DE2711684B2

DE2711684B2 - Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente in einer Probe

Info

Publication number: DE2711684B2
Application number: DE2711684A
Authority: DE
Inventors: Jerome Greyson; Katharine Gentry Johnston
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1976-03-18
Filing date: 1977-03-17
Publication date: 1979-07-19
Also published as: ES463418A1; AR213631A1; JPS52125397A; NL7702607A; JPS5819220B2; DE2711684A1; AU509319B2; DE2711684C3; FR2344839A1; GB1529413A; ES456935A1; US4038485A; IN145596B; CH640059A5; NL172788C; FR2344839B1; CA1078711A; DK156524C; IT1143564B; DK117377A

Description

Die Gebiete der Diagnose in der Medizin, Physik und Chemie haben sich in den letzten fünfundzwanzig Jahren stark ausgeweitet, so daß speziell im medizinischen Bereich viele Parameter unglaublich leicht und schnell bestimmt werden können.

Ein derartiges Gebiet, das sich besonders stark ausgedehnt hat ist das der medizinischen Diagnose, wo viele Körperfunktionen untersucht werden können, indem man lediglich einen reagenshaltigen Streifen in eine Probe der Körperflüssigkeit wie Urin eintaucht und das Ansprechen, z. B. das Auftreten oder die Änderung einer Farbe oder eine Änderung des reflektierten Lichtes an dem Streifen, beobachtet.

Im Zusammenhang mit diesen »dip-and-read«-Verfahren sind zahlreiche chemische Bestimmungen zum Nachweis von Komponenten in Körperflüssigkeiten möglich. Bei den meisten dieser Bestimmungen tritt eine nachweisbare Reaktion auf, die quantitativ oder zumindest semiquantitativ ist. So kann der Analytiker, wenn er die Reaktion nach einer vorher bestimmten Zeit mißii nicht nur einen positiven Nachweis für das Vorhandensein eines bestimmten Bestandteiles in einer Körperflüssigkeit erhalten, sondern auch abschätzen, wieviel dieses Bestandteils vorhanden ist Dadurch s liefern diese Streifen dem Mediziner ein leichtes diagnostisches Mittel sowie die Möglichkeit das Ausmaß einer Erkrankung oder Fehlfunktion des Köpers zu bestimmen. Derartige Prüfmittel umfassen üblicherweise eine oder mehrere Trägennatrices, wie

ίο absorbierendes Papier, in denen jeweils ein spezielles Reagenssystem absorbiert ist das in Gegenwart einer bestimmten Komponente in der zu untersuchenden Probe eine Farbänderung oder ein Auftreten einer Färbung ergibt Je nach dem spezifischen in eine bestimmte Matrix eingebauten Reaktionssystem, kann man mit Hilfe dieser Prüfmittel das Vorhandensein von Glucose, Albumin, Ketonen, Bilirubin, okkultem Blut, Nitrit, Urobilinogen, die Wasserstoffionenkonzentration (pH-Wert) oder ähnliches bestimmen. Das spezifi- sehe Auftreten einer Farbe und deren Intensität, wie sie innerhalb eines bestimmten Zeitraumes nach der Berührung des Streifens mit der Probe auftritt ist ein Zeichen für das Vorhandensein einer bestimmten Komponente und deren Konzentration in der Probe.

Einige dieser Prüfmittel und Reaktionssysteme sind in

den US-PS 31 23 443,32 12 855,38 14 668,31 64 534 und 29 81606 und 30 92 465, 32 98 789, 3164 534 und 29 81 606 angegeben.

Typischerweise kommen diagnostische Reagentien

oder Prüf mittel, wie »dip-and-read«-Reagensstreifen, mit detaillierten, gedruckten Anweisungen in den Verkehr, die sorgfältig befolgt werden müssen, um eine entsprechende Genauigkeit zu erreichen. .Wenn das Ansprechen in einer Farbänderung besteht, ist besonde re Vorsicht erforderlich. Eine Karte mit unterschiedli chen Färbungen ist zum Vergleich mit dem Streifen vorgesehen, und da in den meisten Fällen die Genauigkeit der quantitativen Bestimmung der Vorrichtung von der Bestimmung der Farbbildung in Beziehung auf die Zeit abhängt, ist es unbedingt erforderlich, daß die Farbänderung innerhalb eines vorbestimmten Zeitraums nach dem Eintauchen in die Probe mit der Farbkarte verglichen wird. Die Reaktionszeiten müssen genau eingehalten werden — eine zu frühe Ablesung führt zu einer zu geringen Farbbildung und eine zu späte Ablesung zu einer zu intensiven Farbbildung oder sogar zum Auftreten einer zusätzlichen störenden Farbe. Daher kann, wenn die Farbentwicklung zu früh oder zu spät mit der Farbkarte verglichen wird, ein ungenaues

so Ergebnis erhalten werden, und das ist häufig der Fall.

