DE2803955A1

DE2803955A1 - Pruefmittel und verfahren zur bestimmung peroxidativ wirksamer substanzen

Info

Publication number: DE2803955A1
Application number: DE19782803955
Authority: DE
Inventors: Charles Tak Wai Lam
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1977-03-14
Filing date: 1978-01-30
Publication date: 1978-09-21
Also published as: SE430104B; FR2384261A1; JPS53115288A; BR7800603A; JPS6122780B2; IT1104148B; IT7847859A0; AR220329A1; SE7801164L; DE2803955B2; CA1098808A; AU3279478A; HU177004B; IN148528B; FR2384261B1; DE2803955C3; GB1552747A; DE2857298C2

Description

DR. ING. F. WTIESTHOFF * SUOO MÜNCHEN OO J SCHWEIÖERSTHASSE S DR.E. ν. PECHMANN " O Q Π Q Q E G ™βγοκ (080 J ββ 20«

DR. ING. D. BEHRENS / Q U 0 Cl 0 5

DIPL. ING. R. GOETZ B 84070

ΤΐΜΟΠΑΗΗΧ I

PATENTANWÄLTE pbotkotpatükt

1A-50 485

Patentanmeldung

Anmelder: MILES LABORATORIES, INC.

Elkhart, Indiana 46514, USA

Titel: Prüfmittel und Verfahren zur Bestimmung peroxidativ wirksamer Substanzen

809833/0575

DR. ING. F. WTTESTHOFK DH. 15. ν. I'ECIIMANN DU. ING. D. UKIIRKNS DIPL. ING. R. GOKTZ PATENTANWÄLTE

SOOO ΓιΐϋΓίΟΖΓΕΓΓ OO SCIIV^TEIOEI>i--Tn^.S'iE 2 ΤΕΙ,ΕΓΟΝ (080) 00 20 01 TKLEX S 84 070

TELEnHAMSIF. ι PHOTEOTPAXENT Μ

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Anmelder: Miles Lab.

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Prüfmittel und ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins einer peroxidativ wirksamen Substanz in einer Probe· Das Mittel umfaßt ein organisches Hydroperoxid, einen Indikator, der imstande ist in Gegenwart eines Hydroperoxids und einer peroxidativ wirksamen Svbstanz eine nachweisbare Reaktion zu ergeben, sowie

a) ein Verdünnungsmittel der Formel

D O

R₂

R-,

NR₁R₂

oder ein Gemisch dieser Substanzen, wobei R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe bedeuten und/oder

b) einen Boratester der Formel

N--(CH₂)_n—0—B

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in der m, η und ρ gleich oder verschieden sind und eine ganze Zahl von 1 bis ungefähr 4 bedeuten.

Das Prüfmittel kann in einer Trägermatrix enthalten sein und bei dem Verfahren wird eine Probe, von der angenommen wird, daß sie eine peroxidativ wirksame Substanz enthält mit dem .Prüfmittel . zusammengebracht.

Die Erfindung bezieht sich auf den Nachweis von Bestandteilen in einer Probe und besonders auf den qualitativen Nachweis und die halbquantitative Bestimmung von Bestandteilen, die peroxidative Wirksamkeit besitzen in einer Probe.

Es sind zur Zeit zahlreiche Verfahren bekannt zum Nachweis des Vorhandenseins von peroxidativ wirksamen Substanzen in Proben wie Urin, Fäkalsuspensionen und Magen- und Darminhalt. Hämoglobin und dessen Derivate sind typische derartige "per-

sich oxidativ wirksame" Substanzen, da sie ähnlich verhalten wie das Enzym Peroxidase. Derartige Substanzen werden auch als Pseudoperoxidasen bezeichnet. Peroxidativ wirksame Substanzen sind enzymartig, indem sie die Redoxreaktion zwischen Peroxiden und Benzidin, o-Tolidin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 2,7-Diaminofluoren oder ähnlichen Indikatorsubstanzen katalysieren und dadurch zu einer nachweisbaren Reaktion wie einer Farbänderung führen. Daher beruhen die meisten Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von okkultem Blut in Proben auf dieser Pseudoperoxidaseaktivität.

Innerhalb der letzten Jahre sind verschiedene Verfahren entwickelt worden, die auf der enzymartigen Katalyse der peroxidativen Oxidation von farbbildenden Indikatoren beruhen. In erster Linie handelt es sich um Verfahren der Naßchemie und "dip and read"-Reagensstreifen. Ein Verfahren der zuerst genannten Art ist angegeben von Richard M. Henry, et al. Clinical Chemistry Principles and Techniques (Hagerstown, Maryland:

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Harper and Row, 1974), S. 1124-1125. Dieses Verfahren umfaßt die Anwendung von Eisessig (Puffer), Diphenylamin (Indikator) und Wasserstoffperoxid. Während derartige Naßverfahren sich

für analytische Zwecke als geeignet erwiesen haben,, besitzen sie offensichtliche Nachteile, von denen nicht der geringste die geringe Reagensstabilität und zu geringe Empfindlichkeit •ist. Derartige Reagenslösungen zeigen eine so schnelle Abnahme der Stabilität (und damit Empfindlichkeit), daß nach einigen Tagen frische Reagenslösungen hergestellt werden müssen, was sowohl zeitraubend als auch unwirtschaftlich ist, da teure Reagentien weggeworfen werden müssen.

