und leichte Ablesbarkeit eines Tests mit Hilfe eines speziellen Testreagenses. Die Suche nach besseren Testreagentien muß als in erster Linie empirische Aufgabe angesehen werden, da das Absorptionsspektrum des Reaktionskomplexes, der bei Anwendung eines speziellen Testreagenses entsteht, in den meisten Fällen nicht voraussagbar ist.

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Es wird angenommen, daß die Kupplungsreaktion, die zwischen dem Bilirubinmolekül und dem erfindungsgemäß angewandten Diazoniumsalz auftritt, die Methylenbindung in der konjugierten Pyrrol struktur des Bilirubins umfaßt. Die Diazokupplungsreaktion an der Methylenbindung in dem Bilirubinmolekül führt zu einer Aufspaltung des Moleküls in zwei iCeile, die zwei Azo-Bilirubin-Komplexe bilden.

Das TJrobilinogenmolekül ist ein Reduktionsprodukt des Bilirubins und besitzt eine konjugierte Pyrrolstruktur, die ähnlich ist derjenigen in dem Bilirubinmolekül. Ein Unterschied findet sich jedoch in der Art der Verknüpfung .*■ zwischen den Pyrr ο !ringen. Drei dieser Brülcken finden sich in beiden Molekülen. Bei Bilirubin besteht die mittlere Brücke aus einer Methylengruppe und die beiden anderen Brücken sind Methingruppen, während bei Urobilinogen alle drei Gruppen Methyleilgruppen sind. Der Mechanismus der Reaktion zwischen Urobilinogen und^J den erfindungsgemäß angewandten Diazoniumsalzen ist nicht vollständig klar. Es hat sich jedoch geneigt, daß 4-,4'-Bipheny!diazoniumsalze mit Urobilinogenmolekülen reagieren, wobei ein Reaktionskomplex: entsteht, der unerwarteterweise eine ausreichende kolorimetrlsche Reaktion zur qualitativen und quantitativen Bestimmung ergibt.

Die ^-,V-Biphenyldiazoniumsalze, die vorzugsweise erfindungsgemäß angewandt werden, sind solche, die in . trockener Form verhältnismäßig stabil sind. Diese Stabilität kann durch die Anwendung von Diazoniumsalze stabilisierenden Anionen erhöht werden, wie später noch näher diskutiert wird. Das Testreagens, das die oben erwähnten Diazoniumsalze

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enthält, kann in Formen, wie trockenen Feststoffen, wie Pulvern oder Tabletten mit einem schäumenden Paar und Peststoffen in einem trockenen Prüfmittel vorliegen.

Diazoniumsalze der 4,4'-Biphenylgruppe können angegeben werden durch die folgende Strukturformel:

+ 2 (R²)

in der R und E Anionen oder Anionenteile des Diazoniumsalzes und
sind.

iO
bis R Substituenten an den Benzolringen

Um die Diazoloipplungsreaktion zwischen dem Diazonium·- salz und Bilirubin oder Ux-obilinogen zu ermöglichen, müssen die hier angegebenen 4,4'-Biphenyldiazcniuiasalze in wäßrigen lösungen unter Bildung von Diazoniumionen dissoziieren. Daher beeinflußt die Auswahl eines speziellen Anions für das Diazoniumsalz den Nachweis von Bilirubin oder Urobilinogen solange nicht, solange das Diazoniumsalz in wäßriger Lösung dissoziiert. Aufgrund der inhärenten Neigung von 4,4'-Biphenyldiazoniumsalzen in Wasser zu dissoziieren, hängt die Auswahl eines speziellen Aniöns üblicherweise hauptsächlich von Bequemlichkeits- und Wirtschaftlichkeitsgesichtspunkten ab. Während der Anionenanteil im allgemeinen irgend ein Anion umfassen kann, ist es bevorzugt, daß die Anionenanteile-die Stabilität des

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Diazoniumsalzes in trockener Form erhöhen. Solche Anionenanteile, die diese Funktion erfüllen, sind hier bezeichnet als Diazoniumsalζ stabilisierende Anionen. Derartige Diazoniumsalz stabilisierende Anionen umfassen Halogenionen, Bortstrahalogenionen, wie-BF^, Halogenmetallanionen, wie Übergangsmetallhalogenide, wie ZnCl_-, und C Cl^ und SuIf onatanionen, wie-SO₇H. Von diesen Diazoniumsalz stabilisierenden Anionen sind die Arylsulfonatanionen, die gekennzeichnet sind durch zwei odermehr SuIfonatgruppen, besonders geeignet. Derartige Arylsulfonatanionen Lunfassen die Naphthylendisulfonate, wie die- deprotonisierte Form von Waphthylendisulfonsäure und die Biphenyldisulfonate, wie die deprotonisierte Form von 4,4-'~Biphenyldisulf onsäure. Der Anionenteil von Arylsulfonatsalzen kann ebenfalls angewandt werden. Die Rolle der Diazoniumsalz stabilisierenden Anionen. besteht darin, die Lagerfähigkeit und leichte Handhabung des Testreagenses zu verbessern«, Sie dienen dazu, mindestens eine der reaktionsfähigen Diazokupplungsstellen der zweiwertigen Diazoniumionen zu besetzen und dadurch einen Abbau durch Eebenreaktionen an der besetzten Stelle oder Stellen zu vermeiden. Eine solche chemische Bindung zwischen den reaktionsfähigen Diazokupplungsstellen des Diazoniumsalzes und einem Diazoniumsalz stabilisierenden Anion kann erreicht werden durch irgend ein bekanntes Verfahren, z.B. durch Durchführung der Diazotierungsreaktion in Gegenwart einer Säure oder eines Salzes, die bzw. das das Diazoniumsalz stabilisierende Anion umfaßt. Das stabilisierte Diazoniumsalz kann dann getrocknet oder, wie später beschrieben, in ein Diagnostiziermittel eingebaut werden.