Es sind zahlreiche Versuche unternommen worden, um die Notwendigkeit der genauen Zeiteinhaltung zu umgehen. Insbesondere wurde nach einer Möglichkeit gesucht, um die Nachweisreaktion nach einer bestimm ten Zeitdauer abzubrechen bzw. den nach einer bestimmten Zeit erreichten Farbton konstant zu halten. Dadurch könnte der Vergleich mit der Farbkarte zu einem späteren für den Anwender des Prüfmittels gerade günstigen Zeitpunkt durchgeführt werden.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein solches Prüfmittel zu entwickeln, bei dem der Zeitpunkt zu dem die Reaktion abgelesen wird, nicht mehr kritisch ist.

Diese Aufgabe wird bei einem Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente in

b5 einer Probe mit Hilfe eines Reagenssystems, das bei Berührung mit der Probe mit dieser Komponente in Wechselwirkung tritt und zu einer feststellbaren Reaktion führt, dadurch gelöst, daß es zusätzlich ein

Hemmsystem enthält, das bei Berührung mit der Probe nach Ablauf einer vorbestimmten Zeit härtet oder ein Gel bildet Wahlweise kann das Prüfmittel auch ein Hemmsystem enthalten, das bei Berührung mit der Probe nach Ablauf einer vorbestimmten Zeit Wärme erzeugt, wobei das Reagenssystem eine wärmeempfindliche Substanz umfaßt, oder ein Gift für das Reagenssystem darstellt Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Prüfmittel in einer Trägermatrix enthalten. In diesem Falle kann die Untersuchung durch einfaches Eintauchen des Prüfmittels und späteres Ablesen des Ergebnisses durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Prüfmittel ist anwendbar für viele diagnostische Bestimmungen und umfaßt auch bekannte Reagenssysteme, die zur Zeit im Gebrauch sind, wie Indikatoren für den pH-Wert und andere Ionenkonzentrationen und kompliziertere Reagenssysteme, wie solche, die angewandt werden zur Bestimmung von Bestandteilen von Körperflüssigkeiten. Derartige Prüfmittel können besonders günstig erfindungsgemäß verbessert werden. Bekannte Prüfmittel und Prüfvorrichtungen zum Nachweis und zur Bestimmung von okkultem Blut, Glucose, Bilirubin, Harnstoffstickstoff im Blut, Bakteriurie, Urobilinogen, Cholesterin, Protein und anderen Bestandteilen können erfindungsgemäß modifiziert werden.

Erfindungsgemäß können bekannte oder neue Reagenssysteme angewandt werden, wobei die Wechselwirkung zwischen der Komponente in der Probe und dem Reagenssystem nach Ablauf einer bestimmten Zeit abgebrochen wird. Dadurch ist das Ausmaß der nachweisbaren Reaktion für ein bestimmtes Reagenssystem festgelegt: Eine bei der Wechselwirkung auftretende Farbe wird weder stärker noch schwächer; die Menge an ultraviolett-empfindlichem Produkt, das gebildet oder verbraucht wird bei der Wechselwirkung, bleibt konstant

Für ein Hemmsystem, das härtet oder ein Gel bildet und somit die Wechselwirkung zwischen dem Reagenssystem und der Komponente physikalisch verhindert bestehen verschiedene Möglichkeiten. Zu den gelbildenden oder härtenden Substanzen, die anwendbar sind, gehören solche, die bei Raumtemperatur schnell reagieren und deren Reaktion beginnt oder eingeleitet wird bei Berührung mit der zu untersuchenden Probe. Diese Hemm-Mittel müssen mit einer ausreichenden Geschwindigkeit erhärten oder ein Gel bilden, das eine nachweisbare Reaktion nach einer verhältnismäßig kurzen Zeit hemmt Gleichermaßen günstig ist es, wenn das gehärtete oder zu einem Gel umgeformte Hemmsystem eine weitere Farbänderung verhindert oder die nachweisbare Reaktion auf andere Weise beendet wird.

Typisch für derartige Hemmsysteme sind polymerisierbare oder vernetzbare wasserlösliche Polymere, Epoxid-Polyamin-Gemische, mit Wasser reagierende Polyisocyanate, durch Hydroxylionen polymerisierbare Acrylat- und substituierte Acrylatester, Gemische von Polyvinylalkohol mit verschiedenen Metallverbindungen [z.B. Boraten, Vanadaten, Cr(III) und Ti(IV)], Natriumcarboxymethylcellulose und Al(III), Gemische von Polyvinylalkohol mit mehrwertigen Phenolen (polyphenolischen Verbindungen), z. B. Resorcin, Brenzcatechin, Phloroglucin und Farbstoffen und Diazoniumsalzen, ein Gemisch von Polyvinylalkohol und Dimethylolharnstoff mit einem Ammoniumchloridkatalysator, Gemische von Dimethylolharnstoff mit Hydroxyalkylcellulose und hydrolysierten Maleinsäureanhydridcopolymeren oder Polyacrylsäure, Gemische von Polyvinylalkohol und Polyaldehyd-haltigen Verbindungen, PoIyvinylpyrrolidonkomplexe (d.h. mit Substanzen wie Polycarbonsäuren, einem Methylvinyläther/MaleinsäureanhyiWd-Copolymer oder einer Polyacrylsäure), Gemische von saurem Copolymer und Polyäthylenglykol sowie Gemische von Polyvinylalkohol mit Ausfällmitteln (z. B. Na₂CO₃, Na₂SO₄ oder K₂SO₄).

