CH615460A5

CH615460A5 -

Info

Publication number: CH615460A5
Application number: CH1267775A
Authority: CH
Inventors: Donald Paul Kronish; William Donald Young Jr
Original assignee: Warner Lambert Co
Priority date: 1974-09-30
Filing date: 1975-09-30
Publication date: 1980-01-31
Also published as: IT1054910B; AU8300975A; DK142461B; NO752544L; DK438675A; SE7510895L; DE2531982B2; DK142461C; US3957584A; GB1466828A; JPS5431396B2; NO148380C; FR2286192A1; NO148380B; DE2531982A1; CA1045531A; FR2286192B1; JPS5147491A

Description

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel zur Bestimmung ß-galactosidase-produzierender Mikroorganismen.

Obwohl bereits viele biochemische Tests zur Identifizierung von Mikroorganismen der Familie Enterobakteriaceen zur Verfügung stehen, so ist die Differenzierung von Organismen, wie beispielsweise Arizona oder Citrobacter von Salmonella und von Pseudomonas cepacia oder P. maltophilia von anderen Pseudomonaden immer besonders schwierig. Erst seit kurzem hat sich der o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid-Test als besonders nützlich bei der Differenzierung der oben genannten Organismen herausgestellt. Dieser Test weist die ß-galactosidase-produzierenden Organismen durch die bakterielle Hydrolyse des Substrats o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyra-nosid nach. Dieses zuletzt genannte o-Nitrophenyl-ß-D-galac-topyranosid, für gewöhnlich unter der Bezeichnung «ONPG» bekannt, ist ein künstliches Substrat, welches anfänglich in Lösung farblos ist. Die Hydrolyse des Substrats durch bakteriell produziertes ß-Galactosidaseenzym setzt freies o-Nitro-phenyl frei, das unter alkalischen Bedingungen gelb gefärbt ist. Auf diese Weise ergibt sich eine einfache Methode zur Bestimmung der ß-Galactosidase-Aktivität und des Mikroorganismus, der dieses Enzym produziert.

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Der «ONPG»-Test ist das Objekt mehrerer Studien, so zum Beispiel: Lederberg, J„ J. Bact. 60, 381-392 (1950); Lowe, G.H., J. Med. Technol. 19; 21-25 (1962); Pickett, MJ. et al., Appi. Microbiol. 14, 178-182 (1966); und Sonnenwirth A.C., Kapitel 62, Gradwohl's Clinical Laboratory Methods and Diagnosis, 7th Ed. 1970, Seiten 1111-1112. In all diesen Studien wird das «ONPG»-Substrat in einer Pufferlösung in dem Moment hergestellt, in dem der Test mit einem unbekannten Organismus durchgeführt werden soll. Es wurde von keinen im voraus hergestellten Substratlösungen mit geeigneter Empfindlichkeit und Stabilität berichtet. Vergleichende Studien über die Verwendung eines «ONPG»-Diagnose-Teststreifens sind von Rosner, R. in Appi. Microbio!. 26:

Seiten 890 bis 893 (Dezember 1973) aufgeführt. Die Ergebnisse mit dem «ONPG»-Teststreifen waren nach den Studien von Rosner günstig, jedoch waren bei diesen Aufzeichnungen weder die Zusammenstellung, die Konfiguration noch die Art der Herstellung des Teststreifens aufgeführt. Der «ONPG»-Teststreifen, welcher von Rosner verwendet wurde, stellt einen früheren Versuch des Erfinders zur Herstellung eines geeigneten Testmittels dar, hat sich jedoch als unbrauchbar erwiesen.

Ein im voraus hergestelltes diagnostisches Mittel muss den normalerweise auftretenden Bedingungen bei der Herstellung, beim Versand und der Lagerung Stand halten, um für den Handel geeignet zu sein. Solch ein Produkt muss auch zuverlässig reproduzierbare Testergebnisse liefern. Obwohl zwar bereits einige Fortschritte gemacht worden sind, besteht immer noch ein Mangel an einem vorpräparierten, stabilen, empfindlichen «ONPG»-Testsytem, welches für den raschen Nachweis von Mikroorganismen, welche ß-Galactosidase-Enzyme produzieren, verwendet werden kann.

