DE2018364A1

DE2018364A1 - Diagnostische Zusammensetzung

Info

Publication number: DE2018364A1
Application number: DE19702018364
Authority: DE
Inventors: Donald Paul Rockaway; Prevorsek Metka Morristown; N.J. Kronish (V.St.A.), A6II
Original assignee: Warner Lambert Pharmaceutical Co
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1969-04-17
Filing date: 1970-04-16
Publication date: 1970-10-29
Also published as: CH543589A; FR2039239A1; CA921810A; AU1390770A; SE380042B; US3597321A; GB1266274A

Description

WARNER-LAMBERT PHARMACEUTICAL COMPANT, Morris Plains, N.J.,U.S,A.

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Diagnostische Zusammensetzung

Pift vorliegende Erfindung betrifft eine diagnostische Zusammensetzung und ihre Verwendung bei der Unterscheidung von Staphylokokken. Die Zusammensetzung umfasst die Kombination eines schwammigen Materials, auf das zwei getrennte diagnostische Mittel aufgebracht wurden, wobei eines davon Mannitfermentation nachweist und das andere den Nachweis für Koagulaseproduktion erbringt. Das Mittel, das die Mannitfermentation nachweist, ist eine Zusammensetzung, bestehend aus 1.) einem Nährstoff, der in der Lage ist, das Wachstum von Mikroorganismen zu unterhalten oder eine Kombination derartiger Nährstoffe, 2.) D-Mannit, 3.) einem chemischen Indikator, der seine Färbe ändert, wenn Mannit zu sauren Abbauprodukten fermentiert wird und zusätzlich 4.) Natriumchlorid und/oder einem Verdickungsmittel. Das Mittel, das die Koagulaseproduktion nachweist, ist ein geeignetes koagulierbares Material., das im wesentlichen frei ist von Glucose.

Die diagnostischen Mittel können auf das schwammige Material aufgetragen werden in Form von zwei getrennten Zonen, wobei jede. Zone vorzugsweise abgetrennt wird durch eine Zone, die eine inerte hydrophobe Grenzschicht darstellt. Als Alternative kann das schwammige Material mit dem Mittel imprägniert werden, das die Mannitfermentierung nachweist, wonach auf dieses Mittel das Mittel

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- 2 aarübergelegt werden kann, das die Koagulaseproduktion nachweist.

Wachsende Organismen, die in Salzlösung suspendiert sind und die in Kontakt mit der diagnostischen Zusammensetzung inkubiert werden, können in einem Zeitraum von etwa 4 bis etwa 6 Stunden unterschieden werden.

Die vorliegende Erfindung schafft eine diagnostische Zusammensetzung, die die schnelle und positive Unterscheidung von Staphylokokken gestattet. Zusätzlich schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verwendung dieser Zusammensetzung.

Beim Durchführen der vorliegenden Erfindung wird ein schwammiges Material behandelt"mit 1.) einem diagnostischen Mittel, das in der Lage ist, Mannitfermentation nachzuweisen und 2.) mit einem diagnostischen Mittel, das in der Lage ist, Koagulaseproduktion nachzuweisen. Die Zusammensetzung, die verwendet wird, um Mannitfermentation nachzuweisen, umfasst 1.) einen !Nährstoff, der Art, wie er üblicherweise verwendet wird zur Zucht von Mikroorganismen oder eine Kombination derartiger Nährstoffe, 2.) D-Mannit, J.) einen chemischen Indikator, der durch Farbänderung die Fermentation von D-Mannit zu sauren 'Abbauprodukten anzeigt und zusätzlich 4.) Natriumchlorid und/oder ein geeignetes Verdickungsmittel. Das letztere wird, wenn nötig, verwendet, um eine Zusammensetzung -zu schaffen, deren Viskosität am besten geeignet ist zur Applikation auf das schwammige Material. Die Zusammensetzung, die bei. der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um Koagulaseproduktion nachzuweisen, ist ein geeignetes koagulierbares Material, das frei ist oder im wesentlichen frei ist von Glucose.

Die Unterscheidung zwischen Staphylokokken ist eine wichtige Aufgabe der klinischen Mikrobiologie. Zwei der am meisten verwenderten Testverfahren zur Identifikation von Staphylokokken ist>^: der·"? Koagulaseproduktionstest und der Mannitfermentationstest. Die meisten Stämme, die von menschlichen Verletzungen isoliert werden, sind koagulase-positive und mannit-positive Stämme, d. h.· Staphylokokkus aureus. Der letztere ist pathogen. Koagulase-negätive und mannit-negative Staphylokokken, d. h. Staphylokokkus epidermis,' werden am häufigsten als parasitisch bezeichnet und weniger als

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pathogen. Positive Reaktionen auf beide Tests, also auf den Koagulaseproduktionstest und den Mannitfermentationstest, sind eine Anzeige für die Pathogenität der Staphylokokken. Negative Realctionen auf beide Tests deuten an, daß das isolierte Material weniger klinische Bedeutung hat. Da jedoch auch gewisse Zwischenformen gefunden werden und klinisch bedeutsam sein können, ist es wichtig, dass klinische Laboratorien sowohl den Koagulaseproduktionstest und den Mannitfermentationstest durchführen. Die Fähigkeit ven pa.thoge.nen Staphylokokken,Koagulase herzustellen, ein Enzym, das in der Lage ist, Plasma zu verklumpen, ist bekannt. , Eine Vielzahl von Forschern haben versucht, diese Entdeckung als Mittel zur Bestimmung der Pathogenität von unbekannten Organismen zu verwenden. Klassische Tests für die Koagulaseproduktion werden' routineinässig durchgeführt durch das sogenannte "Röhrchen"-Verfahren ("tube" method), das die..freie.-Koagulaseproduktion bestimmt oder durch die sogenannte "Objektträger"-Technik ("slide technique) die Koagulase bestimmt, die entweder auf oder in der Zellwand der Organismen-gebunden ist. Das Röhrchenverfahren und die Objektträger!echnik sind in den Publikationen J. Bact. 41:431-440 (1941) und Medical Microbiology R. Cruickshank, S. 137 - 158 (veröffentlicht durch Williams and Wilkins Company, 11th Edition, 1965) beschrieben. Bei diesen Tests wurden sowohl Kaninchenpiasma als auch menschliches Plasma als Substrat verwendet.

