DE1284124B - Diagnostisches Mittel und Testindikator zum Nachweis von Glucose in Koerperfluessigkeiten - Google Patents
Diagnostisches Mittel und Testindikator zum Nachweis von Glucose in KoerperfluessigkeitenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein neues und verbessertes diagnostisches Mittel und einen Testindikator zum qualitativen
Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Glucose in biologischen Flüssigkeiten, wie Urin.
Verfahren zum Nachweis von Zucker im Urin sind in der klinischen Chemie an sich bekannt. Es ist bereits
ein Glucoseindikator auf der Basis von Glucoseoxidase und einem auf Oxydation ansprechenden Farbstoffsystem
bekannt. Dabei wird ein Gemisch aus Kaliumjodid und o-Tolidin benutzt, welches bei Anwesenheit
von Glucose durch Umsetzung mit dem bei der Oxydation der Glucose durch die Glucoseoxidase
entstehenden Wasserstoffperoxyd eine blaue Farbe entwickelt.
Das diagnostische Mittel zum Nachweise von Glucose in Körperflüssigkeiten enthält Glucoseoxidase,
Kalium-, Natrium- oder Ammoniumjodid und einen in Gegenwart des Jodides und durch Wasserstoffperoxyd
oxydierbaren Farbbildner. Erfindungsgemäß weist es außerdem einen Gehalt an Natrium-, Kalium- oder
Ammoniummolybdat auf.
H2O2 + Diaminofiuoren (farblos)
KJ
Na2MoO4 Das erfindungsgemäße Mittel unterscheidet sich
von dem bekannten Indikatorsystem wesentlich durch den Gehalt an einem Molybdat. Dieses Molybdat
wirkt als Katalysator und führt gegenüber dem bekannten Indikatorsystem zu einem erheblichen
technischen Fortschritt. Vergleichsversuche haben ergeben, daß die Bestimmung des Glucosegehalts
nicht nur wesentlich schneller durchgeführt werden kann, sondern daß auch die Konzentration durch eine
ίο intensivere Färbung besonders deutlich in Erscheinung
tritt. Schwankungen in der Konzentration können daher exakter bestimmt werden.
Die Glucoseoxydase (Glucose-aerodehydrogenase) katalysiert bekanntlich die aerobische Oxydation der
is Glucose unter Bildung von Gluconsäure (Gluconlacton)
und Wasserstoffperoxyd. Das Jodid und das Molybdat ihrerseits katalysieren die Oxydation von
Indikatoren durch das bei der Oxydation der Glucose gebildete Wasserstoffperoxyd. Die letztere Reaktion
kann durch die folgende schematische Gleichung wiedergegeben werden:
oxydiertes Diaminofiuoren (blaue Farbe).
Der Grad der Blaufärbung zeigt mittelbar, aber genau den Glucosegehalt der zu untersuchenden
Flüssigkeit an.
Das der Wirkung des Jodides und des Molybdate zugrunde liegende Prinzip sowie das Zusammenwirken
und die Wechselwirkung dieser Salze ist noch nicht restlos bekannt. Es scheint aber, daß diese Salze
analytisch die Rolle von Elektronenübertragungsmitteln spielen. Es wurde gefunden, daß infolge der
gemeinsamen Gegenwart dieser Salze — wobei das eine die Wirkung des anderen steigert — die Reaktion
schneller verläuft und geringere Konzentrationen an Wasserstoffperoxyd und dementsprechend an Glucose
bestimmt werden können. Diese Salze können daher als Beschleuniger bezeichnet werden, welche die
Oxydation des Indikators durch das Wasserstoffperoxyd beschleunigen und verstärken.
Der Gehalt des neuen Glucosediagnostikums an Kaliumiodid und Natriummolybdat, die beide im
Handel erhältlich sind, stellt auf dem Gebiete des Nachweises der Glucose einen bedeutenden technischen
Fortschritt dar. Die zur Zeit im Handel befindlichen Glucoseindikatoren in Stiftform machen für den
Nachweis von Wasserstoffperoxyd von der Wirkung von Enzymen^ wife Peroxydäsen, Gebrauch. Im Gegensatz
dazu macht der erfindungsgemäße Glucoseindikator von einem nicht enzymatischen Mittel Gebrauch,
welches eine genauer steuerbare und bestimmtere Zusammensetzung ermöglicht. Es handelt sich
also um einen sehr empfindlichen Nachweis für Wasserstoffperoxyd und dementsprechend für Glucose.