Demgemäss ist Gegenstand der Erfindung:

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zum Nachweis der Produktion von ß-Galactosidase durch bakterielle Hydrolyse eines o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyrano-sid-Substrates, das dadurch gekennzeichnet ist, dass a) man eine wässrige Substrat-Lösung von 0,5 bis 5,0 Gew./ Vol. %, bezogen auf das Volumen der Gesamtlösung, o-Nitro-phenyl-ß-D-galactopyranosid und von 25 bis 75 Vol.% Aceton zubereitet,

b) man eine Pufferlösung, welche einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5 aufrechterhält und 0,5 bis 1,0 Mol pro Liter Lösung eines Puffers enthält, zubereitet,

c) man die Substrat-Lösung aus a) auf einer Zone eines saugfähigen Materials aufträgt und trocknen lässt, wobei pro Testeinheit des saugfähigen Materials 0,05 bis 3,0 mg o-Nitro-phenyl-ß-D-galactopyranosid vorliegen, und d) man die Pufferlösung aus b) auf einer Zone des saugfähigen Materials, welche an die Substrat-Zorie aus c) grenzt, aufträgt und trocknen lässt, wobei pro Testeinheit des saugfähigen Materials 0,01 bis 0,1 Millimol des Puffers vorliegen;

2. das nach dem Verfahren hergestellte diagnostische Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein saugfähiges Material aufweist, welches pro Testeinheit a) eine Substrat-Zone mit 0,05 bis 3,0 mg trockenem galacto-pyranosid und b) eine Pufferzone, welche an die Substrat-Zone angrenzt, mit 0,01 bis 0,1 Millimol eines trockenen Puffersystems, welches geeignet ist, einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5 aufrechtzuerhalten, aufweist; sowie

3. die Verwendung des nach dem Verfahren hergestellten diagnostischen Mittels zum Nachweis und zur Differenzierung von Mikroorganismen, welche ß-Galactosidase produzieren, die dadurch gekennzeichnet ist, dass a) man die Substrat- und die Pufferzone des diagnostischen Mittels in ein Reagensglas, welches ungefähr 0,3 ml einer Suspension einer unbekannten Kultur in Kochsalzlösung enthält, eintaucht,

b) man das Ganze ungefähr 4 Stunden lang bei 35 bis 37°C inkubiert, und c) man beim Vorliegen eines ß-galactosidase-produzierenden Mikroorganismus eine Gelbfärbung der Flüssigkeit in dem Reagensglas beobachtet.

Im allgemeinen werden 0,5 bis 5,0 Gew./Vol. % eines o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid-Substrats in 25 bis 75 Vol. % wässriger Acetonlösung gelöst und auf eine Zone eines saugfähigen Trägermaterials aufgetragen. Auf eine an die Substrat-Zone angrenzende Zone auf dem saugfähigen Trägermaterial wird eine 0,5 bis 1 molare Pufferlösung aufgetragen, welche den pH-Wert bei 6,5 bis 8,5 hält. Das imprägnierte, trockene saugfähige Trägermaterial enthält in einer Zone 0,05 bis 3,0 mg des o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosids und in einer benachbarten Zone 0,01 bis 0,1 Millimol des Puffers. Vorzugsweise wird als Puffer das primäre Kaliumphosphat und das sekundäre Natriumphosphat verwendet. Gegebenenfalls kann eine wasserfeste Trennzone anschliessend an die äusserste mit dem Reagens imprägnierte Zone vorliegen. Bei der Verwendung wird das imprägnierte saugfähige Trägermaterial in eine Suspension eines unbekannten Organismus in Kochsalzlösung eingetaucht und 4 Stunden lang bei 35 bis 37°C inkubiert. Die Entwicklung einer Gelbfärbung zeigt, dass ein Organismus vorliegt, welcher ß-Galactosidase produziert. Das vorliegende diagnostische Mittel ist bei 4°C, bei Zimmertemperatur und bei 37°C ein Jahr haltbar.

