DE2803955C3

DE2803955C3 - Prüfmittel zur Bestimmung einer peroxidativ wirkenden Substanz in einer Probe

Info

Publication number: DE2803955C3
Application number: DE2803955A
Authority: DE
Inventors: Charles Tak Wai Elkhart Ind. Lam
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1977-03-14
Filing date: 1978-01-30
Publication date: 1981-04-23
Also published as: AU3279478A; DE2803955A1; GB1552747A; IT1104148B; CA1098808A; FR2384261B1; DE2857298C2; JPS53115288A; BR7800603A; SE7801164L; JPS6122780B2; IT7847859A0; DE2803955B2; FR2384261A1; HU177004B; SE430104B; IN148528B; AR220329A1

Description

(CHj)_--O

(CH₂),, — O

N-(CH₂),

in der m, π und ρ gleich oder verschieden sein können und jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 4 bedeuten.

2. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Gehalt an einem Verdünnungsmittel der Formel

•0

R₁-S-R₂
O

R₁-C

NR₁R₂

wobei Ri und R2 gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe bedeuten, oder einem Gemisch dieser Substanzen.

3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verdünnungsmittel Dimethylsulfoxid, Dimethylsulfon, Ν,Ν-Dimethylformamid, Benzylsulfoxid, 4-Chlorphenylsulfon und/oder 4-Fluor-3-nitrophenylsulfon ist.

4. Mittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Boratester Trimethanolaminborat, Triäthanolaminborat und/oder Tri(npropanol)aminborat ist.

5. Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Hydroperoxid tert.-Butylhydroperoxid, Cumolhydroperoxid, Diisopropylbenzol-hydroperoxid, 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid und/oder Paramenthanhydroperoxid ist.

6. Mittel nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator Benzidin, o-Tolidin, 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin und/oder 2,7-Diaminofluorin ist.

7. Mittel nach Anspruch
gekennzeichnet, daß es in einer
enthalten ist

S. Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger saugfähiges Papier ist

9. Verfahren zur Bestimmung einer peroxidativ wirksamen Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Probe mit einem Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 8 zusammenbringt und die auftretende nachweisbare Reaktion beobachtet.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Prüfmittel zur Bestimmung einer peroxidativ wirksamen Substanz in einer Probe, umfassend ein organisches Hydroperoxid und einen Indikator, der in Gegenwart des Hydroperoxids und einer peroxidativ wirksamen Substanz eine nachweisbare Reaktion ergibt.

Es sind zur Zeit zahlreiche Verfahren bekannt zum Nachweis des Vorhandenseins von peroxidativ wirksamen Substanzen in Proben wie Urin, Fäkalsuspensionen und Magen- und Darminhalt. Hämoglobin und dessen Derivate sind typische derartige »peroxidativ wirksame« Substanzen, da sie sich ähnlich verhalten wie das Enzym Peroxidase. Derartige Substanzen werden auch als Pseudoperoxidasen bezeichnet. Peroxidativ wirksame Substanzen sind enzymartig, indem sie die Redoxreaktion zwischen Peroxiden und Benzidin, o-Tolidin, 3,3'5,5'-Tetramethy!benzidin, 2,7-Diaminofluoren oder ähnlichen Indikatorsubstanzen katalysieren und dadurch zu einer nachweisbaren Reaktion wie einer Farbänderung führen. Daher beruhen die meisten Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von okkultem Blut in Proben auf dieser Pseudoperoxidaseaktivität.

Innerhalb der letzten Jahre sind verschiedene Verfahren entwickelt worden, die auf der enzymartigen Katalyse der peroxidativen Oxidation von farbbildenden Indikatoren beruhen. In erster Linie handelt es sich um Verfahren der Naßchemie und »dip and read«-Reagensstreifen. Ein Verfahren der zuerst genannten Art ist angegeben von Richard M. Henry, et al. Clinical Chemistry Principles and Techniques (Hagerstown, Maryland: Harper and Row, 1974), S. 1124-1125. Dieses Verfahren umfaßt die Anwendung von Eisessig (Puffer), Diphenylamin (Indikator) und Wasserstoffperoxid. Während derartige Naßverfahren sich für analytische Zwecke als geeignet erwiesen haben, besitzen sie offensichtliche Nachteile, von denen nicht der geringste die geringe Reagensstabilität und zu geringe Empfindlichkeit ist. Derartige Reagenslösungen zeigen eine so schnelle Abnahme der Stabilität (und damit Empfindlichkeit), daß nach einigen Tagen frische Reagenslösungen hergestellt werden müssen, was sowohl zeitraubend als auch unwirtschaftlich ist, da teure Reagentien weggeworfen werden müssen.