Substötuenten ah den Benzolringen der oben angegebenen 4,4'-Biphenyldiazoniumsalze beeinflussen die Stabilität und

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Löslichkeit des Diazoniumsalzes sowie die Stabilität und das Absorptionsspektrum des Reaktionskomplexes. Solche Substituenten können unter all den Resten ausgewählt werden, von denen bekannt ist, daß sie chemisch an Benzolringe gebunden werden und die die Diazokupplungsreaktion zwischen dem Diazoniumion und Bilirubin oder ürobilinogen nicht vollständig unterbinden. Beispiele für solche Reste umfassen die folgenden chemischen Gruppen: Wasserstoff- oder Ealogenatome, niedere Alkylgruppen, d.h. mit, 1 bis 5, Kohlenstoffatomen, niedere Alkoxygruppen, doh. mi.t Λ bis 5 Kohlenstoffatomen, Hydroxygruppen, Carboxygruppen, Aminogruppen usw. Derartige Substituenten können sich symmetrisch oder asymmetrisch an den Benzolringen befinden« Es ist zu bemerken, daß die Anwendung der angegegeben'en Diazoniumsalze zur Bestimmung von Bilirubin und Ürobilinogen abhängt von der Diazokupplungsreaktion, die eintritt an den Diazogruppen des Diazoniumions und daß der Fachmann Substituenten auswählen kann im Hinblick auf die gewünschte Stabilität und Löslichkeit des Diazoniumsalzes und die Stabilität und das Absorptionsspektrum des Reaktionskomplexes. Auf der Grundlage der Stabilität und Wirtschaftlichkeit ist es bevorzugt, daß die Subs tifcuenten an der Biphenylstruktur ausgewählt werden^ unter-H, -ΟΗ,,-ΟΟΗ^, SO-JI und'Ol. Im allgemeinen tritt die Diazokupprungsreaktion zwischen dem Diazoniumsalz und Bilirubin oder ürobilinogen ein, unabhängig von irgend einer Substitution an der Ringstruktur. Eine derartige Substitution kann jedoch zu weniger günstigen Löslichkeitseigenschaften des Diazoniumsalzes und einem weniger günstigen Absorptionsspektrum des Reaktionskomplexes führen. Das Diazoniumsalz sollte ausreichend in Wasser löslich sein,'um zu dissoziieren und dabei das Diazoniumion zu bilden., das in wäßriger Lösung

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mit Bilirubin und Urobilinogen reagiert.

Es ist auch günstig, ein Diazoniumsalz anzuwenden, das im wesentlichen farblos ist, damit die kolorimetrische Reaktion des Azoreaktionskomplexes möglichst stark ist. Natürlich können auch Hintergrundfarbstoffe angewandt werden, um die-kolorimetrische Reaktion zu verstärken. Auf der zusätzlichen Basis der Löslichkeit und Absorptionscharakteristika des Reaktionskomplexes sind Verbindungen, die sich als besonders bevorziigt ^rerwiesen haben, 4,4'-Diazobipbenyl, 4,4'-Dia zo-3,5'-dimethoxybiphenyl ujid '4,4^r-Diazo-3,5'-dimethylbiphenyl. Es hat sich gezeigt, daß die am besten geeigneten Verbindungen die Salze von 4,4' Diazo-$,3'-dimethoxybiphenyl sind. Im allgemeinen sind diese Verbindungen löslich und zeigen deutlich unterschiedliche Farbreaktionen bei der Reaktion mit Bilirubin nnd Urobilinogen, wie in der Zeichnung angegeben ist. Die kolorimetrische Reaktion, die von solchen Verbindungen ■in wäßrigen Lösungen in Gegenwart von Bilirubin auftritt, ist grün, während sie in Gegenwart von Urobilinogen rot ist. Ein so deutlicher Unterschied zwischen den bei der Reaktion mit Bilirubin und Urobilinogen entwickelten Farben ergibt eine ausreichend unterschiedliche kolorimetrische Reaktion, um zu einen außerordentlich geeigneten Hittel zum Nachweis von sowohl Bilirubin als auch Urobilinogen in wäßrigen Lösungen zu führen.

Es hat sich aufgrund der chemischen Vorgänge gezeigt, daß die kolorimetrische Reaktion des Azo-Bilirubin-Reaktions komplexes sehr spezifisch ist für Bilirubin. Keine der bisher störenden Substanzen, die in wäßrigen Lösungen, wie Urin, vorhanden sein können, können mit den angegebenen Diazoniumsalzen unter Bildung eines Reaktionskomplexes rea-

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gieren, der ausreichend konjugiert ist, um zu einer kolorimetrisehen fieaktipn zu führen, die nahe bei derjenigen liegt, die von dem Azo-Bilirübin-Komplex ausgeht. Es hat sich auch gezeigt, daß die Wirkung "bisher störender Substanzen, wie' Pör.phobilinogen, Indol und Ascorbinsäure bezüglich der tJrobilinogenbestimiaungen weitgehend herabgesetzt werden kann. Die kolorimeter.sehe Reaktion des Aiäo-TJrobilinogen-KOiäplexGö· kann möglicherweise gestört werden durch Ascorbinsäure. Andere Substanzen, die bei üblichen Urobilinogenbestimimmgen unter Anwendung von Ehrlich-Roagens stören, stören Jedoch bei dein erfindungsgemäßen System nicht» Ferner kann die durch die Anwesenheit von Ascorbinsäui~-e auftretende Störung weitgehend eliminiert werden dtircli Einstellung des pH-Wertes durch Zugabo eines ausreichend stark sauren Bestandteils. Das erfindungsgeraäße Verfahren zur Bestimmung von "Bilirubin und Urobilinogen ist daher . durch die möglicherweise ungenauen Ergebnisse, wie sie sich bei den üblichen Verfahren unter Anwendung von Benzaldehyde!! ergeben, nicht begrenzt.