An Stelle von Kaliumiodid und Natriummolybdat können auch Natrium- oder Ammoniumjodid bzw.
Kalium- oder Ammoniummolybdat verwendet werden. An Stelle von 2,7-Diaminofluoren können auch als
zufriedenstellende Indikatoren o-Tolidin, o-Dianisidin, Leukoindophenole usw. verwendet werden.
Aus den nachstehenden Beispielen ist ersichtlich, daß den Reagenzgemischen Schutzmittel, Verdickungsmittel,
Netzmittel, Suspendierungsmittel u. dgl. sowie inerte Farbstoffe zur Erzielung einer gleichmäßigen
Grundhelligkeit der Farbe als weitere Zusätze beigegeben werden.
Ferner ist es wichtig, dem Mittel ein geeignetes Puffersystem zuzusetzen, um den gewünschten pH-Bereich
in Gegenwart von Urin innezuhalten. Der pH-Wert kann zwar im Bereich von 4 bis 7,5 variieren;
bevorzugt wird jedoch ein pH-Wert von 6,7.
Das diagnostische Mittel kann das Reagenzgemisch in Form einer Tablette, eines Pulvers oder in anderer
Form enthalten; vorzugsweise wird das Reagenzgemisch jedoch aufsaugenden Grundstoffen oder
Trägern, wie Streifen oder Stiften aus Filterpapier, einverleibt, indem man die Komponenten in einem
geeigneten Lösungsmittel löst, die aufsaugenden Streifen mit der Lösung tränkt und sie dann trocknet.
Durch die Anwendung des diagnostischen Mittels in Form von Teststiften gestaltet sich das Testverfahren
leicht und einfach.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, ihren Umfang jedoch nicht beschränken.
Zusammensetzung der Tränklösung
Polyvinylalkohol Ig
95°/0iges Äthanol 15 ecm
Glycin 3 g
Kaliumiodid Ig
Na2MoO4-2H2O 0,5 g
Gelatine 0,4 g
Dinatriumsalz des 9-o-Carboxyphenyl-o-hydroxy^^jS^-tetrajod-
3-isoxanthons 0,015 g
Glucoseoxydase 0,5 g
2,7-Diaminofluoren · 2 HCl 0,3 g
Phosphatpuffer (pH 6,5) 20 ecm
Wasser 50 ecm
Insgesamt 85 ecm
Herstellung der Tränklösung
1. 1 g Polyvinylalkohol wird in 10 ecm Wasser unter Erhitzen gelöst. Man setzt 15 ecm 95°/oiges
Äthanol und 10 ecm einer Gelatine-Farbstoff-Lösung
zu, die durch Lösen von 4 g Gelatine und 0,15 g Dinatriumsalz des !J-o-Carboxyphenyl-o-hydroxy-2,4,5,7-tetrajod-3-isoxanthons
in 100 ecm siedendem Wasser hergestellt wird.
2. 3 g Glycin und 1 g Kaliumiodid werden in 10 ecm siedendem Wasser gelöst, die Lösung wird zur
Lösung Nr. 1 zugesetzt und gekühlt.
3. 0,5 g Glucoseoxydase (16 000 Einheiten/g) werden in 10 ecm Wasser gelöst und die Lösung zur Lösung
Nr. 2 zugesetzt.
4. 0,3 g 2,7-Diaminofluoren-dihydrochlorid werden
in 5 ecm Wasser gelöst und die Lösung zur Lösung Nr. 3 zugesetzt.
5. 20 ecm Phosphatpuffer (pH 6,5) — hergestellt
durch Lösen von 43,55 g Dikaliumphosphat (K2HPO4)
und 39,0 g Mononatriumphosphat (NaH2PO4 · H2O)
in Wasser und Auffüllen auf 500 ecm — werden unter ständigem Rühren zur Lösung Nr. 4 zugesetzt.
6. Schließlich löst man 0,5 g Na2MoO4 · 2 H2O in
5 ecm Wasser und setzt diese Lösung langsam unter so
ständigem Rühren zur Lösung Nr. 5 zu. Die Tränklösung ist nun gebrauchsfertig.