Mannit-Sals-Agar wird verwendet als selektives Medium zur Isolierung von pathogenen Staphylokokken. Dieses Medium ist beschrieben in J, Bact. $0; 201-203 (1945). Aufgrund der Anwesenheit von 7»5 % Natriumchlorid wird das Wachstum der meisten Bakterien, die nicht Staphylokokken sind, in diesem Medium gehemmt. Wenn das Medium mit einem Material inokuliert wird, das Staphylokokken enthält! und man es über einen Zeitraum von 36 Stunden bei einer Temperatur von 3?°C inkubiert, wachsen, mannitfermentierende Staphylokokken in üppiger Weise umgeben von gelben Zonen. Im Gegensatz dazu produzieren Staphylokokken, die Mannit nicht fermentieren, kleine Kolonien, die von roten oder purpurfarbenen Zonen umgeben sind. Die positive Identifizierung einer unbekannten Probe als pathogen kann bis zu 5 Tage erfordern, wenn übliche Koagulasepro- · duktionstests und Hannitfermentationstests verwendet werden.

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Ein festes Wachstumsmedium, das zur visuellen Bestimmung pathogener Staphylokokken von Ausgangskulturen geeignet ist, ist beschrieben in Am.. J. Clin. Path. j>2: 192-194 (August 1959). Es wurde ein gewisser Eifolg unter Verwendung dieses Mediums erzielt. Jedoch wurde gefunden, daß andere Bakterien, die Koagulase produzieren, auf diesem Medium wachsen, wie z. B. Escherichia coli.

Demgemäß ist, wenn auch bei der Entwicklung von Reagentien und Verfahren zur Differenzierung von Staphylokokken gewisse Fortschritte gemacht wurden, bis jetzt noch kein handelsüblich erhältliches und leicht transportierbares, beim Lagern stabiles diagnostisches Reagens vorhanden zur gleichzeitigen Bestimmung von Koagulaseproduktion und Mannitfermentation, das die Herstellung von Testreagentien durch klinisches Laboratoriumspersonal nicht erforderlich macht.

Die erfindungsgemässe diagnostische Zusammensetzung umfasst ein geeignetes schwammiges Material, auf das ein diagnostisches Mittel, das die Fermentation von Mannit nachweist und ein diagnostisches Mittel, das die Produktion von Koagulase nachweist, appliziert wurde. Im allgemeinen kann ijedes schwammige Material, das üblicherweise bei der Herstellung diagnostischer Zusammensetzungen verwendet wird, bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Ausdruck "schwammig", wie er hierin verwendet wird, beschreibt ein Material, das in der Lage ist, eine Flüssigkeit durch Kapillarwirkung zurückzuhalten. Zu den schwammigen Materialien, die bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können und verwendet werden, gehören Filterpapier, Filz, poröse Keramikstreifen, gewebtes oder mattenartiges Fiberglas etc. Es ist Jedoch klar, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung einer der vorstehend genannten Materialien beschränkt ist. Es ist klar, daß andere geeignete Materialien verwendet werden können« Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Filterpapier verwendet, insbesondere die Art, die im Handel erhältlich ist als Eaton Dikeman No. 623 Filterpapier (70 pounds).

Wie oben bereits angegeben, enthält das diagnostische Mittel, das verwendet wird, um die Fermentation von Mannit nachzuweisen, 1.)

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einen Nährstoff, der in der Lage ist, das Wachstum von Mikroorganismen zu unterstützen und/oder eine Kombination derartiger Nährstoffe, 2.) D-Mannit, 30 einen chemischen Indikator, der die Farbe ändert, wenn Mannit zu sauren Abbauprodukten durch Fermentation konvertiert wird, und zusätzlich 4.) Natriumchlorid und/ oder ein Verdickungsmittel.

Im allgemeinen kann bei der Herstellung dieses diagnostischen Mittels jeder Nährstoff oder eine Kombination von Nährstoffen verwendet werden, die allgemein beim Wachstum von Mikroorganismen verwendet werden. Derartige Nährstoffe schließen z: B. ein Hefeextrakt, Trypton, die Proteosepeptone, Tryptose etc. In der bevorzugten erfindungsgemässen Ausführungsform wird als Nährstoffquelle eine Kombination von Fleischextrakt und Proteosepepton Nr. 3 verwendet. Eine derartige Kombination wird besehrieben in DIFCO MANUAL, 9th Edition, (1953), Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan.

In der Beschreibung und in den Ansprüchen wird D-Mannit als Bestandteil der Zusammensetzung zum Nachweis der Fermentation von Mannit beschrieben. Es ist jedoch zu verstehen, daß man auch gewünscht enf alls anstelle von D-Mannit D,L-Mannit verwenden konnte. Somit sollte der hierin verwendete Ausdruck "D-Mannit" so verwendet werden, daß er auch D,L-Mannit umfasst. Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eher D-Mannit als D,L-Mannit verwendet.

Im allgemeinen kann jeder chemische Indikator, der durch einen geeigneten Farbwechsel die Konversion von Mannit zu Säure enthaltenden Abbauprodukten anzeigt, verwendet werden. So können ζ. B. . Phenol-Rot, Brom-Thymol-Blau, Brom-Cresol-Rot etc. verwendet werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird jedoch Phenol-Eot als Indikator verwendet.

Obwohl Natriumchlorid ein zusätzlicher Bestandteil in der Zusammensetzung zur Bestimmung der Fermentation von Mannit ist, wird eeverwendet bei der Herstellung des bevorzugten erfindungsgemassen Produktes»

Des diagnostische Mittel zum Nachweis der Mannitfermentation ent»

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hält als zusätzlichen Bestandteil ein Verdickungsmittel. Das Verdickungsmittel wird, wenn es nötig ist, verwendet, um ein Mittel zu bilden, das eine Viskosität besitzt, die am besten geeignet ist zur Applikation auf das schwammige Material. Eine Vielzahl von Verdickungsmittel sind zur Verwendung gut geeignet. Im allgemeinen kann jedes Verdickungsmittel verwendet werden, das die Klasse von Enzymen, d. h. Staphylokoagulase, nicht beeinflusst, das verantwortlich ist für die gebundene Koagulasereaktion und die nicht die Enzyme beeinträchtigen, die für die Fermentierung von Mannit verantwortlich sind. Jedoch sind zur Verwendung besonders geeignet z. B. ein Dextran mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 60 000 bis etwa 90 000,Polyäthylenglykole mit höherem Molekulargewicht, Carboxymethylcellulose etc. Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Dextran verwendet.