Das Testreagens enthält vorzugsweise einen sauren Bestandteil. Saurer Bestandteil bedeutet eine Verbindung oder ein Gemisch von Verbindungen, das imstande ist, wenn es mit der zu untersuchenden wäßrigen Lösung zusammenkommt, einen sauren pH-Wert einzustellen. Eine saure Umgebung eliminiert nicht nur die durch die Anwesenheit von Ascorbinsäure auftretenden Störungen, sondern dient auch zur Stabilisierung des Azoreaktionskomplexes und erhöht den molaren Extinktionskoeffizienten des Komplexes, so daß eine stärkere kolorimetrische Reaktion erreicht wird« Eine bevorzugte,; stark saure Umgebung wird erhalten,

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wenn der saure Bestandteil pH-Werte von weniger als 3»O bei einer Konzentration von 0,1 η ergibt. Wenn der saure Bestandteil aus einer einzigen Verbindung besteht, ist es auch, bevorzugt, daß die Verbindung einen pK -Wert von

weniger als ungefähr 4,0 besitzt. Es hat sich üblicherweise gezeigt, daß eine Erhöhung des Säuregrades der Umgebung der Azoreaktionskomplexe zu einer intensiveren kolorimetrischen Reaktion führt. Es ist gezeigt worden, daß die Zugabe des sauren Bestandteils eiuch nach der Bildung des Azoyeaktionskoraplexes erfolgen kann. Das stützt die Tatsache, daß eine saure Umgebung nicht erfo.rderlich ist, damit die Diazokupplungsreaktion abläuft, sondern mehr dazu dient, den Eeaktionskomplex zu stabilisieren und dessen molaren Extinktionskoeffizienten zu erhöhen.

Saure Bestandteile, die zu der zu untersuchenden wäßrigen Lösung nach der Diazokupplungsreaktioh zugegeben werden können, umfassen alle organischen und anorganischen Verbindungen, die, wenn sie mit der wäßrigen Lösung zusammengebracht werden, einen sauren pH-Wert ergeben. Solche Verbindungen umfassen Gase, wie Chlorwasserstoffgas, Flüssigkeiten, xvie wäßrige Salzsäure oder wäßrige Essigsäure und Feststoffe, wie Zitronensäure, Das sind jedoch nur einige Beispiele für eine große Anzahl von Verbindungen, die den sauren Bestandteil ausmachen können. Der saure Bestandteil kann auch im Gemisch mit dem Diazoniumsalz in trockener Form vorliegen. In diesem Falle kann irgend eine feste organische oder anorganische Verbindung angewandt werden, die fähig ist, einen sauren pH-Wert einzustellen, wenn sie mit der wäßrigen Lösung in Berührung kommt, wie Zitronensäure, Sulfosalicylsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Cyclohexansulfaminsäure und Maleinsäure.

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Bevorzugte Mengenverhältnisse zwischen dem Diazoniumsalz und dem sauren Bestandteil sind für den Fall, daß der saure Bestandteil in dem Testreagens enthalten ist, 1 bis 4 Gew.-Teile Diäzoniumsalz und 4 bis 8 G-ew.-Teile saurer Bestandteil» In all den Fällen, bei denen ein saurer Bestandteil in dem Testreagens enthalten ist, können kein, ein oder beide Anioiienanteile des Diazoniuinsalzes ein Diäzoniumsalz stabilisierendes Anion, wie oben erläutert, umfassen. Der Anteil des anionischeii Teils des Diazoniumsalzes und des sauren Bestandteils, wenn ein solcher in dem Testreagens enthalten ist, sollte ausgewählt werden auf der Grundlage der individuellen Erfordernisse von Reaktionszeit, Stabilität und Ausmaß der verstärkten kolorimetrisehen Reaktion, wie sie gewünscht sind. Die Reaktionszeit für die Diazokupplung zwischen dem Diazoniumsalz und Bilirubin oder Uro'bilinogen ka.nn geregelt werden durch entsprechende Auswahl der Diäzoniumsalz stabilisierenden Anionen, der Konzentration der Reaktionsteilnehmer und des pH-Wertes _β Erhöhung der beiden letzteren Faktoren setzt die Reaktionszeit herab.

Wie oben gesagt, können die erfindungsgemäßen Testz^eagen-fcien vorliegen in Form eines trockenen Feststoffs, wie eines' Pulvers oder einer Tablette mit einem schäumenden Paar oder sie können in ein trockenes Prüfmittel eingebaut sein usw. Als trockener Feststoff umfaßt das Testreagens ein 4,4'-Bipher{ildiaaoniumsalz und kann ein Diäzoniumsalz stabilisierendes Anion und/oder einen sauren Bestandteil enthalten. Wenn das Testreagens in Form einer Tablette vorliegt, kann die Tablette außerdem ein schäumendes Paar enthalten, das die Lösung des. Testreagenses erleichtert. Inerte Füllstoffe und andere Verdünnungsmittel können auch zur Erleichterung des Tablettierungsverfahrens ange-

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wandt werden. Ein schäumendes Paar bezeichnet die Kombination aus einem sauren Bestandteil und einem Carbonat oder Bicarbonate das, wenn es mit· einerwäßrigen Lösung zusammenkommt, zum Schäumen bzw. zum Aufbrausen führt. Die Anwendung eines sauren Bestandteils, der imstande ist, einen sauren pH-Wert zu erzeugen, wie oben näher angegeben ist, kann auch als saure Komponente des schäumenden Paars dienen, wobei die saure Komponente in ausreichendem Überschuß gegenüber der Carbonat- oder Bicarbonatkomponente vorhanden sein muß, um einen sauren pH-Wert einzustellen, wenn das Reagens mit der zu untersuchenden wäßrigen Flüssigkeit zusammengebracht wird.