Es hat sich herausgestellt, dass ein gepuffertes o-Nitrophenyl-galactopyranosid-Testsystem zur Bestimmung ß-galactosidase-produzierender Bakterien auf ein saugfähiges Trägermaterial aufgebracht werden kann, wobei ein stabiles, empfindliches diagnostisches Mittel entsteht, welches zur raschen Bestimmung solcher Mikroorganismen verwendet werden kann. Im vorliegenden Fall wird ein o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid Substrat in einer spezifischen Konzentration von Aceton und Wasser gelöst und auf eine Zone auf einem saugfähigen Trägermaterial aufgebracht. Das o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyra-nosid ist ein künstliches Substratmaterial, welches von Calbio-chem. Co., La Jolla, California, vertrieben wird und unter der Bezeichnung «ONPG» allgemein bekannt ist. Die Lösung für die Applikation des «ONPG»-Substrats auf das saugfähige Trägermaterial wird derart hergestellt, dass man 0,5 bis 5,0 Gew./Vol.% «ONPG», basierend auf das Volumen der Gesamtlösung, in einer Lösung von 25 bis 75 Vol.% Aceton in Wasser löst. Vorzugsweise enthält die wässrige Substratlösung 5,0 Gew./Vol.% «OMPG» und 70 Vol.% Aceton. Die Substratlösung wird an der einen Aussenkante des saugfähigen Trägermaterials aufgebracht und trocknen gelassen, so dass pro Testeinheit des saugfähigen Trägermaterials 0,05 bis 3,0 mg trockenes «ONPG» vorliegen. Die Substratlösung kann auf das saugfähige Trägermaterial mittels jeder beliebigen Vorrichtung entweder auf einer oder auf beiden Seiten einer Substrat-Zone aufgetragen werden, um auf der Substrat-Zone die oben genannte Menge trockenes «ONPG»-Substrat zu erhalten. Vorzugsweise wird die «ONPG»-Substratlösung auf jeder Seite des saugfähigen Materials aufgetragen, um eine Gesamtmenge von ungefähr 1,5 mg trockenem Substrat pro Testeinheit zu erzielen.

Auf einer getrennten, jedoch an die obige Zone angrenzenden Zone auf dem saugfähigen Trägermaterial wird ein mikrobiologisch inerter Puffer aufgetragen, der einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise 7,2 bis 7,6. im günstigsten Fall einen pH-Wert von 7,4 aufrechterhalten kann, und trocknen gelassen. Die nachfolgend aufgeführten Puffersysteme besitzen diese Fähigkeit: « Veronal-Natrium/Salzsäure, Natriumacetat» und «Veronal-Natrium/Salzsäure»; Borax/primäres Kaliumphosphat; Zitronensäure, Phosphorsäure, Orthoborsäure und Natriumhydroxyd/Salzsäure; Zitronensäure und sekundäres s

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Natriumphosphat; primäres Kaliumphosphat/sekundäres Natriumphosphat; Piperazidinhydrochlorid/Natriumhydroxyd; Piperazin-dihydrochlorid in Glycylglycin/Natriumhydroxyd; Tris(hydroxymethyl)aminomethan/Salzsäure; und Tris(hydr-oxymethyl))aminomethan und Maleinsäure oder Maleinsäureanhydrid/Natriumhydroxid. Unter den geeigneten Puffersystemen sind die nachfolgenden besonders bevorzugt: primäres Kaliumphosphat/sekundäres Natriumphosphat; Tris(hydroxy-methyI)aminomethan/Salzsäure; und «Veronal-Natrium»/ Salzsäure. Von all diesen Puffersystemen eignet sich am besten der primäre Kaliumphosphat/sekundäre Natriumphosphat-Puffer.