Ein zweites V_er.fahren zur Bestimmung von peroxidativ wirksamen Substanzen und ein von klinischem und medizinischem Personal zur Zeit bevorzugtes Verfahren ist die Anwendung von sogenannten "dip and read"-Reagensstreifen. Typisch für ein derartiges Prüfmittel ist ein Reagensstreifen der Arnes Company Division of Miles Laboratories, Inc., der unter dem Namen Hemastix^ im Handel ist. Dieser Reagensstreifen umfaßt im wesentlichen eine poröse Papiermatrix, die an einem Kunststoffstreifen oder Griff befestigt ist. Das Papier ist imprägniert mit einem gepufferten Gemisch aus einem organischen Hydroperoxid und o-Tolidin. Beim Eintauchen in eine Flüssigkeit, enthaltend Hämoglobin, Myoglobin, Erythrocyten und andere Pseudoperoxidasen entwickelt sich in dem Papier eine blaue Farbe, deren Intensität

der Konzentration an peroxidativ wirksamer Substanz in der Probe proprotional ist. So kann der Laborant durch Vergleich der in dem Reagensstreifen entstandenen Farbe mit einer Standard-Farbkarte halbquantitativ die Menge an unbekannter Substanz in der Probe bestimmen.

Die Vorteile von Reagensstreifen gegenüber Verfahren der Naßchemie sind zweifach: die Streifen können leichter angewandt werden, da weder die Herstellung von Reagentien noch Apparate erforderlich sind und zweitens eine größere Stabilität " der

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Reagentien erreicht wird, was zu einer größeren Genauigkeit, Empfindlichkeit und Wirtschaftlichkeit führt.

Trotz der Vorteile der Streifen gegenüber Verfahren der Naßchemie können die Stabilität und Empfindlichkeit noch weiter verbessert werden. Während diese Eigenschaften bei den derzeit üblichen Teststreifen zur Bestimmung von Pseudoperoxidasen gegenüber denen der Naßchemie weitgehend verbessert sind, könnte ein großer Fortschritt erreicht werden, wenn derartige Streifen noch lagerstabiler und noch empfindlicher gegenüber peroxidativ wirksamen Substanzen gemacht werden könnten. Es wurden intensive Arbeiten vorgenommen, um diese Ziele zu erreichen.

Zumindest drei Versuche, um das oben angegebene Ziel zu erreichen, sind bekannt. Eine Veröffentlichung in Chemical Abstracts, Bd.85, S. 186 (1976) beschreibt ein zweifaches Tauchverfahren zur Herstellung von Reagensstreifen, enthaltend o-Tolidin und Phenylisopropylhydroperoxid. Bei diesem Verfahren wird eine Lösung des Indikators (o-Tolidin. 2HCl) und Polyvinylpyrrolidon in Äthanol hergestellt. Zu dieser Lösung wird eine kleine Menge oberflächenaktives Mittel und ausreichend Citratpuffer zugegeben, um einen pH-Wert von 3»7 zu erreichen. Mit Äthylcellulose imprägnierte Filterpapierstreifen werden in diese Lösung getaucht und getrocknet. Das so imprägnierte Filterpapier wird anschließend in eine zweite Lösung getaucht, enthaltend 1,4-Diazabicyclo-^,2,2J-octan, Phenylisopropylhydrochlorid und Polyvinylpyrrolidon in einem Äthanol-Toluol-Gemisch. Der Zweck dieses Versuches bestand darin, die Kombination aus Peroxid und Indikator zu stabilisieren durch Anwendung des Bicyclooctanderivates und des PoIyvinylpyrrolidons.

Ein zweites derartiges Verfahren ist in der US-PS 3 853 471 beschrieben, wo die Anwendung von Phosphorsäure- oder Phosphonsäureamiden angegeben ist, wobei die Substituenten an den

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Amidogruppen hauptsächlich N-Morpholinreste sind.

Neben diesen Arbeiten ist aus der US-PS 3 252 762 bekannt, das organische Hydroperoxid physikalisch in eine kolloide Substanz wie Gelatine einzukapseln. Wenn ein derartiger Teststreifen angewandt wird, löst die wäßrige Probe die Gelatine-.kapseln und setzt dadurch das Hydroperoxid für die weitere Umsetzung mit dem Indikator in Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz frei.

Jedes dieser Verfahren hat zum Ziel, die Reagentien zu stabilisieren, so daß die potentiell unverträglichen reaktionsfähigen Bestandteile (Hydroperoxid und Indikator) nicht vorzeitig zusammenkommen und dadurch die Teststreifen weniger empfind-

zu
lieh machen. Es kann jedoch gesagt werden, daß die bekannten Verfahren nicht darauf gerichtet waren gleichzeitig die Stabilität und Empfindlichkeit zu erhöhen, sondern sie versuchten nur die bestehende Empfindlichkeit dadurch aufrechtzuerhalten, daß eine Zersetzung bzw. Zerstörung der Reagentien während der Lagerung vermieden wurde.

In der US-PS 3 236 850 ist die Stabilisierung von organischen Hydroperoxiden, die als Katalysatoren und Oxidationsmittel angewandt werden, offenbart. Dort ist die Verwendung von primären, sekundären oder tertiären Aminsalzen mit organischen Peroxiden angegeben. Diese Druckschrift bezieht sich jedoch nicht auf Reagensstreifen.