Herstellung der Reagenzstreifen
25
Aufsaugende Streifen, z. B. zu schmalen Streifen zerschnittenes Filterpapier, werden so in die Tränklösung
getaucht, daß durch das Eintauchen und die Kapillarwirkung etwa 13 mm an einem Ende des
Streifens vollständig getränkt werden. Dann werden die Streifen in dem Trockentunnel eines Ofens mit
künstlichem Luftzug getrocknet. Der Testabschnitt dieser Streifen weist eine rote Farbe auf. Man kann
natürlich auch andere poröse oder absorbierende Stoffe, wie kleine Holzstifte usw., und andere Methoden
zum Aufbringen der Tränklösung und zum Trocknen der getränkten Stifte verwenden.
Glycin-Jodkali-Lösung zugesetzt, und das Ganze wird zur Lösung Nr. 2 zugesetzt.
4. 0,5 g Glucoseoxydase (16 000 Einheiten/g) werden in 5 ecm Wasser gelöst und die Lösung zur Lösung
Nr. 3 zugesetzt.
5. 0,3 g 2,7-Diaminofiuoren-dihydrochlorid werden in 5 ecm Wasser und 15 ecm 95%igem Äthanol gelöst
und die Lösung unter beständigem Rühren zur Lösung Nr. 4 zugesetzt.
6. 10 ecm Gelatine-Farbstoff-Lösung (hergestellt
durch Lösen von 4 g Gelatine und 0,15 g Dinatriumsalz des 9-o-Carboxyphenyl-6-hydroxy-2,4,5,7-tetrajod-3-isoxanthons
in 100 ecm siedendem Wasser) werden zur Lösung Nr. 5 zugesetzt.
7. 0,5 g Na2MoO4 · 2 H2O werden in 5 ecm Wasser
gelöst und die Lösung zur Lösung Nr. 6 zugesetzt. Die Tränklösung ist nun gebrauchsfertig.
Hierauf werden nach dem Verfahren des Beispiels 1 Teststreifen hergestellt.
so
Zusammensetzung der Tränklösung
Beispiel 2
Zusammensetzung der Tränklösung
Zusammensetzung der Tränklösung
Algin 0,3 g
Polyvinylalkohol Ig
Glycin 3 g
Kaliumiodid Ig
Puffer 10 ecm
Glucoseoxydase 0,5 g
2,7-Diaminofluoren · 2 HCl 0,3 g
95%iges Äthanol 15 ecm
Gelatine 0,4 g
Dinatriumsalz des 9-o-Carboxyphe-
nyl-o-hydroxy^ASJ-tetrajod-
3-isoxanthons 0,015 g
Na2MoO4 · 2 H2O 0,5 g
Wasser 65 ecm
Gesamtvolumen 100 ecm
Herstellung der Tränklösung
1. 0,3 g Algin werden in 20 ecm Wasser gelöst.
2. 1 g Polyvinylalkohol wird in 10 ecm Wasser unter Erhitzen gelöst und die Lösung zur Lösung Nr. 1
zugesetzt.
3. 3 g Glycin und 1 g Kaliumiodid werden in 10 ecm siedendem Wasser gelöst. 10 ecm Pufferlösung
— hergestellt durch Lösen von 436 g Dikaliumphosphat (K2HPO4) in 1000 ecm Wasser und Zusatz von
290 ecm 2,5molarer Phosphorsäure — werden zu der
Algin 0,5 g
Kaliumiodid Ig
Na2MoO4-2 H2O 0,5 g
Glycin 3 g
Gelatine 0,4 g
Dinatriumsalz des 9-o-Carboxyphenyl-
6-hydroxy-2,4,5,7-tetrajod-
3-isoxanthons 0,015 g
Glucoseoxydase 0,5 g
Mit 2,7-Diaminofluoren behandelte,
kationenaustauschende Cellulose .. 4 g
Wasser 80 ecm
Herstellung der Tränklösung
1. 0,5 g Algin werden in 30 ecm Wasser gelöst.
2. 1 g Kaliumiodid, 3 g Glycin und 0,5 g Na2MoO4 · 2 H2O werden in 20 ecm heißen Wassers gelöst. Zu dieser Lösung werden 10 ecm 4°/0ige Gelatine-Farbstoff-Lösung, hergestellt nach Beispiel 1, zugesetzt.
2. 1 g Kaliumiodid, 3 g Glycin und 0,5 g Na2MoO4 · 2 H2O werden in 20 ecm heißen Wassers gelöst. Zu dieser Lösung werden 10 ecm 4°/0ige Gelatine-Farbstoff-Lösung, hergestellt nach Beispiel 1, zugesetzt.