Das hier beschriebene Diagnostiziermittel umfaßt einen saugfähigen Träger, der das Testreagens in trockener Form, enthält, Das in dem Träger enthaltene Testreageiis kann einen sauren Bestandteil und/oder ein DiazqniuBi.salz stabilisierendes Anion in der Diaz oniuiasal ζ struktur enthalten. Irgend ein Material, das imstande ist, Feuchtigkeit zu absorbieren und festzuhalten, kann.als" saugfähiger Träger angewandt werden. Derartige Materialien umfassen Papier, Baumwolle, polymere Kissen, poröse Kunststoffe usw. Das trockene Testreagens kann in dem Träger imprägniert sein oder- der Träger kann damit überzogen sein oder es kann'chemisch an den Träger gebunden sein oder es kanu eine Kombination davon vorliegen usw. Der saugfähige Träger- kann auch an einem Halter oder einer Stützvorrichtung angebracht oder auf andere Veise damit verbunden sein. Ein solcher Halter oder eine Stützvorrichtung können geeignet sein, um das Diagnostiziermittel mit der wäßrigen Flüssigkeit in Berührung zu bringen, z.B. durch Eintauchen des saugfähigen Trägers in eine Lösung, während der Halter oder der

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Stützteil mit den Fingern festgehalten wird.

Wenn das mit dem saugfähigen Träger verbundene Testreagens einen sauren Bestandteil enthält, können Probleme "bezüglich der Stabilität des Trägermaterials auftreten, besonders wem der saure Bestandteil, wie es bevorzugt ist, stark sauer ist. Z.B. hat es sich, gezeigt, daß bestimmte-Papierträgermaterialien zerstört werden, wenn sie einen stark sauren Bestandteil enthalten. Um einen stark sauren Bestandteil anzuwenden, xvie es bevorzugt ist, ist es günstig, eine Kombination einer sauren Verbindung, die nicht stark genug sauer ist, um- das Trägermaterial zu zerstören und ein nicht saures oder leicht saures Gemisch von. Verbindungen zu-verwenden, die beim Zusammenbringen mit der wäßrigen Lösung unter Bildung weiterer Säure reagieren. Eine solche Kombination, die sich als geeignet erwiesen hat, umfaßt eine organische Säure und ein festes, Addukt, bestehend aus einem Friedel-Crafts-SaIz und einer organischen Lewis-Base. Das feste Addukt hydrolysiert, wenn es mit der wäßrigen Lösung zusammenkommt und setzt dabei eine Mineralsäure frei, die zusammen mit der organischen Säure die gewünschte saure Umgebung ergibt. Das trockene feste Addukt, das mit dem saugfähigen Träger zusammengebracht wird, ist nicht sauer oder nur leicht saiier und dadurch wird ein Abbau des Trägermaterials vermieden. Solche' organischen Säuren, die sich als geeignet in dem Gemisch erwiesen haben, umfassen Zitronensäure, SuIfοsalicylsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Cyclohexansulfaminsaure und Maleinsäure.. Die angewandten Priedel-Crafts-Salze können solche Halogensalze sein, wie sie als Katalysatoren für die klassische Friedel-Crafts-Alkylie-

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rungsreaktion angewandt werden, wie Zinn-IV-chlorid Bor-

trifluorid, Zinkchlorid, Eisen-III-chlorid usw. Organische Lewis-Basen, die angewandt werden können, umfassen Pyridin und substituierte Pyridine, wie die Picoline, Κ,ϊί-Dialkylalkolamide, wie Dimethylformamid und Dimethylacetaiiiid, andere Amide und Imide, wie Benzamid und Succinimid, Harnstoffe, wie sym-Dimethylhamstoff, Äther, wie Dioxan und Tetrahydrofuran, Nitrite, wie Acetonitrit und Amine, wie Morpholin.

Die Herstellung der Prüfmittel umfaßt grundsätzlich die "beiden Stufen des Einbaus des Testreagenses in das Diagnostiziermittel und das Trocknen des Diagnostizierinittels« Der Einbau des -Testreagenses kann durch solche Maßnahmen erreicht werden, wie Imprägnieren des saugfähigen Trägers mit einer Lösung oder" Lösungen, enthaltend die Bestandteile oder das Testreagens, Aufgießen eines Films oder von Filmen aus den Bestandteilen in Lösung auf den Träger usw. Das Prüfmittel kann auf irgend eine Weise getrocknet werden, die das eingebaute Testreagens „nicht nachteilig beeinflußt. Es soll bemerkt werden, daß, wenn , ein festes Addukt eines Friedel-Crafts-Salzes und einer organischen Lewis-Base in dem einzubauenden Testreagens enthalten sein soll, ein solches festes Addukt nicht mit Hilfe einer wäßrigen Lösung in den Träger eingebaut werden kann, da das Addukt in dem Falle hydrolysieren würde. Wenn eine Lösung erforderlich ist, um den Einbau des festen Produktes in den Träger durchzuführen, sollten nicht — uäßrige Lösungen, wie solche in Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dimethylsulfoxid, wasserfreiem Alkohol, Aceton usw. angewandt werden. Das Zusammenbringen des Diagnostiziermittels mit dem Testreagens kann die Anwendung von einer oder mehreren Lösungen der Bestandteile umfassen,

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wobei das Testreagens als Ganzes letzten Endes eingebaut wird. Z.B. können eine oder mehrere wäßrige Lösungen angewandt werden, um den Träger mit dem Diazoniumsalz und dem sauren Bestandteil zu imprägnieren, der anschliessend getrocknet und danach, mit dem festen Addukt in einer nicht wäßrigen-Lösung' imprägniert wird.

Das Verfahren zum Nachweis von Bilirubin und Urobilinogen umfaßt grundsätzlich ein Zusammenbringen eines 4-,4'-Biphenyldiazoniumsalzes mit der zu untersuchenden wäßrigen Lösung, wobei Azoreaktionskomplexe entstehen, die unterschiedliche Reaktionen ergeben. Ein bevorzugtes Verfahren umfaßt ein Zusammenbringen der zu untersuchenden wäßrigen Lösung mit einem sauren Bestandteil. Das Zusammenbringen des sauren Bestandteils mit der zu untersuchenden Lösung kann vor oder nach dem Zusammenbringen" des Diazoniumsalzes oder gleichzeitig erfolgen in dem Sinne, daß das Testreagens selbst aen sauren Bestandteil enthalten kann. Wenn, das Testreagens in Form eines Feststoffes vorliegt, kann ein Kontakt mit der zu untersuchenden wäßrigen Lösung erreicht werden,indem man es zu der Lösung zugibt oder indem man einen Tropfen der zu untersuchenden Lösung auf eine (Glas-) Platte gibt, auf der sich das Testreagens in fester Form schon befindet, oder indem man das Testreagens löst und die beiden Lösungen miteinander vermischt "usw. Auch wenn das Testreagens in Tablettenforra angewandt wird, kann die Tablette in der zu untersuchenden wäßrigen Lösung gelöst oder in einer zweiten Lösung gelöst und anschließend die beiden Lösungen vermischt werden oder sie kann auf eine saugfähige Matte gegeben und .die wäßrige Lösung zugegeben werden usw.

