DE2030720A1

DE2030720A1 - Diagnostische Zusammensetzung und Verfahren zum Nachweis der Nitratreduktion

Info

Publication number: DE2030720A1
Application number: DE19702030720
Authority: DE
Inventors: Donald P Rockaway Young William D Montclair NJ Kronish (V St A )
Original assignee: Warner Lambert Pharmaceutical Co , Morris Plains, NJ (V St A )
Priority date: 1969-06-24
Filing date: 1970-06-22
Publication date: 1971-01-07
Also published as: CH541626A; JPS5413508B1; SE380044B; GB1246080A; DE2030720B2; US3645853A; FR2051227A5; DE2030720C3

Description

weis der Nitratreduktion

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine diagnostische Zusammensetzung und ein Verfahren zum Nachweis der Nitrat-zuNitrit-Reduktion durch Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Trägermaterial in verschiedenen Zonen mit einem Nitrat enthaltenden Medium, einer Trennzusammensetzung und zwei stabilen Reagenslösungen imprägniert ist. Bei der Verwendung wird eine Suspension der zu untersuchenden Kultur in Gegenwart des Nitratmediums inkubiert, und die Reduktion von Nitrat zu Nitrit wird durch die Farbbildung in den Reagenszonen angezeigt.

Der taxonomische Wert des Nitratreduktionsversuchs für die Identifizierung und Differenzierung von Mikroorganismen, die

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ORIGINAL INSPECTED

gegenüber Menschen pathogen sind, ist gut bekannt. Die Enterobacteriaceen-Familie reagiert bei dem Nitratreduktionsversuch positiv. Bestimmte Bakterien reduzieren nur Nitrat zu Nitrit, während andere weiter reduzieren und Nitritverbindungen in freien Stickstoff oder Ammoniak überführen.

Unabhängig von seinem Wert ist die Anwendung des Nitratreduktionsversuchs im klinischen Laboratorium beschränkt wegen der Tatsache, daß die Zeit, die erforderlich ist, zu lang ist, um Ergebnisse von wirklichem Wert zu erhalten. Weiterhin erfordern die bekannten Testverfahren die sorgfältige Herstellung der notwendigen Reagentien unmittelbar vor dem Gebrauch.

Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit von Bakterien, Nitrat zu Nitrit zu reduzieren, sind bekannt. Bei dem klassischen Versuch wird ein Nährmedium, das Kaliumnitrat (nitritfrei) enthält, mit einer reinen Kultur des zu prüfenden Stammes inokuliert und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wird auf die Anwesenheit von Nitriten geprüft, indem man 0,1 ml einer Mischung der Testreagentien, hergestellt aus 0,8 Gewi chts-/VoIumen-% SuIfanilsäure in 5n-Essigsäure und 0,5 Gewichts-/Volumen-% a-Naphthylamin (1-Aminonaphthalin) in 5n-Essigsäure, zufügt. Diese Reagentien werden unmittelbar vor dem Gebrauch vermischt. Die Entwicklung einer deutlichen rosa oder roten Farbe in dem Testmedium nach der Zugabe der Mischung der Reagentien zeigt die Anwesenheit von Nitrit an, das aus dem ursprünglichen Nitrat entstanden ist ("Identificatiion of Enterobacteriaceae", P.R. Edwards und W.H. Ewing, Burgess Pub. Co., 1962, gedruckt 1964).

In einer anderen Arbeit ("Quicker Bacteriological Results", R.H. Weaver, Am. J. Med. Tech., 2£, S. 14 bis 26, 1954) wird angegeben, daß eine Inkubationszeit von 15 Minuten möglich ist unter Verwendung eines Mediums, das Pepton, Rindfleischextrakt und Kaliumnitrat enthält; jedoch muß das übliche Nitritreagens noch zugefügt werden, um als Anzeichen dafür, daß die Reduktion des Nitrats zu Nitrit stattgefunden hat, Farbentwicklung zu liefern. 0 09882/1683

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Daraus ist ersichtlich, obgleich einiger Fortschritt erhalten wurde, daß die bekannten Verfahren noch die mühevolle Herstellung der kritischen Testreagentien einschließen, die nur unmittelbar vor der Verwendung vermischt werden können. Die bekannten Verfahren besitzen alle den Nachteil, daß sie ein beachtliches Wissen und hohe Geschicklichkeit erfordern, um zuverlässige, reproduzierbare Versuchsergebnisse zu liefern.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine verbesserte diagnostische Zusammensetzung zu liefern für die schnelle Identifizierung und Differenzierung von Mikroorganismen, die Nitrat zu Nitrit reduzieren. *

Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine diagnostische Zusammensetzung zu liefern, die alle erforderlichen Nährmedien und Reagentien für diesen Differenzierungsversuch in einer vorbestimmten, stabilen, lei»Jit zu verwendenden Form enthält.

Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine diagnostische Zusammensetzung zu liefern, in der all die erforderlichen Nährstoffe und Testreagentien in ein einziges Trägermaterial eingearbeitet sind.

Ein schnelles, empfindliches und genaues Testverfahren, bei dem die erfindungsgemäße diagnostische Zusammensetzung verwendet wird und für das nur etwa 2 Stunden bis zur Beendigung erforderlich sind, ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Eine stabile diagnostische Zusammensetzung und ein schnelles Verfahren zur Identifikation und Differentiation von Mikroorganismen, die Nitrat zu Nitrit reduzieren, wird in Form eines imprägnierten Trägermaterials geliefert. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung macht es möglich, zwischen Mikroorganismen zu unterscheiden, die Nitrat reduzieren oder nicht reduzieren, in einer so kurzen Zeit wie etwa 2 Stunden,

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da sie so empfindlich ist, daß es möglich ist, so wenig wie 1 Aig Nitrit nachzuweisen. Die diagnostische Zusammensetzung ist mindestens 12 Monate bei Zimmertemperatur stabil»

Die beigefügte Zeichnung ist eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen schwammigen Teststreifens, imprägniert im Bereich 1 mit dem Nitratmedium als Zone A, im Bereich 2 mit der hydrophoben Trennschicht als Zone B^,_s an einer Seite des Bereichs 3 mit dem Reagensmittel als Zone C und an der anderen Seite des Bereichs 3 mit dem Reagensmittel als Zone D, im Bereich 4 mit einer hydrophoben Trennschicht als Zone B„ und im Bereich 6 mit einem Farbstoff als Zone E; der Bereich ist nicht behandelt.

Die erfindungsgemäße diagnostische Zusammensetzung wird hergestellt, indem man bestimmte spezifische Bereiche eines schwammartigen Trägermaterials mit einer Lösung eines Nitrat enthaltenden Mediums imprägniert (im folgenden als Nitratmedium Zone A bezeichnet) und stabilen Reagenslösungen (im folgenden Reagentien der Zone C und D bezeichnet), wobei das Nitratmedium von dem Reagens-Zonenbereich durch eine hydrophobe Trennzusammensetzung (die im folgenden als hydrophobe Trenn-Zone B. bezeichnet wird) getrennt ist«, Eine weitere Trennzone, ein nicht behandelter Bereich und eine gefärbte Identifissierungszone sind gegebenenfalls in einer bevorzugten diagnostischen Zusammensetzung vorhanden.

Das imprägnierte schwanunartige Material wird in einzelne Streifen geschnitten, die ausreichende Mengen aller für die Identifizierung und Differenzierung der Mikroorganismen, die in der Lage sind, Nitrat zu Nitrit zu reduzieren, nötigen Bestandteile enthalten«,

Die Zone A mit dem Nitrat enthaltenden Medium kann irgendeine Zusammensetzung sein, die ein nicht»toxisches.Nitratsalz allein oder vorzugsweise zusammen mit einem Nährmediura_s wie Pepton, enthalte Ein bevorzugtes Medium vsxrd beispielsweise hergestellt, indem man" eine i*äßrige Lösung von Rindflei-sch-

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extrakt bzw. Fleischbrühe, Pepton und Kaliumnitrat bildet. Ein besonders bevorzugtes Medium dieser Art wird als Bacto— Nitrat-Fleischbrühe (Bacto-Niträte Broth) (dehydratisiert)
von Difco Laboratories, Detroit, Michigan, verkauft und enthält diese Komponenten in einem Verhältnis von 3 g Rindfleischextrakt zu 5g Pepton und 1 g Kaliumnitrat. Es wurde gefunden, daß eine Lösung von etwa 10 bis 27 g der dehydratisierten Bacto-Nitrat-Fleischbrühe in 100 ml destilliertem Wasser für die Herstellung der erfindungsgemäßen diagnostischen Zusammensetzung sehr geeignet ist.

Die in der Zone B. als hydrophobe Trennschicht verwendete Zusammensetzung verhindert das vorzeitige Auslaugen der Kultur während der Inkubation aufwärts in -die Reagenszone.

