DE1284124B

DE1284124B - Diagnostisches Mittel und Testindikator zum Nachweis von Glucose in Koerperfluessigkeiten

Info

Publication number: DE1284124B
Application number: DEM45193A
Authority: DE
Inventors: Mast Raymond L; Bauer Robert
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1959-05-15
Filing date: 1960-05-04
Publication date: 1968-11-28
Also published as: NL251599A; US3016292A; CH392109A; IT630626A; BE590824A; GB883744A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues und verbessertes diagnostisches Mittel und einen Testindikator zum qualitativen Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Glucose in biologischen Flüssigkeiten, wie Urin.

Verfahren zum Nachweis von Zucker im Urin sind in der klinischen Chemie an sich bekannt. Es ist bereits ein Glucoseindikator auf der Basis von Glucoseoxidase und einem auf Oxydation ansprechenden Farbstoffsystem bekannt. Dabei wird ein Gemisch aus Kaliumjodid und o-Tolidin benutzt, welches bei Anwesenheit von Glucose durch Umsetzung mit dem bei der Oxydation der Glucose durch die Glucoseoxidase entstehenden Wasserstoffperoxyd eine blaue Farbe entwickelt.

Das diagnostische Mittel zum Nachweise von Glucose in Körperflüssigkeiten enthält Glucoseoxidase, Kalium-, Natrium- oder Ammoniumjodid und einen in Gegenwart des Jodides und durch Wasserstoffperoxyd oxydierbaren Farbbildner. Erfindungsgemäß weist es außerdem einen Gehalt an Natrium-, Kalium- oder Ammoniummolybdat auf.

H₂O₂ + Diaminofiuoren (farblos)

KJ

Na₂MoO₄ Das erfindungsgemäße Mittel unterscheidet sich von dem bekannten Indikatorsystem wesentlich durch den Gehalt an einem Molybdat. Dieses Molybdat wirkt als Katalysator und führt gegenüber dem bekannten Indikatorsystem zu einem erheblichen technischen Fortschritt. Vergleichsversuche haben ergeben, daß die Bestimmung des Glucosegehalts nicht nur wesentlich schneller durchgeführt werden kann, sondern daß auch die Konzentration durch eine

ίο intensivere Färbung besonders deutlich in Erscheinung tritt. Schwankungen in der Konzentration können daher exakter bestimmt werden.

Die Glucoseoxydase (Glucose-aerodehydrogenase) katalysiert bekanntlich die aerobische Oxydation der

is Glucose unter Bildung von Gluconsäure (Gluconlacton) und Wasserstoffperoxyd. Das Jodid und das Molybdat ihrerseits katalysieren die Oxydation von Indikatoren durch das bei der Oxydation der Glucose gebildete Wasserstoffperoxyd. Die letztere Reaktion kann durch die folgende schematische Gleichung wiedergegeben werden:

oxydiertes Diaminofiuoren (blaue Farbe).

Der Grad der Blaufärbung zeigt mittelbar, aber genau den Glucosegehalt der zu untersuchenden Flüssigkeit an.

Das der Wirkung des Jodides und des Molybdate zugrunde liegende Prinzip sowie das Zusammenwirken und die Wechselwirkung dieser Salze ist noch nicht restlos bekannt. Es scheint aber, daß diese Salze analytisch die Rolle von Elektronenübertragungsmitteln spielen. Es wurde gefunden, daß infolge der gemeinsamen Gegenwart dieser Salze — wobei das eine die Wirkung des anderen steigert — die Reaktion schneller verläuft und geringere Konzentrationen an Wasserstoffperoxyd und dementsprechend an Glucose bestimmt werden können. Diese Salze können daher als Beschleuniger bezeichnet werden, welche die Oxydation des Indikators durch das Wasserstoffperoxyd beschleunigen und verstärken.

Der Gehalt des neuen Glucosediagnostikums an Kaliumiodid und Natriummolybdat, die beide im Handel erhältlich sind, stellt auf dem Gebiete des Nachweises der Glucose einen bedeutenden technischen Fortschritt dar. Die zur Zeit im Handel befindlichen Glucoseindikatoren in Stiftform machen für den Nachweis von Wasserstoffperoxyd von der Wirkung von Enzymen^ wife Peroxydäsen, Gebrauch. Im Gegensatz dazu macht der erfindungsgemäße Glucoseindikator von einem nicht enzymatischen Mittel Gebrauch, welches eine genauer steuerbare und bestimmtere Zusammensetzung ermöglicht. Es handelt sich also um einen sehr empfindlichen Nachweis für Wasserstoffperoxyd und dementsprechend für Glucose.

