DE2925524A1 - Einrichtung zum nachweis von bilirubin, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zum nachweisen von bilirubin - Google Patents

Einrichtung zum nachweis von bilirubin, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zum nachweisen von bilirubin

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Description

Einrichtung zum Nachweis von Bilirubin, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zum Nachweisen von Bilirubin
Die Erfindung betrifft eine verbesserte Testeinrichtung, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Einrichtung und ein Verfahren zum Nachweis von Bilirubin in Serum. Sie betrifft insbesondere eine Zusammensetzung, die nach dem Einbringen in ein Trägermaterial eine Einrichtung ergibt, bei welcher sich Farbe gleichmässig in der Testeinrichtung entwickelt.
Beim Aufbrechen von Harn werden Gallenpigmente, insbesondere Bilirubin, im Serum gebildet und über die Leber ausgeschieden. Die Menge der täglich gebildeten Gallenpigmente steht in engem Zusammenhang mit der Menge an zerstörtem Hämoglobin und der Leberfunktion. Man nimmt an, dass ein Gramm Hämoglobin 35 mg
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Bilirubin ergibt. Normalerweise sind o,1 bis 1,5 mg Bilirubin in 1oo ml Humanplasma oder -serum vorhanden.
Die Bestimmung von Serum-Bilirubin ist für klinische Untersuchungen, z.B. bei Untersuchungen von Leberschäden, sehr wertvoll. Ein Verfahren zum quantitativen Bestimmen des BiIirubingehaltes in Serum wurde zuerst von Van den Bergh durch Anwendung des Ehrlich-Tests für Bilirubin in Urin entwickelt. Die Ehrlich-Reaktion basiert auf der Kupplung von diazotierter Sulfanilsäure (Ehrlich's Diazoreagens) und Bilirubin unter Bildung einer rot-purpurnen Azoverbindung. Bei' dem ursprünglich von Ehrlich beschriebenen Verfahren wurde Alkohol als Lösungsmittel verwendet, in dem sowohl Bilirubin als auch die Diazoverbindung löslich waren. Van den Bergh entdeckte dann, dass beim Fortlassen des Alkohols bei Bestimmung von Gallenpigmenten in menschlichen Gallen die Normalentwicklung der Farbe "direkt" eintrat, d.h. ohne Zugabe von Alkohol. Diese Form von Bilirubin, die ohne Zugabe von Alkohol reagiert, wurde deshalb als "direkt reagierend" bezeichnet. Es war jedoch nach wie vor erforderlich, Alkohol zuzugeben, um Bilirubin in normalem Serum nachzuweisen. Diese Form des Bilirubins, die nur nach Zugabe von Alkohol gemessen werden konnte, wurde als "indirekt reagierendes" Bilirubin bezeichnet.
Das indirekte Bilirubin ist "frei" (nicht konjugiertes) Bilirubin a Route zur Leber aus dem retikuloendothelialen Gewebe, wo das Bilirubin beim Zusammenbrechen des Häm-porphyrins gebildet wird. Da Bilirubin nicht wasserlöslich ist, ist Alkohol zum Einleiten der Kupplung mit dem Diazoreagens erforderlich. In der Leber wird das freie Bilirubin mit Glucoronsäure konjugiert. Konjugiertes Bilirubin, das wasserlöslich ist, kann direkt
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mit dem Diazoreagens reagieren, so dass das "Direkt-Bilirubin" von Van den Bergh tatsächlich ein Bilirubinkonjugat (Bilirubinglucoronid) ist.
Ausser Sulfony!säure wurden auch andere Sulfonsäuren als geeignet bei der Diazo-Kupplungsreaktion vorgeschlagen. Zu diesen Sulfonsäuren gehören p-Toluolsulfonsäure, Sulfosalicylsäure, SuIfonsäure und Hexamsäure. (Siehe hierzu US-PS 3 585 oo1.)