Die Trennzusammensetzung muß natürlich in diesem Versuchssystem chemisch und biologisch inert sein. Jede Substanz, die eine wasserdichte Trennschicht dieser Art bildet, kann verwendet werden. Geeignete Materialien schließen ein Wachse,
Lacke und Kunststoffe, insbesondere farblose polymerisiert Methylrnethacrylatüberzugszusammensetzungen, die von Kry'lon, Inc., Norristown, Pa. unter dem Handelsnamen KRYLON 150
Crystal Clear vertrieben werden. Das KRYLON-Material ist besonders bevorzugt. Es wird in einem Toluolträger geliefert ™ und kann zur leichteren Anwendung mit weiterem Toluol oder
anderen Verdünnungsmitteln, wie Äthyl-, Methyl— oder Propylalkohol USP verdünnt werden.

Es wurde gefunden, daß eine Trennschichtlösung, hergestellt aus etwa 75 bis 100 ml KRYLON und 0 bis 25 ml Verdünnungsmittel, geeignet ist.

Auf dem erfindungsgemäßen diagnostischen Testprodukt sind
zwei Reagenszonen vorgesehen. Das Reagens der Zone C enthält eine aminosubstituierte Naphthalinsulfonsäure und ein Alkalimetallsalz der SuIfani!säure oder alternativ SuIfadiazin oder ein. Alkalimetalisalz., von SuIf athiazol, währenddes Reagens

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der Zone D eine kristalline Saure, wie Oxalsäure, Malonsäure oder Citronensäure enthält. Die aminosubstituierte Naphthalinsulfonsäure kann beispielsweise sein 5-Amino-2-naphthalinsulfonsäure, 8-Amino-2-naphthalinsulfonsäure oder 5-Amino-1-naphthalinsulfonsäure, wobei unter diesen drei Säuren die 5-Amino-l-naphthalinsulfonsäure bevorzugt ist. Als. Salz der Sulfanilsäure ist das Natriumsalz bevorzugt. Die zwei mit Reagens imprägnierten Zonen sind einander benachbart auf jedem einzelnen diagnostischen Testprodukt angeordnet, entweder in einer Seite-an-Seite-Lage auf der gleichen Seite des Trägermaterials oder vorzugsweise Rückseite zu Rückseite, wobei die eine der Reagenslösungen auf der einen Seite und die andere Reagenslösung auf der anderen Seite des gleichen Bereichs des Trägermaterials imprägniert wurde» Die zwei Reagenslösungen werden auf dem schwammartigen Trägermaterial getrennt aufgebracht, wobei man zwischen den beiden Anwendungen trocknet, um zu frühes Vermischen der Reagenslösungen vor dem Befeuchten während der Durchführung des Tests zu vermeiden.

Die Reagenslösung der Zone C wird hergestellt aus einer Lösung von 100 ml destilliertem Wasser von:

1. etwa 0,1 bis 4 g, vorzugsweise etwa 0,2 bis 2 g einer aminosubstituierten Naphthalinsulfonsäure und

2. etwa 0,16 bis 7g, vorzugsweise etwa 0,3 bis 4 g eines Alkalimetallsalzes der Sulfanilsäure.

Der p„-Wert der Endlösung für das Reagens der Zone C wird zwischen etwa 7 und 12, vorzugsweise zwischen etwa 9,8 und 10 eingestellt mit einem geeigneten p_H-Modifizierungsmittel, das den diagnostischen Test nicht beeinflußt, wie Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxyd; vorzugsweise verwendet man eine Ο,ΐη-Natriumhydroxydlösung. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine zwischenzeitliche p_H-Einstellung zweckdienlich mit der wäßrigen Lösung der aminosubstituierten Naphthalinsulfonsäure,durchgeführt, wobei man eine ausreichende Menge des p^-einstellenden Mittels (vorzugsweise ln-Natriumhydroxyd) verwendet, um .diese lösung auf einen p„-Wert von

etwa 7 bis 12, vorzugsweise etwa 9,5 bis 10, einzustellen,. Danach wird das Sulfanilsäuresalz zugefügt, die Lösung auf ein Volumen von 100 ml gebracht und der End-p_H-Wert der Lösung eingestellt.

Die Reagenslösung der Zone D wird aus einer Lösung von etwa 20 bis 65 g und vorzugsweise etwa 35 bis 60 g in 100 ml destilliertem Wasser von mindestens einer kristallinen Säure, wie Oxalsäure, Malonsäure oder Citronensäure hergestellt. Die beschriebene Reagenslösung der Zone D wird vorteilhaft an der gegenüberliegenden Seite von dem Teil der Reagenszone des Trägermaterials angebracht, der die Reagenslösung der Zone C trägt.

