NL7905350A - Onderzoekinstrument voor de detectie van bilirubine; werkwijze voor de vervaardiging van het onderzoekin- strument; werkwijze voor het detecteren van bilirubine. - Google Patents

Description

Jr \ VO 1953

Miles Laboratories Inc.

Elkhart, Indiana Verenigde Staten van Amerika

Onderzoekinstrument voor de detectie van bilirubine; werkwijze voor de vervaardiging van het onderzoekinstrument; werkwijze voor het detecteren van bilirubine.

De uitvinding heeft betrekking op een onderzoekinstrument, werkwijze voor de vervaardiging daarvan en werkwijze voor het detecteren van bilirubine in serum. Meer in het bijzonder verschaft de uitvinding een preparaat, dat bij opname met een drager onder vorming van een instrument, een uniforme kleur ontwikkeling op het onderzoekinstrument mogelijk maakt.

Bij de afbraak van haem, worden in het serum galpigmenten, vooral bilirubine, gevormd die vervolgens door de lever warden verwerkt. De elke dag gevormde hoeveelheid galpigmenten is nauw verbonden met de hoeveelheid afgebroken hemoglobine en de leverfunctie.

Men schat dat 1 g hemoglobine 35 mg bilirubine oplevert. Gewoonlijk is 0,1 tot 1,5 mg bilirubine aanwezig in 100 ml menselijk plasma of serum.

, Men heeft ingezien dat de bepaling van serum bilirubine van groot belang is bij clinische studies, b.v. van leverdisfunctie.

Een werkwijze voor het kwantitatief bepalen van het bilirubinegehalte van het serum werd voor het eerst ontworpen door 7an den 3ergh door Ehrlich’s onderzoek voer bilirubine in urine toe te passen. De Ehrlich '· reactie is gebaseerd op de koppeling van geaiazoteerd sulfanilzuur (Ehrlich's diazoreagens) en bilirubine onder vorming van een rood purperen azoverbinding. Volgens de oorspronkelijke door Ehrlich beschreven werkwijze werd alcohol gebruikt cm een oplossing te verkrijgen, waarin zowel bilirubine als het diazoreagens oplosbaar waren.

Van den Bergh heeft gevonden dat door de alcohol weg te laten bij de analyse van galpigment in de menselijke gal, een normale ontwikkeling van de kleur direct plaatsvond, d.w.z. zonder toevoeging van alcohol. Deze vorm van bilirubine die zonder toevoeging van alcohol zou reageren, werd aangeduid met de tem"direct reagerend".

790 5 3 50 2 i

De toevoeging van alcohol -was echter nog steeds nodig cm hiliruhine in normaal serum te detecteren. Aan die vorm van hilirubine, die slechts kon worden gemeten na toevoeging van alcohol, werd de term "indirect reagerend" toegekend.

5 Het indirecte hiliruhine is "vrij" (niet geconjugeerd) hili rubine onderweg naar de lever vanaf de reticuloëndotheelveefsels waar het hiliruhine door de afbraak van haem porfyrinen wordt gevormd. Omdat dit hiliruhine niet in water oplosbaar is, is de toevoeging van alcohol nodig cm de koppeling met het diazoreagens op 10 gang te brengen. In de lever wordt het vrije hiliruhine geconjugeerd met glucuronzuur. Geconjugeerd hiliruhine dat in water oplosbaar is, kan direct met het diazoreagens reageren, dus het directe hiliruhine van Van den Bergh is feitelijk een bilirubineconjugaat. (hiliruhine glucuronide).

15 Andere sulfonzuren dan sulfanilzuur zijn aanvaardbaar ge bleken in de beschreven diazokoppelingsreactie. Dergelijke sulfonzuren omvatten paratolueensulfonzuur, sulfosalicylzuur, sulfonzuur en hexaminezuur. Zie h.v. het Amerikaanse octrooischrift 3-505.001.