Bei der Herstellung der oben beschriebenen Zusammensetzung werden der Nährstoff oder die Kombination von Nährstoffen, D-Mannit, der chemische Indikator und Natriumchlorid, wenn es benötigt wird, in destilliertem Wasser gelöst. Danach wird, wenn es nötig ist, das Verdickungsmittel zu der Lösung gegeben, um sie auf die gewünschte Viskosität zu bringen. Zusätzlich kann danach destilliertes Wasser zugegeben werden, um eine Lösung zu schaffen, die die Bestandteile in der gewünschten Konzentration enthält und die eine Viskosität innerhalb der akzeptierbaren Grenzen besitzt.

Obwohl die Mengen der verschiedenen Bestandteile, die bei der Herstellung des diagnostischen Reagens, das Mannitfermentation nachweist, verwendet werden, zu einem gewissen Grad kritisch sind, sind sie doch innerhalb gewisser vorgeschriebener Grenzen variabel. Somit werden z. B. für jeweils 100 ml Lösung die Bestandteile in den folgenden Bereichen vorhanden seinj

Nährstoffmaterial oder -materialien von etwa 5»5 g bis etwa

17 S

D-Mannit oder D,L-Mannit von etwa 5»0 g bis etwa

30,0 g

Natriumchlorid von etwa 0 g bis etwa 10,0g

chemischer Indikator von etwa O₅035 g Ms etwa

0,075 g-

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Die verwendete Menge von Verdickungsmittel ist ähnlich variierbar. Im allgemeinen wird eine Menge von Verdickungsmittel verwendet, die ausreicht, um eine Lösung zu schaffen mit einer Viskosität von 6 cps. bis 14- cps., bestimmt bei 26⁰C unter Verwendung eines Brookfield Viskosimeters. Wenn Dextran verwendet wird, wird dieses Ziel erreicht werden durch Verwendung von bis zu 6,0 g Dextran für je 100 ml Produkt. Weiterhin kann, obwohl es aus der Formulierung weggelassen werden kann, bis zu 10 g Natriumchlorid pro 100 ml Lösung verwendet werden. Die bevorzugten Produkte enthalten von etwa 3,0 g bis etwa 10,0g Natriumchlorid für de 100 ml Lösung. Eine bevorzugte Zusammensetzung enthält in jeweils 100 ml destillierter Wasserlösung die im folgenden angegebenen Bestandteile in den entsprechenden Mengen: .

Nährstoff oder Nährstoff mischung etwa 11 g

D-Mannit etwa 15 g '

Natriumchlorid etwa 5 g

••nciaischer Indikator etwa 0,55 g

Verdickungsmittel etwa 3,Λ g

Bei der letzteren Formulierung ist der bevorzugte Nährstoff eine" Kombination von 1 g Fleischextrakt und 10 g Proteosepepton Nr. 3. Weiterhin ist in der bevorzugten Formulierung der chemische Indikator Phenol-Hot und das Verdickungsmittel ist Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 60 000 bis etwa 90 000.

Das diagnostische Mittel, das bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um Koagulaseproduktion nachzuweisen, ist ein geeignetes koagulierbares Material, von dem alle oder im wesentlichen alle Glucose entfernt wurde. Ein derartiges Material Bchließt z. B. ein dialysiertes, lyophilisiertes menschliches Plasma, dialysiertes lyophilisiertes Kaninchenplasma und Fibrinogen. Vorzugsweise wird dialysiertes lyophilisiertes Plasma verwendet. Die Art, durch die die Glucose aus dem lyophilisierten Plasma entfernt wird, ist nicht von wesentlicher Bedeutung. Die Glucose kann entfernt werden durch jedes Verfahren, das das Plasma nicht zerstört und das nicht die wirksame Funktion im diagnostischen Verfahren stört. In einem Verfahren wird die Entfernung von Glucose bewirkt durch die Dialyse eines geeigneten lyophilisierten Plasmas gegen einen Puffer mit .einem pH-Wert von etwa 7,0

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bis etwa 7)8. Nach der Lyophilisierung wird das Plasma bei einer Temperatur von etwa 4 C in einem luftdicht abgeschlossenen Behälter gelagert,, bis es verwendet wird. Bei dem Dialyseverfahren wird eine Menge von etwa 20 g lyophilisierten Plasma auf 100 ml destilliertes Wasser gebracht. Das rekonstituierte Plasma wird bei einer Temperatur von etwa 4 C gehalten, um Bakterienwachstum zu verhindern. Je 100 ml rekonstituiertes Plasma wird gegen 10 Puffer auf einen pH von 7»0 bis 7?8 dialysiert. Im allgemeinen kann jedes geeignete Puffersystem verwendet werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Puffer, der verwendet wird, hergestellt durch Auflösen einer Menge von etwa 2,67 g einbasischen Natriumphosphats, etwa 11_?34 g wasserfreien dibasischen Natriumphosphats und etwa 8,75 S Natriumchlorid in etwa 9,5 1 destilliertem Wasser. Danach wird die Lösung auf ein Volumen von 10 1 gebracht durch weitere Zugabe von destilliertem Wasser. Die so erhaltene Pufferlösung wird bei einer Temperatur von etwa 4⁰C gehalten und die Dialyse wird bei dieser Temperatur durchgeführt unter dauerndem Rühren der Pufferlösung unter Verwendung eines geeigneten Dialyseröhrensystems. Unter normalen Umständen benötigt die Dialyse ungefähr 48 Stunden und während dieser Zeit sollte die Pufferlösung zweimal gewechsel werden mit jeweils 2 Stunden zwischen zwei aufeinanderfolgenden Wechseln. Somit werden in dem gesamten Verfahren eine Gesamtmenge von etwa 30 1 der Pufferlösung verwendet für jeweils 100 ml verwendeten rekonstituierten Plasmas. Das dialysierte, lyophilisierte Plasma, das man so erhält, ist frei oder im wesentlichen frei von Glucose. Das dialysierte Material wird noch einmal lyophilisiert und das Produkt wird bei einer Temperatur von 4⁰C gelagert, bis es verwendet wird. Direkt vor der¹ Verwendung werden etwa 12,5 g des dialysierten lyophilisierten Produktes zu etwa 50 ml sterilem destilliertem Wasser gegeben.

Wie oben angegeben, umfasst die erfindungsgemässe diagnostische Zusammensetzung ein schwammiges Material, das behandelt wurde mit einem diagnostischen Mittel, das die Fermentation von Mannit nachweist und mit einem diagnostischen Mittel, das die Produktion von Koagulase nachweist. In einer Ausführungsform liegen die erfindungsgemässen Zusammensetzungen in Form von engen Streifen von schwammigem Material vor, wobei jeder Streifen sechs Zonen auf-

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weist, wie folgt:

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wobei die Zone, die als 1 "bezeichnet wird, die Zone ist, in der die Koagulaseproduktion nachgewiesen wird, die den glycosefreien lyophilisierten Plasma- oder Fibrinogenbestandteil enthält; wobei die Zone 2 eine hydrophobe Grenzschicht darstellt, wobei die Zone 3 die Mannitfermentationsnachweiszone darstellt, die Mannit und andere Substrate enthält; wobei die Zone A eine zweite hydrophobe Grenzschicht ist, wobei die Zone 5 unbehandelt ist und wobei die Zone6ein Identifizierungsstreifen ist. Natürlich können die Zonen 5 "und 6 gewünschtenfalls weggelassen werden.