Da keines der oben beschriebenen Verfahren die gewünschte Stabilität und Empfindlichkeit in einem Teststreifen zum Nachweis von peroxidativ wirksamen Substanzen erreicht, wurde erfindungsgemäße ein-anderer Weg beschritten. Durch das erfindungsgemäße Mittel und das Verfahren zur Bestimmung von peroxidativ wirksamen Substanzen werden diese Ziele der erhöhten Stabilität und Empfindlichkeit vollkommen erreicht.

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9 ο no 955 überraschenderweise hat sich jedoch noch ein anderer \forteft.

ergeben, d.h. eine einfachere Herstellung des erfindungsgemäßen Prüfmittels, die wesentlich einfacher ist als die in den oben angegebenen Druckschriften offenbarten Verfahren. Es handelt sich erfindungsgemäß um ein Verfahren durch einfaches Eintauchen.

Die Erfindung betrifft ein Prüfmittel zur Bestimmung des Vor handenseins einer Pseudoperoxidase in einer Probe. Das Prüfmittel umfaßt ein organisches Hydroperoxid, einen Indikator, der in Gegenwart eines Hydroperoxids und einer peroxidativ wirksamen Substanz eine nachweisbare Reaktion ergibt, und

(i) ein Verdünnungsmittel der Formel

0 , R₁—S—R₇ ,

R₁ C

NR₁R₂

in der R₁ und R₂ gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe bedeuten oder ein Gemisch

dieser Substanzen und/oder

(ii) einen Boratester der Formel

—0

:-C^CH2)n— Ο"

(CH₂)

in der m, η und ρ gleich oder verschieden sein können und jeweils eine ganze Zahl von 1 bis ungefähr 4 bedeuten.

— 7 —

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Das erfindungsgemäße Prüfmittel kann in einer Trägermatrix enthalten sein. Bei der Herstellung wird das Prüfmittel in die Matrix eingebaut (Prüfvorrichtung).

Das für das erfindungsgemäße Prüfmittel infrage kommende organische Hydroperoxid kann aus vielen bekannten organischen ■Hydroperoxiden ausgewählt werden. Es muß jedoch imstande sein, mit einer peroxidativ wirksamen Substanz in Gegenwart eines Peroxid-empfindlichen Indikators unter Bildung einer nachweisbaren Reaktion wie einer Farbänderung oder Änderung der absorbierten oder reflektierten Lichtmenge zu reagieren.

Zu den Hydroperoxiden, die sich als geeignet erwiesen haben, gehören fert.Butylhydroperoxid, Cumolhydroperoxid, Diisopropylbenzolhydroperoxid, 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid, Paramenthanhydroperoxid oder .deren Gemische. Dabei ist Cumolhydroperoxid besonders geeignet.

Es gibt zahlreiche Indikatoren, die imstande sind, in Gegenwart eines Hydroperoxids und einer Pseudoperoxidase eine nach-

zu

weisbare Reaktion ergeben und die daher erfindungsgemäß angewandt werden können. Derartige Indikatoren sind z.B. die sogenannten "Benzidin-artigen" Verbindungen. Typische Beispiele hierfür sind Benzidin, o-Tolidin, 3,3',5,5^f-Tetramethylbenzidin, 2,7-Diaminofluoren oder deren Gemische in unterschiedlichen Mengenanteilen.

Die Boratester, die zur Erhöhung der Stabilität und Empfindlichkeit beitragen, besitzen die oben angegebene Struktur. Von den Verbindungen, die unter die allgemeine Formel fallen, haben sich Trimethanolaminborat, Triäthanolaminborat und Tri(n-propanol)aminborat als besonders geeignet erwiesen. Diese Verbindungen entsprechen der oben angegebenen allgemeinen Formel, in der m, η und ρ gleich sind und jeweils 1, 2 bzw. 3 bedeuten.

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AA

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Die Menge an Boratester, die in dem erfindungsgemäßen Prüfmittel angewandt werden kann, kann in weiten Grenzen variieren. Das geht aus,den unten angegebenen Beispielen hervor. So ist

nach Beispiel 1

das Molverhältnis von Triäthanolaminborat-Aquivalenten zu Cumolhydroperoxid-Äquivalenten 4,71 und in Beispiel 3 ist ein Molverhältnis von Borat zu Hydroperoxid von 2,83 angegeben (1,42, wenn die Zweiwertigkeit des Peroxids berücksichtigt wird).

Der Bereich von Aquivalentverhältnissen von ungefähr 1,4 bis ungefähr 5, wie er in den Beispielen angegeben ist, stellt jedoch keine Begrenzung dar bezüglich der erfindungsgemäß geeigneten Boratmenge. Jede Menge, die ausreicht, um die gewünschte Stabilität und Empfindlichkeit des Prüfmittels zu erreichen, kann angewandt werden und diese Menge kann leicht im Labor bestimmt werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Prüfmittel Cumolhydroperoxid, o-Tolidin, ein Gemisch von Dimethylsulfon und Dimethylsulfoxid und Triäthylaminborat.

Das Prüfmittel wird typischerweise hergestellt durch Lösen oder Suspendieren von Anteilen jedes anzuwendenden Bestandteils in Wasser oder einem anderen geeigneten Suspensionsmedium oder Lösungsmittel. Derartige Lösungsmittel oder Suspensionsmedien umfassen Chloroform, Methanol, Äthanol, Methy-: lenchlorid, Cyclohexan usw.