Beim Herstellen der Pufferlösung zur Applikation auf dem saugfähigen Trägermaterial hat sich herausgestellt, dass sich eine ungefähr 0,5 bis 1 molare Lösung besonders gut eignet. Diese Lösungen dienen dazu, die erforderlichen 0,01 bis 0,1 Millimol Puffer pro Testeinheit auf dem saugfähigen Trägermaterial in einer separaten, jedoch an die Substratzone angrenzenden Zone aufzutragen. In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird auf das saugfähige Trägermaterial eine 1 molare primäre Kali-umphosophat- und sekundäre Natriumphosphat-Pufferlösung in einer an die Substratzone angrenzenden Zone aufgetragen, um pro Testeinheit des saugfähigen Materials 0,02 Millimol Puffer zu erzielen. Ebenso wie bei der Applikation der Substrat-Lösung kann auch zum Auftragen der Pufferlösung auf das saugfähige Trägermaterial jede geeignete Methode angewendet werden, vorausgesetzt, dass die oben genannte Menge trockenen Puffers auf der entsprechenden Zone des saugfähigen Trägermaterials aufgetragen wird. Vorzugsweise wird die Pufferlösung zweimal auf jeder Seite der entsprechenden Zone des saugfähigen Trägermaterials aufgetragen, wobei zwischen den einzelnen Applikationen getrocknet wird.

Die oben genannten Mengen trockenen Substrats und imprägnierten Puffers auf getrennten, aber aneinander liegenden Zonen einer Testeinheit des saugfähigen Trägermaterials sind dazu bestimmt, mit ungefähr 0,3 ml einer Suspension des zu testenden Organismus in einer Kochsalzlösung während 4 Stunden bei 35 bis 37°C inkubiert zu werden. Um während der empfohlenen Inkubationszeit optimale Ergebnisse zu erzielen, sollte eine genügend grosse Menge des zu testenden Organismus vorliegen, so dass die Suspension sichtbar trübe ist. Es kann auch eine weniger dichte Suspension verwendet werden, jedoch würde diese eine verlängerte Inkubationszeit erfordern. Eine noch dichtere Suspension, welche eine grössere Konzentration des Organismus enthält, kann ohne Schwierigkeit mit dem vorliegenden diagnostischen Mittel verwendet werden. Sollte die Menge des zu testenden Organismus oder die Inkubationszeit oder die Temperatur variiert werden, so ist es erforderlich, die entsprechenden Korrekturen bei der Menge des Puffers und des Substrats vorzunehmen, um genügend Kontakt zwischen den Testreagentien und dem zu testenden Organismus zu gewährleisten, um falsche negative Ergebnisse zu vermeiden. Die im vorliegenden Fall für das diagnostische Mittel verwendeten Mengen liefern rasche, genaue und empfindliche Ergebnisse. Es können natürlich Variationen bei den Reagensmengen, den Mengen des zu testenden Organismus oder Änderungen bei der Inkubationszeit oder der Temperatur vorgenommen werden, jedoch können diese Testzusammensetzungen nicht so empfindliche oder genaue Ergebnisse in einem so kurzen Zeitabschnitt liefern.

Das vorliegende diagnostische Mittel kann ein saugfähiges Trägermaterial mit nur zwei Zonen aufweisen, wobei beide Zonen vollständig mit Substrat und Puffer imprägniert sind. Liegt jedoch zusätzliches nichtimprägniertes saugfähiges Trägermaterial vor, so ist die Applikation einer wasserfesten oder hydrophoben Trennlösung notwendig, um die Wanderung des Testreagens und des Endproduktes in die nicht imprägnierten

Zonen des saugfähigen Trägermaterials während der Inkubation mit der Suspension des Testorganismus zu vermeiden. Werden die Testreagentien über die nicht imprägnierten Bereiche des saugfähigen Trägermaterials verteilt, so werden die Konzentrationen der letztlich tatsächlich mit den zu testenden Organismen in Kontakt kommenden Reagentien herabgesetzt und es können ungenaue Ergebnisse auftreten. Darüberhinaus kann ein positives Testergebnis, wenn es nur schwach gelb ist, schwer festgestellt werden. Aus diesem Grunde ist eine wasserfeste oder hydrophobe Trennzone notwendig, um die Wanderung der Reagentien zu verhindern.