Ein zweites Verfahren zur Bestimmung von peroxidativ wirksamen Substanzen und ein von klinischem und medizinischem Personal zur Zeit bevorzugtes Verfah ren ist die Anwendung von sogenannten »dip and read«-Reagensstreifen. Ein solcher Reagensstreifen umfaßt im wesentlichen eine poröse Papiermatrix, die an einem Kunststoffstreifen oder Griff befestigt ist. Das Papier ist imprägniert mit einem gepufferten Gemisch aus einem organischen Hydroperoxid und o-Tolidin.

Beim Eintauchen in eine Flüssigkeit, enthaltend Hämoglobin, Myglobin, Erythrocyten und andere Pseudoperoxidasen, entwickelt sich in dem Papier eine blaue Farbe, deren Intensität der Konzentration an peroxidativ wirksamer Substanz in der Probe proportional ist So kann der Laborant durch Vergleich der in dem Reagensstreifen entstandenen Farbe mit einer Standard-Farbkarte halbquantitativ die Menge an unbekannter Substanz in der Probe bestimmen.

Trotz der Vorteile der Streifen gegenüber Verfahren der Naßchemie könnte ein noch größerer Fortschritt erreicht werden, wenn derartige Streifen noch lagerstabiler und noch empfindlicher gegenüber peroxidativ wirksamen Substanzen gemacht werden könnten. Es wurden intensive Arbeiten vorgenommen, um diese Ziele zu erreichen.

Zumindest drei Versuche, um das oben angegebene Ziel zu erreichen, sind bekannt Eine Veröffentlichung in Chemical Abstracts, Bd. 85, S. 186 (1»76) beschreibt ein zweifaches Tauchverfahren zur Herstellung von Reagensstreifen, enthaltend o-Tolidin und Phenylisopropylhydroperoxid. Bei diesem Verfahren wird eine Lösung des Indikators (o-Tolidin · 2 HCl) und Polyvinylpyrrolidon in Äthanol hergestellt Zu dieser Lösung wird eine kleine Menge oberflächenaktives Mittel und ausreichend Citratpuffer zugegeben, um einen pH-Wert von 3,7 zu erreichen. Mit Äthylcellulose imprägnierte Filterpapierstreifen werden in diese Lösung getaucht und getrocknet. Das so imprägnierte Filterpapier wird anschließend in eine zweite Lösung getaucht, enthaltend l,4-Diazabicyclo-[2,2,2]-octan, Phenylisopropylhydrochlorid und Polyvinylpyrrolidon in einem Athanol-Toluol-Gemisch. Der Zweck dieses Versuches bestand darin, die Kombination aus Peroxid und Indikator zu stabilisieren durch Anwendung des Bicyclooctanderivates und des Polyvinylpyrrolidons.

Ein zweites derartiges Verfahren ist in der US-PS 38 53 471 beschrieben, wo die Anwendung von Phosphorsäure- oder Phosphonsäureamiden angegeben ist, wobei die Substituenten an den Amidogruppen hauptsächlich N-Morpholinreste sind.

Neben diesen Arbeiten ist aus der US-PS 32 52 762 bekannt, das organische Hydroperoxid physikalisch in eine kolloide Substanz wie Gelatine einzukapseln. Wenn ein derartiger Teststreifen angewandt wird, löst die wäßrige Probe die Gelatinekapseln und setzt dadurch das Hydroperoxid für die weitere Umsetzung mit dem Indikator in Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz frei.

Jedes dieser Verfahren hat zum Ziel, die Reagentien zu stabilisieren, so daß die potentiell unverträglichen reaktionsfähigen Bestandteile (Hydroperoxid und Indikator) nicht vorzeitig zusammenkommen, und dadurch die Teststreifen weniger empfindlich zu machen. Es kann jedoch gesagt werden, daß die bekannten Verfahren nicht darauf gerichtet waren, gleichzeitig die Stabilität und Empfindlichkeit zu erhöhen, sondern sie versuchten nur die bestehende Empfindlichkeit dadurch aufrechtzuerhalten, daß eine Zersetzung bzw. Zerstörung der Reagentien während der Lagerung vermieden wurde.