Es ist auch bekannt, dass ausser Alkohol andere Substanzen den gleichen Einfluss haben, nämlich die Diazo-Kupplung des "freien" Bilirubins zu verstärken, und dadurch eine indirekte Messung und somit eine Messung an Gesamt-Bilirubin ermöglichen. Solche Substanzen werden als "Beschleunigungsmittel" bezeichnet und zu diesen gehört Koffein, Dyphyllin, Natriumacetat, Natriumbenzoat, Gummi arabicum und dergleichen. (Siehe hierzu Henry,R.J., Clinical Chemistry, Principles and Technics, Second Edition, Harper and Row, Seite 1o47 (1974); With, T.K. Bile Pigments, Academic Press, Seiten 324-327 (1967) und US-PS 4 o38 o31.)
Testeinrichtungen zur Bilirubihbestiiranung, z.B. Teststreifen, die man bei der Diazo-Kupplungsreaktion verwenden kann, sind bekannt. Hierzu wird auf die oben erwähnten Patentschriften sowie auf die US-PSen 3 853 476, 3 88o 588, 3 912 456, 4 o69 o16 und 4 o69 o17 verwiesen. Diese Einrichtungen haben sich bei der klinischen Diagnose als brauchbar erwiesen.
Es wurde nun jedoch festgestellt, dass die bisherigen Einrichtungen insofern nachteilig sind, als sie nicht Serumproben gleichmassig adsorbieren. Die Farbe, die am Aufgabepunkt der Probe gebildet wird, ist sehr intensiv, während am Rande, also peripher zu diesem Punkt wenig oder überhaupt keine Farbe entwickelt wird.
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Diese üngleichförmigkeit ist eine besonders unerwünschte Eigenschaft, weil eine gleichmässige Farbentwicklung erforderlich ist, um die bei einer quantitativen Bestimmung erforderliche Genauigkeit zu erzielen.
Dieses Problem der bekannten Einrichtungen wurde nun gemäss der vorliegenden Erfindung erkannt und in der nachfolgenden Weise überwunden.
Es wurde festgestellt, dass man eine Testeinrichtung zum Nachweis von Bilirubin in Serum erhält, die aus einem Trägermaterial und, eingebettet darin, einer Zusammensetzung aus einem Diazoniumsalz, p-Toluolsulfonsäure und Dyphyllin besteht, die die unerwünschte Eigenschaft der . . .ungleichmassigkeit der Farbentwicklung bei der Reaktion mit einer Testprobe nicht zeigt. Die Gegenwart von Bilirubin in einer Serumprobe wird durch ein Verfahren nachgewiesen, bei dem man die erfindungsgemässe Einrichtung mit der zu prüfenden Probe in Berührung bringt, und die dabei eintretende Farbansprechung beobachtet. Die Testeinrichtung wird hergestellt, indem man einen Träger mit einer Imprägnierlösung, welche die vorerwähnte Zusammensetzung enthält, sättigt.
Die Schwierigkeiten der Ungleichmassigkeit, die erfindungsgemäss überwunden werden, beruhen wahrscheinlich auf einer Ausfällung von Serumprotein in den bisher verwendeten Vorrichtungen. Dies ist aber nur eine Vermutung.
Unabhängig von der Fähigkeit der p-Toluolsulfonsäure, einen pH einzustellen, der ausreichend niedrig ist, um die Diazoniumverbindung zu stabilisieren, ist es nunmehr möglich, die erfindungsgemässe Testeinrichtung anzuwenden, wobei man beim Anspechen
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auf Serium-Bilirubin eine gleichmässige Farbentwicklung erhält. Infolge dessen kann man ganz genaue quantitative Instrurcentenablesungen erzielen, die der Bilirubin-Konzentration entsprechen, und zwar unabhängig von der Stelle, auf welcher die Serumprobe auf die Testeinrichtung aufgebracht wurde.
Bestimmte nachfolgend verwendet Ausdrücke sollen sich nur auf spezielle Ausführungsformen, die der näheren Beschreibung dienen, beziehen.
