DE2521402B2

DE2521402B2 - Diagnostisches mittel zum nachweis von urobilinogen

Info

Publication number: DE2521402B2
Application number: DE19752521402
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dipl.-Chem. Dr. 3O51Luthe Hirsch
Original assignee: Riedel de Haen AG
Current assignee: Honeywell Riedel de Haen AG
Priority date: 1975-05-14
Filing date: 1975-05-14
Publication date: 1977-03-03
Also published as: NL7604922A; DE2521402C3; IT1063099B; FR2311303A1; ATA349576A; GB1540448A; US3989462A; CA1054032A; FR2311303B1; JPS52493A; AT345476B; BE841864A; DE2521402A1

Description

Es ist bereits bekannt, Urobilinogen mit einer Lösung von Di'.nethylaminobenzaldehyd in Salzsäure nachzuweisen. Dieser Nachweis, als Ehrlichreaktion bekannt, hat im Laufe der Zeit, obwohl er nicht sehr spezifisch ist, in der medizinischen Diagnostik erheblich an Bedeutung gewonnen. Der Nachweis von Urobilinogen in Urin gilt mittlerweile als Standardmethode für die Diagnose von Leber- und Gallenerkrankungen.

Im Rahmen der verbreiteten Anwendung von Schnelldiagpostika sind seit einiger Zeit auch Testpapiere zum Nachweis von Urobilinogen auf der Basis der Ehrlich-Reaktion entwickelt worden. Diese Papiere besitzen naturgemäß die Unspezifität der Ehrlich-Probe und haben zudem noch den Nachteil, daß die Farbreaktion sich sehr langsam entwickelt.

Bereits 1907 (Dissertation Karl Thomas, Freiburg) wurde beschrieben, daß Urobilinogen auch mit diazotierten Aminen reagiert. Diese sogenannte gelbe Diazoreaktion hat aber in der Folgezeit keinen Eingang in das ärztliche Labor gefunden.

In neuerer Zeit (DT-PS 21 30 559, DT-OS 22 29 611, DT-OS 23 64 844) sind jedoch Testpapiere zum Nachweis von Urobilinogen in Flüssigkeiten beschrieben worden, die auf der Diazoreaktion beruhen. Als Reagenzien werden aromatisch substituierte bzw. anellierte stabile Phenyl-, Pyrrol- und Pyrazoldiazoniumsaize beschrieben (DT-OS 22 29 611) oder auch substituierte Benzidinderivate verwendet (DT-OS 23 64 844). In einem anderen Patent (DT-PS 21 30 559) wird die Verwendung stabiler Benzodiazoniumsalze beschrieben, die in o- oder p-Stellung mindestens eine mehratomige mesomeriefähige Elektronendonatorgruppe enthalten, wobei die Summe der Hamettschen

!o Sigmawerte aller Substituenten den Wert 0,4 nicht überschreiten darf.

Die auf der Diazoreaktion beruhenden Testpapiere sind im allgemeinen weniger störungsanfällig als die auf der Ehrlich-Reaktion beruhenden Papiere. Sie zeigen

aber häufig auch noch mit Bilirubin, einem ebenfalls bei Gallen- und Lebererkrankungen im Urin auftretenden Gallenfarbstoff eine Reaktion.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Verbindungen der allgemeinen Formel

in welchen X- ein stabilisierendes Anion bedeutet, für den Nachweis an Urobilinogen ausgezeichnet brauchbar sind und empfindliche und spezifische Reagenzien auf Urobilinogen darstellen, obwohl die Summe der Hamettschen Sigmawerte aller Substituenten 0,77 beträgt. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I reagieren nicht mit Bilirubin.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die im Patentanspruch 1 angegebene Verwendung.

Das stabilisierende Anion der Verbindungen der Formel I kann ein Chlorid-, Sulfat-, Tetrafluoroborat-, Hexafluorantimonat-, Hexafluorantimonsulfonat-, Trifluormethylsulfonat-, Arylsulfonat- oder Carbonsäurerest sein.

Diazoniumsalze der Formel 1 sind gegebenenfalls in Verbindung mit einer oder mehreren festen Säuren und/oder einem Stabilisator und/oder einem Netzmittel und/oder einem optischen Aufheller als diagnostische Mittel zum Nachweis von Urobilinogen insbesondere für die Verwendung auf einem saugfähigen Träger brauchbar.

Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen reagieren mit Urobilinogen innerhalb weniger Sekunden zu roten Farbstoffen. Die Farbreaktion wird durch die natürlichen Harninhaltsstoffe wie z. B. Harnindikan und Harnstoff nicht gestört. Auch mit Bilirubin reagieren die erfindungsgemäßen Diazoniumverbindungen nicht, so daß bei gleichzeitigem Vorhandensein von Bilirubin und Urobilinogen das Letztere spezifisch nachgewiesen werden kann.
Das ist um so erstaunlicher als in der DT-AS 21 30 559, Spalte 4, Zeilen 29—29, der Hinweis gegeben wird, daß zur Unterdrückung der Reaktion mit Bilirubin als Indikator ein Diazoniumsalz relativ niedriger Elektrophilie zu verwenden ist. Demgegenüber wird hier mit einer Diazoniumverbindung relativ hoher Elektrophilie eine große Spezifität bei gleichzeitiger Anwesenheit beider Inhaltsstoffe erreicht.

Vorzugsweise werden die Verbindungen der Formel I zur Herstellung von Testpapieren verwendet Sie

werden zu diesem Zweck mit einer Säure und gegebenenfalls mit Zusatzstoffen wie Stabilisatoren, Netzmittel und Aufbelllern auf einen saugfähigen Träger aufgebracht.

Im folgenden wird zur näheren Erläuterung der Erfindung die Herstellung solcher Testpapiere beispielsweise beschrieben:

Zur Herstellung wird ein saugfähiger Träger vorzugsweise Papier oder Polyestervlies mit einer Lösung der o.g. Reagenzien in einem Gemisch aus einem organischen mit Wasser mischbaren Lösungsmittel und Wasser getränkt und anschließend in bewegter Luft zwischen 0 und 80⁰C getrocknet

Die Diazonhimverbindung der Formel I, die in Mengen von 0,02 bis 2 g vorzugsweise 0,1 bis 0,5 g/100 ml der Tränklösung zugesetzt wird, kann nach den üblichen Verfahren der Diazochemie hergestellt werden oder wird in der Tränklösung aus dem entsprechenden aromatischen Amin nach in der Diazochemie bekannten Verfahren erzeugt

Als feste Säuren, die in Mengen von 1 bis 30 g, vorzugsweise 5 bis 50 g/100 ml, der Tränklösung zugesetzt werden, kommen organische aromatische und aliphatische Carbon- bzw. Sulfonsäuren allein oder in Mischung auch mit anorganischen Säuren in Betracht Stabilisatoren wie Naphthalin(l,5)disulfonsäure-Dinatriumsalz bzw. Natriumlaurylsulfat sind aus der Diazochemie hinlänglich bekannt Sie können in Mengen von 1 bis 10 g, vorzugsweise 1 bis 7 g/100 ml, der Tränklösung zugesetzt werden.

Netzmittel wie Dodecylbenzolsulfonsäure oder Natriumlaurylsulfat können in Mengen von 0,1 bis 5 g, vorzugsweise 0,5 bis 1 g/100 ml der Tränklösung zugesetzt werden.

Optische Aufheller, die eine Verbesserung der Ablesbarkeit ergeben, können in Mengen von 0,01 bis 5 g, vorzugsweise 0,1 bis 2 g/100 ml, der TrSnklösung zugegeben werden. In Betracht kommen hierfür handelsübliche Stilben-Derivate.

Als Lösungsmittel kommt Wasser in Verbindung mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem niederen Alkohol, z. B. Methanol, in Betracht wobei das Verhältnis Wasser zu Lösungsmittel nicht kritisch ist sondern lediglich von der Löslichkeit der Komponenten bestimmt wird.

Als saugfähige Träger können Filterpapiere, aber auch Vliese aus Polyamid bzw. Polyester oder anderen säurebeständigen Kunststoffen in Frage kommen. Das Material des saugfähigen Trägers ist aber nicht kritisch. Auch andere Materialien, die in der Lage sind die Tränklösung aufzunehmen, können verwendet werden. Die einzelnen Bestandteile der Rezeptur können selbstverständlich auch nacheinander auf den Träger aufgebracht werden, wenn die Löslichkeit oder besondere Umstände es erfordern sollten.