Die Zusammensetzung der auf das saugfähige Trägermaterial aufzutragenden Trennzone muss für das vorliegende, biologische Testsystem chemisch inert sein. Jede inerte Substanz, welche eine wasserfeste Trennzone bilden kann, ist geeignet. Geeignete Stoffe hierfür sind Wachse, Lacke und Kunststoffe. Eines dieser Materialien ist beispielsweise das farblose, polymerisierte Methyl-methacrylat-Überzugsmate-rial, welches von Krylon, Inc., Norristown, Pennsylvania, unter dem Namen «Krylon 150 Crystal Clear» vertrieben wird. Dieses wird in Toluol geliefert und kann mit weiterem Toluol oder mit Verdünnungsmitteln, wie beispielsweise Methyl-, Äthyl- und/oder Propylalkohol verdünnt werden. Eine andere geeignete Zubereitung für die Trennzone ist ein Chromkomplex, der unter dem Namen «Quilon» von E.I, du Pont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, Delaware, vertrieben und in einer Isopropanollösung vorliegt, welche verdünnt werden kann. Eine besonders bevorzugte wasserfeste Ternnzone erhält man derart, dass man zuerst den «Quilon»-Überzug auf das saugfähige Trägermaterial aufträgt und sodann das «Krylon 150 Crystal Clear» über die «Quilon-Schicht» mit oder ohne Trocknen aufträgt, wie es in der USA-Patentschrift Nr. 3 846 247 beschrieben ist. Diese oben erwähnten Zubereitungen für die Trennzone werden auf beiden Seiten des saugfähigen Trägermaterials aufgetragen, um ein vollständiges Eindringen in das saugfähige Material zu gewährleisten.

Gegebenenfalls kann eine Identifizierungszone zur Handhabung des diagnostischen Mittels auf der den imprägnierten Zonen gegenüberliegenden Seite des saugfähigen Trägermaterials vorliegen. Dazu eignet sich jede Marke oder Farbstoff, welcher das saugfähige Material kennzeichnet oder färbt und somit die «Handhabungs-Zone» von den mit Reagentien imprägnierten Zonen unterscheidet. So hat sich z. B. herausgestellt, dass ungefähr 0,40 bis 0,60 g eines Farbstoffes, der in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und die Lösung auf 100 ml aufgefüllt ist, für das saugfähige Trägermaterial verwendet werden kann. Die bevorzugte Farblösung enthält 0,50 g «FD & C Blue#2», 0,10 g «FD & C Red^2» und 0,10 g wasserlösliches «Nigrosin». Jedoch können mit gleicher Wirkung auch andere Farbstofflösungen verwendet werden.

Als saugfähige Trägermaterialien zur Verwendung für das voliegende diagnostische Mittel eignen sich die Materialien, welche aufgrund ihrer Kapillarwirkung Flüssigkeit halten können. Solche Materialien sind beispielsweise Filterpapier, Filz, poröse Keramikstreifen, verwebte oder gepresste Fasern und ähnliches. Ein besonders bevorzugtes saugfähiges Material ist dickes (heavy weight) Filterpapier.