Testeinrichtungen zum Nachweis von Serum-Bilirubin können alle aromatischen Diazoniumsalze anwenden, die ausschliesslich oder überwiegend ..elektronenanziehende Gruppen haben. In der Benzolreihe können z.B. diese Substituenten Nitrogruppen, Halogenatome, Carboxylgruppen, Sulfonsäurereste, Nitrilgruppen oder quaternäre Ammoniumgruppen sein. Elektronenabgebende Gruppen, z.B. Alkoxyreste, können auch in einem begrenzten Ausmass vorliegen. Auch diazotierte Dinaphthylamin- und Benzidinderivate können verwendet werden. Weniger geeignet sind Benzoldiazoniumsalze, die ausschliesslich elektronenabgebende Gruppen haben, wie Alkoxy-, Alkyl- oder Arylaminoreste, weil sie verhältnis-· massig langsam mit Bilirubin reagieren.
Solche Diazoniumsalze können direkt zugegeben oder in situ bei der Reaktion der Glieder der Anilinreihe mit einem Nitrit gebildet werden, wie dies in dem Beispiel gezeigt wird. Unabhängig davon, ob das Diazoniumsalz direkt als Salz oder als in situ gebildetes Salz zugegeben wird, werden vorzugsweise als Diazoniumsalze substituierte und unsubstituierte Halogenbenzole, insbesonder 2,4-Dichlorbenzol, verwendet. Vorzugsweise werden auch Diazoniumsalze von nitrosubstituierten Benzolen, wie p-Nitrobenzol-diazoniumtetrafluoroborat verwendet.
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Die Diazoniumsalze sind in der Imprägnierlösung in Konzentrationen zwischen etwa o,o2 g/dl bis etwa 2,ο g/dl vorhanden und vorzugsweise in einem Bereich von o,o5 g/dl bis etwa o,5 g/dl, Die in der Imprägnierlösung verwendete p-Toluolsulfonsäure liegt in Konzentrationen von etwa o,5 g/dl bis etwa 1o,o g/dl und vorzugsweise etwa 1,o g/dl bis etwa 6,ο g/dl vor. Das Dyphyllin wird in der Imprägnierlösung in Konzentrationen zwischen etwa 6,o g/dl bis etwa 14,ο g/dl und vorzugsweise etwa 8,ο g/dl bis etwa 12,ο g/dl verwendet. Das zur Zubereitung der Imprägnierlösung verwendete Lösungsmittel kann Wasser sein oder eine physiologische Lösung, ein geeignetes organisches Lösungsmittel oder Mischungen davon. Gewünschtenfalls können verschiedene Zusatzkomponenten zugegeben werden. Dazu gehört z.B. Gantrez AN-139 (ein Copolymer aus Methylvinylather und Maleinsäureanhydrid der GAF Corporation, Chemical Products, New York, N.Y.). Vorzugsweise wird die Reaktion bei einem verhältnismässig niedrigen pH, z.B. im pH-Bereich von 1 bis etwa 5, durchgeführt.
Die erfindungsgemassen Testeinrichtungen werden hergestellt, indem man einen Träger, z.B. eine saugfähige Matrix mit der Testzusammensetzung imprägniert. Folgt das Einbringen durch Sättigung mit einer Imprägnierlösung der vorher angegebenen Art, so wird der Träger so imprägniert und dann getrocknet. Ausser der Imprägnierung kann man die Einreichung gemäss der Erfindung auch auf andere Weise herstellen, z.B. durch Aufdrucken oder Aufsprühen der Zusammensetzung auf ein Substrat oder eine Matrix.