Eine Verzögerung der Polymerisation oder Vernetzung des wasserlöslichen Polymers kann erreicht werden, indem man die Initiatoren von dem wasserlöslichen Polymer isoliert bis das Prüfmittel mit der zu untersuchenden Probe in Berührung gebracht worden ist Eine Möglichkeit, eine solche Trennung von Polymer und Initiator zu erreichen, besteht darin, den Initiator in wasserlösliche Mikrokapseln einzuschließen oder in Mikrokapseln, die beim Benetzen aufbrechen. So würden sich Gelatinemikrokapseln, die den Initiator enthalten, bei Berührung mit einer wäßrigen Probe lösen und dadurch den Initiator freisetzen, wodurch das wasserlösliche Polymer polymerisieren könnte.

Mikrokapseln, die beim Benetzen aufbrechen, umfassen osmotisch zerbrechliche semipermeable membranartige Wände, in denen eine wäßrige Phase eingeschlossen ist, die den Initiator enthält Die wäßrige Phase besitzt ein relativ hohes spezifisches Gewicht, bezogen auf die zu untersuchende Probe. Wenn die Kapseln mit der Probe in Berührung kommen, tritt über die Membran ein osmotischer Gradient auf, der zu einer Zunahme des Druckes innerhalb der Kapsel führt die ausreicht um die Wände aufzubrechen und dadurch den Initiator freizusetzen.

Eine Hemmung durch Härtung oder Gelbildung kann auch mit einem Hemmsystem erreicht werden, umfassend ein Epoxid und eine desaktivierte Polyaminquelle, die bei Berührung mit Wasser verfügbare Polyamine ergibt Typische derartige Polyaminquellen sind Ketimine und Molekularsiebe, die mit Polyamin imprägniert sind. Im ersten Fall reagiert das Ketimin mit Wasser unter Bildung von Polyamin und einem Keton, im letzten Falle kann Wasser in die Struktur des Molekularsiebes eindringen und das Polyamin daraus verdrängen.

Wahlweise kann das Prüfmittel ein Polyisocyanat enthalten, das mit Wasser einen Schaum bildet

Von den Basen- oder Hydroxylionen-katalysierten Acrylathemmsystemen sind 2-Cyanoacryiatester erfindungsgemäß besonders geeignet. Diese Ester sind wesentliche Bestandteile von Klebmitteln und können in Gegenwart von Wasser leicht zu härten Polymeren polymerisieren. Die Methyl- und Äthylester sind hauptsächlich in kommerziellen Klebemitteln erhältlich, und die Klebemittel enthalten Stabilisatoren und Verdickungsmittel neben den Estern.

Polyvinylalkohol bildet in Gegenwart von Alkali, wie Natriumhydroxid, wenn er mit Borsäure vermischt wird, schnell ein Gel und ist daher als Hemmsystem geeignet. Ein bevorzugtes Verfahren zur Ausnutzung dieser Alternative besteht darin, das Alkali in Form von wasserlöslichen oder osmotisch zerbrechlichen Mikrokapseln dem Prüfmittel zuzusetzen. So kommen, wenn das Prüfmittel mit der Probe in Berührung kommt, alle Reagentien des Hemmsystems zusammen, und durch die Bildung eines Gels wird die Analyse abgebrochen.

Außer mit Borax (Borsäure und Alkali) bildet Polyvinylalkohol auch mit einer Vielzahl anderer Metallionen und Salze, wie Vanadaten, dreiwertigem Chrom und vierwertigem Titan, Gele. Zum Beispiel

machen Kaliumtitanoxalat

(TiO(C₂O₄K)₂ · 2 H₂O)

und andere organische Titanate Polyvinylalkohol bei Raumtemperatur bei einem pH-Wert oberhalb von ungefähr 7 schnell unlöslich. Außerdem bildet Polyvinylalkohol mit mehrwertigen Phenolen, wie Resorcin, Brenzcatechin, Phloroglucin und bestimmten Farbstoffen und Diazoniumsalzen thermisch reversible Gele.

Polyvinylalkohol ist erfindungsgemäß auch geeignet durch seine Fähigkeit über eine Acetalbildung mit 1,3-Bis-hydroxymethylhamstoff (Dimethylolharnstoff) und ähnlichen Verbindungen in Gegenwart von Ammoniumchlorid zu vernetzen. Wie bei vielen der vorhergehenden Systeme kann der Katalysator oder Initiator (NH₄Cl) durch Einschluß in Mikrokapseln isoliert werden.