Jede der obigen Lösungen für die Zonen A, C und D werden auf dem schwammartigen Material angebracht, so daß man auf jedem einzelnen diagnostischen Testprodukt die folgenden Mengen der Bestandteile erhält:

Breiter Enger Bereich Bereich

.-.;■■ . in mcr -in mg-

Nährmedium der Zone A
Reagenslösung der Zone C Naphthalinsulfonsäure

SuIfanilsäure
Reagenslösung 'der Zone D

1,4 - 4,6 2

- 4

0,005 - 0,2 O,01 - 0,1 0,008-0,36 0,015 --0,2 1 -4,5 2 - 4

Gegebenenfalls kann ein Ende des imprägnierten Teststreifens weitere zusätzliche Zonen enthalten, um zu verhindern, daß das Nitratmedium und die Reagenszonen durch das Handhaben bzw«, Berühren zerstört werden. Beispielsweise kann benachbart an die äußerste Reagenszone an einem Ende des Streifens eine weitere Trennzone vorhanden sein, die im folgenden als hydrophobe Trennzone Bp bezeichnet wird, weiterhin kann eine gefärbte Identifizierung szone, die im folgenden als Färbstoff-Zone E bezeichnet wird, angrenzend an die Trennzone B»vorhanden sein, oder sie kann von dieser zweiten" Trennzone durch einentnicht behan-

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- 8 delten Bereich getrennt sein.

Die zuvor beschriebene Zone B. mit der hydrophoben Trennschichtzusammensetzung ist ebenfalls zur Verwendung als hydrophobe Trennschicht in der Zone B₂ geeignet.

Jeder geeignete Farbstoff, der das schwammartige Material
ausreichend färbt, um das Ende des diagnostischen Teststreifens, der die farblosen Reagenszonen enthält, kenntlich zu
machen, die in die zu untersuchende Kultur eingetaucht werden, kann verwendet werden. Man hat gefunden, daß etwa 0,025 bis 0,3 g eines Farbstoffs, gelöst .in einem geeigneten Lösungsmittel und auf ein Volumen von 100 ml eingestellt, eine geeignete Lösung für die .Identifizierungs-Zone E liefern«, Die bevorzugte Farbstofflösung wird aus Brillantgrün (brilliant green), einem biologischen Farbstoff (Matheson, Coleman and Bell), der in Wasser löslich ist, hergestellt» Jedoch können andere Farbstofflösungen gleich wirkungsvoll verwendet werden, beispielsweise Methylgrün (Methyl Green) (National Aniline).

Die schwammartigen Materialien, die als Trägermaterialien
für die erfindungsgemäße diagnostische Zusammensetzung
geeignet sind, sind Materialien, die in der Lage sind, durch ihre kapillare Wirkung Flüssigkeit zu halten. Solche Materialien schließen ein Filterpapier, Filz, poröse keramische
Streifen, gewebte oder zusammengepreßte Glasfasern und ähnliche. Ein besonders bevorzugtes Papier ist Eaton-Dikeman
No. 623 (70 lbs)i

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind in
eine diagnostischen Zusammensetzung, v/ie sie in der beiliegenden Zeichnung gezeigt ist, enthalten;

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Bereich 1: Zone A: etwa 2,8 rag Nitrat-Fleischbrühe, hergestellt

aus Rindfleischextrakt, Pepton und Kaliumnitrat;

Bereich 2:

Bereich

Bereich
Bereich

4:

5:

6:

Zone B,!gesättigt mit einer Lösung von etwa 85 ml einer Methylmethacrylatharz-Überzugszusammensetzung und etwa 15 ml Äthylalkohol;

Zone C: etwa 0,05 mg 5-Amino-l-naphthalinsulfon- * säure und etwa 0,08 mg des Natriumsalzes von Sulfanilsäure;

Zone D; etwa 3 mg Citronensäure;

Zone B^:vollkommen gesättigt mit der Lösung der Zone B^;

nicht behandelter Bereich

Zone E: sichtbar gefärbt durch die Anwendung von 100 ml einer wäßrigen Lösung von 0,1 g Brillantgrün. ·

Die erfindungsgemäße diagnostische Zusammensetzung ist mindestens 12 Monate bei 4 C und bei Zimmertemperatur stabil.

Um die Reduktion von Nitrat zu Nitrit durch einen besonderen Mikroorganismus zu bestimm en, wird eine Schleif ebzw. Öse yöE der Kultur, die untersucht werden soll, in 0,3 ml Salzlösung in einem Versuchsröhrchen von 13 χ 100 mm oder ähnlicher Größe suspendiert. Der Testreifen mit der erfindungsgemäßen diagnostischen Zusammensetzung wird in das Röhrchen eingeführt auf solche Art, daß die Zone A mit dem Nitratmedium in die Testsuspension eintaucht. Das Röhrchen wird bei 35 bis 37° etwa 1 l/2 bis 2 Stunden inkubiert. Das Röhrchen wird dann gekippt, um die Reagenszonenbereiche zu befeuchten, und die Entwicklung einer rosa oder roten Farbe in der Reagenszone innerhalb von 30 Sekunden bis 10 Minuten zeigt ein positives Ergebnis an, d..h.. daß Nitrat zu Nitrit reduziert wurde. Kein Farbwechsel oder eine helle Chamois-Färbung zeigt ein negatives Ergebnis an.