Ook is bekend dat andere stoffen naast alcohol dezelfde 20 invloed vertonen, d.w.z. de versterking van de diazokqppeling van vrij hiliruhine, waardoor een meting van indirect, derhalve totaal hiliruhine mogelijk wordt gemaakt. Deze stoffen worden versnellers genoemd en omvatten caffeine, dyfylline, natriumacetaat, natrium-henzoaat, arabische gom en andere verbindingen. Verwezen wordt naar 25 Henry, R.J., Clinical Chemistry, Principles and Technics, 2e ed. Harper and How, hlz. 101+7 (197^); With, T.K., Bile Pigments,

Academic Press, hlz. 321+-327 (1968); en het Amerikaanse octrooischrift I+.O38.O31.

Onderzoekinstrumenten voor de bepaling van hiliruhine, h.v.

30 in stripformaat, welke gebruik maken van de diazokoppelingsreactie, zijn bekend. Zie h.v. de bovenstaand vermelde octrooischriften alsmede de Amerikaanse octrooi schriften 3.853.1+76; 3.880.588; 3-912.1+57; I+.069.OI6 en li-.069.017. Deze instrumenten dienen een nuttig doel in de clinische diagnose.

35 Men heeft echter ingezien, dat deze bekende instrumenten 790 5 3 50 3 ir Λ het nadeel hebben, dat ze semmmonsters niet op een uniforme wijze absorberen. De kleur, welke gevormd wordt op de plaats waar het monster wordt aangehracht, is zeer intens, terwijl zeer weinig of geen kleur ontwikkeld wordt aan de ontrek van deze plaats. Deze 5 niet uniformiteit is een zeer ongewenste eigenschap, omdat een uniforme kleur ontwikkeling nodig is om de voor een kwantitatief onderzoek vereiste precisie te "bereiken.

Dit probleem van bekende instrumenten is volgens de uitvinding ingezien en qpgelost, zoals onderstaand volledig zal worden 10 uiteengezet.

Men heeft nu gevonden, dat een onder zoekinstrument voor het detecteren van biiirubine in serum, dat een drager omvat alsmede een daarmee opgencmen preparaat, dat een diazoniumzout, p-tolueen-sulfonzuur en dyfylline bevat, niet de ongewenste eigenschap van 15 niet uniforme kleurontwikkeling bij reactie met een onderzcekmonster bezit. De aanwezigheid van biiirubine in een serummonster wordt gedetecteerd door een werkwijze, waarbij het instrument volgens de uitvinding in contact wordt gebracht met het te onderzoeken monster en een eventuele colorimetrische responsie wordt waargenomen.

20 Het onderzoekinstrument wordt vervaardigd volgens een werkwijze, waarbij b.v. door verzadiging met een impregneringsoplossing, een drager wordt voorzien van een preparaat, zoals bovenstaand beschreven.

De thans overwonnen problemen van niet uniformiteit waren, naar men nu aanneemt, een resultaat van serumeiwitprecipitatie 25 in de bekende onderzoekinstrumenten. Het gaat hier echter slechts cm een theorie, waaraan de uitvinding niet meet werden opgehangen.

niettegenstaande het vermogen van p-tolueensulfcnzuur cm een voldoende lage pH te geven voor het stabiliseren van de diazo-niumverbinding, is het nu mogelijk cm onder toepassing van het on-30 derzoekinstrument van de uitvinding een uniforme kleur ontwikke lang in resuensie op serum biiirubine te verkrijgen. Als resultaat kunnen in hoge mate kwantitatieve instrumentale reflectievermogen-waarden overeenkomstig de bilirabineconcentratie worden verkregen, onafhankelijk van de plaats waar het serummonster op het onderzoek -35 instrument wordt aangebracht.

790 53 50 * k

In de volgende beschrijving gebruikte specifieke termen verwijzen slechts naar de bijzondere uitvoeringsvormen, welke ter illustratie van de uitvinding zijn gegeven.

Voor de detectie van serum bilirubine ontworpen onderzoek-5 instrumenten kunnen van elk aromatisch diazoniumzout gebruik maken, dat uitsluitend of in hoofdzaak electronen-aantrekkende groepen bevat. In de benzeenreeks kunnen b.v. de substituenten nitrogroepen, halogeen-atomen, carboxylgroepen, sulfonzuurresten, nitrilegroepen of quater-naire ammoniumgroepen zijn. Electronen-stuwende groepen, b.v.