Mehrwertige Aldehyde reagieren ebenfalls mit Polyvinylalkohol unter Bildung vor> vernetzenden Acetalgruppen. Bei diesem Verfahren wird ein saurer Katalysator, wie Oxalsäure oder eine andere Säure, die mit dem Reagenssystem verträglich ist, dem Prüfmittel zugesetzt, und der Aldehyd wird von dem Polyvinylalkohol, z. B. durch Einschluß in Mikrokapseln getrennt Natürlich kann anstelle des Aldehyds auch die Säure abgetrennt werden, vorausgesetzt, daß der Aldehyd gegenüber dem Polyvinylalkohol in Abwesenheit eines Katalysators ausreichend inaktiv ist

Polymere Präzipitate (Niederschläge) haben sich ebenfalls als erfindungsgemäßes Hemmsystem als geeignet erwiesen. Beispiele hierfür sind die Ausfällung von Polyvinylalkohol aus einer Lösung durch Salze, wie Na₂CO₃, Na₂SO₄ und K₂SO₄. Darüber hinaus können polymere Säuren, wie Polyacrylsäure, aus einer Lösung ausgefällt oder geliert werden durch Acetatsalze von Schwermetallen und andere wasserlösliche Quellen zweiwertiger Ionen sowie durch Polyäthylenglykol.

Hydroxypropylcellulose ist ein weiteres Polymer, das geeignet ist als Hemmsystem für die erfindungsgemäßen Prüfmittel. Diese Substanz kann mit sauren Polymeren, wie hydrolysierten Maleinsäureanhydridcopolymeren oder Polyacrylsäure unter Verwendung von Verbindungen, wie Dimethylolharnstoff, vorzugsweise bei einem niedrigen pH-Wert vernetzt werden.

Ein weiteres System, das ein Gel bildet und das erfindungsgemäß geeignet ist, ist Natriumcarboxymethylcellulose und Al(II I)-Ionen.

Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid-Copolymer
ist auf verschiedene Weise für die erfindungsgemäßen Prüfmittel anwendbar. Es bildet einen unlöslichen Komplex mit Polyvinylpyrrolidon bei pH-Werten unter ungefähr 5. Polyacrylsäure verhält sich ähnlich mit Polyvinylpyrrolidon. Das Copolymer bildet auch einen unlöslichen Komplex mit Gelatine in saurer Lösung. Ähnlich werden dieses Copolymer und andere Säurepolymere und Copolymere durch Verbindungen, wie Glykole, Polyvinylalkohol, Hydroxyalkylcellulose und Diamine, ausgefällt.

Hemmsysteme, die nach Ablauf einer vorherbestimmten Zeit Wärme erzeugen, sind zum Beispiel dann geeignet, wenn ein wärmeempfindliches Enzym im Reagenssystem vorliegt. So wirkt ein derartiges Enzym dann nicht, wenn die Temperatur des Systems ausreichend hoch wird, um es zu desaktivieren. Folglich kann ein Prüfmittel, das ein derartiges Enzym enthält, daran gehindert werden nach einer vorbestimmten Zeit noch eine nachweisbare Reaktion zu ergeben durch Anwendung eines wärmeentwickelnden Hemmsystems.

Ein Beispiel für ein wärmelabiles Enzym ist Salicylatdehydroxylase. Substanzen, die bei Berührung mit einer wäßrigen Probe Wärme entwickeln, sind z. B. NaOH, AICJ3, TiCIi Aluminiumalkyle und andere.
Ähnlich kann das Hemmsystem ein Gift für das Reagenssystem enthalten. Zum Beispiel werden Enzyme, die Mercaptogruppen (-SH) enthalten, durch Hg(II) desaktiviert, und Enzyme werden im allgemeinen in Gegenwart starker Säuren und Basen wie HCI und NaOH inaktiviert Beispiele für Enzyme, die durch Hg(II) gehemmt werden, sind Glutamatdecarboxylase, Lactatdehydrogenase, Malatdehydrogenase, Myokinase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase (pH 5,2), Aldehydoxidase, Diaminosäureoxidase, /J-Amylase, Kohlensäureanhydratase, Cholinesterase, «-Glucosidase, 0-Glucuronidase, Homogentisatoxidase, 3-Hydroxyanthranilatoxidase und Invertase.

Eine Möglichkeit, die Denaturierung oder Vergiftung eines Enzyms hinauszuzögern, besteht darin, das wärmeerzeugende oder das Enzym vergiftende System durch Einschluß in Mikrokapseln abzutrennen. Derartige wasserlösliche Kapselmaterialien können so ausgewählt werden, daß die wärmeerzeugenden Substanzen nicht mit der Probe in Berührung kommen bis das Kapselmaterial gelöst ist Wasserlösliche Materialien, wie Gelatine, Acrylamide, Styrol/Maleinsäure-Copolymere und Hydroxypropylcellulose sowie Gemische wie ein Coacervat, aus Gelatine und natürlichen oder synthetischen Polymeren, haben sich für die Einkapselung als geeignet erwiesen.