Das Testreagens wird am bequemsten mit der zu untersuchenden

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wäßrigen Lösung zusammengebracht, wenn es sich in einem trockenen Diagnostiziermittel befindet. Das trockene Diagnostiziermittel kann in die zu untersuchende wäßrige Losung eingetaucht werden oder die wäßrige Lösung kann mit Hilfe eines Tropfers auf das Diagnostiziermittel aufgebracht werden usw. Wenn die zu untersuchende Lösung Urin ist, kann das Diagnostiziermittel direkt in den Urinstrom gehalten werden.

Es ist bevorzugt, daß man die Diasokupplungsreaktion im wesentlichen vollständig ablaufen läßt, bevor man die entstehende kolorimetrisch^ Reaktion abliest oder mißt. Wie oben gesagt, reduziert eine geeignete Auswahl der Diazoniumsalz stabilisierenden Anionen, Konzentration der ■ Reaktionsteilnehmer und des pH-Wertes die Reaktionszeit, der Diazokuppluiigsreaktion. Wenn das Testreagens in .einem trockenen Träger enthalten ist und mit der wäßrigen^ zu untersuchenden Lösung zusammengebracht wird, ist die Konzentration eines Teils der Reaktionsteilnehmer, najmlich von Bilirubin und Urobilinogen festgelegt durch ihre Konzentration in der xfäßrigen Lösung. Die Anwendung eines 4,4'~Biphenyldiazo.riiumsalzes in dem Testreagens ergibt ein Diagnostiziermittel, das imstande ist, Bilirubinkonzentrationen bis herab zu 0,2 mg/100 cnr nachzuweisen. Dieses Diagnostiziermittel ist daher' empfindlicher als die bekannten, die nur imstande sind, Bilirubin in Konzentrationen von 1 mg/100 cnr oder darüber nachzuweisen.

Halbquantitative Ergebnisse können erzielt werden durch einen visuellen Vergleich der entstehenden kolorimetrischen Reaktion mit einer Parbkarte, die die Farben angibt, die mit

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Hilfe bekannter Konzentrationen von Bilirubin und Urobilinogen erhalten worden sind. Wenn beide Verbindungen in der zu untersuchenden wäßrigen Lösung vorhanden sind, ist die entstehende Farbe ein Gemisch der beiden jeweils entwickelten Farben. Die Standardfarbkar-te nimmt daher die Form eines zweidimensionalen Gitters an, rait der kolorimetrischen Farbreaktion von Bilirubin "auf der einen Achse und derjenigen ihrer Gemische in dem durch die beiden Achsen gebildeten Quadranten* Quantitative Bestimmungen können erreicht werden durch Beobachtung dex* entstehenden Reaktionen durch "cpektrophotometrisehe Mittel, wie durch Instrumente, die aas durchgehende oder reflektierte Licht messen und öle imstande sind, Absorptionswerte _zu liefern Wenn z.B. das Testreagens direkt zu der wäßrigen Lösung gegeben wird, kann das Gemisch in eine Cuvette gegeben werden, und die . Absorption bei einer entsprechenden Wellenlänge geioer-üün werden. ¥enn andererseits das Testreagens in einem opaken Diagnostiziermittel enthalten ist, kann- die Reflektion des saugfähigen Trägers bei einer entsprechenden Wellenlänge gemessen werden.

Wäßrige Lösungen,, die mit Hilfe des^ erfindungsgemäßen Testreagenses, Diagnostiziermittels und Verfahrens untersucht werden können, umfassen Urin, Gexirebeflüssigkeiten, Cerebral- und Spinalflüssigkeiten, Fe^ alienaus züge usw., sowie andere Körperflüssigkeiten und künstlich hergestellte wäßrige Lösungen, enthaltend Bilirubin oder Urobilinogen.

Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.

derjenigen von Urobilinoyen auf der anderen Achse

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B e i s ρ i e 1

100 mg Echt-Blau-Salz B, ein 4,4-'-Diazo-3,3'-dimethoxybiphenylsalz wurden gelöst in 3 car Wasser. Drei wäßrige Testlösungen wurden hergestellt mit den folgenden Konzentrat tionen an. Bilirubin und Urobilinogen: 1,8 mg/100 cm - Bilirubin; 8,0 Ehrlich-Einheiten urobilinogen und 0,9 mg/100 cnr Bilirubin und 4,0 Ehrlich-Einheiten Urobilinogen. Ein Tropfen" jeder dieser drei Testiösungen wurde in getrennten, 0,5 cnr große Löcher von Platten für die Tropfenanalyse gegeben. Sin Tropfen der Diazoniumsalzlösung wurde dann in jedes der dx^eiLöcher gegeben, \«;obei man die folgenden Ergebnisse erhielt:

TestlÖBung entwickelte Farbe

Bilirubin braun-grün

Bilirubin-Urobilinogen braun-rot

Urobilinogen rot

Wenn ein Tropfen 1n HCl zugegeben wurde, wurden die Farben intensiver. Ein Tropfen von jeder der gleichen Testlösungen wurde ,in getrennte Höhlungen gegeben und 1 Tropfen 1n HGl jeweils zugegeben und anschließend ein Tropfen der Diazoniumsalzlösung. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Te st lösung ~ entwickelte i'arbe

Biliribin grün

Bilirubin-Urobilinogen orange

Urobilinogen orange-rot

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Beispiel 2 .