Das Prüfmittel in Form eines Teststreifens kann durch ein einfaches Eintauchverfahren hergestellt werden. Ein Teil des Trägermatrixmaterials wird in die Lösung oder Suspension eingetaucht und anschließend getrocknet. So hergestellte Prüfmittel zeigen einen geringen Verlust an Reaktionsfähigkeit selbst nach einer Lagerung unter harten Bedingungen wie bei ungefähr 60 bis 70⁰C innerhalb von 1 bis 3 Tagen oder darüber. Zum Vergleich wurden Prüfmittel ähnlich hergestellt, aber ohne Zusatz

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des Boratesters und/oder Verdünnungsmittels. Wenn diese Streifen unter im wesentlichen identischen Bedingungen gelagert wurden, wurde ein drastischer Verlust an Reaktionsfähigkeit und Empfindlichkeit beobachtet.

Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Prüfmittel angewandte Trägermatrix kann vielerlei Formen annehmen. So lehrt die US-PS 3 846 247 die Anwendung von Filzen, porösen Keramikstreifen und Geweben oder Vliesstoffen aus Glasfasern. In der US-PS 3 552 938 ist die Anwendung von Holzstäben, Tuch, Schwammmaterialien und tonartigen Substanzen offenbart. Die Verwendung von Vliesstoffen aus synthetischen Harzen und Glasfasern als Trägermatrix ist in der GB-PS 1 369 139 angegeben und die GB-PS 1 349 623 erwähnt die Anwendung von lichtdurchlässigen Wirkstoffen aus dünnen Fäden zum Bedecken einer darunterliegenden Papiermatrix und Polyamidfäden sind in der FR-PS 2 179 397 angegeben. Trotzdem ist das nach dem Stand der Technik haupt- ■■ sächlich als Trägermatrix angewandte Material, das auch erfindungsgemäß besonders geeignet ist, saugfähiges Papier wie Filterpapier. Es können also viele verschiedene Materialien als Trägermatrix angewandt werden und die Matrix kann verschiedene physikalische Formen annehmen, die alle unter die Erfindung fallen.

Der Mechanismus nach dem die Erhöhung der Stabilität und Empfindlichkeit erreicht wird, ist noch nicht vollständig klar. Die einzigartigen chemischen Eigenschaften des angegebenen Boratesters ermöglichen jedoch eine begründete Vermutung. Es ist bekannt, daß Peroxide allgemein instabile Verbindungen sind oder daß sie zumindest weniger stabil sind als die meisten in der Natur vorkommenden Verbindungen. Einige sind explosiv. Andere wie organische Hydroperoxide (z.B. Cumolhydroperoxid) sind verhältnismäßig stabil, aber es wird angenommen, daß sie in Gegenwart von Säuren, wie sie üblicherweise bei Prüfmitteln zum Nachweis von okkultem Blut angewandt werden, sich zersetzen "(dissoziieren). Wenn diese Zersetzung in Gegenwart

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eines oxidierbaren Indikators (wie er hier beschrieben wird) eintritt, findet eine Redexreaktion statt. Es wird angenommen, daß diese vorzeitige Wechselwirkung der Grund für die verringerte Empfindlichkeit bei peroxidativ empfindlichen Reagensstreifen ist.

Andererseits sind Boratester wie sie hier beschrieben sind einzigartig in der Geometrie des Stickstoff- und Boratoms in der bicyclischen Struktur, wobei jedes ein getrenntes Brückenkopfatom darstellt. Das Stickstoffatom an dem einen Brückenkopf ist elektronenreich und besitzt ein freies Elektronenpaar, das von der Molekülachse aus außen liegt. Das andere Brückenkopfatom, nämlich das Boratom, das sich an dem anderen Ende der Molekülachse befindet, ist elektronenarm und neigt dazu, mit elektronenreichen Anionen koordinative Bindungen einzugehen.

Aufgrund des Elektronenüberschusses kann das Stickstoffende des Moleküls daher leicht ein Proton aufnehmen während das elektronenarme Bor-Brückenkopf-Atom koordinativ mit einem anionischen Peroxidrest Bindungen eingehen kann. So wird angenommen, daß die einzigartige Elektronenverteilung in dem eben diskutierten bicyclischen Molekül das organische Peroxid in dem Prüfmittel stabilisiert, indem es sich zwischen das peroxidische Proton und das Sauerstoffatom einlagert und ein koordinativ gebundenes Ionenpaar bildet.

So wird angenommen, daß bei dem erfindungsgemäßen Prüfmittel die überraschend höhere Stabilität daher rührt, daß das organische Hydroperoxid daran gehindert wird, mit dem Indikator ionische Wechselwirkungen einzugehen bis die Solvatisierungskraft der Probe den Peroxid-Borat-Komplex zerstört und das Peroxid freisetzt, das dann den Indikator in Gegenwart einer peroxidativ· wirksamen Substanz oxidieren kann.

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Aber obwohl eine deutliche Zunahme der Stabilität und Empfindlichkeit durch die Anwendung von Boratestern erreicht wird, hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß noch eine größere Stabilität und Empfindlichkeit erreicht werden kann, wenn der Boratester und das oben angegebene Verdünnungsmittel zusammen in dem Prüfmittel enthalten sind.