10 alkoxygroepen, kunnen eveneens in beperkte mate aanwezig zijn.

Voorts kunnen ook gediazoteerde naftylamine en benzidinederivaten worden toegepast. Minder geschikt zijn benzeen-diazoniumzouten, die uitsluitend electronen-stuwende groepen, bevatten, b.v. alkoxy-, alkyl- of arylaminogroepen, omdat deze betrekkelijk langzaam met 15 bilirubine reageren.

Dergelijke diazoniumzouten kunnen direct worden toegevoegd of ter plaatse worden gevormd door de reactie van leden van de aniline-reeks met een nitriet, zoals in het voorbeeld is aangetoond. Of het diazoniumzout nu direct als het zout zelf wordt toegevoegd of ter 20 plaatse wordt gevormd, hebben de diazoniumzouten van gesubstitueerde en niet gesubstitueerde halogeenbenzenen, in het bijzonder 2,4— dichloorbenzeen, de voorkeur. Ook hebben diazoniumzouten van nitro gesubstitueerde benzenen, b.v, p-nitrobenzeendiazoniumtetrafluor-boraat de voorkeur.

25 De diazoniumzouten zijn in de impregnerings oplos sing aanwezig in concentraties van ongeveer 0,02 g/dl tot ongeveer 2,0 g/dl, bij voorkeur van ongeveer 0,05 g/dl tot ongeveer 0,5 g/dl. Het p-tolueensulfonzuur wordt in de impregneringsoplossing toegepast in concentraties van ongeveer 0,5 g/dl tot ongeveer 10,0 g/dl en bij 30 voorkeur van 1,0 g/dl tot ongeveer 6,0 g/dl. Het dyfylline wordt in de impregneringsoplossing toegepast in concentraties van ongeveer 6,0 g/dl tot ongeveer 1^,0 g/dl, bij voorkeur van ongeveer 8,' g/dl tot ongeveer 12,0 g/dl. Het bij de bereiding van de impregnerings-oplossingen toegepaste oplosmiddel kan water, fysiologische oplos-35 singen, geschikte organische oplosmiddelen of mengsels daarvan zijn.

790 5 3 50 ψ· -·, * 5

Verschillende extra componenten kunnen desgewenst worden toegevoegd.

Deze kunnen b.v. zijn Gantrez AN-139 (een copolymeer van methylvinyl-ether en malexne zuur anhydride van GAF Corp., Chemical Products, N.Y., N.I.). De reactie wordt hij voorkeur uitgevoerd hij een be-5 trekkelijk zure pH, b.v. van ongeveer 1 tot ongeveer 5·

Gnderzoekinstrumenten volgens de uitvinding worden vervaardigd volgens een werkwijze, waarbij een drager, b.v. een opzuigende matrix, wordt gecombineerd met het onderzoekpreparaat. Wanneer deze opname wordt gerealiseerd door verzadiging met een impregneringsoplossing, 10 zoals bovenstaand is beschreven, van het preparaat, wordt de aldus ge ïmpregneerde drager vervolgens gedroogd. Behalve impregnering, kunnen de instrumenten volgens de uitvinding ook volgens elke andere geschikte techniek worden vervaardigd, b.v. door drukken of sproeien van het preparaat cp een substraat of matrix.

15 De term drager slaat op cpzuigende en niet opzuigende matrices, die onoplosbaar in water of fysiologische vloeistoffen zijn en bij blootstelling daaraan hun. structurele integriteit behouden. Geschikte opzuigende matinees die gebruikt kunnen werden, zijn papier, cellulose, hout, synthetische harsvliezen, glasvezel, geweven en niet geweven 20 weefsels e.d. Niet opzuigende matrices zijn organoplastische materialen zoals polypr opeen e.d. Wanneer een op zuigende matrix gebruikt wordt, wordt de matrix bij voorkeur met geschikte middelen, b.v. dubbelzijdig plakband, bevestigd aan een onoplosbaar draagorgaan, b.v. een organoplastische strip, b.v. polystyreen, voor een gemakkelijk ge-25 bruik.