An Stelle von Kaliumiodid und Natriummolybdat können auch Natrium- oder Ammoniumjodid bzw. Kalium- oder Ammoniummolybdat verwendet werden. An Stelle von 2,7-Diaminofluoren können auch als zufriedenstellende Indikatoren o-Tolidin, o-Dianisidin, Leukoindophenole usw. verwendet werden.

Aus den nachstehenden Beispielen ist ersichtlich, daß den Reagenzgemischen Schutzmittel, Verdickungsmittel, Netzmittel, Suspendierungsmittel u. dgl. sowie inerte Farbstoffe zur Erzielung einer gleichmäßigen Grundhelligkeit der Farbe als weitere Zusätze beigegeben werden.

Ferner ist es wichtig, dem Mittel ein geeignetes Puffersystem zuzusetzen, um den gewünschten pH-Bereich in Gegenwart von Urin innezuhalten. Der pH-Wert kann zwar im Bereich von 4 bis 7,5 variieren; bevorzugt wird jedoch ein pH-Wert von 6,7.

Das diagnostische Mittel kann das Reagenzgemisch in Form einer Tablette, eines Pulvers oder in anderer Form enthalten; vorzugsweise wird das Reagenzgemisch jedoch aufsaugenden Grundstoffen oder Trägern, wie Streifen oder Stiften aus Filterpapier, einverleibt, indem man die Komponenten in einem geeigneten Lösungsmittel löst, die aufsaugenden Streifen mit der Lösung tränkt und sie dann trocknet. Durch die Anwendung des diagnostischen Mittels in Form von Teststiften gestaltet sich das Testverfahren leicht und einfach.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, ihren Umfang jedoch nicht beschränken.

Beispiel 1

Zusammensetzung der Tränklösung

Polyvinylalkohol Ig

95°/₀iges Äthanol 15 ecm

Glycin 3 g

Kaliumiodid Ig

Na₂MoO₄-2H₂O 0,5 g

Gelatine 0,4 g

Dinatriumsalz des 9-o-Carboxyphenyl-o-hydroxy^^jS^-tetrajod-

3-isoxanthons 0,015 g

Glucoseoxydase 0,5 g

2,7-Diaminofluoren · 2 HCl 0,3 g

Phosphatpuffer (pH 6,5) 20 ecm

Wasser 50 ecm

Insgesamt 85 ecm

Herstellung der Tränklösung

1. 1 g Polyvinylalkohol wird in 10 ecm Wasser unter Erhitzen gelöst. Man setzt 15 ecm 95°/_oiges Äthanol und 10 ecm einer Gelatine-Farbstoff-Lösung

zu, die durch Lösen von 4 g Gelatine und 0,15 g Dinatriumsalz des !J-o-Carboxyphenyl-o-hydroxy-2,4,5,7-tetrajod-3-isoxanthons in 100 ecm siedendem Wasser hergestellt wird.

2. 3 g Glycin und 1 g Kaliumiodid werden in 10 ecm siedendem Wasser gelöst, die Lösung wird zur Lösung Nr. 1 zugesetzt und gekühlt.

3. 0,5 g Glucoseoxydase (16 000 Einheiten/g) werden in 10 ecm Wasser gelöst und die Lösung zur Lösung Nr. 2 zugesetzt.

4. 0,3 g 2,7-Diaminofluoren-dihydrochlorid werden in 5 ecm Wasser gelöst und die Lösung zur Lösung Nr. 3 zugesetzt.

5. 20 ecm Phosphatpuffer (pH 6,5) — hergestellt durch Lösen von 43,55 g Dikaliumphosphat (K₂HPO₄) und 39,0 g Mononatriumphosphat (NaH₂PO₄ · H₂O) in Wasser und Auffüllen auf 500 ecm — werden unter ständigem Rühren zur Lösung Nr. 4 zugesetzt.

6. Schließlich löst man 0,5 g Na₂MoO₄ · 2 H₂O in

5 ecm Wasser und setzt diese Lösung langsam unter so ständigem Rühren zur Lösung Nr. 5 zu. Die Tränklösung ist nun gebrauchsfertig.