Die Verdünnungsverbindungen, die zu der erhöhten Stabilität und Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Prüfmittel beitragen, haben die oben angegebene Struktur. Von den Verbindungen dieser allgemeinen Struktur haben sich N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dimethylsulfon oder deren Gemische als besonders geeignet erwiesen. Andere Verdünnungsmittel, die sich als geeignet erwiesen haben, sind Benzylsulfoxid, 4-Chlorphenylsulfon, 4-Fluor-3-nitrophenylsulfon und andere ähnliche Substanzen. Diese Verbindungen entsprechen der oben angegebenen Formel, wobei R₁ und R₂ jeweils eine Methylgruppe bedeuten,

R₁ und Rp können Jedoch auch andere Bedeutungen haben. R₁ und R₀ bedeuten jeweils eine substituierte oder nicht-substituier-

^ά ca.

te Alkylgruppe mit- 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele für derartige Alkylgruppen sind die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, Isobutyl-, sek.Butyl-, n-Pentyl-, Isopentyl-, Neopentyl-, tert.Pentylgruppe und andere Isomere einschließlich derjenigen von Hexan. Diese Alkylgruppen sind auch beispielhaft für die Alkoxygruppen, die unter die Definition von R₁ und R₂ fallen.

Wenn R und R₂ Arylgruppen bedeuten, ist dieser Ausdruck ebenfalls in weiterem Sinne zu verstehen und umfaßt substituierte und nicht-substituierte Arylgruppen wie Phenyl-, Benzyl-, Tolyl-, Anilin- und Naphthylgruppen usw. Typische Gruppen, die als Substituenten an R₁ und R₂ auftreten können, sind Amino-, Nitro-, Amido-, Nitrilo-/ Hydroxy.-, Alkyloxy-, Phenyl-, Sulfonsäure-,

Carbonsäuregruppen, Halogenatome usw.

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Die Menge an Verdünnungsmittel, die bei den erfindungsgemäßen Prüfmitteln angewandt werden kann, variiert in weiten Grenzen und kann leicht im Labor bestimmt werden. So kann die Menge an Verdünnungsmittel, wenn es eine Flüssigkeit wie Dimethylsulfoxid (siehe Tabelle 2, unten) ist, von ungefähr 10 bis ungefähr 100 %,, bezogen auf das Volumen, das zu dem Mittel • zugesetzt wird, variieren im Vergleich mit dem Volumen des Lösungs- oder Suspensionsmittels (im Falle von Beispiel Wasser). Ein bevorzugter Bereich beträgt ungefähr 25 bis ungeführ 100 %.

Ähnlich kann, wenn das Verdünnungsmittel ein Gemisch aus mehr als einer der oben angegebenen Verbindungen ist, das Mengenverhältnis der einzelnen Verbindungen, das in dem Verdünnungsmittel angewandt wird, in weiten Grenzen variieren und diese Grenzen können ebenfalls leicht im Labor bestimmt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläuert.

A. Herstellung des Prüfmittels Beispiel 1

Ein Prüfmittel wurde hergestellt durch Lösen der folgenden Bestandteile in 150 ml entionisiertem Wasser. Die Bestandteile wurden in der unten angegebenen Reihenfolge zugegeben.

Trinatriumcitrat 3,2 g

Citronensäure 2,2 g Äthylendiamintetraessigsäure, Tetranatriumsalz 0,1 g

Dirnethylsulfon 10,0 g

Natriumlaurylsulfat 1,0 g

6-Methoxychinolin 0,5 g

Dimethylsulfoxid 25,0 ml

Aceton 25,0 ml

Cumolhydroperoxid 2,0 g Triäthanolaminborat (Aldrich Chemical Co., Inc.)10,0 g

o-Tolidin 0,4 g

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Beispiel 2

Filterpapierstrelfen (Whatmann 3MM) wurden in das Prüfmittel nach Beispiel 1 getaucht. Sie wurden anschließend 15 min bei 7O⁰C getrocknet, um ein Prüfmittel zu erhalten, das in einer Trägermatrix enthalten war (Prüfvorrichtung). Die getrockneten Matrices wurden dann an Kunststoffstreifen (Polystyrol) oder Handgriffe mit Hilfe eines Doppelklebebandes (3M Company) befestigt.

Die entstehenden Prüfmittel können angewandt werden zum Nachweis von peroxidativ wirksamen Substanzen, indem man sie in eine Probe wie Urin eintaucht, von der vermutet wird, daß sie eine solche Substanz enthält und die Entwicklung der Farbe in der Trägermatrix beobachtet.

B. Stabilitätsuntersuchung von verschiedenen Prüfmitteln

Beispiel 3 - Wirkung von Boratester

Der Zweck dieses Versuches war die Wirkung von Triäthylaminborat auf Prüfmittel zum Nachweis von okkultem Blut im Vergleich mit anderen Zusätzen zu zeigen. Es wurde die folgende Lösung hergestellt.

Chloroform 100 ml

o-Tolidin 0,5 g

2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid 2,0 g

Poly(N-vinylpyrrolidon) 10,0 g

Zu jeweils 20 ml dieser Lösung wurde 1 g der in der folgenden Tabelle angegebenen Zusätze gegeben. Diese Lösungen von Prüfmitteln wurden ungefähr 5 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Man erhielt die in der folgenden Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse.