A. 100 mg 4,V-Diaminobiphenyl wurden vermischt mit 2 cmr 1n HBF. und 1 cm-^ 1m NaNO₂. Ein Kröpfen jeder der drei Testlösungen des Beispiels 1 wurde in einzelnen Höhlungen in einer Platte gegeben und ein Tropfen der Diazoniiunsalzlösung dann jeweils in jede Höhlung zugegeben. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

entwickelte ffarbe

Bilirubin ' grün

Bilirubin-ilrobilinogen ' . grün-orange Urobilinogen orange

B. 100 mg ^/+,4'-Diaminobiphenyl wurden vermischt mit 2 cnr 1n HOl und 1 cm^ 1m HaNOp und diese Diazonrumsalzlösung zu den drei Tectlösungen wie unter A. angegeben, zugegeben. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

entwickelte_ JB'

Bilirubin ' grün

Bilticrubin-Urobilinogen ' grün-orange

Urobilinogen orange

C. 100 mg ^-,^-'-Diaminobiphenyl ΐτ/urden vermischt mit 2 cm-^ In HpSO. und 1 cm^ 1m NaNOo und diese Diazonium salzlösung auf die unter A. angegebene Weise zu den drei Testlösungen zugegeben. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

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Testlösung

entwickelte Farbe

Bilirubin Bilirubin-Urobilinogen Urobilinogen

grün

grün-orange

orange

D. 100 mg 4,4-' -Diamino-3,3' -diinethylbiphenyl wurden vermischt mit 2 cnr 1n HBI' und 1 cirr 1m MaNO₂ und diese Diazoniumsalzlösung wurde augegeben zu den drei I'estlösungen, wie unter A. beschrieben. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Testlösung

entwickelte Farbe

Bilirubin Bilirubin-Urobilinogen Urobilinogen

grün (Klumpen)

blaßcremefarben-grün (Klump en) ., cremefarDen CLlumpenj

100 mg 4,4-'-Diamino-5,3¹ -diinethylbiphenyl wurden ver

mischt mit 2

■1n HCl und 1 cm-'' 1m NaIiOp und diese" Diazonium-

salzlösung vmrde zu den drei Testlösungen,wie unter A.beschrieben, zugegeben. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Testlösunf

entwickelte'Farbe

Bilirubin Bilirubin-Urobilinogen

Urobilinogen

dunkelorange (trüb)

rot-dunkel-orange (trüb)

orange

E. ' 100 mg 4-,4-'-Diamino-3",3 '-dimethylbiphenyl wurden ver-

mischt mit 2 cmr 1n

7.

und 1 cnr 1m NaNO₂ und diese Diazo-

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niumsalzlösung wurde wie unter A "beschrieben zu den drei Lösungen zugegeben. Man erhielt die folgenden Ergebnisse

Je st

Bilirubin Bilirubin«Urobilinogen Urcbilinogen

entwicke1te .Farbe grau~be ige-purpur b ei g e-purpur rosa-purpur

B e i

i e

Λ. 2-5 mg Echt-Blau-Salz B, ein 4_s4^I--Ma2o~3,3^f-dimethoxy~ biphenylsalz, vaxrden in jede von 0,5 cm^v große Höhlungen einer Platte gegeben. 50 bis 100 mg einer organischen
Säure und anschließend M- Tropfen V/asser wurden in jede
der drei Höhlungen gegeben« .Ein Tropfen von jeder der Tesü« lösung des Beispiele 1 wurde in die Vertiefungen gegeben. Es vmrden sechs verschiedene organische Säuren angewandt, x-zobei man die folgenden Ergebnisse erhielt:

Organische Säure

entwickelte Farbe

Bilirubin

Bilirubin-Urobilino gen

Zitronensäure Weinsäure Maleinsäure Bernsteinsäure

SuIfο salicylsäure

Cyclohexansulfaminsäure

grün-grau grün-οrange grün "blaßgelb

tiefgrün staubig-grün

grau-orange
grau-orange
rot-grau

blaßgelborange
grau-rosa

staubig-rosa

Urobilinogen

orange orange rot orange

tiefrot orange-rosa

B. 2~5 mg 4,^-'-DiainirLobiph.enyl wurden jnit einem Tropfen 1n HCl und einem Tropfen 1m NaJiO₂ in drei Vertiefungen von

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7.

0,5 cnr in einer Platte gegeben und wie -unter A beschrieben, behandelt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Organische Säure

entwickelte Farbe

Bilirubin

Bilirubin-Urobilinogen

Urbilinogen

Zitronensäure	hellgrau	grau-grün	hellrot
Weinsäure	grün '"~~~~	bernstein	rot-orange
Maleinsäure	grau-grün	farben . sermutzlg- or ange	orange
Bernsteinsäure	grau-grün	schmutzig- orange	orange
BuIfοsalicyl säure	grün	. grau-orange	rot-orange
Cyclohexansulf- aminsäure	grün	grau-οrange	rot-οrange
Beispiel	4

A. 100 mg ^{-,^'-Diaminobiphenyl wurden vermischt mit 2 cm^ 1n HOl und 1 cm ^ Im NaNO₂ und mit H₂O auf 65 cm* verdünnt. Drei Streifen von Whatman-Papier 3MM wurden in diese Diazoniumsalzlösung getaucht und sofort daraus entfernt und in einem Druckluft" 10 min bei 70⁰G getrocknet, Diese drei Streifen vmrden jeweils in die Testlösung des Beispiels 1 eingetaucht und sofort daraus entfernt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Testlösung Bilirubin

Bilirubin-Urobilinogen Urobilinogen

entwickelte Farbe grau-beige purpur beige-purpur rosa-purpur

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B. 100 rag 4-,4-'-Diamin.o-3r3 '-dimethylbiphenyl wurden

vermischt mit 2 cm"¹ 1n

und 1 cm'