Wie oben gesagt, sind Mikrokapseln verschiedener Art besonders geeignet für die erfindungsgemäßen Zwecke, wenn Bestandteile zeitweilig getrennt werden müssen. Sie können nach verschiedenen bekannten Verfahren hergestellt werden. Ein Beispiel hierfür ist das Verfahren, das beschrieben ist, in Angewandte Chemie, International Edition, 14, 539 (1975) und der dort angegebenen Literatur. Verfahren, wie Grenzschichtpolykondensation, Coacervation und ähnliches, führen zur Bildung von Mikrokapseln. Andere Verfahren, wie Zentrifugieren, Sprühtrocknen und andere physikalisch-mechanische Verfahren, finden ebenfalls Anwendung zur Herstellung von Mikrokapseln.
Geeignete polymere Substanzen zur Bildung osmotisch zerbrechlicher semipermeabler Membranwände für die Mikrokapseln sind neben Polyamid, Polyester, Polyurethan, Polyharnstoff und ähnliches.

Eine andere Möglichkeit, die Bestandteile des Hemmsystems zu trennen, wenn einer der Bestandteile in Wasser und der andere in organischen Lösungsmitteln löslich ist, besteht in einem zweifachen Eintauchverfahren (»two-dip«-process). Dabei wird die Trägermatrix des Prüfmittels zunächst mit einer wäßrigen Lösung eines Bestandteils imprägniert, getrocknet und anschlie-Bend mit einer zweiten Lösung des anderen Bestandteiles in einem organischen Lösungsmittel imprägniert

Bei einigen der oben beschriebenen Hemmsysteme, bei denen keine Trennung bzw. Isolierung der Bestandteile erforderlich ist, wie denjenigen, bei denen 2-CyanoacryIate, mit Wasser schäumbare Isocyanate und Epoxidreagentien angewandt werden, muß sorgfältig darauf geachtet werden, Feuchtigkeit auszuschließen, sowohl während der Herstellung des Prüfmittels und der Vorrichtung als auch bei der Lagerung vor der Endanwendung. Dadurch wird eine Polymerisation des Hemmsystems vermieden bis zur Berührung mit der zu untersuchenden Probe.
Gelbildende oder härtende Hemmsysteme, von denen

einige typische oben angegeben sind, und das gewünschte Reagenssystem können auf irgendeine geeignete Weise zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Prüfvorrichtung in eine Trägermatrix eingebaut werden. So kann eine Trägermatrix in eine einzige Lösung aller Bestandteile des Reagenssystems und Hemmsystems getaucht werden. Wahlweise wird, wenn ein zweistufiges Eintauchverfahren zur Isolierung der Bestandteile erforderlich ist, die Matrix nacheinander eingetaucht, getrocknet und erneut eingetaucht, wie oben beschrie- ι ο ben. Wenn Mikrokapseln angewandt werden, können diese mit Hilfe von Bindemitteln an der Matrix fixiert werden. Dabei haben sich als besonders geeignet erwiesen Celluloseacetat, Celluloseacetatbutyrat, Hydroxypropylcellulose und Polyvinylpyrrolidon. Bindemittel sollten mit der zu untersuchenden Probe unmischbar sein und eine Absorption der Probe in der Träge^rmatrix nicht hindern.

Geeignete Substanzen, die als Trägermatrix für die erfindungsgemäße Vorrichtung geeignet sind, umfassen Papier, Cellulose, Holz, Vliese aus synthetischen Harzen, Glasfaser- und andere synthetische Papiere, Polypropylenfilz, Vliesstoffe und Gewebe und ähnliches. Die Matrix wird günstigerweise an einem üblichen Träger, wie einem polymeren Streifen, befestigt, um die Anwendung zu erleichtern.

Bei der Anwendung der Vorrichtung wird die Matrix, die das Reagenssystem und Hemmsystem enthält in die zu untersuchende Probe eingetaucht. Man läßt die vorherbestimmte Zeit, die der Vorrichtung entspricht, verstreichen und die Vorrichtung wird dann auf eine nachweisbare Reaktion untersucht. Wenn die Reaktion eine Farbbildung oder -änderung ist, kann die Vorrichtung mit einer Standardfarbkarte verglichen werden. Sollte bei der Reaktion eine Änderung der Lichtreflexion auftreten, wird die Vorrichtung mit einem geeigneten Lichtmeßgerät, wie es bekannt ist, untersucht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Eine Lösung von 10 Gew.-% Klebemittel, enthaltend Methyl-2-cyanoacrylat, wurde hergestellt und in einem dicht verschlossenen Glasgefäß aufbewahrt. Ein Prüfmittel zum Nachweis von Glucose in Urin wurde auf die folgende Weise hergestellt. Filterpapiere wurden mit einer Lösung eines Testreagenses wie in den US-PS 29 81606 und 3154 534 imprägniert und getrocknet. Speziell wurde die folgende Rezeptur angewandt:

Farbstoffe (FD+ C 3 + 4)	0,29 g
o-Tolidin · 2 HCI	5,0 g
Citronensäure (wasserfrei)	15,42 g
Natriumeilrat	67,92 g
Methylvinyläther/Malein-
säureanhydrid-Copolymer	7,5 g
oberflächenaktives Mittel	2,5 g
Glucoseoxidase	76,0 ml
Peroxidase	0,5 g

destilliertes Wasser	758,1 ml
Äthanol (95%)	205,0 ml
Carageenan Viscarin	2,5 g
Polyvinylpyrrolidon	25,0 g

55 Teile dieses imprägnierten Papiers wurden dann weiter mit den oben beschriebenen Lösungen imprägniert. Andere wurden als Vergleich nur mit Chloroform behandelt. Der Imprägnierbehälter erlaubte den Ein- und Austritt des Papiers, war jedoch abgedeckt, um eine Verdampfung des Chloroforms zu verhindern, während ein Überschuß an Imprägnierlösung von dem Papier in einer lösungsmittelreichen Atmosphäre innerhalb des Gefäßes ablaufen konnte. Nach Entfernung des Papiers aus dem Bad konnte das Lösungsmittel 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer Atmosphäre geregelter niedriger Feuchtigkeit (<10%RH) trocknen. Das mit dem Monomer imprägnierte Papier wurde in dunkler trockner Atmosphäre gelagert und anschließend auf einer Kunststoffunterlage befestigt und in die üblichen Reagensstreifen geschnitten. Diese Streifen wurden dann in dunklen Glasflaschen in Gegenwart von Silicagel als Feuchtigkeitsadsorbens gelagert.

Die so hergestellten Streifen wurden untersucht, indem sie einzeln 3 s in Urinproben mit bekannter Glucosekonzentration (0, 50, 100, 200 und 500 mg/dl) getaucht wurden, ein Überschuß der Probe wurde entfernt, und die Streifen wurden in eine Vorrichtung zur Reflexionsmessung gegeben. Die Ablesung der Reflexion bei 680 nm wurde als Funktion der Zeit von /= 15 s einschließlich der Eintauchzeit über 3,5 min notiert. In Tabelle i sind die Änderungen der Reflexionswerte in Intervallen und die Endreflexionswerte für das Glucose-spezifische Papier, das mit 10% Klebemittel imprägniert war, für verschiedene Glucosekonzentrationen angegeben. Die Änderung der Reflexion bei 15 s ist die Differenz gegenüber dem Reflexionswert, wenn keine Glucose vorhanden ist.

Aus diesen Werten geht hervor, daß nach 2 min keine Änderung des Reflexionswertes mehr auftritt. Diese Endfärbungen können klar visuell unterschieden werden und bleiben über Zeiträume von einigen Tagen bis zu mehreren Wochen, je nach den Lagerbedingungen stabil.

Die Teststreifen, die nur mit Chloroform imprägniert waren (Vergleich), entwickelten sehr intensive Farben 10 s nach dem Eintauchen, aber die Farbentwicklung schritt rasch voran, und nach zwei Minuten waren die Streifen schwarz, und es konnte keine Differenzierung mehr vorgenommen werden.

Tabelle

Änderung der Reflexion mit der Zeit nach Berührung mit der Probe

Glucose-	15s	40s	65 s	90s	115s	140 s	165 s	215 s	Ende
Konzen-	A%	A%	A%	A%	A%	A%	A%	A%	%R
tration	R*)	R**)	R**)	R")	R**)	R**)	R**)	R**)
(mg %)
50	6,8	8,5	3,5	0,1	0	0	0	0	59
100	13,8	13,8	5,6	2,0	0,1	0	0	0	43

Foitset/uim

ίο

Glucose-	15s	40 s	65 s	90s	115s	140 s	165 s	215s	Ende
Konzen-	Δ%	Δ%			Δ%	Δ%		Δ%	%R
tration (mg %)	R*)	R**)	R**)	R**)	R**)	R")	R**)	R**)

200	22,6	15,3	6,2	2,7	0,7	0
500	30,8	15,7	6,5	2,7	0,7	0

0 0

*) % R bei / = 15 S = % R(O _mg % Glucose)"⁰/" ^R(" mg % Glucose)· **) %R bei / = /S = %R<vorherigerr%R</>·

0 0

Beispiel 2

Vorher hergestelltes glucoseempfindliches Reagenspapier wurde wie in Beispiel 1 mit einer Chloroformlösung, enthaltend 10% Klebemittel (Äthy!-2-cyanoacrylat), 1% (GewyVol.) festes nichtionisches Detergens und 0,01% (GewVVol.) feste Dicarbonsäure, imprägniert. Die aus diesem imprägnierten Papier hergestellten Streifen zeigten Eigenschaften ähnlich denjenigen nach Beispiel 1, und die gefärbten Streifen waren besonders gleichmäßig.

Beispiel 3

Es wurde ein ketonempfindliches Reagenspapier entsprechend der US-PS 32 02 855 hergestellt durch Eintauchen von Filterpapier in das folgende erste Eintauchgemisch, Trocknen und anschließendes Eintauchen in das zweite Gemisch.