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Mit der erfindungsgemäßen diagnostischen Zusammensetzung ist es möglich, die Anwesenheit von 1 Aig Nitritionen in 0,3 ml der Suspension einer zu untersuchenden Kultur nachzuweisen.

Die erfindungsgemäße diagnostische Zusammensetzung und das erfindungsgemäße Verfahren wurden mit den Ergebnissen verglichen, die man erhält, wenn man das klassische Verfahren von Edwards und Ewing ("Identification of Enterobacteriaceae", P,R. Edwards und W.H. Ewing, Burgess Pub. Co., 1962, gedruckt 1964) verwendet.

Insgesamt wurden 107 Organismen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben. 106 Kulturen gaben bei beiden Verfahren die gleiche Reaktion mit einer Korrelation von besser als 99 %»

Untersuchte Organismus Anzahl

Gram h 32

Gram (Enterobac teriaceae) 52

Gram -

(andere) 23

Tabelle I

Streifen und Streifen und keine

Fleischbrühe Fleischbrühe Überein-

positiv negativ Stimmung

26

51

13

10

keine

1 (Streifen -

Fleischbrühe schwach)

keine

Gesamt

107

90

16

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1

A. Herstellung der Mitrat enthaltenden Lösung für die Zone A

Man fügt zu 60 ml destilliertem Wasser 20 g Baeto-Nitrat-Fleischbrühe (Bacto-Niträte Broth), dehydratisiert (Difco). Man mischt gut und ergänzt mit destilliertem Wasser auf 100 ml,

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Man erhitzt auf 1OO°C und kocht kurz, um eine klare Lösung zu erhalten, dann wird auf 25°C abgekühlt. Diese Lösung wird innerhalb von 2 Stunden nach ihrer Herstellung an die Teststreifen angewendet.

B. Herstellung der hydrophoben Trennschichtzusammensetzung für die Zone B„ und die Zone B-

85 ml Krylon 150 Crystal Clearwerden mit 95 %-igem Äthanol (USP) verdünnt.

C. Herstellung der Reaqenslösung für die Zone C, aminosubsti tuierte Naphthalinsulfonsäure und Sulfanilsäuresalz

Zu 50 ml destilliertem Wasser fügt man 1 g 5-Amino-l-naphthalinsulfonsäure zu. Unter Vermischen fügt man langsam In-Natriumhydroxydlösung zu, bis man einen stabilen p„-Wert von 9,5 bis 10 erhält. Dazu fügt man 1,6g Natriumsalz der SuIfanilsäure, schüttelt bis zum Lösen und stellt dann den p„-Wert mit 0,In--NaOH-Lösung auf 9,8 bis 10 ein. Man fügt destilliertes Wasser bis zur Ergänzung auf 100 ml zu und vermischt.

D. Herstellung der Reaqenslösunq für die Zone D, Citronensäure

Zu 50 g Citronensäure fügt man destilliertes Wasser bis zur Ergänzung auf ein Endvolumen von 100 ml zu. Man vermischt und erwärmt nötigenfalls, um die Citronensäure zu lösen.

E. Herstellung der Farbstofflösung für die Zone E

0,1 g Brillantgrün, biologischer Farbstoff (Matheson, Coleman und Bell) wird in destilliertem Wasser gelöst und mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 ml gebracht und vermischt.

Beispiel 2

Anbringung der diagnostischen Lösungen an schwammartiqes Material

Zur Herstellung der Streifen wird ein kontinuierlicher Bogen Eaton-Dikeman-Filterpapier Nr. 623 (70 lbs.) mit einer Breite

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von 83 mm verwendet. Das Papier wird, wie in der beigefügten Zeichnung gezeigt, in 6 getrennte Bereiche geteilt.