Herstellung der Reagenzstreifen

25

Aufsaugende Streifen, z. B. zu schmalen Streifen zerschnittenes Filterpapier, werden so in die Tränklösung getaucht, daß durch das Eintauchen und die Kapillarwirkung etwa 13 mm an einem Ende des Streifens vollständig getränkt werden. Dann werden die Streifen in dem Trockentunnel eines Ofens mit künstlichem Luftzug getrocknet. Der Testabschnitt dieser Streifen weist eine rote Farbe auf. Man kann natürlich auch andere poröse oder absorbierende Stoffe, wie kleine Holzstifte usw., und andere Methoden zum Aufbringen der Tränklösung und zum Trocknen der getränkten Stifte verwenden.

Glycin-Jodkali-Lösung zugesetzt, und das Ganze wird zur Lösung Nr. 2 zugesetzt.

4. 0,5 g Glucoseoxydase (16 000 Einheiten/g) werden in 5 ecm Wasser gelöst und die Lösung zur Lösung Nr. 3 zugesetzt.

5. 0,3 g 2,7-Diaminofiuoren-dihydrochlorid werden in 5 ecm Wasser und 15 ecm 95%igem Äthanol gelöst und die Lösung unter beständigem Rühren zur Lösung Nr. 4 zugesetzt.

6. 10 ecm Gelatine-Farbstoff-Lösung (hergestellt durch Lösen von 4 g Gelatine und 0,15 g Dinatriumsalz des 9-o-Carboxyphenyl-6-hydroxy-2,4,5,7-tetrajod-3-isoxanthons in 100 ecm siedendem Wasser) werden zur Lösung Nr. 5 zugesetzt.

7. 0,5 g Na₂MoO₄ · 2 H₂O werden in 5 ecm Wasser gelöst und die Lösung zur Lösung Nr. 6 zugesetzt. Die Tränklösung ist nun gebrauchsfertig.

Hierauf werden nach dem Verfahren des Beispiels 1 Teststreifen hergestellt.

so

Beispiel 3

Zusammensetzung der Tränklösung

Beispiel 2
Zusammensetzung der Tränklösung

Algin 0,3 g

Polyvinylalkohol Ig

Glycin 3 g

Kaliumiodid Ig

Puffer 10 ecm

Glucoseoxydase 0,5 g

2,7-Diaminofluoren · 2 HCl 0,3 g

95%iges Äthanol 15 ecm

Gelatine 0,4 g

Dinatriumsalz des 9-o-Carboxyphe-

nyl-o-hydroxy^ASJ-tetrajod-

3-isoxanthons 0,015 g

Na₂MoO₄ · 2 H₂O 0,5 g

Wasser 65 ecm

Gesamtvolumen 100 ecm

Herstellung der Tränklösung

1. 0,3 g Algin werden in 20 ecm Wasser gelöst.

2. 1 g Polyvinylalkohol wird in 10 ecm Wasser unter Erhitzen gelöst und die Lösung zur Lösung Nr. 1 zugesetzt.

3. 3 g Glycin und 1 g Kaliumiodid werden in 10 ecm siedendem Wasser gelöst. 10 ecm Pufferlösung — hergestellt durch Lösen von 436 g Dikaliumphosphat (K₂HPO₄) in 1000 ecm Wasser und Zusatz von 290 ecm 2,5molarer Phosphorsäure — werden zu der

Algin 0,5 g

Kaliumiodid Ig

Na₂MoO₄-2 H₂O 0,5 g

Glycin 3 g

Gelatine 0,4 g

Dinatriumsalz des 9-o-Carboxyphenyl-

6-hydroxy-2,4,5,7-tetrajod-

3-isoxanthons 0,015 g

Glucoseoxydase 0,5 g

Mit 2,7-Diaminofluoren behandelte,

kationenaustauschende Cellulose .. 4 g

Wasser 80 ecm

Herstellung der Tränklösung

1. 0,5 g Algin werden in 30 ecm Wasser gelöst.
2. 1 g Kaliumiodid, 3 g Glycin und 0,5 g Na₂MoO₄ · 2 H₂O werden in 20 ecm heißen Wassers gelöst. Zu dieser Lösung werden 10 ecm 4°/₀ige Gelatine-Farbstoff-Lösung, hergestellt nach Beispiel 1, zugesetzt.