Bei der Herstellung des vorliegenden diagnostischen Mittels kann eine Rolle aus geeignetem saugfähigem Material, beispielsweise eine 10 m lange Rolle Filterpapier verwendet werden. Die Substratlösung, die Pufferlösung und die Trennlösung werden auf die gesamte Rolle der Länge nach in parallelen Zonen oder Banden derart aufgetragen, dass das Filterpapier zwischen Applikationswalzen entsprechender Grösse, welche die Reagenslösung aus Behältern aufnehmen, hindurchgezogen wird. Das Filterpapier wird beim Passieren der Walzen mit der jeweiligen Lösung imprägniert. Die Menge des auf den jeweiligen Filterpapierzonen aufgetragenen Reagens

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hängt von der Grösse der Applikationsvorrichtung und davon ab, wie oft das Filterpapier die Applikationswalzen passiert. Darüberhinaus können bei Bedarf beide Seiten des Filterpapiers imprägniert werden. Nach dem Auftragen sämtlicher Reagenslösungen auf den entsprechenden Zonen des Filterpapiers und dem Trocknen wird das Filterpapier in einzelne Streifen geschnitten, wobei jeder Streifen eine Testeinheit des diagnostischen Mittels darstellt, und wovon jeder eine genügende Menge Substrat und Puffer enthält, die zur Bestimmung und Differenzierung der ß-galactosidase-produzierenden Organismen nötig sind.

Bei der Verwendung wird eine Testeinheit oder ein Teststreifen des vorliegenden diagnostischen Mittels in ein Reagensglas eingebracht, welches eine Suspension der zu testenden unbekannten Kultur in einer Kochsalzlösung enthält. Der Teststreifen wird mit der Substrat- und der Pufferzone in die zu testende Suspension eingetaucht. Sodann wird das Reagensglas bei 35 bis 37°C ungefähr 4 Stunden lang inkubiert und auf das Auftreten einer Gelbfärbung in der Flüssigkeit hin geprüft, was ein positiver Hinweis auf das Vorliegen von ß-galactosi-dase-produzierender Organismen ist. Bleibt die Suspension farblos, so ist der Test negativ. Ausführungsbeispiele des vorliegenden diagnostischen Mittels sowie deren Herstellung und Anwendung sind in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben:

Beispiel 1 Herstellung der Substratlösung 70 ml Aceton und 30 ml destilliertes Wasser werden vermischt und sodann 5 g o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid unter Rühren hinzugefügt, um das Substrat zu lösen.

Beispiel 2 Herstellung der Pufferlösung 2,006 g primäres Kaliumphosphat und 12,106 g sekundäres Natriumphosphat werden in destilliertes Wasser gegeben, die Lösung auf 100 ml aufgefüllt und auf ungefähr 60°C erwärmt, wobei der Puffer unter Rühren gelöst wird.

Beispiel 3 Herstellung der Trennlösung

Lösung A

5,45 ml «Quilon C» (duPont)-Lösung wird sorgfältig gemischt und zu 21,8 ml Isopropylalkohol unter konstantem Rühren hinzugefügt. Sodann werden zu der «Quilon C»/ Isopropylalkohol-Lösung 45,4 ml Wasser hinzugefügt. Sodann werden 27,3 ml 0,05 n-Natriumhydroxydlösung unter konstantem Rühren zugesetzt und die gesamte Lösung mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

Lösung B

15 ml Äthanol (95%ig) werden zu 85 ml «Krylon 150 Crystal Clear» hinzugesetzt und das Ganze sorgfältig vermischt.

Beispiel 4

Herstellung der identifizierten Farbstofflösung 0,5 g «FD & C Blue#2», 0,10 g «FD & C Red#2» und 0,10 g wasserlösliches «Nigrosin» werden in destilliertem Wasser gelöst und auf 100 ml aufgefüllt.

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Beispiel 5

Herstellung des diagnostischen Testsystems

Eine 10 m lange Rolle dicken Filterpapiers mit einer Breite von 83 mm wird als saugfähiges Material verwendet. Die Substratlösung aus Beispiel 1 wird in einen Behälter gegeben, aus dem sie auf die Oberfläche einer rotierenden Applikationswalze gelangt. Eine 3,7 mm breite Zone entlang der Kante der 10 m langen Filterpapierrolle wird derart mit der Substratlösung imprägniert, dass das Filterpapier über eine rotierende Applikationswalze mit einer Breite von 4 mm läuft. Die rotierende Walze schiebt gleichzeitig das Filterpapier weiter und die darauf befindliche Substratlösung wird getrocknet. Dieser Vorgang wird dreimal auf jeder Seite der 3,7 mm breiten Substratzone wiederholt, wobei zwischen den einzelnen Applikationen getrocknet wird.