Der Ausdruck "Träger" bezieht sich auf saugfähige und nicht saugfähige Matrices, die unlöslich sind und ihren Strukturzusmmenhalt beibehalten, wenn man sie Wasser oder physiologischen Flüssigkeiten aussetzt. Geeignete saugfähige Matrices sind Papier, Cellulose, Holz, synthetische Faservliese, Glasfasern,
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Gewebe und Vliese und dergleichen. Nicht saugfähige Materialien sind organoplastische Materialien, wie Polypropylen und dergleichen. Verwendet man eine saugfähige Matrix, so wird die Matrix vorzugsweise auf geeignete Weise befestigt, z.B. mittels eines doppelseitigen Klebepapiers, an einen unlöslichen Träger, wie einen organoplastischen Streifen, z.B. Polystyrol. Dadurch wird die Handhabung erleichtert.
Die Testeinrichtung wird angewendet, indem man eine geringe Menge der zu prüfenden Probe darauf tropft oder auf andere Weise eine Probe auf die Trägermatix aufbringt, und dadurch bildet sich dann eine nachweisbare Farbänderung, sofern Bilirubin vorhanden ist. Die Testeinrichtung kann in gleicher Weise verwendet werden, unabhängig ob die zu untersuchenden Proben Plasma oder Serum enthalten.
Die reagierten Einrichtungen können mit dem Auge abgelesen werden, aber für genauere quantitative Bestimmungen der Konzentration an Bilirubin werden colorimetrische Ablesungen mittels eines Beugungsspektrofotometers durchgeführt. Beugungsablesungen kann man mit im Handel erhältichen Spektrofotometern wie einem Beckman DK-2 Spectrofotometer, Beckman Instruments Inc., Fullerton, Californien 92 634, oder einem Spektrocolorimeter SCF-1, der Israel Electro-Optical Industry, Ltd. erhalten.
Die Ausführungen in den nachfolgenden Beispielen können von jedem Fachmann noch abgeändert werden, ohne dass man dadurch vom Umfang der Erfindung bzw. der Ansprüche abweicht.
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Beispiel 1
In diesem Beispiel werden erfindungsgemässe Einrichtungen und Einrichtungen, die andere Reagentien-Kombinationen enthalten, hinsichtlich der Gleichmässigkeit der Farbentwicklung verglichen und somit hinsichtlich der Zuverlässigkeit der erzielten Konzentrationsdaten für Bilirubin.
In einem Laboratorium wurden unter Umgebungsbedingungen 6 verschiedene Imprägnierlösungen hergestellt in einem Lösungsmittel aus 45,ο ml destillierten H2O und 5,ο ml einer 1o g/dl-Lösung von Gantrez AN-139, entsprechend den in Tabelle 1 angegebenen Formulierungen.
p-Tuluolsulfonsäure und Sulfosylicylsäure stammte von der Eastman Organic Chemicals, Rochester, N.Y. 1465o. Hexamsäure wurde von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, erhalten. 1,5-Napthalendisulfonsäure-dinatriumsalz, 2,4-Dichloranilin und Natriumnitrit waren handelsübliche Materialien von Standard-Reinheit. Dyphyllin und Koffein waren von der Aldrich Chemical Co., Inc. Milwaukee, Wisconsin 53233, bezogen worden.
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Tabelle 1
Komponenten A B CD E F
Sulfosalicylsaure - 3,5g - 4,6 g
Hexamsäure - - - - 3,ο g 3,ο g
p-Toluolsulfonsäure 2,8g - 2,8 g - - -
Koffein - 5,og 5,o g - 5,og
ca Dyphyllin 5,og - - 5,og - 5,ο
ο
ο 115-Naphtalen-disulfon-
—» säure-dinatriumsalz o,3 g o,3 g o,3 g o,3 g o,3g o,3 g
>^ 2,4-Dichloranilin o,o375 g oro375 g o,o375 g o,o375 g o,o375 g o,o375 g
Natriumnitrit o,1o g o,1o g o,1o g o,1o g o,1o g o,1o g
Die Reagentien, einschliesslich 2,4-Dichloranilin und Natriumnitrit wurden in situ in der Imprägnierlösung unter Bildung eines 2,4-Dichlorbenzoldiazoniumsalzes, in diesem Falle von 2,4-Dichlorbenzoldiazonium-1,5-naphthalen-disulfonat, umgesetzt.