3. Die Lösung Nr. 2 wird zur Lösung Nr. 1 zugesetzt, wobei man die Lösung Nr. 3 erhält.
4. 0,5 g Glucoseoxydase (16 000 Einheiten/g) werden in 10 ecm Wasser gelöst und die Lösung zur Lösung
Nr. 3 zugesetzt.
5. Schließlich setzt man zu dem Gemisch 4 g kationenaustauschende Cellulose zu, die mit 2,7-Diaminofluoren
nach dem folgenden Verfahren behandelt worden ist:
2 g 2,7-Diaminofluoren-dihydrochlorid werden in
100 ecm Wasser gelöst. 20 g kationenaustauschende Cellulose werden mit dieser Lösung gemischt, und das
Gemisch wird unter gelegentlichem Umrühren 30 Minuten stehengelassen. Die Cellulose wird dann auf
einer Nutsche abfiltriert und viermal durch Wiederaufschlämmen in je 100 ecm Wasser gewaschen. Vor
der Verwendung wird die Cellulose getrocknet.
Die Verwendung der kationenaustauschenden Cellulose bei dieser Ausführungsform der Erfindung hat
einen doppelten Zweck: Sie hält den Indikator in Suspension, so daß er sich nicht absetzen kann, und
sie dient als Puffer für das Reagenzgemisch. Bei den Ausführungsformen gemäß Beispiel 1 und 2 übernehmen
der Polyvinylalkohol und das Puffersystem diese Aufgaben.
Testverfahren
Bei der Anwendung wird ein, wie oben beschrieben, getränkter Streifen in die 2x1 untersuchende Flüssigkeitsprobe
eingetaucht. Kommt der Streifen mit Urin in Berührung, der Glucose enthält, so liefert er in etwa
5 bis 30 Sekunden eine positive Reaktion, die sich durch verschiedene blaue Farbtönungen folgendermaßen
zu erkennen gibt:
Mit Urin, der 1 oder 2% Glucose enthält, entwickelt sich eine starke, tiefblaue Farbe, während bei
Urin, der nur 0,1% °der weniger Glucose enthält,
die rote Farbe des getränkten Streifens in ein deutliches Hellblau umschlägt. Bei Urinproben, die 0,1
bis 1 % Glucose enthalten, besitzen die sich entwickelnden blauen Farben mittlere Intensitäten; je
höher der Glucosegehalt des Urins ist, desto tiefer ist der Farbton. Taucht man den Streifen in Urin, der
keine Glucose enthält, so findet keine Farbänderung statt. Eine auf Grund dieser Erscheinung hergestellte
einfache Farbtafel läßt sich leicht zur Verwendung bei der Untersuchung des Urins auf Glucose herstellen.
Außer den in den obigen Beispielen beschriebenen Stoffgemischen, die die optimalen Konzentrationen
veranschaulichen, sind Änderungen in den Mengen der Komponenten gemäß der nachfolgenden Tabelle
statthaft:
Glucoseoxydase 4000 bis 16 000 Einheiten
Kaliumjodid 0,25 bis 1,5 g
Natriummolybdat 0,1 bis 1,5 g
2,7-Diaminofluoren ■ 2 HC 0,2 bis 1,0 g
Puffer 0,1- bis 0,3molar
(pH 4,0 bis 7,5)
Polyvinylalkohol 0 bis 3 g
Algin Obis 0,5 g
Glycin Obis 12g
Gelatine 0 bis 1,0 g
Dinatriumsalz des
9-o-Carboxyphenyl-
6-hydroxy-
2,4,5,7-tetrajod-
3-isoxanthons 0 bis 0,015 g
Die nach den obigen Beispielen hergestellten Tränklösungen sowie die mit ihnen getränkten Teststreifen
haben sich als sehr beständig erwiesen. Es wird jedoch empfohlen, die Streifen in braunen Flaschen aufzubewahren,
die Trockenmittelpackungen enthalten.
Claims (3)
1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Glucose in Körperflüssigkeiten, enthaltend GIucoseoxidase,
Kalium-, Natrium- oder Ammoniumjodid und einen in Gegenwart des Jodides durch
Wasserstoffperoxyd oxydierbaren Farbbildner, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem
Natrium-, Kalium- oder Ammoniummolybdat enthält.
2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 2,7-Diaminofluoren,
o-Tolidin oder Dianisidin als Farbbildner enthält.
3. Testindikator zum Nachweis von Glucose in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß
er aus einem mit den in den Ansprüchen 1 und 2 angegebenen Bestandteilen getränkten saugfähigen
Träger besteht.
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