Die Pufferlösung aus Beispiel 2 wird ebenfalls in einen Behälter gegeben und mittels einer rotierenden Applikationswalze mit einer Breite von 4 mm auf eine 3,7 mm breite Pufferzone, welche an die Substratzone auf dem Filterpapier angrenzt, aufgetragen. Die Pufferlösung wird zweimal auf jeder Seite der Pufferzone aufgetragen und nach jeder Applikation trocknen gelassen. Die Pufferzone darf die Substratzone nicht überschneiden.

Die Trennlösung A aus Beispiel 3 wird in einen Behälter gegeben und mittels einer rotierenden Applikationswalze mit einer Breite von 5 mm in die Mitte einer 16 mm breiten Zone, welche an die Pufferzone angrenzt, aufgetragen. Die Applikation erfolgt einmal auf jeder Seite dieser in der Mitte gelegenen Trennzone. Die Trennlösung B aus Beispiel 3 wird in einen Behälter gegeben und über die imprägnierte Lösung A ohne Trocknen aufgetragen, und zwar auf beiden Seiten der gesamten 16 mm breiten Trennzone, ebenfalls mittels einer rotierenden Walze mit einer Breite von 15 mm und trocknen gelassen.

Die identifizierende Farbstofflösung aus Beispiel 4 wird in einen Behälter gegeben und auf eine 6 mm breite Zone, an der der Substratzone entgegengesetzt liegenden Kante der 10 m langen Filterpapierrolle mittels einer Applikationswalze mit einer Breite von 6,3 mm aufgetragen. Die identifizierende Farbstofflösung wird einmal auf jeder Seite der Identifizierungszone aufgetragen und trocknen gelassen.

Nach dem vollständigen Trocknen aller imprägnierten Zonen auf der Filterpapierrolle wird das Filterpapier der Breite nach in 6,3 mm breite Streifen geschnitten.

Beispiel 6

Verwendung des diagnostischen Testsystems Man nimmt mit einer Drahtschlinge eine entsprechende Menge einer unbekannten Kultur und suspendiert sie in 0,3 ml einer physiologischen Kochsalzlösung in einem Reagensglas mit den Massen 13 X100 mm. Sodann wird der Teststreifen aus Beispiel 5 derart in das Reagensglas eingebracht, dass die der identifizierenden Farbstoffzone entgegengesetzte Zone eintaucht. Das Ganze wird in einem Wasserbad 4 Stunden lang bei 35 bis 37°C inkubiert.

Die Entwicklung einer Gelbfärbung in der Flüssigkeit zeigt ein positives Testergebnis an. Bleibt die Flüssigkeit farblos, so ist der Test negativ.

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zum Nachweis der Produktion von ß-Galactosidase durch bakterielle Hydrolyse eines o-Nitrophenyl-ß-galactopyrano-sid-Substrates, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine wässrige Substrat-Lösung von 0,5 bis 5,0 Gew-Vol.%, bezogen auf das Volumen der Gesamtlösung o-Nitro-phenyl-ß-D-galactopyranosid und von 25 bis 75 Vol.% Aceton zubereitet,

b) eine Pufferlösung, welche einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5 aufrechterhält und 0,5 bis 1,0 Mol pro Liter Lösung eines Puffers enthält, zubereitet,