Het onderzoekinstrument wordt bij voorkeur gebruikt door een kleine hoeveelheid van een onderzoekmenster daarop te druppelen of door anderszins een onderzoekmonster in de dragermatrix te brengen, waardoor een detecteerbare kleurverandering wordt verkregen 3C wanneer hiiirubine aanwezig is. Het onderzoekinstrument kan zowel bij onderzoek bij monsters van plasma als bij monsters van serum op dezelfde wijze worden gebruikt.

De instrumenten kunnen na de reactie met het oog worden afgelezen, maar voor een meer nauwkeurige bepaling van de gedecteerde 35 bilirubineccncentratie, werden colorimetrische bepalingen van de 790 5 3 50 - '*· • · 6 instrumenten na de reactie gedaan met een reflectievermogenspectro-fotcmeter. Reflectievermogenbepalingen kunnen worden verkregen met in de handel verkrijgbare spectrofotameters, b.v. een Beekman DK-2 spectrofotcmëter, Beckmann Instruments, Inc., Fullerton, 5 Californië 9263^· of spectrocolorimeter SCF-1, Israel Electro-

Optical. Industrie Ltd. (in de Verenigde Staten verkocht door Brocmer Research Corporation, Flainwell, Long Island, N.T. 11803).

Ter toelichting wordt onderstaand een voorbeeld gegeven, waarin door een deskundige verschillende substituties en wijzigingen kunnen 10 worden aangebracht, welke binnen de uitvinding vallen.

Voorbeeld

In dit voorbeelden werden instrumenten, bereid, volgens, de uitvinding, en. instrumenten, die andere combinaties van reagentia bevatten, met elkaar vergeleken op uniformiteit van de kleuront-15 wikkeling en derhalve betrouwbaarheid van. de verkregen bilirubine- concentratiegegevens.

Zes verschillende impregneringsoplossingen werden bereid onder normale laboratoriumomstandigheden in een oplosmiddel van *4-5,0 ml gedestilleerd water en 5S0 ml van een 10 g/dl oplossing 20 Gantrez AN-139 volgens de in tabel A gegeven samenstellingen.

Het p-tolueensulfonzuur en het sulfosalicylzuur werden verkregen van Eastman Organic Chemicals, Rochester, N.Y. 1*4-650. Hexaminezuur werd verkregen bij Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois.

Het dinatrium-1,5-naftaleendisulfonzuur; 2, L-dichlooraniline; 25 en natriumnitriet waren standaardstoffen van reagenskwaliteit.

Dyfylline en caffeine werden verkregen bij Aldrich Chemical Co.,

Inc. , Milwaukee, Wisconsin 53233.

30 35 790 5 3 50 τ so

la bO

60 bO bO t~ mo fc, ο o m ο h I cn 1 i la ο ο o

bO

la bD

60 bO W t- „ (=3 m g w ο o m ο h

A A AAA

I m i ia i ο ο ο bo

la bO

60 bo bd ία mo w is\ o m ο h A Λ Λ Λ Λ

ΡΠ I 1 I IA ‘O O O

bO

LA bD

bO bO bO t—

O m O

03 o m O 1-4

A A A A A

l 1 CJ LA ! o O o 60

LA bO

< 60 M ^ O

a la On m o^ Η S m i i itl i o o o c3

bO

tA bO

<- 60 bO bO C— ^ m o co o m o h

A A A A A

I i CJ l LA o o o

It 3 § §

<H

r4 <-< Γ-» m r-f

S

<u <u r-i

U CÖ <U

3 -PC

3 4-t «Η

1*23 CÖ H

3 o I C -P

3 q-i la to o S :—> S-t £—! ? fc ·η -Hi *>, zi ZS cH 0 w

•i) t O £ CQ i ° "T

-P ! ·η « 3 aj S "2 I

a r-i a? a? <u 3 3 -- a 0J| S3 C U « ή *ri O S ! — I m ·ι— 3 >!-i r-i1 m ·—i —i ·

O CS^air-i+JO-H I

a in 3 o 5-i ο I m o I 3 o I d i>i ·!-· ^ 3 ο ! M/CaC O'C—'-' j

! I

‘I ' 790 53 50 8

De reagentia omvatten 2,^-dichlooraniline en natriumnitriet, die ter plaatse in de impregneringsoplossing reageren onder vorming van een 2,k-dichloorbenzeendiazoniumzout, in dit geval 2-A-dichloor-benzeendiazonium-l,5-aaftaleendisulfonaat.