1m NaNOp und mit

HpO auf 65 cm verdünnt. Papierstreifen vnirden wie unter A beschrieben mit dieser Diazoniumsalzlösung behandelt und angewandt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Testlösung Bilirubin Bilirubin-Urobilinogen Urobilinogen

entwickelte Farbe braun-purpur beige-purpur rosa-purpur

C. .250 mg Echt-Blau-Salz B, ein 4,4'-Diazo-3,3^l-dimethoxybiphenylsalz, wurden gelöst in 65 cnr HpO. Papierstreifen vnirden entsprechend A mit dieser Diazoniuuisalzlösung behandelt und angewandt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Jestlösung Bilirubin Bilirubin-Urobilinogen Urobilinogen.

entvfickelt e _tjFarb e grau-beige purpur grau-purpur rosa-purpur

Beispiel

0,5 g Echt-Blau-Salz B, ein 4,4'-IUaZO-J^'-dimethoxybiphenylsalz und 1 g einer organischen Säure wurden in 50 cm^ Wasser vermischt und 50 car Methanol zugegeben» Drei Streifen von E & D 204-Papier wurden in diese Diazoniumsalzlösung getaucht, sofort daraus entfernt und 10 min in einem Ofen mit Druckluft bei 70°C getrocknet. Diese Streifen wurden jeifeils in die im Beispiel 1 angegebenen Lösungen getaucht und sofort daraus entfernt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

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Organische Säure

entwickelte Farbe.

	Bilirubin	Bilirubin-	Urobilinogen
		Urobilinogen
Zitronensäure	grün	himbeerfarben	rot
Weinsäure	ti	Il	It
Maleinsäure	Il	It	Il
Bernsteinsäure	ti	ti	»
SuIfοsalicylsäure	If	It	Il
Cyclohexansulf-	Il	Ii	tt

aminoäure

Eine Lösung wurde hergestellt durch Vermischen der folgenden Bestandteile bei' Bäumt einp era tür:

Echt-Blau-SaIζ Β SuIf o,salicyl säure.. Methanol
V/asser

0,48 g 2,0 g

50
50

cm

cur

Streifen von Mead Nr. 469 filterpapier wurden- in diese Lösung eingetaucht, sofort daraus entfernt und 15 min in einem Ofen mit Druckluft bei ungefähr 70 bis 75°G getrocknet. Die getrockneten Streifen besaßen ein creraefarbiges bis weißes Aussehen. Urinproben, enthaltend Bilirubin, Urobilinogen oder beides wurden bekannten quantitativen Verfahren zur Bestimmung des jeweiligen Bilirubin- und Urobilinogengehalts unterworfen. Urobilinogen wurde bestimmt nach dem Verfahren von. Watson-Schwartz Am.J.Clin Path., 14:605 (1944) und Bilirubin wurde bestimmt nach dem Verfahren von Golden-Snavely J.Lab, Clin. Med., 33:890 (1848). Die behandelten Streifen

A 0 9 829/0729

wurden in die verschiedenen Urinproben eingetaucht und sofort daraus entfernt. Eine rote Farbe wurde,nach 15 see in Gegenwart von Urobilinogen beobachtet. Eine grüne Farbe wurde innerhalb von 45 see in Gegenwart von Bilirubin beobachtet oder eine braune Farbe j wenn gleichzeitig Urobilinogen zugegen war. Urobilinogen konnte in einer Menge von 0,3 Ehrlich-Einheiten und Bilirubin in einer Menge von 0,2 mg/100 cnr nachgewiesen werden. Es zeigte sich, daß Ascorbinsäure durch Entwicklung einer orangen Farbe in 25 see störte. Protein störte bei ' ■ der Ifarbentwicklung. nicht.

B e i^ s. ρ i e 1 2.

Es wurde eine Lösung wie im Beispiel 6 hergestellt unter Zugabe einer der folgenden Verbindungen: ZnGl₂, CoCl.,, HaCl, ITH^BF^, 1,5-l\^Taphthylendisulfonsäure und. 4,4'~Biphenyl disulfonsäure. Das Verfahren des Beispiels 6 wurde wiederholt, T=.robei man im wesentlichen die gleichen Ergebnis se erhielt. Im allgemeinen erhöhtedie Zugabe dieser Verbindungen die Stabilität der festen Diazoniumsalzpulver. Trockene Pulver, die diese Verbindungen nicht enthielten, wurden innerhalb von 2Ά- h zerstört.

Beispiel 8 ^r

A. 250 mg Echt-Blau^Salz B, ein 4,4'-Diazo-3,3'-dimethoxybiphenylsalz vnirden gelöst in 65 cnr HpO. Drei Streifen , von V/hatinan ^YM. Papier wurden in diese Diazoniumsalzlösung getaucht und unmittelbar danach entfernt und darauf 10 min in einem Ofen mit Druckluft bei 70⁰C getrocknet. Sie wurden dann in eine zweite Lösung von 1 g SnCl^-N,N-Diiaethylformamid-

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Komplex in 25 cm^ Ιί,Ν-Dimethylforinamid getaucht. Die behandelten Streifen wurden sofort daraus entfernt und 15 min in einem Ofen mit Druckluft bei 70⁰C getrocknet. Die drei Streifen wurden jeweils in die zu untersuchenden Lösungen des Beispiels 1 getaucht und sofort daraus entfernt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

ffestipsung Bilirubin Bilirubinr-Urobilinogen Urobilinogen

entwickelte garbe beige-grün beige-hell-purpur dunkelrosa-violett

B. Das unter A beschriebene Verfahren wurde auf drei andere Streifen angewandt mit der Ausnahme, daß die zweite Lösung bestand aus 1 g SnCl/.-M,F-Diniethylacetamid-Komplex in 25 cm Methanol. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

!Pestlösung Bilirubin Bilirubin-Urohilinogen Urobilinogen

entwickelte farbe beige-grün beige-hell-purpur dunkelviolett

C^ Es wurde das unter A beschriebene Verfahren auf drei ■ andere Streifen angewandt mit der Ausnahme, daß die zweite Lösung bestand aus 1 g SnCl^-Dioxan-Κοΐαρlex in 25 cnr Methanol. Man erhielt die unter B angegebenen Ergebnisse.