c) die Substrat-Lösung aus a) auf einer Zone eines saugfähigen Materials aufträgt und trocknen lässt, wobei pro Testeinheit des saugfähigen Materials 0,05 bis 3,0 mg o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid vorliegen, und d) die Pufferlösung aus b) auf einer Zone des saugfähigen Materials, welche an die Substrat-Zone aus c) grenzt, aufträgt und trockne lässt, wobei pro Testeinheit des saugfähigen Materials 0,01 bis 0,1 Millimol des Puffers vorliegen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Pufferlösung zubereitet, die einen pH-Wert von 7,2 bis 7,6 aufrechterhält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Puffer primäres Kaliumphosphat und sekundäres Natriumphosphat verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wasserfeste Trennlösung zubereitet, diese auf einer Zone des saugfähigen Materials, welche an die äusserste, mit Reagens imprägnierte Zone grenzt, aufträgt und trocknen lässt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine wässrige Substrat-Lösung von 5,0 Gew./Vol.%, bezogen auf das Volumen der Gesamtlösung, o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid und 70 Vol. % Aceton zubereitet,

b) eine Pufferlösung, welche einen pH-Wert von 7,4 aufrechterhält und 1,0 Mol pro Liter Lösung eines Puffers enthält, zubereitet,

c) die Substrat-Lösung aus a) auf einer Zone eines saugfähigen Materials aufträgt und trocknen lässt, wobei pro Testeinheit des saugfähigen Materials 1,5 mg o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid vorliegen, und d) die Pufferlösung aus b) auf einer Zone des saugfähigen Materials, welche an die Substrat-Zone aus c) grenzt, aufträgt und trocknen lässt, wobei pro Testeinheit des saugfähigen Materials 0,02 Millimol des Puffers vorliegen.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wasserfeste Trennlösung zubereitet, diese auf einer Zone des saugfähigen Materials, welche an die äusserste, mit Reagens imprägnierte Zone grenzt, aufträgt und trocknen lässt.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine identifizierende Farbstofflösung zubereitet,

diese auf die den imprägnierten Zonen entgegengesetzt liegende äusserste Zone aufträgt und trocknen lässt.
8. Diagnostisches Mittel zum Nachweis der Produktion von ß-Galactosidase erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein saugfähiges Material aufweist, welches pro Testeinheit a) eine Substrat-Zone mit 0,05 bis 3,0 mg trockenem o-Nitrophenyl-ß-galactopyranosid und b) eine Pufferzone, welche an die Substrat-Zone angrenzt, mit 0,01 bis 0,1 Millimol eines trockenen Puffersystems, welches geeignet ist, einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5 aufrechtzuerhalten,

aufweist.
9. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Puffersystem geeignet ist, einen pH-Wert von 7,2 bis 7,6 aufrechtzuerhalten.
10. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es als Puffer primäres Kaliumphosphat und sekundäres Natriumphosphat enthält.
11. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wasserfeste Trennzone, welche an die äusserste, mit Reagens imprägnierte Zone grenzt, aufweist.
12. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es auf dem saugfähigen Material eine Substrat-Zone mit ungefähr 1,5 mg trockenem o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid und eine Pufferzone mit ungefähr 0,02 Millimol eines Puffers, der geeignet ist, einen pH-Wert von ungefähr 7,4 aufrechtzuerhalten, aufweist.
13. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es als Puffer primäres Kaliumphosphat und sekundäres Natriumphosphat enthält.
14. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wasserfeste Trennzone, welche an die äusserste, mit Reagens imprägnierte Zone grenzt, aufweist.
15. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es eine, den mit Reagens imprägnierten Zonen entgegengesetzt liegende äusserste Zone eines identifizierenden Farbstoffs auf dem saugfähigen Material aufweist.
16. Verwendung des nach Anspruch 1 hergestellten diagnostischen Mittels zum Nachweis und zur Differenzierung von Mikroorganismen, welche ß-Galactosidase produzieren, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die Substrat- und die Pufferzone des diagnostischen Mittels in ein Reagensglas, welches ungefähr 0,3 ml einer Suspension einer unbekannten Kultur in Kochsalzlösung enthält, eintaucht,

b) das Ganze ungefähr 4 Stunden lang bei 35 bis 37°C inkubiert, und c) beim Vorliegen eines ß-galactosidase-produzierenden Mikroorganismus eine Gelbfärbung der Flüssigkeit in dem Reagensglas beobachtet.