5 De oplossing met samenstelling A werd. toegepast voor het ver vaardigen van instrumenten volgens de uitvinding. De oplossingen met de samenstellingen B-F werden toegepast voor het vervaardigen van andere instrumenten ter vergelijking. Het bleek onmiddellijk, dat de samenstellingen C en E, die caffeine met p-tolueensulfonzuur 10 resp. hexaminezuur combineerden, niet in oplossing gingen, en daarom niet eens goed in de toegepaste papiermatrices konden worden geïmpregneerd.

Afzonderlijke vellen van Eaton-Dikeman 205 filtreerpapier (Eaton-Dikeman, Mount Holly Springs, Pa. 17065) ver den tot verzadi-15 ging geïmpregneerd, elk met een van de resterende impregnerings- oplossingen die bovenstaand zijn geïdentificeerd. De aldus geïmpregneerde vellen werden in een standaardlaboratoriumoven op 60°C gebracht tot ze droog waren. Deze papiervellen, die het gedroogde residu van de verschillende impregneringsoplossingen be-20 vatten, werden vervolgens teneinde instrumenten te vormen, gesneden tot vierkante stukjes van 2,5 mm bij 2,5 mm. De instrumenten werden vervolgens ondersteund door dubbelzijdig plakband en daaimee aan kunststof draagorganen bevestigd. De vervaardigde instrumenten, welke preparaten met de samenstellingen A, B, D en F bevatten, worden 25 verder aangeduid als instrumenten A, B, D en F.

Serummonsters, waarvan bij vooronderzoek was gebleken dat zij 1 mg/dl bilirubine bevatten, werden vervolgens in hoeveelheden van ongeveer 30 p.1 op verschillende plaatsen (centraal en aan de omtrek) op elk van de vervaardigde instrumenten aangebracht. De chromogene 30 responsie werd bepaald door reflectievermogenspectrofotametrie.

Het procentuele reflectievermogen (#R) werd bepaald bij een golflengte van 560 run en wel 90 seconden na de aanbrenging van de monsters. De bij deze proef verkregen resultaten zijn als $R-waarden in tabel B aangegeven.

35 790 5 3 50 *

* - Q

_Tabel B

plaats van bet monster A B C D Ξ F

centraal ^9,5 Vr,0 - ^8,8 5 aan de ontrek ^9,8 56*5 - 58,2

Het faB. van instrument F bij $60 nm was 20 verwaarloosbaar klein, dat het niet kon worden bepaald. Het kon echter wel worden bepaald bij ïj-50 nm, het reflectievermogen minimum, maar metingen bij 10 deze golflengte varieerden afhankelijk van de kleur van het serum, zelf en waren derhalve onbetrouwbaar.

De weergegeven resultaten tonen een /SR-ver schil van 0,3 bij de preparaten met samenstelling A bevattende instrumenten tussen de monsters die centraal waren aangebracht en die welke aan de omtrek 15 waren aangebracht. Dit verschil bedroeg bij preparaten met samen stelling B bevattende instrumenten 9,5· Het verschil in uniformiteit van bepaling bij instrument A vergeleken met de niet uniformiteit van de bepaling in instrument B, bedroeg bij deze vergelijking een verhouding van 1:31,7. Het %R-verschil bij preparaten met samen-20 stelling D bevattende instrumenten tussen monsters die centraal waren aangebracht en monsters die aan de amtrek waren aangebracht, bedroeg 11, U. Het verschil in uniformiteit van de bepaling bij instrument A vergeleken met de niet uniformiteit van de bepaling in instrument D bedroeg een verhouding van 1:38. Zoals bovenstaand opgemerkt, konden 25 bij instrumenten met preparaten van de samenstellingen C en E niet eens resultaten worden verkregen, aadat de impregneringsoplossingen niet eens konden worden bereid.