Die Lösung der Formulierung A wurde zur Herstellung einer Einrichtung gemäss der Erfindung verwendet. Die Lösungen der Formulierungen B bis F wurden zur Herstellung von anderen Einrichtungen zu Vergleichszwecken verwendet. Es konnte direkt beobachtet werden, dass die Formulierungen C und E, bei denen Koffein mit p-Toluolsulfonsäure bzw. Hexamsäure kombiniert wird, nicht in Lösung gehen, und daher nicht in geeigneter Weise auf die verwendeten Papiermatrices aufimprägniert werden konnten.
Getrennte Blätter von Eaton-Dikeman 2o5-Filterpapier wurden bis zur Sättigung imprägniert und zwar jedes mit einer der oben angegebenen Imprägnierlösungen. Die imprägnierten Blätter wurden in einem Standard-Laboratoriumofen bei 6o°C getrocknet. Die Papierblätter, enthaltend die trockenen Rückstände der verschiedenen Imprägnierlösungen, wurden dann in 2,5 mm χ 2,5 mm Quadrate geschnitten, diese Quadrate wurden auf ein doppelseitiges Klebepapier aufgebracht und auf einen plastischen Trägerstreifen fixiert. Die Einrichtungen, die die Zusammensetzungen gemäss den Formulierungen A, B, D und F haben, werden als Einrichtungen A, B, D bzw. F bezeichnet.
Serumproben, die zuvor untersucht worden waren und 1 mg/dl Bilirubin enthielten, wurden in Mengen von etwa 3o/Ul auf λ schiedene Stellen (zentral und peripher) auf jede der
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hergestellten Einrichtungen aufgetragen. Die Ablesungen der chromogenen Ansprechung wurde durch Beugungsspektrofotometrie aufgenommen. Die prozentuale Beugung (%R) wurde bei 560 Nanometer Wellenlänge 9o Sekunden nach dem Aufbringen der Proben abgelesen. Die erzielten Ergebnisse in Form von %R-Werten werden in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Probe Posxtxon A B C D E F
Zentral
Peripher		 49,4
49,8		 47,o
56,5		 - 46,8
58,2		 - -
Das %R bei der Einrichtung F bei 56o nm war so .vernachlässigbar, dass es nicht ablesbar war. Dagegen war es bei 45o nm ablesbar, was dessen Beugungsminimum darstellte, aber Ablesungen bei dieser Wellenlänge unterliegen Veränderungen aufgrund der Farbe des Serums und sind deshalb unzuverlässig.
Die Ergebnisse zeigen %R-Unterschiede von o,3 zwischen den Einrichtungen, enthaltend Zusammensetzungen gemäss Formulierung A, bei denen die Proben zentral und peripher aufgebracht waren. Die %R-Differenz zwischen der Einrichtung, enthaltend die Zusammensetzungen von Formulierung B, bei denen die Proben zentral und peripher aufgetragen waren, betrugen 9,5. Der Unterschied zwischen der Gleichförmigkeit der Ablesungen bei der Einrichtung A gegenüber der Nichtgleichmässigkeit der Ablesung bei der Einrichtung B entspricht in diesem Fall einem
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Verhältnis von 1 : 31,7. Die %R-Differenz zwischen der Einrichtung, enthaltend die Zusammensetzung der Formulierung D, bei denen die Proben zentral bzw. peripher aufgetragen wurden, beträgt 11,4. Der Unterschied zwischen der Gleichmässigkeit der Ablesung in der Einrichtung A gegenüber der Ungleichmässigkeit der Ablesung in der Einrichtung D enspricht einem Verhältnis von 1 : 38. Wie vorher angegeben wurden keine Ergebnisse für die Einrichtungen mit den Zusammensetzungen der Formulierungen C und E erhalten, weil die Imprägnierlösungen nicht hergestellt werden konnten.