Tabelle 1:

$09838/0576 ■ -14 -

1A-50 48?

Tabelle 1
Probe Zusatz Ergebnisse

Nr.

1 Hexamethylentetramin sehr dunkle, nahezu schwarze

Lösung, geringe Empfindlichkeit

• 2 1,4-Diazabicyclo-^,2,2-joctan dunkelgrün/braune Verfärbung,

minimale Empfindlichkeit auf okkultes Blut im Urin

3 Triäthanolaminborat leicht bräunlich, hohe Em

pfindlichkeit gegenüber okkultem Blut im Urin

4 Vergleich (kein Zusatz) wurde innerhalb von ungefähr

2 h schwarz, nicht brauchbar zur Analyse von okkultem Blut

Beispiel 4 - Wirkung des Verdünnungsmittels

In ein 500 ml Becherglas wurden die folgenden Bestandteile gegeben:

Chloroform 100 ml

Cumolhydroperoxid 4,0 g

o-Tolidin 0,4 g

Dimethylsulfoxid 25,OmI

Das entstehende Mittel, das nach Zusammengehen der oben angegebenen Bestandteile leicht gelb war, wurde in einen Erlenmeyer» Kolben gegeben, der mit ftinem Stopfen verschlossen und bei Raumtemperatur (18,3⁰C)'auf dem Labortisch stehengelassen wurde. Nach 1 Tag war das Mittel nur etwas dunkler geworden als bei der Herstellung.

Beispiel 5 - Vergleich mit Beispiel 4

Ein Prüfmittel für Vergleichszwecke, d.h. zum Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Prüfmittel wurde nach dem Verfahren des

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Beispiels 4 hergestellt mit der Ausnahme, daß anstelle von Dimethylsulfoxid 25 ml Chloroform zusätzlich verwendet wurden. Dieses Prüfmittel ohne Dimethylsulfoxid wurde in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben, mit einem Stopfen verschlossen und wie in Beispiel 4 auf dem Labortisch stehengelassen (d.h. bei
18,3⁰C 1 Tag). Im Gegensatz zu dem Mittel des Beispiels 4
wurde das Vergleichsmittel dunkel und nahezu schwarz, was die bessere Stabilität des Prüfmittels, das das Verdünnungsmittel enthält, zeigt.

C. Stabilisierung der Prüfmittel durch Boratester Beispiel 6 - Vergleich

Eine Lösung des folgenden Prüfmittels wurde hergestellt, um einen auf Pseudoperoxidasen empfindlichen Teststreifen herzustellen. Dieses Mittel enthielt nicht den erfindungsgemäß verwendeten Boratester.

H₂O 150 ml

Trinatriumcitrat 3,2 g

Citronensäure 2,2 g

Äthylendiamintetraessigsäure-tetranatriumsalz 0,1 g

Dimethylsulfon 10,0 g

Natriumlaurylsulfat 1,0 g

6-Methoxychinolin 0,5 g

Dimethylsulfoxid 25,0ml

Aceton 25,0ml

Cumolhydroperoxid 2,0 g

o-Tolidin 0,4 g

Ein Stück Filterpapier (Whatmann 3MM) wurde in die oben angegebene Prüfmittellösung getaucht und bei 70⁰C getrocknet. Das getrocknete Papier wurde in Quadrate mit einer Kantenlänge
von ungefähr 5 ram geschnitten und diese wurden an Plastik-Handgriffen mit Hilfe von Doppelklebeband (3M Company) befestigt, wodurch eine Prüfvorrichtung entstand.

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Beispiel 7 - erfindungsgemäßes Prüfmittel

Es wurde eine Lösung wie in Beispiel 6 hergestellt mit der Ausnahme, daß 10 g Triäthanolaminborat vor dem Cumolhydroperoxid zugegeben wurden. Es wurden Prüfvorrichtungen wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt.

Beispiel 8 - 1,4-Diazabicyclo-^,2,2J-octan Es wurde eine Lösung wie in Beispiel 6 hergestellt mit der Ausnahme, daß 10 g 1 ^-Dizaabicyclo-^i^^jfoctan vor dem Cumolhydroperoxid zugegeben wurden. Diese Lösung wurde angewandt zur Herstellung von Prüfvorrichtungen wie in Beispiel 6.

Beispiel 9 - Hexamethylentetramin

Es wurde eine Lösung wie in Beispiel 6 hergestellt mit der Ausnahme, daß 10 g Hexamethylentetramin vor dem Cumolhydroperoxid zugegeben wurden. Es wurden aus dieser Lösung Prüfvorrichtungen wie in Beispiel 6 hergestellt.

Beispiel 10 - Vergleich der Stabilität und Empfindlichkeit

Die Prüfvorrichtungen nach den Beispielen 6 bis 9 wurden unter harten Bedingungen gelagert, um ihre relative Stabilität und Empfindlichkeit zu bestimmen. Vorrichtungen nach den Beispielen 6 bis 8 wurden 3 Tage bei ungefähr 60⁰C und solche nach Beispiel 9 1 Tag bei ungefähr 70⁰C gelagert. Diese Prüfvorrichtungen wurden dann auf ihre Empfindlichkeit untersucht durch Eintauchen in Urin enthaltend 1 ppm Blut. Nur die Triäthanolaminborat enthaltende Vorrichtung (Beispiel 7) ergab bei dieser Konzentration an okkultem Blut (0,015 mg/dl) eine Farbänderung. Die übrigen Vorrichtungen waren bei diesem Gehalt an okkultem Blut nicht empfindlich.