Bei Herstellung dieses Produkts wird die Zone 1 zunächst mit einer wässrigen Dextranlö sung behandelt und getrocknet, um einen Dextranüberzug darauf zu schaffen. Die glucosefreie koagulierbare Materialkomponente wird auf die Zone 1 auf gebläht, die Dextranschicht überdeckend.Es wurde gefunden, daß die besten Ergebnisse erzielt werden unter Verwendung einer'Dextranlösung mit einer Viskosität von etwa 13 bis etwa 29 cps., bestimmt bei 26⁰G unt-er Verwendung eines Brookfield Viskosimeters. Eine derartige Lösung kann erhalten werden, indem man von etwa 16 bis etwa 25 Gew.-% Dextran in destilliertem Wasser löst*

Die hydrophoben Grenzschichten dienen zur Verhinderung der Wanderung, eines diagnostischen Mittels zu dem anderen während der Inkubationsperiode. Die Art der Zusammensetzung', die als hydrophobe Grenzschicht verwendet wird, bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung, ist nicht besonders kritisch. Im allgemeinen kann jedes Material verwendet werden, das mikrobiologisch inert in dem System und unt.er den hierin beschriebenen Bedingungen ist, und das in der Lage ist, das Auslaugen oder das Wandern der Bestandteile während der Inkubation zu verhindern. Somit sind z. B. Wachse, Lacke, natürlich vorkommende hydrophobe Materialien, wie Ithylcellulose und gewisse Polymerisate, zur Verwendung geeignet. Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine farblose polymerisierte Methylacrylatüberzugszusamiriensetzung verwendet, die im Handel erhältlich ist unter dem !Tarnen

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KRYLON 150 CRYSTAL CLEAR durch die Krylon, Inc., Norristown, Pennsylvania. Das vorstehend genannte Produkt wird in den Handel gebracht in einem Toluolträger und kann gewünschtenfalls oder notwendigerweise mit zusätzlichem Toluol oder anderen Kohlenwasserstoff lösungsmitteln, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Propylalkohol etc. verdünnt werden, um seine Aufbringung auf das schwammige Material zu erleichtern. Obwohl Variationen möglich sind, ohne daß man den Rahmen der vorliegenden Erfindung- verlässt, wurde gefunden, daß eine Lösung, die von etwa 75 bis etwa 100 Vol.-% Kry.lon enthält und etwa 0 bis etwa 25 Vol.-% zugesetzten Verdünnungsmittels eine Grenzschichtlösung schafft, die zur Verwendung gut geeignet ist. Eine besonders bevorzugte Kombination ist eine Mischung von 85 Vol.-% Krylon 150 Crystal Clear und 15 Vol.-% Äthylalkohol U.S.P. Offensichtlich können die unbehandelten Zonen 5 und die Identifikationszone 6 gewünschtenfalls weggelassen werden.

Das oben stehende ist eine Beschreibung eines bevorzugten erfin-ΰ./Γ-^sgemäßen Produktes, d. h. Papierstreifen von schwammigem Material imprägniert mit den diagnostischen Mitteln in getrennton Zonen, wobei die Zonen durch eine hydrophobe Grenzschicht getrennt sind. Bei einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das diagnostische Mittel, das die Fermentation von Mannit nachweist, auf das schwammige Material appliziert werden und das diagnostische Mittel, das die Produktion von Eoagulase nachweist, kann darüber aufgebracht werden, um einen Streifen zu schaffen, der beide diagnostische Mittel in einer einzigen ersten Zone enthält» Bei dieser erfindungsgemässen lusführungsform wird eine hydrophobe Grenzschicht-zusammensetzung direkt angrenzend an die Reakbionszone als zweite Zone aufgebracht. Eine dritte Zone, direkt angrenzend an die zweite Zone, wird unbehandelt gelassen und eine vierte Zone, ein Identifizierungsstreifen, wird direkt angrenzend an die unbehandelte dritte Zone aufgebracht. Es ist klar, daß die unbehandelte dritte Zone und der Identifizierungsstreifen gewünschtenfalls weggelassen werden können» Die Herstellung eines Produkts, das die diagnostischen Reagentien in getrennten Zonen enthält,und die Herstellung des Produkts, das die diagnostischen Reagentien in einer einzigen Zone enthält, werden in den folgenden Beispielen genau beschrieben.

Die erfindungsgemäßen diagnostischen Zusammensetzungen haben sich

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BAD ORfGiNAL

stabil gezeigt für eine Zeitdauer von mindestens 6 Monaten, wenn sie bei einer Temperatur von etwa 37°C gehalten wurden. Um die Verpackung und die Verwendung zu erleichtern, wird das behandelte schwammige Material, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde und hierin beschrieben wurde, normalerweise zu schiaalen Streifen zerschnitten, die bequemerweise in eine geeignete Ampulle oder in ein geeignetes Teströhrchen eingebracht werden können. Jeder geschnittene Streifen enthält natürlich die erforderlichen Reagentien zum Nachweis der Fermentation von Mannit und zum Nachweis der !Produktion von Koagulase. Die so verpackten Streifen können leicht transportiert oder gelagert werden, ohne eine Gefahr der Kontaminierung.