De /iH-bepaiingen van tabel B voor de verschillende instrumenten werden wiskundig geëxtrapoleerd tot biürubineconcentraties, die uit-30 gedrukt waren in mg/dl. De ^R-waarden, die voor instrument A zijn aangegeven, stemden zeer goed overeen en wezen beide op een bili-rubinebepaling bij een concentratie van 1,0 mg/dl, derhalve precies de vooraf bepaalde waarde. De $R-waarden voor instrument B, ^7,0 en 56,5, wezen cp 1,0 mg/dl (nauwkeurig voor het instrument met de 35 samenstelling 3) en een foutieve negatieve bepaling (O mg/dl).

790 5 3 50 10

V · V

De $R-waarden voor instrument D gaven resp. 1,0 mg/dl en 0 mg/dl. Zoals "bij instrument B werd een aanzienlijke variatie in de. gedetecteerde bilirubineconcentratie waargenomen, afhankelijk van de plaats waar het serum op het instrument was aangebracht, 5 De bovenstaand beschreven en geanalyseerde proefresultaten laten duidelijk zien, dat de kleurontwikkeling veel uniformer is en derhalve clinische gegevens veel nauwkeuriger zijn, wanneer voor de bepaling gebruik wordt gemaakt van een instrument volgens de uitvinding.

10 Het is duidelijk dat verschillende veranderingen kunnen worden aangebracht in de beschreven uitvoeringsvormen, zonder dat daarmede de uitvinding wordt verlaten.

790 5 3 50

Claims (8)

1. Een onder zoekinstrument voor de “bepaling van bilirubine in een serummonster, met het kenmerk, dat het instrument een drager en daarmee opgenomen een preparaat omvat, welke preparaat een diazonium-zcut, . p-tolueensulfonzuur en dyfyiline hevat.

2. Instrument volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het diazcniumzcut een halogeenbenzeendiazoniumzout is.

3. Instrument volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het diazoniumzout 2,U-dichloorbenzeendiazonium-l,5-naftaleendisulfoaaat is. 10 k. Instrument volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het dia zoniumzout een p-nitrohenzeendiazoniumzout is.

5. Instrument volgens conclusie k, met het kenmerk, dathet p-nitrobenzeendiazoniumzout p-nitrobenzeendiazoniumtetrafluorboraat is.

6. Onder zoekinstrument voor de bepaling van bilirubine in een 15 serummmonster, met het kenmerk, dat dit instrument een drager omvat alsmede een daarmee opgenomen preparaat, dat p-tolueensulf onzuur; dyfyiline; dxnatrium-1,5-naftaleendisulfonzuur; 2, U-di chloor aniline; en natriumnitriet bevat.

7. Werkwijze voor het vervaardigen van het onderzoekinstrument met /het kenmerk 20 volgens conclusie ij dat men een drager in contact brengt met een preparaat dat een diazoniumzout,p-tolueensulfonzuur en dyfyiline bevat.

3. Werkwijze voor het vervaardigen van het onderzoekinstrument volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men een drager in contact 25 brengt met een preparaat, dat p-tolueensulfonzuur; dyfyiline; dinatrium-i,5-naftaleendisulfonzuur; 2,U-dichlooraniline; en natrium!triet bevat.

9. Werkwijze voor het detecteren van bilirubine in een serummonster, met het kenmerk, dat men het instrument volgens conclusie 1 30 in contact brengt met het monster en een eventuele resulterende cciorimetrische responsie waarneemt. 1G. Werkwijze voor het detecteren van bilirubine in een serummonster, met het kenmerk, dat men het instrument volgens conclusie 6 in contact brengt met het monster en een eventuele resulterende cciorimetrische responsie waarneemt. 790 53 50