D. Stabilisierung der Prüfmittel durch das Verdünnungsmittel Beispiel 11

Es wurden 6 Prüfvorrichtungen aus 6 Prüfmittellösungen herge-

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stellt, enthaltend unterschiedliche Mengen Dimethylsulfoxid entsprechend Tabelle 2. Die 6 Prüfmittellösungen wurden entsprechend der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Wasser 75 ml

Trinatriumcitrat 3,2 g

Citronensäure 4,5 g

Triäthanolaminborat 10,0 g

Äthylendiamintetraessigsäure-tetranatriumsalz 0,1 g

Dimethylsulfon 5,0 g

Natriumlaurylsulfat 1,0 g

6-Methoxychinolin 0,5 g

Cumolhydroperoxid 2,0 g

o-Tolidin 0,4 g

Zu jeder der 6 Lösungen wurden die folgenden Mengen an Dimethylsulfoxid bzw. Methanol gegeben:

Tabelle 2

Prüfmittel	Dimetbylsulfoxid	Methanol
Nr.	ml	ml
1	0	75
2	5	70
3	10	65
4	25	50
5	40	35
6	60	15

Es wurden dann mit Hilfe der oben angegebenen Prüfmittellösungen Prüfvorrichtungen hergestellt durch Eintauchen eines Stück Filterpapiers (Whatmann 3MM) in jede Lösung. Die eingetauchten Filterpapierstreifen wurden aus den Lösungen entfernt, getrocknet und unter harten Bedingungen bei 70⁰C 18 h in einem Ofen behandelt. Nach dieser Behandlung wurde jeder Streifen in einer Testlösung enthaltend eine 1:1 000 000 Verdünnung von frischem ganzen Blut in Urin untersucht. Die Intensität der Färbung, die sich in jedem Streifen entwickelte, konnte zum Vergleich herangezogen werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3t

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— ΊΟ —

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	2803355
Tabelle 3
Prüfvorrichtung	*# Farbbewertung
Nr.
1	0 (keine Färbung)
2	1 (Spuren)
3	3
4	VJl
VJl	6
6	7 (nahezu kein Reaktivitäts
	verlust )

* Die Nummer der Prüfvorrichtung entspricht der Nummer des Prüfmittels in Tabelle 2

**Die Farbbewertung wurde anhand einer 0 bis 8 Skala durchgeführt, wobei 8 die Farbe angibt, die von einer frisch hergestellten nicht-behandelten Prüfvorrichtung aus dem Prüfmittel 6 (Tabelle 2) entwickelt wurde. Eine Bewertung von 0 bedeutet keine Farbentwicklung, eine Bewertung von 7 nahezu keinen Reaktivitätsverlust und eine Bewertung von 1 nur Spuren von Färbung.

Aus den Werten der Tabelle 3 geht sehr deutlich hervor, daß die Empfindlichkeit mit der Menge an Verdünnungsmittel (hier Dimethylsulfoxid) zunimmt, die in dem Prüfmittel angewandt wird.

E. Erhöhte Stabilität der Prüfmittel (mit Boratester) durch verschiedene Verdünnungsmittel

Beispiel 12

Es wurden 8 Prüfmittel wie in Beispiel 11 hergestellt, von denen 7 unterschiedliche Verdünnungsmittel und 1 (Vergleich) kein Verdünnungsmittel enthielt. Der Zweck dieses Versuches war die Wirksamkeit von verschiedenen Verdünnungsmitteln zur Erhöhung der Stabilität von Prüfmitteln zu untersuchen, die auf peroxidativ wirksame Substanzen ansprechen, wenn die Menge an Boratester in dem Mittel konstant gehalten wird.

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T.% IA-50 485

Es wurde eine Lösung hergestellt, enthaltend die folgenden Bestandteile:

Wasser . 50 ml

Trinatriumcitrat 3,2 g

Citronensäure 2,2 g

Natriumlaurylsulfat 1,0g

6-Methoxychinolin 1,0 g

Methanol 50,0ml

Triathanolaminborat 5,0 g

Cumolhydroperoxid 2,0 g

o-Tolidin ' 0,4 g

Ein kleiiET Anteil dieser Lösung wurde in jedes von 8 Reagensgläsern gegeben. Anschließend wurden kleine Mengen der in Tabelle 4 angegebenen Verdünnungsmittel jeweils in ein Reagensglas gegeben und die Reagensgläser mit einem Stopfen verschlos-

temperatur sen und 1 Woche bei Raum- auf dem Labortisch stehengelassen.

Am Ende der Woche wurde die Reagensgläser untersucht wie weit sie nachgedunkelt waren. Je dunkler die Farbe war, umso weniger stabil war das Mittel. Die Ergebnisse sind in Tabelle angegeben in der Reihenfolge einer abnehmenden Stabilität (d.h. das Prüfmittel 1 war das stabilste und das Prüfmittel 8 das am wenigsten stabile).