Erstes Gemisch	722 ml
H₂O
dreibasisches Natrium	202,2 g
phosphat
zweibasisches Natrium	86,7 g
phosphat (wasserfrei)	180,6 g
Aminoessigsäure
Zweites Gemisch	1,64 g
oberflächenaktive Mittel
Polyvinylpyrrolidon/	67 ml
Vinylacetat-Copolymer	8.24 g
Natriumnitroferricyanid	401 ml
Dimethylsulfoxid	350 ml
Chloroform	200 ml
Äthanol (wasserfrei)

So hergestellte Streifen wurden dann mit einer Chloroformlösung, enthaltend 10 Gew.-% Klebemittel (Äthyl-2-cyanoacrylat), wie in Beispiel 1, imprägniert Aus diesem imprägnierten Papier hergestellte Streifen, die mit Urinproben, enthaltend verschiedene Konzentrationen an Acetoessigsäure untersucht wurden, zeigten ausgezeichnete Eigenschaften bezüglich der Farbentwicklung und Farbintensitäten, die typisch waren für die Acetoessigsäurekonzentration in dem untersuchten Urin und blieben stabil.

Beispiel 4

Glucoseempfindliches Reagenspapier wurde mit einer Benzollösung von 10% Klebemittel, enthaltend Methyl^-cyanoacrylat, imprägniert. Diese Streifen zeigten bei der Untersuchung die gleichen ausgezeichneten Eigenschaften wie die Streifen der vorherigen Beispiele.

mit der folgenden

2,02 g

0,87 g 1.81g

82,4 mg

8,4 mg 8,0 mg 16,7 ml 0,9 g

Beispiel 5

Ein »one-dip«-System wurde Rezeptur hergestellt.

,₀ Reagens A

3-basisches Natriumphosphat 2-basisches wasserfreies
Natriumphosphat
Aminoessigsäure (Glycin)
Natriumnitroferricyanid

(gemahlen und getrocknet)

Reagens B

Dioctylnatriumsulfosuccinat jo oberflächenaktives Mittel
Chloroform
Polyurethanprepolymer

mischen bis alles gelöst ist

Alle Bestandteile des Reagens A wurden in einem Mörser zu einem feinen Pulver vermählen und in Reagens B suspendiert. Trockenes Whatman 3MM-FiI-terpapier (erhältlich von 3M Co, St. Paul, Minn.) wurde mit dieser Suspension imprägniert und die aus diesem imprägnierten Papier hergestellten Streifen mit Urinproben, enthaltend verschiedene Konzentrationen an Acetoessigsäure, untersucht Die Farbintensitäten der Streifen waren stabil und eine Funktion der Acetoessigsäurekonzentration in dem untersuchten Urin.

Beispiel 6

Ein Glucoseindikatorreagens und eine Enzymlösung so der folgenden Zusammensetzung wurden hergestellt;

Glucoseindikatorreagens

destilliertes Wasser 16,6 ml

Polyvinylpyrrolidon (PVP) 9,5 ml

Kaliumjodid 13 g

FD+C Mau Nr. 1 5,3 mg

Citronensäure 0,497 g

Trinatriumcitrat 2,182 g (Äthylendinitrilo)-tetra-

essigsäure-tetranatriumsalz 1,67 g Methylvinyläther-Maleinsäureanhydridcopolymer

(10%ige Lösung) 5 ml

Enzymlösung 16,7 ml

Enzymlösung

225 ml Glucoseoxidase
0,842 g Peroxidase

Alle oben angegebenen Reagentien wurden vermischt bis sie in Lösung waren. Gleiche Volumina dieser Reagensindikatorlösung, glucosehaltiger Urin und Polyurethanprepolymer wurden in die Aushöhlung einer Tüpfelplatte gegeben und mit einem Spatel vermischt ^r> bis das Gemisch zu schäumen begann (ungefähr 1 min). Das Prepolymer bildete einen gefärbten festen Schaum in 3 bis 5 min.

Das System entwickelte, wenn es mit Urin, enthaltend 0,100,250,500,1000 und 2000 mgGlucose/dl, untersucht wurde, nach einer kurzen Zeit eine stabile Farbe, und die Farbintensitäten waren ein Maß für die Konzentration an Glucose. Die Endfarben variierten von blau bis grün bis braun, je nach der Glucosekonzentration, und wurden mit Farbstandards verglichen.

Da ein Tropfen Polyurethanprepolymer ausreichend Schaum bildet, um die Vertiefung in der Tüpfelplatte auszufüllen, kann der Versuch mit einem Tropfen einer Urinprobe durchgeführt und noch visuell ausgewertet werden.

Beispiel 7

Ketonspezifisches Reagenspapier wurde gemäß der US-PS 32 12 855 hergestellt und mit einer 10%igen Chloroformlösung von einem mit Wasser schäumbaren Urethanprepolymer imprägniert. Diese Lösung kann zusätzlich irgendeines von verschiedenen ionischen Detergentien in einer Konzentration zwischen 1 und 5%, bezogen auf das Gewicht des Prepolymers, enthalten. Streifen, die aus diesem imprägnierten Papier hergestellt worden waren, wurden mit Urinproben, enthaltend unterschiedliche Mengen Acetoessigsäure, untersucht und zeigten Entfärbungen innerhalb von 2 bis 4 min. Diese Farbintensitäten waren stabil und waren klar visuell unterscheidbar und eine Funktion der Acetoessigsäurekonzentration.