Die Verbindungen der Formel I können auch für einen Nachweis in Lösung verwendet werden. Man stellt sich dann nach der o. g. Vorschrift eine Lösung her, in die zweckmäßigerweise die Untersuchungslösung eingetropft wird. In diesem Fall ist die Verwendung eines optischen Aufhellers nicht nötig. Die Ablesung wird entweder in Vergleich mit einer Farbtafel oder mit einem Spektralphotometer durchgeführt

Die nach der oben beschriebenen Methode hergestellten diagnostischen Mittel werden kurz in die zu untersuchende Flüssigkeit eingetaucht Nach wenigen Sekunden kann man den Farbumschlag, gegebenenfalls durch Vergleich mit einer Farbskala ablesen.

Durch die folgenden speziellen Beispiele wird die S Erfindung noch näher erläutert:

Filterpapier Schleicher & Schüll 2316 wird mit je einer der Lösungen folgender Zusammensetzung (BeispieJ 1—3) getränkt und bei Raumtemperatur getrocknet

4-Fluor-3-nitrobenzol-
diazoniumfluorobo-
rat

Methanol
SulfosalicyJsäure
Wasser

Beispiel 1

Ig 10 ml

2g

ca. 100 ml

Das Testnapier zeigt nach Eintauchen in urobilinogenhaltigen Urin innerhalb von 10—15 Sek. eine rote Farbe.

Beispiel 2	0.1g
4-Fluor-3-nitrobenzoldiazoniumsalz	10 ml
Methanol	10g
meta-Phosphorsäure	3g
Citronensäure-1 -hydrat	1g
Dodecylbenzolsulfonsäure	ca. 100ml
Wasser

Als Diazoniumsalze werden verwendet: 4-Fluor-3-nitrobenzoldiazoniumtetrafluoroborat.-trifluormethylsulfonat und -Hexafluoroantimonsulfonat

Alle nach diesem Beispiel hergestellten Testpapiere zeigen 0,5 mg Urobilinogen/100 ml Lösung an und geben mit urobilinogenhaltigem Urin eine rote Färbung.

Beispiel 3

4-Fluor-3-nitrobenzoldiazonium-	0,1 g
tetrafluoroborat	10 ml
Methanol	3g
Citronensäure-1-hydrat	10g
45 meta-Phosphorsäure
Naphthalin 1,5)disulfonsaure-	ig
dinatriumsalz	ig
Dodecylbenzolsulfonsäure
Aufheller	ig
50 (handelsübliches Stilben-Derivat)	ca. 100 ml
Wasser

Ein nach diesem Beispiel hergestelltes Testpapier zeigt nach Eintauchen in normalen Urin abhängig von seinem Urobilinogengehalt eine schwach rosa Färbung. Mit stark urobilinogenhaltigem Urin ergeben sich rote bis tiefrote Färbungen.

Die gleichen Färbungen werden erhalten, wenn den Urinproben vor dem Test jeweils 10 mg Bilirubin pro 100 ml Lösung zugesetzt werden. Dagegen zeigt das Testmittel mit urobilinogenfreiem, aber bilirubinhaltigem Urin innerhalb vergleichbarer Zeit keine Farbreaktion. Während noch nach fünf Minuten keine Färbung zu beobachten ist, tritt erst nach 10 Minuten eine Grünfärbung auf.

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung der Verbindung I

N=N⁺X-

NO₂

in welcher X- ein stabilisierendes Anion bedeutet, für den Nachweis von Urobilinogenin Flüssigkeiten, vorzugsweise in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere im Urin.
2. Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch I, in welchen X~ einen Chlorid-, Sulfat-, Tetrafluoroborat-, Hexafluoroantimonat-, Hexafluoroantimonsulfonat-, Trifluormethylsulfonat-, Arylsulfonat- oder Carbonsäurerest bedeutet für den Nachweis von Urobilinogen.
3. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Urobilinogen, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Diazoniumsalz gemäß Anspruch 1 bzw. 2, eine oder mehrere fdste Säuren und gegebenenfalls ein Netzmittel sowie einen oder mehrere Stabilisatoren enthält.
4. Mittel gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Diazoniumsalz 4-Fluor-3-nitrobenzoldiazoniumtetrafluoroborat, als Säure ein Gemisch aus Metaphosphorsäure und Zitronensäure, als Netzmittel Dodecylbenzolsulfonsäure und als Stabilisator Naphthalin(1,5)disulfonsäuredinatriumsalz sowie gegebenenfalls einen optischen Aufheller enthält.
5. Mittel gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einem saugfähigen Träger imprägniert ist.