In Abhängigkeit von der Art des verwendeten Teststreifens, d. h. ein Teststreifen, der eine einzige Reagenzzone enthält oder ein Teststreifen, der die Reagentien in getrennten Zonen enthält und in Abhängigkeit von den verwendeten Medien gibt es gewisse Unterschiede in der Art, in der die Produkte verwendet werden bei der Unterscheidung von Staphylokokken. Somit ist z. B., wenn ein Einzelzonenstreif en verwendet wird und ein nicht-selektives Medium, d. h. Inocula aus neutralen Medien, wie Blutagar, Trypticasesojaagar etc., verwendet werden, das Verfahren das folgende: Eine 3 mm öse von Organismen von einer 18 loi. 24 Stunden alten Agarkultur wird in 0,5 ml Salzlösung in einem geeigneten Röhrchen suspendiert. Bas Inoculum sollte gut vermischt werden, so daß die Suspension gleichmässig ist. Danach v/ird der Teststreifen in das Röhrchen derart eingebracht, daß die Reagenzzone in die Salzlösung eintaucht. Das Rohrchen wird dann in einem Wasserbad bei einer Temperatur von'etwa 35° C bis etwa 37°C inkubiert und nach etwa 45 bis 60 Minuten Inkubation wird das Röhrchen untersucht, um festzustellen, ob die Koagulasereaktion eingetreten ist. Ein positiver Test wird angezeigt durch Zusammenklumpen der bakteriellen Suspension, wobei der Grad der Zusainmenklumpung von einem feinen Niederschlag bis zu großen Klumpen in Abhängigkeit von den untersuchten Organismen sich erstreckt. Ein negativer Test für die Eoagulaseproduktion wird angedeutet durch das Nicht-Auftreten einer Ausklumpung. Nachdem das Röhrchen auf die Koagulasereaktion untersucht würde, wird es nochmals in das Wasserbad gebracht und bei einer Temperatur von 35 bis 37°C weitere 3 bis 5 Stunden inku-

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biert. Wenn Phenol-Rot als chemischer Indikator beim Mannitfermentationsnachweis vorhanden ist, wird ein positiver Mannitfermentationstest angezeigt durch die Bildung einer gelben Färbung im Reagenzstreifen und in der Salzsuspension. Ein negatives Ergebnis wird angezeigt durch die Bildung einer rosafarbenen bis kirschroten Färbung in der Reagenzzone und in der Salzsuspension.

Wenn der verwendete Teststreifen das Mittel zum Nachweis der Fermentation von Mannit und das Mittel zum Nachweis der Koagulaseproduktion als getrennte und einzelne Zonen enthält, und wo ein nicht-selektives Medium verwendet wird, wird die Unterscheidung von Staphylokokken in der folgenden Weise durchgeführt: Eine 3,0 mm öse von Organismen von einer 18 bis 24- Stunden alten Kultur wird gleichförmig in 0,3 ml Salzlösung in einem geeigneten Röhrchen suspendiert. Der Teststreifen wird so in das Röhrchen eingebracht, daß die Koagulaseproduktionsnachweis-Reagenzzone, d. h. die Zone, die das speziell hergestellte und standardisierte Plasma CvI^0-T¹ Fibrinogen enthält, wird in die Suspension eingetaucht. Sofort danach wird das Röhrchen umgeschwenkt, um die Mannitfermentationsnachweis-Reagenzzone zu befeuchten. Das Röhrchen wird im folgenden bei einer Temperatur von etwa 37 C in einem Inkubator inkubiert. Die Koagulasereaktion kann eine Stunde nach Beginn der Inkubation oder zu Jeder Zeit danach abgelesen werden.. Ein positiver Koagulasetest wird angezeigt durch die Bildung von Klumpen, die von einem feinen Niederschlag bis zu großen Klumpen, auftreten können. Eine negative Koagulasereaktion wird angezeigt durch die Abwesenheit von Verklumpung. Nachdem die Untersuchung des Röhrchens auf die Koagulasereaktion beendet ist, wird das Röhrchen nochmals in den Inkubator gegeben und darin bei einer Temperatur von 37 G während weiterer 3 bis 5'Stunden aufbewahrt. Wenn Phenol-Rot als chemischer Indikator in dem Mannitfermentationsnachweismittel enthalten ist, wird ein positiver Mannitfermentationstest angezeigt durch die Bildung einer gelben Färbung in der Mannitreagenzzone. Ein negativer Mannitfermentationstest wird angezeigt durch die Bildung einer rosafarbenen oder kirschroten Farbe in der Mannitreagenzzone. .

Das Verfahren, das man anwendet, wenn der verwendete Teststreifen das Reagenz zum Nachweis der Koagulaseproduktion und das Reagenz

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zinn Nachweis der Mannitfermentation in Jorm von getrennten und einzelnen Streifen aufweist, und wenn ein selektives Medium verwendet wird, d. h. ein Inoculum von Staphylokokkenlsolationsmedium, wie Mannit-Salz-Agar, Chapman-Stone-Agar etc., verwendet wird, ist das Verfahren das folgende: Eine 3*0 mm öse von Organismen von einer 18 Ms 24- Stunden alten Kultur wird in 0,3 ml Salzlösung in einem geeigneten Röhrchen suspendiert. Eine öse von Or*- ganismen wird in die Mannitreagenzzone eingerieben, worauf die Zone mit einem Tropfen Salzlösung befeuchtet wird. Der Teststreifen. ■ wird dann in das Röhrchen gebracht in einer derartigen Weise, daß die Koagulaseproduktionsnachweis-Reagenzzone in die Suspension eintaucht. Das Röhrchen wird dann "bei einer Temperatur von etwa 37°C inkubiert, wobei die Koagulasereaktion eine Stunde nach Beginn der Inkubation oder zu jeder Zeit danach abgelesen werden "kann. Ein positiver Koagulasetest wird angezeigt durch die Bildung von Klumpen, die eine Größe aufweisen können von einem feinen Niederschlag bis zu großen Klumpen. Ein negativer Koagulasetest wird 'angezeigt durch die Abwesenheit von der Klumpung. Nachdem das Röhrchen untersucht wurde auf die Produktion von Koagulase wird es nochmals in einen Inkubator gebracht, worin es bei einer Temperatur von etwa -37⁰C während weiterer 3 bis 5 Stunden aufbewahrt wird. Wenn Phenol-Rot in dem Mannitfermentationsnachweismittel als chemischer Indikator enthalten ist, wird ein positiver Test für Mannitfermentation angezeigt durch die Bildung einer gelben Färbung in der Reagenzzone-,während.ein-negativer'Test, für die Mannitfermentatiön angezeigt wird durch die Bildung einer rosafarbenen bis kirschroten Färbung auf der Mannitreagenzzone.

Der primäre Wert der erfindungsgemässen diagnostischen Zusammen-Setzungen in einem klinischen Laboratorium ist die Unterscheidung von pathogenem Staphylokokkus aureus von Staphylokokkus epidermidis, der öfter als parasitisch als pathogen bezeichnet wird. Der erstere produziert Koagulase und fermentiert Mannit, während der letztere weder Koagulase produziert noch Mannit fermentiert. Die vorliegende Erfindung schafft ein schnelles,empfindliches und reproduzierbares Verfahren zu einer derartigen Unterscheidung'.

Zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Beispiele gegeben, die jedoch die vorliegende Erfindung

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nicht beschränken sollen.