In der US-PS 32 36 850 ist die Stabilisierung von organischen Hydroperoxiden, die als Katalysatoren und Oxidationsmittel angewandt werden, offenbart. Dort ist die Verwendung von primären, sekundären oder tertiären Aminsalzen mit organischen Peroxiden angegeben. Diese Druckschrift bezieht sich jedoch nicht auf Reagensstreifen.

Da keines der oben beschriebenen Verfahren die gewünschte Stabilität und Empfindlichkeit in einem Teststreifen zum Nachweis von peroxidativ wirksamen Substanzen erreicht, wurde erfindungsgernäß ein anderer Weg beschriften.

Erfindungsgemäß ist ein Prüfmittel der eingangs genannten Art gekennzeichnet durch den Gehalt an einem Boratester der Formel

(CH₂^-O

N—(CH₂)„—Ο—Β

(CHj)₇₁-O

Durch das erfindungsgemäße Mittel werden die Ziele der erhöhten Stabilität und Empfindlichkeit vollkommen erreicht.

Überraschenderweise hat sich jedoch noch ein anderer Verteil ergeben. So ist die Herstellung des erfindungsgemäßen Prüfmittels wesentlich einfacher als die in den oben angegebenen Druckschriften offenbarten Verfahren. Das erfindungsgemäße Mittel kann durch ein einfaches Eintauchen hergestellt werden.

Besonders günstige Ergebnisse werden erhalten durch ein Prüfmittel, das zusätzlich ein Verdünnungsmittel der Formel

R₁

	\	S-	/	ο	>o
35	R₂	ΐ
	R₁-S-

	O
40		-R₂

oder

R₁-C

NR₁R₂

wobei Ri und R₂ gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe bedeuten, oder ein Gemisch dieser Substanzen enthält.

Das erfindungsgemäße Prüfmittel kann in einer Trägermatrix enthalten sein. Bei der Herstellung wird das Prüfmittel in die Matrix eingebaut.

Das für das erfindungsgemäße Prüfmittel in Frage kommende organische Hydroperoxid kann aus vielen bekannten organischen Hydroperoxiden ausgewählt werden. Es muß jedoch imstande sein, mit einer peroxidativ wirksamen Substanz in Gegenwart eines Peroxid-empfindlichen Indikators unter Bildung einer nachweisbaren Reaktion wie einer Farbänderung oder

Änderung der absorbierten oder reflektierten Lichtmenge zu reagieren.

Zu den Hydroperoxiden, die sich als geeignet erwieGen haben, gehören tert-Butylhydroperoxid, Cumolhydroperoxid, Diisopropylbenzolhydroperoxid, 2,5-DimethyIhexan-2,5-dihydroperoxid, Paramenthanhydroperoxid oder deren Gemischt. Dabei ist Cumolhydroperoxid besonders geeignet

Es gibt zahlreiche Indikatoren, die imstande sind, in Gegenwart eines Hydroperoxids und einer Pseudoperoxidase eine nachweisbare Reaktion zu ergeben und die daher erfindungsgemäß angewandt werden können. Derartige Indikatoren sind z. B. die sogenannten »Benzidin-artigen« Verbindungen. Typische Beispiele hierfür sind Benzidin, o-Tolidin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 2,7-Diaminofluoren oder deren Gemische in unterschiedlichen Mengenanteilen.

Die Boratester, die zur Erhöhung der Stabilität und Empfindlichkeit beitragen, besitzen die oben angegebene Struktur. Von den Verbindungen, die unter die allgemeine Formel fallen, haben sich Trimethanolaminborat, Triäthanolaminborst und Tri(n-propanol)aminborat als besonders geeignet erwiesen.

Die Menge an Boratester, die in dem erfindungsgemäßen Prüfmittel angewandt werden kann, kann in weiten Grenzen variieren. Das geht aus den unten angegebenen Beispielen hervor. So ist nach Beispiel 1 das Molverhältnis von Triäthanolaminborat-Äquivalenten zu Cumolhydroperoxid-Äquivalenten 4,71 und in Beispiel 3 ist ein Molverhältnis von Borat zu Hydroperoxid von 2,83 angegeben (1,42, wei.n die Zweiwertigkeit des Peroxids berücksichtigt wird).

Der Bereich von Äquivalentverhältnissen von ungefähr 1,4 bis ungefähr 5, wie er in den Beispielen angegeben ist, stellt jedoch keine Begrenzung der bezüglich der erfindungsgemäß geeigneten Boratmenge. Jede Menge, die ausreicht, um die gewünschte Stabilität und Empfindlichkeit des Prüfmittels zu erreichen, kann angewandt werden und diese Menge kann leicht im Labor bestimmt werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Prüfmittel Cumolhydroperoxid, o-Tolidin, ein Gemisch von Dimethylsulfon und Dimethylsulfoxid und Triäthylaminborat.