Tabelle 4

Prüfmittel	Verdünnungsmittel
Nr. ·
1	Dimethylsulfoxid
2	N,N-Dimethylformamid
3	Dimethylsulfon
4	Benzylsulfoxid
5	4-Chlorphenylsulfon
6	4-Fluor-3-nitrophenylsulfon
7	2-Imidazolidon
8 (Vergleich)	ke ine s

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1A-5U 405

Die Proben 1 und 2 in Tabelle 4 zeigten eine ausgezeichnete Stabilität, die Lösung 3 eine geringere, aber immer noch gute Stabilität, die Lösungen 4 bis 7 waren mäßig stabil und die Lösung 8, die Vergleichslösung, war sehr viel weniger stabil als die Lösungen 1 bis 7.

F. Bevorzugte Ausführungsformen Beispiel 15

Die folgenden Bestandteile wurden mit 150 ml Wasser vermischt!

Trinatriumcitrat 3>2 g

Citronensäure 2,2 g Äthylendiamintetraessigsäure-tetranatriumsalz 0,1 g

Dimethylsulfon 10,0 g

Natriumlaurylsulfat 1,0 g

6-Methoxychinolin 0,5 g

Dimethylsulfoxid 25,0 ml

Aceton 25,0 ml

Triäthanolaminborat 10,0 g

Cumolhydroperoxid 2,0 g

o-Tolidin 0,4 g

Es wurden Filterpapierstreifen (Whatmann 3MM) in die oben angegebene Lösung getaucht und bei 70⁰C getrocknet. Nach dem Trocknen wurde das Filterpapier in Quadrate mit einer Kantenlänge von 4 mm geschnitten. Diese Quadrate wurden dann mit Hilfe von Doppelklebeband (3M Company) auf Polystyrolhandgriffe von ungefähr 8 χ 15 mm geklebt.

Entsprechend diesem Beispiel hergestellte Prüfvorrichtungen wurden 3 Tage bei 60°C behandelt und sie erwiesen sich gegenüber okkultem Blut in Urin in Konzentrationen von mindestens so gering wie 0,015 mg?6 als empfindlich.

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14-50

Beispiel 14

Dieses Beispiel zeigt eine zweite bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Prüfvorrichtung.

Ein Prüfmittel wurde hergestellt durch Vermischen der folgenden Bestandteile in der angegebenen Reihenfolge unter Rühren in einem Becherglas.

Wasser 75 ml

Trinatriumcitrat 3,2 g

Citronens äure 4,15 g

Triäthanolaminborat 10,0 g

Äthylendiamintetraessigsäure 0,1 g

Natriumlaurylsulfat 1,5 g

Dimethylsulfon 10,0 g

6-Methoxychinolin 0,6 g

Ν,Ν-Dimethylformamid 75 ml

Cumolhydroperoxid 3,0 g

o-Tolidin 0,8 g

Filterpapierstreifen (Whatmann 3MM) wurden in das oben angegebene Mittel getaucht und ungefähr 11 min bei ungefähr 90 bis 92°C getrocknet. Die getrockneten Streifen wurden dann an Plastikhandgriffen mit Hilfe von Doppelklebeband befestigt. Einige der Streifen wurden 1 Tag bei 70⁰C aufbewahrt, andere 12 Wochen bei 40⁰C. Beide Gruppen von Streifen entwickelten eine blau-grüne Farbe, wenn sie mit einer 1:1 χ 10 Verdünnung von frischem ganzen Blut in Urin zusammengebracht wurden.

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Claims

Patentansprüche

Prüf mittel zur Bestimmung des Vorhandenseins einer peroxidativ wirksamen Substanz in der Probe, umfassend ein organisches Hydroperoxid, einen Indikator, der in Gegenwart des Hydroperoxids und einer peroxidativ wirksamen Substanz eine nachweisbare Reaktion ergibt und a) ein Verdünnungsmittel der Formel

s-> ο

R₁-C

NR₁R.

oder eines Gemisches dieser Substanzen, wobei R-, und R₂ gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoff atom, eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe bedeuten und/oder b) einen Boratester der Formel

- O—B CCH₂) _p—

in der m, η und ρ gleich oder verschieden sein können und jeweils eine ganze Zahl von 1 bis ungefähr 4 bedeuten.

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2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Verdünnungsmittel Dirnethylsulfoxid, Dimethylsulfon, Ν,Ν-Dimethylformamid, Benzylsulfoxid, 4-Chlorphenylsulfon und/oder 4-Fluor-3-nitrophenylsulfon ist.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verdünnungsmittel ein Gemisch aus Dimethylsulfon und Ν,Ν-Dimethylformamid ist.
4. Mittel nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß der Boratester Trimethanolaminborat, Triäthanolaminborat und/oder Tri(n-propanol)aminborat ist.
5. Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß das organische Hydroperoxid tert.-Butylhydroperoxid, Cumolhydroperoxid, Diisopropylbenzol-hydroperoxid, 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid und/oder Paramenthanhydroperoxid ist.
6. Mittel nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator Benzidin, o-Tolidin, 3f3'»515'-Tetramethylbenzidin und/oder 2,7-Diaminofluorin ist.
7. Mittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer Trägermatrix enthalten ist.
8. Mittel nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, daß der Träger saugfähiges Papier ist.
9. Verfahren zur Bestimmung einer peroxidativ wirksamen Substanz, dadurch gekennzeichnet , daß man die zu untersuchende Probe mit einem Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 8 zusammenbringt und die auftretende nachweisbare Reaktion beobachtet.

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