Beispiel 1

A. Herstellung von Reagenz, das die Fermentation von Mannit nachweist

Zu einem Gefäß, das 80 ml destillierten Wassers enthält, werden nacheinander 1,0 g Bacto-Fleisch-Extrakt, 10,0 g Proteose-Pepton Nr. 3, 15 E D~Mannit, 5 S Natriumchlorid und 0,55 6 Phenol-Rot zugegeben. Danach werden 3,4 g Dextran mit einem Molekulargewicht ,von etwa 60 000 bis etwa 90 000 zugegeben und die Mischung wird auf eine Temperatur von 100°C erhitzt, um eine Lösung zu bilden. Die !Lösung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, wonach sie auf ein Volumen von 100 ml gebracht wurde durch Zusatz von destilliertem V/asser.

B. Herstellung von Reagenz, das die Produktion von Koägulse nachweist

(■j) 12,5 lyophilisierten, dialysierten, gesammelten menschlichen Plasmas, von dem alle nachweisbaren Spuren von Glucose entfernt worden waren, wurde zu 50 ml sterilem destilliertem Wasser gegeben und dann aufgelöst.

(b) Das lyophilisierte, dialysierte, gesammelte menschliche Plasma, das bei der Herstellung der in dem vorstehenden Absatz beschriebenen Lösung verwendet wurde, wurde in der folgenden V/eise hergestellt;: 20,0 g lyophilisierten, menschlichen Plasmas wurden in 80 ml destilliertem V/asser gelöst und die Lösung wurde danach in ein Volumen von 100 ml durch Zusatz von destilliertem Wasser gebracht. Je 100 ml rekonstituierten Plasmas, die man so erhielt, wurden gegen 10 1 Puffer dialysiert. Der verwendete Puffer wurde hergestellt, indem man nacheinander 8,0 g monobasischen Kaliumphosphats, 34,0 g wasserfreien dibasischen Natriumphosphatε, 26,5 g Natriumchlorid in 9>5 destillierten Wassers auflöste. Die Lösung wurde durch Zusatz von destilliertem Wasser auf ein Volumen von 10 1 gebracht. Der Puffer wurde bei einer Temperatur von 4⁰C gehalten und das Plasma wurde mit Hilfe einer 2,54 cm (1 inch) Dialyserohrleitung dialysiert. Die Dialyse wurde bei einer Temperatur von 4⁰C durchgeführt unter kontinuierlicher Rührung des Puffers. Im Verlaufe der gesamten Dialysezeit von etwa 48 Stunden wurde die

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Pufferlösung zweimal gewechselt,.-wobei mindestens 8 Stunden zwischen den Wechseln vergingen. Da in allen lallen 100 ml rekonstituierten Plasma gegen 10 1 Puffer dialysiert wurden, wurde eine Gesamtmenge von 30 1 Puffer in dem Verfahren verwendet.

So erhielt man ein lyophilisiertes dialysiertes Plasma, das völlig frei war von Glucose.

G. Herstellung von hydrophober Grenzschichtzusammensetzung Diese Zusammensetzung wurde hergestellt, indem man 85 ml KRYLON 150.GEYSTAL CLEAR mit 10 ml Äthylalkohol USP verdünnte.

D. Aufbringen des diagnostischen Reagenz auf schwammiges Material Ein kontinuierliches Blatt Eaton-Dikeman-Filter-Papier 623 (70 pounds) mit den Abmessungen 82 mm χ 630 mm wurde als schwammiges Material bei der Herstellung von 100 diagnostischen Papierstreifen verwendet, die 82 mm χ 6,3 mm Abmessungen -aufwiesen. Das Blatt TjMe in vier Zonen wie folgt markiert:

1
- - ■ . -

2

3

4

15 mm 15 mm

48 mm

4 mm

Die hydrophoben Grenzschichtzusammensetzungen, deren Herstellung in Abschnitt G des Beispiels beschrieben ist, wurden auf Zone 2 aufgebracht in einer Menge, die genügte, um die Zone zu sättigen. Das Blatt wurde danach bei Raumtemperatur stehengelassen, um das Lösungsmittel verdunsten zu lassen.

Nachdem die Zone 2 völlig trocken war, wurde das Reagenz zum Kachweis der Fermentation von Mannit, d. h. das Produkt des Abschnitts A dieses Beispiels, auf Zone 1 aufgebracht, wobei Vorsorge getragen wurde, daß die Zone 1 die Zone 2 nicht berührt oder überlappt. Daraufhin ließ man die Zone 1 trocken.

Das Reagens zum Nachweis der Produktion von Koagulase, d. h. die Zusammensetzung, die in Abschnitt B dieses Beispiels beschrieben wurde, wurde auf die Zone 1, d. h. auf das getrocknete Mannitfermentationsnachweisreagenz aufgebracht. Daraufhin ließ man die Zone 1 wiederum trocknen, gefolgt von einer zusätzlichen Menge der

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Zusammensetzung des Abschnitts B, die wiederum aufgebracht wurde. Die Zone 3 blieb unbehandelt und die Zone 4 ist ein Identifizierungsstreifen. Nach dem Trocknen wurde das Papier in 100 Streifen zerschnitten, die die Abmessung 82 mm χ 6,3 mm aufwiesen, und wobei jeder Streifen die oben beschriebenen vier Zonen aufwies.

E. Verwendung der diagnostischen Zusammensetzung

Bei der Verwendung der diagnostischen Zusammensetzungen, die,wie in Abschnitt D dieses Beispiels beschrieben wurde,hergestellt wurden, wird eine volle 3 mm Öse von Organismen aus Trypticasesojabrühe oder Blut-Agar-Platte in 0,3 ml Salzlösung in einem 13 x 100 mm Teströhrchen suspendiert. Ein Teststreifen, der hergestellt wurde, wie es in Abschnitt D dieses Beispiels beschrieben ist, wird in das Röhrchen derart eingebracht, daß die Medienzone in

ψ die Suspension eintaucht. Das Röhrchen wird danach in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit von einer Stunde wird das Röhrchen auf die Koagulasereaktion unter s^cliö. Ein positiver Koagulasetest wird angedeutet durch Verklumpung der bakteriellen Suspension, die sich erstrecken kann von einem feinen Niederschlag bis zu großen Klumpen. Bei einem negativen Koagulasetest bleibt die Suspension homogen. Daraufhin wird die Inkubation des Röhrchens fortgesetzt und am Ende der gesamten Inkubationsdauer von 6 Stunden wird das Röhrchen nochmals untersucht, diesmal zur Bestimmung der Mannitfermentation. Ein positiver Mannitfermentationstest wird angedeutet durch die Entwicklung einer gelben Färbung auf der Mediumzone,d.h.