Das Prüfmittel wird typischerweise hergestellt durch Lösen oder Suspendieren von Anteilen jedes anzuwendenden Bestandteiles in Wasser oder einem anderen geeigneten Suspensionsmedium oder Lösungsmittel. Derartige Lösungsmittel oder Suspensionsmedien umfassen Chloroform, Methanol. Äthanol, Methylenchlorid, Cyclohexan usw.

Das Prüfmittel in Form eines Teststreifens kann durch ein einfaches Eintauchverfahren hergestellt werden. Ein Teil des Trägermatrixmaterials wird in die Lösung oder Suspension eingetaucht und anschließend getrocknet. So hergestellte Prüfmittel zeigen einen geringen Verlust an Reaktionsfähigkeit selbst nach einer Lagerung unter harten Bedingungen wie bei ungefähr 60 bis 70° C innerhalb von 1 bis 3 Tagen oder darüber. Zum Vergleich wurden Prüfmittel ähnlich hergestellt, aber ohne Zusatz des Boratestei ? Wenn diese Streifen unter im wesentlichen identi S:,n\ Bedingungen gelagert wurden, wurde ein drastischer Verlust an Reaktionsfähigkeit und Empfindlichkeit beobachtet.

Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Prüfmittel angewandte Trägermatrix kann vielerlei Formen annehmen.

Erfindungsgemäß besonders geeignet ist saugfähiges Papier wie Filterpapier. Es können grundsätzlich aber alle nach dem St d. T. bekannten Materialien als Trägermatrix angewandt werden und die Matrix kann verschiedene physikalische Formen annehmen.

Der Mechanismus nach dem die Erhöhung der Stabilität und Empfindlichkeit erreicht wird, ist noch nicht vollständig klar. Die einzigartigen chemischen Eigenschaften des angegebenen Boratesters ermöglichen jedoch eine begründete Vermutung. Es ist bekannt daß Peroxide allgemein instabile Verbindungen sind oder daß sie zumindest weniger stabil sind als die meisten in der Natur vorkommenden Verbindungen. Einige sind explosiv. Andere wie organische Hydroperoxide (z. B. Cumolhydroperoxid) sind verhältnismäßig stabil, aber es wird angenommen, daß sie in Gegenwart iyon Säuren, wie sie üblicherweise bei Prüfmitteln zum Nachweis von okkultem Blut angewandt werden, sich zersetzen (dissoziieren). Wenn diese Zersetzung in Gegenwart eines oxidierbaren Indikators (wie er hier beschrieben wird) eintritt findet eine Redoxreaktion statt Es wird angenommen, daß diese vorzeitige Wechselwirkung der Grund für die verringerte Empfindlichkeit bei peroxidativ empfindlichen Reagensstreifen ist.

Andererseits sind Boratester wie sie hier beschrieben sind einzigartig in der Geometrie des Stickstoff- und Boratoms in der Acyclischen Struktur, wobei jedes ein getrenntes Brückenkopfatom darstellt Das Stickstoffatom an dem einen Brückenkopf ist elektronenreich und besitzt ein freies Elektronenpaar, das von der Molekülachse aus außen liegt. Das andere Brückenkopfatom, nämlich das Boratom, das sich an dem anderen Ende der Molekülachse befindet, ist elektronenarm und neigt dazu, mit elektronenreichen Anionen koordinative Bindungen einzugehen.

Aufgrund des Elektronenüberschusses kann das Stickstoffende des Moleküls daher leicht ein Proton aufnehmen während das elektronenarme Bor-Brückenkopf-Atom koordinativ mit einem anionischen Peroxidrest Bindungen eingehen kann. So wird angenommen, daß die einzigartige Elektronenverteilung in dem eben diskutierten bicyclischen Molekül das organische Peroxid in dem Prüfmittel stabilisiert, indem es sich zwischen das peroxidische Proton und das Sauerstoffatom einlage« und ein koordinativ gebundenes Ionenpaar bildet.

So wird angenommen, daß bei dem erfindungsgemäßen Prüfmittel die überraschend höhere Stabilität daher rührt, daß das organische Hydroperoxid daran gehindert wird, mit dem Indikator ionische Wechselwirkungen einzugehen bis die Solvatisierungskraft der Probe den Peroxid-Borat-Komplex zerstört und das Peroxid freisetzt, das dann den Indikator in Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz oxidieren kann.