Aus dem oben Gesagten geht deutlich hervor, daß die vorliegende Erfindung nicht nur auf die Herstellung von Teststreifen oder Prüfvorrichtungen vom »dip-andread«-Typ anwendbar ist, sondern auch auf andere Tests, einschließlich flüssiger Systeme.

Beispiel 8

Ein Prüfmittel zur Bestimmung von Urobilinogen in Urin wurde hergestellt indem man zunächst Whatman 3MM-Filterpapier mit dem folgenden Gemisch imprägnierte:

destilliertes Wasser 70,5 g

Methylvinyläther/Malein-

säureanhydrid-Copolymer 5,6 g

Sulfosalicylsäure	9,16 g
Coffein	7,05 g
Sulfaminsäure	1,41g
p-Dimethylaminobenzaldehyd	0,53 g
(Äthylendinitrilo)-tetra-
essigsäure-tetranatriumsalz	0,14 g
Ascorbinsäure	3,52 g
N atriumlaurylsulf at	0,70 g

Das Papier wurde dann getrocknet und weiter mit einer Lösung von 4 Gew.-% Polyvinylpyrrolidon in Chloroform imprägniert. Das entstehende Papier wurde dann getrocknet und auf Polystyrolstreifen zur Untersuchung befestigt. Die Reagensstreifen wurden untersucht durch 3 s langes Eintauchen in Urinproben mit bekannten Urobilinogenkonzentrationen (0, 4, 8 und 12 Ehrlich-Einheiten). Die Färbungen entwickelten sich innerhalb 2 min und waren typisch für die Urobilinogenkonzentration. Dieser die Zeit ausschaltende Effekt wird erreicht durch schnelle Bildung eines Komplexes von hydrolysiertem Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid-Copolymer mit Polyvinylpyrrolidon bei niedrigem pH-Wert.

Beispiel 9

Ein Streifen, der angewandt wird zum Nachweis von okkultem Blut in Urin, wurde hergestellt durch Imprägnieren von Whatman 3MM-Filterpapier mit der folgenden Lösung:

Natriumlaurylsulfat	0,84 g
Kumolhydroperoxid	1,67 g
6-Methoxychinolin	0,39 g
Natriumeitrat · 2 H₂O	1,79 g
Citronensäure	2,32 g
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin	0,45 g
Triäthanolaminborat	5,58 g
(Äthylendinitrilo)tetra-
essigsäure-tetranätriumsalz	0,06 g
Dimethylsulfon	5,58 g
Wasser	40,67 g
Dimethylformamid	40,67 g

Nach dem Trocknen wurde das Papier weiter imprägniert mit einer Lösung von 1 Gew.-% Eastman 910EM in Chloroform. Die aus diesem Papier hergestellten Streifen bildeten, wenn sie in Urinproben, enthaltend bekannte Mengen Hämoglobin (0, 0,016, 0,064, 0,16, 0,80 mg/dl), untersucht wurden, innerhalb von 2 min deutlich stabile Färbungen, deren Intensität eine Funktion der Hämoglobinkonzentration war.

Claims

Patentansprüche:

1. Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente in einer Probe mit Hilfe eines Reagenssystems, das bei Berührung mit der Probe mit dieser Komponente in Wechselwirkung tritt und zu einer feststellbaren Reaktion führt, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Hemmsystem enthält, das bei Berührung mit der Probe nach Ablauf einer vorher bestimmten Zeit härtet oder ein Gel bildet

2. Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente in einer Probe mit Hilfe eines Reagenssystems, das bei Berührung mit der Probe mit dieser Komponente in Wechselwirkung tritt und zu einer feststellbaren Reaktion führt, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Hemmsystem enthält, das bei Berührung mit der Probe nach AbJauf einer vorher bestimmten Zeit Wärme erzeugt, wobei das Reagenssystem eine wärmeempfindliche Substanz umfaßt

3. Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente in einer Probe mit Hilfe eines Reagenssystems, das bei Berührung mit der Probe mit dieser Komponente in Wechselwirkung tritt und zu einer feststellbaren Reaktion führt, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Hemmsystem enthält, das bei Berührung mit der Probe nach Ablauf einer vorher bestimmten Zeit ein Gift für das Reagenssystem darstellt.

4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das Hemmsystem einen Ester von 2-Cyanoacrylsäure umfaßt.

5. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das Hemmsystem Polyvinylalkohol umfaßt

6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Reagenssystem enthält, das zur Bestimmung von Glucose, Keton, okkultem Blut, Bilirubin, Urobilinogen, Cholesterin, Wasserstoff ionen, Protein oder Nitrit geeignet ist

7. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer Trägermatrix enthalten ist.