κ auf der Zone 1 und in der Suspension. Ein negativer Test wird angedeutet durch das Auftreten einer rosafarben bis kirschroten Färbung in der Mediumzone und in der Suspension.

F. Alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Dieses Beispiel wurde in seiner Gänze wiederholt mit der Ausnahme, daß das lyophilisierte dialysierte gesammelte menschliche Plasma, das darin verwendet wurde, ersetzt wurde durch 12,5 g glucosefreien lyophilisierten dialysierten gesammelten Kaninchenplasmas.

Das so erhaltene Produkt, d. h. der Teststreifen, erwies sich als vollständig zufriedenstellend für den schnellen und verlässlichen Nachweis der Koaguiaseproduktioß und Manüitfermentation von Staphy-

lokokken.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Produktion von schwammigen Teststreifen, auf die das Reagenz zum Nachweis von Koagulaseproduktion und das Reagenz zum Nachweis von Mannitfermentation in Form von separaten Zonen aufgebracht wurde.

A. Herstellung von Reagenz, das die Fermentation von Mannit nachweist

B. Herstellung von Reagenz, das die Produktion von Koagulase nachweist ·

C. Herstellung von hydrophober Grenzschichtzusammensetzung

Reagenz (A) und (B) und die Zusammensetzung (C) wurden herge- ■ stellt unter Verwendung der gleichen Bestandteile und der gleichen Mengen durch die Verfahren, wie sie in den Abschnitten (A), (B) und (C) von Beispiel 1 beschrieben wurden.

D. Aufbringen der diagnostischen Reagentien auf das schwammige Material

Bei der Herstellung der Streifen wurde ein kontinuierliches Blatt von Eatori-Dikeman-Filter-Papier 623 (70 pounds) , das 82 mm breit war, verwendet. Das Papier wurde in 6 getrennte Zonen aufgeteilt wie folgt:

^I82 mm

1

2

3

4

5

6

15 μ 16mm 15 m 16mm 16mm 4 mm

Die hydrophobe Grenzschichtzusammensetzung, die, wie, in Abschnitt C von Beispiel 1 beschrieben wurde, hergestellt wurde, wurde auf die Zonen 2 und 4 aufgebracht. Diese Zonen ließ man trocknen und wenn sie trocken waren, wurde die Zone 1 mit einer Lösung von Dextran (Molekulargewicht 60 000 bis 90 000) in destilliertem Wasser behandelt, wobei die verwendete Lösung 18,3 g Dextran pro 100 ml Lösung enthielt. Man achtete darauf, daß die Zonen 1 und .2 sich nicht berührten oder überlappten. Als die Zone 1 trocken war,wurde darauf über den Dextranüberzug die lyophilisierte dialysierte

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Plasmazusammensetzung appliziert, die hergestellt wurde, wie es in Abschnitt B von Beispiel 1 beschrieben ist. Es wurde ein Überlappen der Zonen 1 und 2 vermieden. Nachdem die Zone 1 brocken war, wurde die Zusammensetzung zum Nachweis der Mannitfermentation auf die Zone 3 aufgebracht, wonach die Zone getrocknet wurde. Die Zone 6 wurde lediglich zu Identifizierungszwecken mit einer destillierten Vasserl-ösung behandelt, von der je 100 ml 0,1 g F.D. & C. Blue Nr. 1 und 0,4 g P.D. & C. Yellow Nr. 6 enthielt. Das so behandelte Papier wurde dann in Streifen von 0,635 cm (1/4 inch) Breite geschnitten, wobei jeder derartige Streifen die sechs oben beschriebenen Zonen 'aufwies.

E. Verwendung der diagnostischen Zusammensetzung Die Teststreifen, deren Herstellung in diesem Beispiel beschrieben ist, haben gewisse Vorteile gegenüber den Teststreifen, die gemäss Beispiel 1 hergestellt wurden. Da das Koagulaseproduktionsnachweisreagenz und das Mannitfermentationsnachweismittel als . zv/ei getrennte Zonen aufgebracht wurden, ist es iuüglich, den Test durchzuführen unter Verwendung von entweder einem Inoculum aus neutralen Medien, ζ. B. Blut-Agar, Trvpticase-Scja-Agar etc. oder unter Verwendung eines Inoculum von Staphylokokkum-Isolierungsmedium, z. B. Mannit-Salz-Agar, Chapman-Stone-Agar etc. Demgemäß wird im folgenden eine Beschreibung des Verfahrens gegeben, das beide Typen von Medien verv;endet.

Bei dem Verfahren, das ein Inoculum aus neutralem Medium verwendet, wurde eine 3>0 mm Öse von Organismen in 0,3 ml Salzlösung in einem Teströhrchen suspendiert. Der Teststreifen, dessen Herstellung in Abschnitt D dieses Beispiels beschrieben ist, wird in die Suspension derart eingetaucht, daß die Zone 1 in Kontakt mit der Suspension ist. Direkt danach wird das Teströhrchen in einem derartigen Winkel geneigt, daß die Suspension die Zone 3.berührt und benetzt. Das Röhrchen wird dann bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Die Koagulasereaktion wird nach einer Inkubationsdauer von einer Stunde oder danach abgelesen. Ein positiver Koagulasetest wird angedeutet durch ein Verklumpen der bakteriellen Suspension in dem Teströhx'chen. Das Verklumpen variiert von einem feinen Niederschlag bis zu großen Klumpen. Eine negative Koagulasereaktion wird angedeutet durch die' Abwesenheit von Klumpen. Die

Inkubation wird über die Beendigung der Koagulaseproduktion hinaus für einen Zeitraum von bis 2u zusätzlichen 5 Stunden weitergeführt, d. h. es ergibt sich eine Gesamtinkubationszeit von 6 Stunden. Bei der Bestimmung der Mannit!'ermentation kann die Reaktion schnell sein oder verzögert in Abhängigkeit von den biochemischen Eigenschaften des entsprechenden isolierten Produktes. Ein positiver Mannittest wird angedeutet durch die Bildung einer gelben Färbung auf Zone 3 des Streifens. Eine negative Reaktion wird angedeutet durch die Bildung einer rosafarbenen oder kirschroten Färbung auf Zone 3 des Streifens. Eine negative Ilannitfermentation sollte nicht abgelesen werden vor Beendigung der sechsstündigen Inkubationszeit.