Aber obwohl eine deutliche Zunahme der Stabilität und Empfindlichkeit durch die Anwendung von Boratestern erreicht wird, hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß noch eine größere Stabilität und Empfindlichkeit erreicht werden kann, wenn der Boratester und das oben angegebene Verdünnungsmittel zusammen in dem Prüfmittei enthalten sind.

Die Verdünnungsverbindungen, die die Stabilität und Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Prüfmittels noch weiter steigern können, haben die oben angegebene Struktur. Von den Verbindungen dieser allgemeinen Struktur haben sich Ν,Ν-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dimethylsulfon oder deren Gemische als besonders geeignet erwiesen. Andere Verdünnungsmit-

tel, die sich als geeignet erwiesen haben, sind Benzylsulfoxid, 4-Chlorphenylsulfon, 4-Fluor-3-nitrophenylsulfon und andere ähnliche Substanzen.

Ri und R2 können in der oben angegebenen Struktur jeweils eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten. Beispiele für derartige Alkylgruppen sind die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl-, n-Pentyl-, Isopentyl-, Neopentyl-, tertPentylgruppe und andere Isomere einschließlich derjenigen von Hexan. Diese Alkylgruppen sind auch beispielhaft für die Alkoxygruppen, die unter die Definition von Ri und R2 fallen.

Wenn Rj und R2 Arylgruppen bedeuten, ist dieser Ausdruck ebenfalls in weiterem Sinne zu verstehen und umfaßt substituierte und nicht-substituierte Aryigruppen wie Phenyl-, Benzyl-, ToIyI-, Anilin- und Naphthylgruppen usw. Typische Gruppen, die als Substituenten an Ri und R2 auftreten können, sind Amino-, Nitro-, Amido-, Nitrilo-, Hydroxy-, Alkyloxy-, Phenyl-, Sulfonsäure-, Carbonsäuregruppen, Halogenatome usw.

Die Menge an Verdünnungsmittel, die bei den erfindungsgemäßen Prüfmitteln angewandt werden kann, variiert in weiten Grenzen und kann leicht im Labor bestimmt werden. So kann die Menge an Verdünnungsmittel, wenn es eine Flüssigkeit wie Dimethylsulfoxid (siehe Tabelle 2, unten) ist, von ungefähr 10 bis ungefähr 100%, bezogen auf das Volumen, das zu dem Mittel zugesetzt wird, variieren im Vergleich mit dem Volumen des Lösungs- oder Suspensiosmittels (im Falle von Beispiel 12 Wasser). Ein bevorzugter Bereich beträgt ungefähr 25 bis ungefähr 100%.

Ähnlich kann, wenn das Verdünnungsmittel ein Gemisch aus mehr als einer der oben angegebenen Verbindungen ist, das Mengenverhältnis der einzelnen Verbindungen, das in dem Verdünnungsmittel angewandt wird, in weiten Grenzen variieren und diese Grenzen können ebenfalls leicht im Labor bestimmt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

A. Herstellung des Prüfmittels
Beispiel 1

a) Ein Prüfmittel wurde hergestellt durch Lösen der folgenden Bestandteile in 150 ml entionisiertem Wasser.

Tabelle 1

Die Bestandteile wurden in der unten angegebenen Reihenfolge zugegeben.

Trinatriumcitrat	3,2 g
Citronensäure	2,2 g
Äthylendiamintetraessigsäure,
Tetranatriumsalz	0,1g
Dimethylsulfon	10,0 g
Natriumlaurylsulfat	1,0 g
6-Methoxychinolin	0,5 g
Dimethylsulfoxid	25,0 ml
Aceton	25,0 ml
Cumolhydroperoxid	2,0 g
Triäthanolaminborat
(Aldrich Chemical Co., Inc.)	10,0 g
o-Tolidin	0=4 g

b) Filterpapierstreifen wurden in das Prüfmittel nach Beispiel 1 getaucht. Sie wurden anschließend 15 min bei 7O⁰C getrocknet, um ein Priifmittel zu erhalten, das in einer Trägermatrix enthalten war (Prüfvorrichtung). Die getrockneten Matrices wurden dann an Kunststoffstreifen (Polystyrol) oder Handgriffe mit Hilfe eines Doppelklebebandes befestigt