Die hydrophobe Trennschichtlösung von Beispiel 1 wird auf der Zone B in den Bereichen 4 und 2 in Mengen angebracht, die ausreichen, um das Papier zu sättigen, und dann läßt man trocknen. Die Nitratlösung des Beispiels 1 für die Zone A wird einmal auf jeder Seite des Papiers im Bereich 1 angebracht, und dann läßt man trocknen. Die Farbstofflös.ung des Beispiels 1 für die Zone E wird auf jede Seite des Papiers im Bereich 6 angebracht und trocknen gelassen. Die Reagenslösung des Beispiels 1 für die Zone C wird auf jede Seite des Bereichs 3 angebracht, wobei die Menge, die aufgebracht wird, so begrenzt wird, daß nicht mehr als die Hälfte der Dicke.des Papiers feucht ist. Man läßt trocknen. Die Reagenslösung des Beispiels 1 für die Zone D wird an die entgegengesetzte Seite des Bereichs 3 angebracht, so daß nicht mehr als die Hälfte der Dicke des Papiers feucht ist. Die Reagenslösungen müssen sorgfältig aufgebracht werden, so daß die Reagenslösung der Zone C sich nicht mit der Reagenslösung der Zone D vermischt. Nachdem alle Bereiche des Papiers gut getrocknet sind, schneidet man e.s in Streifen von 6,3 mm(1/4 inch), wobei jeder Streifen die 6 Bereiche enthält, die auf die beschriebene Weise mit den Lösungen imprägniert wurden. Im allgemeinen wird die Nitrat-Fleischbrühe auf das Papier mit einer Geschwindigkeit von 0,70 ml für jeweils 30 cm der Länge mit der SuIfanilsäure aufgebracht, und die 5-Aminonaphthalinsulfonsäure wird mit einer Geschwindigkeit von 0,25 ml aufgebracht,.und die Citronensäure wird mit einer Geschwindigkeit von 0,3 ml pro 30 cm aufgebracht.

Beispiel 3 Verwendung der diagnostischen Zusammensetzung Verwendungsverfahren

1. Eine Schleife voll von Kultur (loopful of culture) aus einem Agarmedium wird in 0_}3 ml Salzlösung in einem Reagenzglas von 13 χ 100 mm Größe oder ähnlicher Größe suspendiert«.

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2. Man gibt die gemäß den Beispielen 1 und 2 hergestellten
Teststreifen mit der diagnostischen Zusammensetzung so in die Suspension, daß die Zone gegenüber der grünen Markierungszone eintaucht.

3. Das Reagenzglas wird in einem Wasserbad 2 Stunden bei
35 bis 37°C inkubiert.

4. Das Reagenzglas wird gekippt, um die Reagenszone zu befeuchten. Das Auftreten einer rosa oder roten Farbe in den
Reagenszonen innerhalb von 30 Sekunden bis 10 Minuten zeigt
einen positiven Test an. Kein Farbwechsel oder eine helle
Chamois-Färbung zeigt einen negativen Test an.

Beispiel 4

A. Herstellung der Nitratlüsung für die Zone A

Man fügt 27 g Bacto-Nitrat-Fleischbrühe, dehydratisiert (Difco) zu 60 ml destilliertem Wasser. Man vermischt gut und stellt
das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml ein. Man erhitzt auf 100 C und kocht kurz, um eine klare Lösung zu erhalten, und kühlt dann auf 25 C ab. Die Lösung wird innerhalb 2 Stunden nach ihrer Herstellung verwendet.

B. Herstellung der hydrophoben Trennschichtlösunq für die Zonen B. und B^

Man verdünnt 85 ml Krylon 150 Crystal Clear mit 15 ml Toluol.

C. Herstellung der Reaqenslösung für die Zone C, aminosubstituierte Naphthalinsulfonsäure und SuIfanilsäuresalz

Man fügt 1 g 8-Amino~2-naphthalinsulfonsäure zu 50 ml destilliertem Wasser. Danach fügt man langsam unter Schütteln l,Ön~ Natriumhydroxydlösung hinzu, bis ein stabiler p^-Wert von 9„5 bis 10 erhalten wird. Man gibt 1,6 g Sulfathiazol, Natriumsalz, hinzu, mischt, um zu lösen,und stellt den p„-Wert der Mischung mit 0„ln NaOII-Iiösung auf 9,8 bis 10 ein. Das Volumen wird mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt, und dann vermischt

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,j - ."20

^D· Hej-istgl\y.n.g der Reagens lösung für die Zone D _? Malon.säure

Zu 50 g Malonsäure fügt man ausreichend destilliertes Wasser ?λϊ, um ein End^olumen von 100 ml zu erhalten. Man vermischt und erwärmt nötigenfalls, um zu losen.

^E· ü.g^-gJ-ί6Li-UDJiI der ^Farbstpf_flö_5ung für die Zone E

Man löst 0,1 g Methylgrün (Methyl Green) (National Aniline) in destilliertem Wasser, stellt das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml ein und vermischt.