B e i spiel- 9

A. Es wurde eine Lösung hergestellt durch Vermischen der folgenden Bestandteile bei Raumtemperatur:

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4,4'-Diamino-5,3^l-d.imethoxybiphenyl 1 mg

Natriumnitrit · 0,1 g

Zitronensäure 8 g

4,4'-Biphenyldisulfonsäure 0,5 g

Metlianol 50

Wasser 50

Diese Lösung wurde gründlich. 5 rain vermischt. Drei Streifen -Whatman Nr. 17 I'ilterpapier wurden in diese Diazonium salzlösung getaucht, sofort daraus entfernt und .10 min bei ■70 0 in einem Druckluftofen getrocknet. Die getrockneten Streifen wurden dann augenblicklich in eine Lösung getaucht, enthaltend die folgenden Bestandteile:

SnCl^ -N, N-Dimethylfο rmamid-Kompl ex 3,2g

H,N-Dimethylformamid 25 cm-^

Aceton ' 7¹? cm-^

Die Streifen wurden dann 10 min bei 70⁰G in einem Druckluftofen getrocknet. Die Streifen wurden jeweils in die zu untersuchenden Lösungen des Beispiels Λ getaucht und sofort daraus entfernt, wobei man im wesentliehen die gleichen Ergebnisse wie im Beispiel 6' erhielt, wobei jedochAscorbinsäure in einer Konzentration unter 400 mg/1 nicht wesentlich störte.

B. Es wurde eine Lösung wie unter A hergestellt unter Anwendung von 4,4'-Diamonobenzidin anstelle von 4,4-' -Diamino-3,3'«dimethoxybiphenyl. Es wurde wie unter A gearbeitet, wobei man im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhielt.

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B eis pie! 10

Die Absorptionsspektren der entsprechend Beispiel 9 A •umgesetzten Streifen wurden über den sichtbaren Bereich mit einem Beckman DK2-Spektrophotometer gemessen, wobei der Ausgang in Werten für die prozentuale Absorption, bezogen auf die gemessene Reflektion, angegeben war. Die Ergebnisse sind in der beiliegenden Figur angegeben, die die unterschiedliche kolorimetrische Reaktion verdeutlicht, die unter Anwendung der hier angegebenen 4,4'-Biphenyldiazoniumsalze erhalten wird. Kurve 10 ist das Absorptionsspektrum eines Streifens, der in die Testlösung, enthaltend 8,0 Ehrlich-Einheiten Urobilinogen eingetaucht woi-den ist. Kurve 11 entstand beim Eintauchen eines Streifens in die Testlösung, enthaltend 0,9 mg/100 cmr Bilirubin und 4,0 Ehrlich-Einheiten Urobilinogen* Beim Eintauchen eines Streifens in eine Testlösung, enthaltend 1,8 mg/100 cm^ Bilirubin erhielt man die Kurve 12.

'.B^ e i s ρ ic 1 11

Es wurden drei Tabletten aus den folgenden Bestandteilen hergestellt:

Echt-Blau-SaIζ B- " - 0,2g

SuIfοsalicylsäure 2,0 g

Katriumbicarbonat 0·, 5 g

Diese Tabletten wurden dann in getrennte Vertiefungen von 0,5 car in einer Platte gegeben und jeweils ein

Tropfen der Testlösung des Beispiels 1 zugegeben. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

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enti^iekelte Farbe

Bilirubin grün

Bilirubin-Urobilinogen braun

Urobilinogen - .... rot

B e i S₁ ρ i- e 1 12 -'■'-'

Verschiedene -"andere ^-,4^f-,Biphenyldiazonitüasalze lr.öiinen auf übliche Weise angewandt werden und ^u den zu untersuchenden Lösungen, enthaltend Bilirubin, Urobilinogen oder ein Gemisch der beiden augeceben werden,_ wobei man typischer—-weise unter V-erwendung von 4,4 ¹~I)ia2o-3»3^l-hipheny;ldisul±^>onsäure die fo3.gend.en Werte erhält.

entwickelte Farbe

Bilirubin .-' Bilirubän-Urobilinogen Urobilinogen

grün ' braun rot

PAIMTANSERtfCHE;

62ZXIY

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Claims

Patentansprüche

in der· H^! und E" gleich oder verschieden sein können und jeweils Anionen bedeuten und die Benzolringe weitere Substituenten enthalten können, enthält und gegebenenfalls zusätzlich einen sauren Bestandteil, der"Berührung mit der zu untersuchenden v/ässrigen Lösung einen sauren pH-Wert einstellen kann.

Mittel nach Anspruch 1 _T dadurch gekennzeichnet daß raindcstens eines der Anionen ein diazoniuinsalz-stabilisierendes Anion ist.

3- Mittel nach Anspruch 2, dadurch g e k e η ηζ e i c h net, daß das diazoniumsalz-stabilisierende Anion ein Bortetrafluorid, Halogen, SuIfonat oder Halogeniaetallanion ist.

4· Mittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Substituenten an den Benzolringen

ausgewählt sind aus -H, -GH₇,

-OCH₃, -SO₃H und Cl.

— 2 —

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Jt - 1A-44

5. Mittel nach. Anspruch. 4, dadurch g e k e η η zeich-, n e t , daß mindestens einer der Benzolringe mindestens eine GH -oder OCli_v-G-ruppe enthält.

6. Mittel nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Verbindung 4_}4'-Diazobiphenyl, 4,4'-Diazo-3,3^f-dimethylbiphenyl und/oder 4,4'-Diazo-3j3'-Dimethoxybiphenyl,ist.

7·. Mittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß es in Form eines festen Pulvei's oder einer Tablette vorliegt, umfassend ein schäumendes Paar, dessen saurer Bestandteil in ausreichendem Überschuß vorhanden ist, um einen sauren pH-Y/ert in Berührung mit der wässrigen Lösung einzustellen.

8. Mittel nach Anspruch "1- bis 6, dadurch g e k e η η ζ e i c h net, daß es in oder auf einem saugfähigen Träger enthalten ist. . ■

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