Die entstehenden Priifmittel können angewandt werden zum Nachweis von peroxidativ wirksamen Substanzen, indem man sie in eine Probe wie Urin eintaucht, von der vermutet wird, daß sie eine solche Substanz enthält, und die Entwicklung der Farbe in der Trägermatrix beobachtet

B. Stabilitätsuntersuchung von
verschiedenen Prüfmitteln

Beispiel 2
Wirkung von Boratester

Der Zweck dieses Versuches war die Wirkung von Triäthylaminborat auf Prüfmittel zum Nachweis von okkultem Blut im Vergleich mit anderen Zusätzen zu zeigen. Es wurde die folgende Lösung hergestellt

Chloroform 100 ml

o-Tolidin 0,5 g

2,5-Dimethylhexan-2,5-dihy-

droperoxid 2,0 g

PoIy(N-vinylpyrrolidon) 10,0 g

Zu jeweils 20 ml dieser Lösung wurde 1 g der in der

folgenden Tabelle angegebenen Zusätze gegeben. Diese Lösungen von Prüfmitteln wurden ungefähr 5 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Man erhielt die in der

so folgenden Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse.

Probe

Nr.

Zusatz

Ergebnisse

1 2

Hexamethylentetramin

Triäthanolaminborat
Vergleich (kein Zusatz)

sehr dunkle, nahezu schwarze Losung,
geringe Empfindlichkeit

dunkelgrün/braune Verfärbung, minimale Empfindlichkeit auf okkultes Blut
im Urin

leicht bräunlich, hohe Empfindlichkeit
gegenüber okkultem Blut im Urin

wurde innerhalb von ungefähr 2 h
schwarz, nicht brauchbar zur Analyse
von okkultem Blut

C. Stabilisierung der Prüfmittel durch Boratester

Beispiel 3

a) Vergleich

Eine Lösung des folgenden Prüfmittels wurde hergestellt, um einen auf Pseudoperoxidasen empfindlichen Teststreifen herzustellen. Dieses Mittel enthielt nicht den erfindungsgemäß verwendeten Boratester.

H₂O	150 ml
Trinatriumcitrat	3,2 g
Citronensäure	2,2 g
Äthylendiamintetraessigsäure-
tetranatriumsalz	0,1g
Dimethyisuifon	10,0 g
Natriumlaurylsulfat	1,0 g
6-Methoxychinolin	0,5 g
Dimethylsulfoxid	25,0 ml
Aceton	25,0 ml
Cumolhydroperoxid	2,0 g
o-Tolidin	0,4 g

Ein Stück Filterpapier wurde in die oben angegebene Prüfmittellösung getaucht und bei 70⁰C getrocknet. Das getrocknete Papier wurde in Quadrate mit einer Kantenlänge von ungefähr 5 mm geschnitten und diese wurden an Plastik-Handgriffen mit Hilfe von Doppelklebeband befestigt, wodurch eine Prüfvorrichtung entstand.

b) erfindungsgemäße Prüfmittel

Es wurde eine Lösung wie in Beispiel 3a hergestellt mit der Ausnahme, daß 10 g Triäthanolaminborat vor dem Cumolhydroperoxid zugegeben wurden. Es wurden Prüfvorrichtungen wie in Beispiel 3a) beschrieben hergestellt

nach d) 1 Tag bei ungefähr 7O⁰C gelagert. Diese Prüfvorrichtungen wurden dann auf ihre Empfindlichkeit untersucht durch Eintauchen in Urin enthaltend I ppm Blut. Nur die Triäthanolaminborat enthaltende Vorrichtung (b) ergab bei dieser Konzentration an okkultem Blut (0,015 mg/dl) eine Farbänderung. Die übrigen Vorrichtungen waren bei diesem Gehalt an okkultem Blut nicht empfindlich.

D. Stabilisierung der Prüfmittel durch das
Verdünnungsmittel

Beispiel 4

Es wurden 6 Prüfvorrichtungen aus 6 Prüfmittellösungen hergestellt, enthaltend unterschiedliche Mengen Dimethylsulfoxid entsprechend Tabelle 2. Die 6 Prüfmittellösungen wurden entsprechend der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Wasser	75 ml
Trinatriumcitrat	3,2 g
Citronensäure	4,5 g
Triäthanolaminborat	10,0 g
Äthylendiamintetraessigsäure-
tetranatriumsalz	0,1g
Dimethyisuifon	5,0 g
Natriumlaurylsulfat	1,0 g
6-Methoxychinolin	0,5 g
Cumolhydroperoxid	2,0 g
o-Tolidin	0,4 g