Man wendet die Lösungen für die Zonen A, B, D, D und E, die gemäß Beispiel 4 hergestellt worden waren, an das schwammartige Trägermaterial, wie in Beispiel 2 beschriebe;¹, an.

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 verwendet man die gemäß den Beispielen 4 und 5 hergestellten Teststreifen mit der diagnostischen Zusammensetzung.

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Claims

2UJ-.37-20" Patentansprüche

1.) Diagnostische Zusammensetzung zum Nachweis von Nitrit, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein schwammartiges Material umfaßt, das mindestens vier imprägnierte Zonen enthält, worin:

A. die Zone A ein Nitrat enthaltendes Medium enthält;

B. die Zone B mit einer inerten, hydrophoben Trennschichtzusammensetzung, die die Zone A von allen folgenden imprägnierten Zonen trennt, gesättigt ist;

C. die Zone C enthält

1. eine aminosubstituierte Naphthalinsulfonsäure der % Gruppe bestehend aus S-Amino^-naphthalinsulfonsäure, 8-Amino-2-naphthalinsulfonsäure und 5-Amino-l—naphthalinsulfonsäure, und

2. ein Reagens der Gruppe der Alkalimetallsalze von SuIfanilsä'ure, Sulfadiazin und ein Alkalimetallsalz von Sulfnthiazol; und

D. die Zone D mindestens eine kristalline Säure, wie Citronensäure, Oxalsäure und Malonsäure enthält,

wobei die Zonen so angeordnet sind, daß die Entwicklung einer Färbung in den Reagenszonen C und D möglich ist, um jede Reduktion von vorhandenem Nitrat zu Nitrit durch Mikroorganis- % men, die in Gegenwart eines Nitrat enthaltenden Mediums in Zone A inkubiert·'wurden, nachzuweisen.

2.) Diagnostische Zusammensetzung zum Nachweis von Nitrit, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein schwammartiges Material enthält mit mindestens vier imprägnierten Zonen, worin:

A. die Zone A etwa 1,4 bis etwa 4,6 mg eines Nitrat enthaltenden Nährmediums enthält;

B. die Zone B mit einer inerten, hydrophoben Trennschichtzusammensetzung gesättigt ist, die die Zone A von allen

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- 16 nachfolgenden imprägnierten Zonen trennt;

C. die Zone C enthält

1. etwa 0,005 bis etwa .0,2 mg einer aminosubstituierten Naphthalinsulfonsaure, wie S-Amino-S-naphthalinsulfonsäure, 8-Amino-2-naphthalinsulfonsäure und 5-Amino-l-naphthalinsulfonsäure und

2. etwa 0,008 bis etwa 0,36 mg eines Reagens, wie ein Alkalimetallsalz von SuIfanilsäure, Sulfadiazin und ein Alkalimetallsalz von Sulfathiazol, und

D, die Zone D etwa 1 bis etwa 4,5 mg einer kristallinen Säure, wie Citronensäure, Oxalsäure und Malonsäure, enthält,

wobei die Zonen so angeordnet sind, daß in den Reagenszonen C und D Farbentwicklung möglich ist, um irgendeine Reduktion des vorhandenen Nitrats zu Nitrit durch Mikroorganismen, die in Gegenwart des Nitrat enthaltenden Nährmediums in der Zone A inkubiert wurde, nachzuweisen.

3.)Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere Trennzone B, imprägniert mit einer inerten, hydrophoben Trennschichtzusammensetzung, benachbart an die äußerste mit dem Reagens imprägnierte Zone angeordnet ist.

4.)Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere Zone E, imprägniert mit einer Farbstofflösung zur Identifizierung an einem Ende des Teststreifens mit der diagnostischen Zusammensetzung angeordnet ist,

und zwaren dem der Zone A gegenüberliegenden Ende mit dem Nährmedium.

5.)Diagnostische Zusammensetzung zum Nachweis von Nitrit, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein schwammartiges Material enthält, das mindestens vier imprägnierte Reagenszonen besitzt, worin

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ORIGINAL !NSPECTED

.:, . ^: ; : 2G3ü720

A. die Zone A et a 2 bis etwa 4 mg eines Nitrat enthaltenden Nährmediums enthält;

B. die Zone B mit einer inerten, hydrophoben Trennschichtzusammensetzung gesättigt ist, die die Zone A von allen nachfolgenden imprägnierten Zonen trennt, wobei eine inerte,hydrophobe Trennschichtzusammensetzung verwendet wird, die enthält:

1. etwa 75 bis etwa 100 ml einer acrylischen Überzugs- ' zusammensetzung und

2. etwa 0 bis etwa 25 ml eines Verdünnungsmittels für ' die Überzugszusammensetzung,