3. Die Lösung Nr. 2 wird zur Lösung Nr. 1 zugesetzt, wobei man die Lösung Nr. 3 erhält.

4. 0,5 g Glucoseoxydase (16 000 Einheiten/g) werden in 10 ecm Wasser gelöst und die Lösung zur Lösung Nr. 3 zugesetzt.

5. Schließlich setzt man zu dem Gemisch 4 g kationenaustauschende Cellulose zu, die mit 2,7-Diaminofluoren nach dem folgenden Verfahren behandelt worden ist:

2 g 2,7-Diaminofluoren-dihydrochlorid werden in 100 ecm Wasser gelöst. 20 g kationenaustauschende Cellulose werden mit dieser Lösung gemischt, und das Gemisch wird unter gelegentlichem Umrühren 30 Minuten stehengelassen. Die Cellulose wird dann auf einer Nutsche abfiltriert und viermal durch Wiederaufschlämmen in je 100 ecm Wasser gewaschen. Vor der Verwendung wird die Cellulose getrocknet.

Die Verwendung der kationenaustauschenden Cellulose bei dieser Ausführungsform der Erfindung hat einen doppelten Zweck: Sie hält den Indikator in Suspension, so daß er sich nicht absetzen kann, und sie dient als Puffer für das Reagenzgemisch. Bei den Ausführungsformen gemäß Beispiel 1 und 2 übernehmen der Polyvinylalkohol und das Puffersystem diese Aufgaben.

Testverfahren

Bei der Anwendung wird ein, wie oben beschrieben, getränkter Streifen in die 2x1 untersuchende Flüssigkeitsprobe eingetaucht. Kommt der Streifen mit Urin in Berührung, der Glucose enthält, so liefert er in etwa 5 bis 30 Sekunden eine positive Reaktion, die sich durch verschiedene blaue Farbtönungen folgendermaßen zu erkennen gibt:

Mit Urin, der 1 oder 2% Glucose enthält, entwickelt sich eine starke, tiefblaue Farbe, während bei Urin, der nur 0,1% °der weniger Glucose enthält, die rote Farbe des getränkten Streifens in ein deutliches Hellblau umschlägt. Bei Urinproben, die 0,1 bis 1 % Glucose enthalten, besitzen die sich entwickelnden blauen Farben mittlere Intensitäten; je höher der Glucosegehalt des Urins ist, desto tiefer ist der Farbton. Taucht man den Streifen in Urin, der keine Glucose enthält, so findet keine Farbänderung statt. Eine auf Grund dieser Erscheinung hergestellte einfache Farbtafel läßt sich leicht zur Verwendung bei der Untersuchung des Urins auf Glucose herstellen.

Außer den in den obigen Beispielen beschriebenen Stoffgemischen, die die optimalen Konzentrationen veranschaulichen, sind Änderungen in den Mengen der Komponenten gemäß der nachfolgenden Tabelle statthaft:

Glucoseoxydase 4000 bis 16 000 Einheiten

Kaliumjodid 0,25 bis 1,5 g

Natriummolybdat 0,1 bis 1,5 g

2,7-Diaminofluoren ■ 2 HC 0,2 bis 1,0 g

Puffer 0,1- bis 0,3molar

(pH 4,0 bis 7,5)

Polyvinylalkohol 0 bis 3 g

Algin Obis 0,5 g

Glycin Obis 12g

Gelatine 0 bis 1,0 g

Dinatriumsalz des

9-o-Carboxyphenyl-

6-hydroxy-

2,4,5,7-tetrajod-

3-isoxanthons 0 bis 0,015 g

Die nach den obigen Beispielen hergestellten Tränklösungen sowie die mit ihnen getränkten Teststreifen haben sich als sehr beständig erwiesen. Es wird jedoch empfohlen, die Streifen in braunen Flaschen aufzubewahren, die Trockenmittelpackungen enthalten.

Claims

Patentansprüche:

1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Glucose in Körperflüssigkeiten, enthaltend GIucoseoxidase, Kalium-, Natrium- oder Ammoniumjodid und einen in Gegenwart des Jodides durch Wasserstoffperoxyd oxydierbaren Farbbildner, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem Natrium-, Kalium- oder Ammoniummolybdat enthält.

2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 2,7-Diaminofluoren, o-Tolidin oder Dianisidin als Farbbildner enthält.

3. Testindikator zum Nachweis von Glucose in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem mit den in den Ansprüchen 1 und 2 angegebenen Bestandteilen getränkten saugfähigen Träger besteht.