Zu jeder der 6 Lösungen wurden die folgenden Mengen an Dimethylsulfoxid bzw. Methanol gegeben:

Tabelle 2

c) l,4-Diazabicyclo-[2Ä2]-octan

Es wurde eine Lösung wie in Beispiel 3a) hergestellt mit der Ausnahme, daß 10 g l^-Diazabicyclo-ß^j-octan vor dem Cumolhydroperoxid zugegeben wurden. Diese Lösung wurde angewandt zur Herstellung von Prüfvorrichtungen wie in Beispiel 3a).

d) Hexamethylentetramin

Es wurde eine Lösung wie in Beispiel 3a) hergestellt mit der Ausnahme, daß 10 g Hexamethylentetramin vor dem Cumolhydroperoxid zugegeben wurden. Es wurden aus dieser Lösung Prüfvorrichtungen wie in Beispiel 3a) hergestellt

e) Vergleich der Stabilität und Empfindlichkeit

Die Prüfvorrichhxngen Bach a) bis d) wurden unter harten Bedingungen gelagert, um ihre relative Stabilität und Empfindlichkeit zu bestimmen. Vorrichtungen nach a) bis c) wurden 3 Tage bei ungefähr 60⁰C und solche Prüfmittel

Dimethylsulfoxid
ml

0
5
10
25
40
An

Methanol
ml

75
70
65
50
35
15

Es wurden dann mit Hilfe der oben angegebenen Prüfmittellösungen Prüfvorrichtungen hergestellt durch Eintauchen eines Stück Filterpapiers in jede Lösung.

Die eingetauchten Filterpapierstreifen wurden aus den Lösungen entfernt, getrocknet und unter harten Bedingungen bei 70⁰C 18 h in einem Ofen behandelt Nach dieser Behandlung wurde jeder Streifen in einer Testlösung enthaltend eine 1:1 000 000 Verdünnung von frischem ganzen Blut in Urin untersucht Die Intensität der Färbung, die sich in jedem Streifen entwickelte, konnte zum Vergleich herangezogen werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3 Tabelle 4

Prüfvorrichtung
Nr.*)

Farbbewertung**) Prüfmittel
Nr.

0 (keine Färbung)

1 (Spuren)
3

5
6
7 (nahezu kein Reaktivitätsverlust)

!0

*) Die Nummer der Prüfvorrichtung entspricht der Nummer des Prüfmittels in Tabelle 2.

**) Die Farbbewertung wurde anhand einer 0- bis 8-Skala durchgeführt, wobei 8 die Farbe angibt, die von einer frisch hergestellten nichtbehandelten Prüfvorrichtung aus dem Pmfmittel 6 (Tabelle 2) entwickelt wurde. Eine Bewertung von 0 bedeutet keine Farbentwicklung, eine Bewertung von 7 nahezu keinen Reaktivitätsverlust und eine Bewertung von 1 nur Spuren von Färbung.

20

Aus den Werten der Tabelle 3 geht sehr deutlich hervor, daß die Empfindlichkeit mit der Menge an Verdünnungsmittel (hier Di-methylsulfoxid) zunimmt, die in dem Prüfmittel angewandt wird.

E. Erhöhte Stabilität der Prüfmittel (mit
Boratester) durch verschiedene Verdünnungsmittel

Beispiel 5

30

Es wurden 8 Prüfmittel wie in Beispiel 4 hergestellt, von denen 7 unterschiedliche Verdünnungsmittel und 1 (Vergleich) kein Verdünnungsmittel enthielt. Der Zweck dieses Versuches war die Wirksamkeit von verschiedenen Verdünnungsmitteln zur Erhöhung der Stabilität von Prüfmitteln zu untersuchen, die auf peroxidativ wirksame Substanzen ansprechen, wenn die Menge an Boratester in dem Mittel konstant gehalten wird.

Es wurde eine Lösung hergestellt, enthaltend die folgenden Bestandteile:

Wasser

Trinatriumcitrat

Citronensäure

N atriumlaurylsulf at

6-M ethoxychinolin

Methanol

Triäthanolaminborat

Cumolhydroperoxid

o-Tolidin

50 ml
3,2 g
2,2 g
1.0 g
1,0 g

50,0 ml
5,0 g
2,0 g
0,4 g

45

50

Ein kleiner Anteil dieser Lösung wurde in jedes von 8 Reagensgläsern gegeben. Anschließend wurden kleine Mengen der in Tabelle 4 angegebenen Verdünnungsmittel jeweils in ein Reagensglas gegeben und die Reagensgläser mit einem Stopfen verschlossen und 1 Woche bei Raumtemperatur auf dem Labortisch stehengelassen. Am Ende der Woche wurden die Reagensgläser untersucht, wie weit sie nachgedunkelt ■waren. Je dunkler die Farbe war, um so weniger stabil war das Mittel. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben in der Reihenfolge einer abnehmenden Stabilität (d. h. das Prüfmittel 1 war das stabilste und das Prüfmittel 8 das am wenigsten stabile).