C. die Zone C enthält:

1. etwa 0,01 bis etwa 0,1 mg einer aminosubstituierten Naphthalinsulfonsäure, wie 5-Amino-2-napthalinsulfonsäure, 8-Amino-2-naphthalinsulfonsäure und 5-Amino-1-naphthalinsulfonsäure und

2. etwa 0,015 bis 0,2 mg eines Reagens, wie ein Alkalimetallsalz der SuIfanilsäure, Sulfadiazin und ein Alkalimetallsalz von Sulfathiazol, und

D. die Zone D etwa 2 bis etwa 4 mg mindestens einer kristallinen Säure enthält, wie Citronensäure, Oxalsäure

und Malonsäure, ™

wobei die Zonen so angeordnet sind, daß Farbentwicklung in der Reagenszone C und D möglich ist, um jede Reduktion von vorhandenem Nitrat zu Nitrit durch Mikroorganismen, die in Gegenwart des Nitrat enthaltenden Nährmediums in der Zone A inkubiert wurden, nachzuweisen.

6.) Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere inerte, hydrophobe Trennschicht B vorhanden ist, benachbart zu der äußeren, mit Reagens imprägnierten Zone.

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7.) Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere Zone E an einem Ende der diagnostischen Zusammensetzung mit einer Farbstofflösung, die etwa 100 ml einer Lösung aus etwa 0,025 bis etwa 0,3 g eines Farbstoffs enthält, imprägniert ist, wobei die Zone E an dem der mit dem Nitratmedium imprägnierten Zone A gegenüberliegenden Ende angeordnet ist.

8.J Diagnostische Zusammensetzung zum Nachweis von Nitrit, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein schwammartiges Material enthält, das mindestens vier imprägnierte Zonen enthält, worin:

A. die Zone A etwa 2,8 mg eines Nährmediums, hergestellt aus etwa 3 mg Rindfleischextrakt, etwa 5 mg Pepton und etwa 1 mg Kaliumnitrat, enthält;

B. die Zone B mit einer inerten, hydrophoben Trennschicht zusammensetzung gesättigt ist» die etwa 85 ml einer Methylmethacrylat-Überzugszusammensetzung und etwa 15 ml Äthylalkohol enthält;

C. die Zone enthält

1. etwa 0,05 mg 5-Amino-l-naphthalinsulfonsäure und

2. etwa 0,08 mg des Natriumsalzes von SuIfanilsäure und

D. die Zone D etwa 3 mg Citronensäure enthält,

wobei die Zonen auf dem schwammartigen Material in der Reihenfolge A, B, C angeordnet sind mit einer Zone D, die auf dem schwammartigen Material auf der gegenüberliegenden Seite der Zone C angebracht wurde und wobei die Zone A nur an die Zone B angrenzt, die Zone B nur an die Zone A angrenzt und die Zone C auf einer Seite des schwammartigen Materials ist und nur an die Zone A angrenzt und die Zone D auf der anderen Seite des schwammartigen Materials ist und die Zone C und die Zone D in einer Rückseite-zu-Rückseite-Anordnung miteinander angebracht sind und jede nur an die Zone B und aneinander angrenzen.

0 9 8 8 2/1583

ORIGINAL INSPEGTEO

9.) Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere inerte hydrophobe Trennschichtzone B angrenzend an die äußerste, mit Reagens imprägnierte Zone vorhanden ist.

10.) Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere Zone E an einem Ende des diagnostischen Teststreifens mit einer Färbstofflösung imprägniert ist, die etwa 100 ml einer Lösung von etwa 0,1 g eines Farbstoffs enthält, wobei die Zone E so angeordnet ist, daß sie an dem Ende liegt, das gegenüber der Zone A mit dem Nitratmedium ist, und das vor ihr ein nicht behandelter Bereich liegt, der an die zusätzliche Trennzone angrenzt.

11.) Verfahren zur Identifizierung und Differenzierung von Mikroorganismen, die Nitrat zu Nitrit reduzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man

A. die Zone A der diagnostischen Zusammensetzung von Anspruch 1 in ein Reagenzglas eintaucht, das eine Salzsuspension der Kultur enthält, die untersucht werden soll,

B. das Reagenzglas etwa 1,5 bis etwa 2 Stunden bei etwa bis etwa 37°C inkubiert,

C. das Reagenzglas kippt, um die Reagenszonen C und D zu befeuchten und

D. 30 Sekunden bis 10 Minuten wartet, damit sich Farbe entwickeln kann als positives Anzeichen, das vorhandenes Nitrat durch die Mikroorganismen zu Nitrit reduziert wurde.

0 0 9 8 8 2/ 1 663 bad

Leerse