Die %R-Ablesungen in Tabelle 2 für die verschiedenen Einrichtungen wurden mathematisch extrapoliert auf Bilirubin-Konzentrationen, .ausgedrückt als mg/dl. Die %R-Werte für die Einrichtung A sind sehr ähnlich und geben im wesentlichen den Nachweis von Bilirubin in einer Konzentration von 1,o mg/dl, dem tatsächlich zuvor festgestellten Wert an. Die für die Einrichtung B angegebenen Werte von 47,ο bzw. 56,5 geben 1,o mg/dl (korrekt für die Einrichtung mit der B-Formulierung) und einen falschen Wert (0 mg/dl) an. Die %R-Werte für die Einrichtung D ergeben 1,o mg/dl bzw. 0 mg/dl Bilirubin. Wie bei der Einrichtung B lagen erhebliche Unterschiede der nachgewiesenen Bilirubin-Konzentrationen vor, je nach dem wo die Probe auf die Einrichtung aufgebracht worden war.
Die erzielten Ergebnisse und Analysen zeigen deutlich, dass bei der Bestimmung mit einer Einrichtung gemäss der Erfindung sehr viel gleichmässigere und darum genauere klinische Daten erzielbar sind.
Für den Fachmann ist ersichtlich, dass zahlreiche Änderungen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
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Claims (10)

  1. Einrichtung zum Nachweis von Bilirubin, Verfahren zui deren Herstellung und deren Verwendung zum Nachweisen von Bilirubin
    Patentansprüche
    y 1/ Testeinrichtung zum Nachweisen von Bilirubin in einer
    Serumprobe, gekennzeichnet durch einen Träger, der eine Zusammensetzung aus einem Diazoniumsalz, p-Toluolsulfonsäure und DyphyllLn enthält.
  2. 2. Einrichtung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass Diazoniumsaiz ein Halogenbenzoidiazoniumsalz ist.
  3. 3. Einrichtung gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Diazoniumsalz 2,4-Dichlorbenzoldiazonium-1,5-naphthalin-disulfonat ist.
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    ORIGINAL INSPECTED
  4. 4. Einrichtung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Diazoniumsalz ein p-Nitrobenzoldiazoniumsalz ist.
  5. 5. Einrichtung gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass das p-Nitrobenzoldiazoniumsalz p-Nitrobenzoldiazonium-tetrafluorat ist.
  6. 6. Testeinrichtung zum Nachweis von Bilirubin in einer Serumprobe, gekennzeichnet durch einen Träger, der eine Zusammensetzung aus: p-Toluolsulfonsäure, Dyphyllin, 1,5-Naphthalindisulfonsäure-dinatriumsalz, 2,4-Dichloranilin und Natriumnitrit enthält.
  7. 7. Verfahren zur Herstellung einer Testeinrichtung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man einen Träger mit einer Zusammensetzung aus einem Diazoniumsalz, p-Toluolsulfonsäure und Dyphyllin in Berührung bringt.
  8. 8. Verfahren zur Herstellung einer Testeinrichtung gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass man einen Träger mit einer Zusammensetzung aus p-Toluolsulfonsäure, Dyphyllin, 1,5-Naphthalin-disulfonsäure-dinatriumsalz, 2,4-Dichloranilin und Natriumnitrit zusammenbringt.
  9. 9. Verwendung einer Einrichtung gemäss Anspruch 1 zum Nachweis von Bilirubin in einer Serumprobe durch in Kontaktbringen der Einrichtung mit der Probe und Ablesen der eintretenden colorimetrischen Ansprechung.
  10. 10. Verwendung einer Einrichtung gemäss Anspruch 6 zum Nachweis von Bilirubin in einer Serumprobe durch in Kontaktbringen der Einrichtung mit der Probe und Ablesen der eintretenden colorimetrischen Ansprechung.
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