55 Verdünnungsmittel

2
3
4
5
6
7
8 (Vergleich)

Dimethylsulfoxid

N,N-Dimethylformamid

Dimethylsulfon

Benzylsulfoxid

4-Chlorphenylsulfon

4-Fluor-3-nitrophenylsuIfon

2-Imidazolidon

keines

Die Proben 1 und 2 in Tabelle 4 zeigten eine ausgezeichnete Stabilität, die Lösung 3 eine geringere, aber immer noch gute Stabilität, die Lösungen 4 bis 7 waren mäßig stabil und die Lösung 8, die Vergleichslösung, war sehr viel weniger stabil als die Lösungen 1 bis 7.

F. Bevorzugte Ausführungsformen

Beispiel 6 Die folgenden Bestandteile wurden mit 150 ml

Wasser vermischt:	3,2 g
Trinatriumcitrat	2,2 g
Citronensäure
Äthylendiamintetraessigsäure-	0.1g
tetranatriumsalz	10,0 g
Dimethylsulfon	1,0 g
N atriumlaurylsulf at	0,5 g
6-Methoxychinolin	25,0 ml
Dimethylsulfoxid	25,0 ml
Aceton	10,0 g
Triäthanolaminborat	2,0 g
Cumolhydroperoxid	0.4 g
o-Tolidin

Es wurden Filterpapierstreifen in die oben angegebene Lösung getaucht und bei 70° C getrocknet Nach dem Trocknen wurde das Filterpapier in Quadrate mit einer Kantenlänge von 4 mm geschnitten. Diese Quadrate wurden dann mit Hilfe von Doppelklebeband auf Polystyrolhandgriffe von ungefähr 8 χ 15 mm geklebt

Entsprechend diesem Beispiel hergestellte Prüfvorrichtungen wurden 3 Tage bei 60° C behandelt und sie erwiesen sich gegenüber okkultem Blut in Urin in Konzentrationen von mindestens so gering wie 0,015 mg% als empfindlich.

Beispiel 7 Dieses Beispiel zeigt eine zweite bevorzugte Ausfüh-

f „;_»„ _n_C_.J — r\ r^ — ρ * ^ ,

ι utigaiiri in citici eiiiiiuuiigsgcinaijdi nut τυιιn~iiiuiig.

Ein Prüfmittel wurde hergestellt durch Vermischen der folgenden Bestandteile in der angegebenen Reihenfolge unter Rühren in einem Becherglas.

60

65

Wasser	75 ml
Trinatriumcitrat	3,2 g
Citronensäure	4,15 g
Triäthanolaminborat	10,0 g
Äthylendiamintetraessigsäure	0,1g
Natriumlaurylsulfat
Dimethylsulfon	10,0 g
6-Methoxychinolin	0,6 g
Njsf-Dimethylformamid	75 ml
Cumolhydroperoxid	3,0 g
o-Tolidin	0,8 g

13 14

Filterpapierstreifen wurden in das oben angegebene 70° C aufbewahrt, andere 12 Wochen bei 40° C. Beide

Mittel getaucht und ungefähr 11 min bei ungefähr 90 bis Gruppen von Streifen entwickelten eine blau-grüne

92° C getrocknet. Die getrockneten Streifen wurden Farbe, wenn sie mit einer 1 :1 χ 10⁶ Verdünnung von

dann an Plastikhandgriffen mit Hilfe von Doppelklebe- frischem ganzem Blut in Urin zusammengebracht

band befestigt. Einige der Streifen wurden 1 Tag bei 5 wurden.

Claims

!8 03 955

Patentansprüche:

i. Prüfmittel zur Bestimmung einer peroxidativ wirksamen Substanz in einer Probe, umfassend ein organisches Hydroperoxid und einen Indikator, der in Gegenwart des Hydroperoxids und einer peroxidativ wirksamen Substanz eine nachweisbare Reaktion ergibt, gekennzeichnet durch den Gehalt an einem Boratester der Formel

bis 6, dadurch Trägermatrix