Wenn ein Inoculum aus Staphylokokkum-Isolations-Medium verwendet wird, z. B. Mannit-Salz-Agar, Chapman-Stone-Agar etc., wird eine 3,0 mm Öse von Organismen in 0,3 ml Salzlösung in einem Teströhrchen suspendiert. Eine öse von Organismen wird in die Mannitfermentationszone des Teststreifens eingerieben, d»n. Zone3» und die Zone wird mit einem Tropfen Salzlösung befeuchtet. Der Teststreifen wird dann zu der Suspension gegeben, derartig, daß die Zone 1 darin eintaucht. Das Röhrchen wird im folgenden bei einer Temperatur von 37°C inkubiert und die Koagulasereaktion kann eine Stunde oder später nach den Beginn der Inkubation abgelesen werden. Ein positiver Koagulasete sty angedeutet .durch die Bildung von Klumpen, während ein negativer Koagulasetest angedeutet wird durch die Abwesenheit von Klumpen. Die Inkubation wird weitere 5 Stunden/durchgeführt, um die Gesamtinkubationsdauer auf/6 Stunden zu bringen. Eine positive Mahnitfermentation wird angezeigt durch die Bildung einer gelben Farbe auf Zone 3 des TestStreifens, während ein negatives Ergebnis angezeigt wird durch die Bildung einer rosafarbenen oder kirschroten Färbung in Zone 3-des Teststreifens.

F. Alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Dieses Beispiel wurde in seiner Gänze wiederholt mit der Ausnahme, daß 1,0 g Fibrinogen verwendet wurde anstelle von 12,5 g des lyo— pMlisierten dialysierten gesammelten menschlichen Plasmas als Reagenz zur Bestimmung der Eoagulaseproduktion.

Ims so erhaltene Eroctekt, d» i* ä&f Teststreifen, zeigte sich

ständig zufriedenstellend zum schnellen und verlässlichen Nachweis von Koagulaseproduktion und Mannitfermentation in Staphylokokken.

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Claims

Betrifft: Patentanmeldung P 20 18' 36k.6 ^

.1. Diagnostisches Reagenz zur schnellen und positiven Identifizierung von Staphylokokken, dadurch gekennzeichnet, daß es ein schwammiges Material umfasst, das

(i) eine Zusammensetzung bestehend aus

(a) einen Nährstoff, der in der Lage ist, das Wachstum von Mikroorganismen zu erhalten,

(b) D-Mannit, und

(c) einen chemischen Indikator, der eine Farbänderung in Gegenwart von sauren Abbauprodukten aufweist, die gebildet v/erden durch die Fermentation von Mannit, enthält, und

(ii) ein koagulierbares Material, von dem alle oder im wesentlichen alle Glucose entfernt wurde, umfaßt, wobei die Zusammensetzung (ii) die Zusammensetzung (i) überdeckt.

2. Diagnostisches Eea'genz zur schnellen und positiven Identifizierung von Staphylokokken, dadurch gekennzeichnet, daß es ein schwammiges Material umfasst, das imprägniert ist mit (i) einer Zusammensetzung, die

(a) einen Nährstoff, der in der Lage ist, das Wachstum von Mikroorganismen zu erhalten,

(b) D-Mannit,. und .

(c) einen chemischen Indikator, der eine Farbänderung in Gegenwart von sauren Abbauprodukten schafft, die gebildet werden durch die Fermentation von Mannit, enthält, und

(ii)einem koagulierbaren Material, von dem alle oder im wesentlichen alle Glucose entfernt wurde,

wobei die Zusammensetzungen (i) und (ii) getrennt auf das schwammige Material aufgebracht werden, um zwei Reagenzzonen zu bilden, wobei die Reagenzzone (i) von der Reagenzzone (ii) durch eine hydrophobe Grenzschicht getrennt ist.

3· Diagnostisches Reagenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung (i) auch Natriumchlorid enthält.

.4. Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch

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gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung (i) auch ein Verdickungsmittel enthält.

5. Diagnostisches Reagenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Zusammensetzung (i) der Bestandteil (a) eine Mischung von Fleischextrakt und Proteose-Pepton und der Bestandteil (c) Phenol-Rot ist.

6. Diagnostisches Reagenz gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung (ii) auf eine Zone auf dem schwammigen Material aufgebracht wird, das mit Dextran überzogen ist. - ' '

7. Diagnostisches Reagenz gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn-

zeichnet, daß die Zusammensetzung (i) auch Natriumchlorid -enthält.

8. Diagnostisches Reagenz gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung (i) auch ein Verdickungsmittel enthält.

9. Diagnostisches Reagenz gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Zusammensetzung (i) der Bestandteil (a) eine Mischung von Fleischextrakt und Proteose-Pepton und Bestandteil (c) Phenol-Rot ist.

10. Diagnostisches Reagenz gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophobe Grenzschichtzone eine polymerisierte

f Methylacrylatüberzugszusanunensetzun'g umfasst.

11. Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Vex-dickungsmittel Dextran ist.

12. Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Verdickungsmittel Dextran ist.

13. Zusammensetzung zum Nachweis von Koagulaseproduktion in Staphylokokken, dadurch gekennzeichnet, daß es ein koagulierbares Material, ausgewählt aus lyophilisiertem menschlichem Plasma, lyophilisiertem Kaninchenplasma und Fibrinogen, umfasst, wobei dieses

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Material frei odor im wesentlichen frei von Glucose ist.

14. Diagnostisches Reagenz zum Nachweis von Koagulaseproduktion in Staphylokokken, dadurch gekennzeichnet, daß es ein schwammiges Material umfaßt, auf das die Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 aufgebracht ist.

15· Verwendung des diagnostischen Reagenz gemäß Anspruch 1 für ein Verfahren zur Unterscheidung von Staphylokokken, dadurch gekennzeichnet, daß man das diagnostische Reagenz in eine Salzlösungssuspension eines Inoculum aus neutralem Medium eintaucht, die Suspension über einen Zeitraum von etwa einer Stunde bei einer Temperatur von etwa 55°C bis etwa 37°C inkubiert, die Suspension auf die Bildung von Klumpen untersucht und man die Suspension während einer zusätzlichen Zeitdauer von etwa 5 bis etwa 5 Stunden inkubiert bei einer Temperatur von >7°C, und man die Reagenzzone und die Suspension auf.einen Farbwechsel untersucht.

16. Verwendung des diagnostischen Reagenz gemäß Anspruch 2 für ein Verfahren zur Unterscheidung von Staphylokokken, dadurch gekennzeichnet, daß man das diagnostische Reagenz in eine SaIzlösungssüspension eines Inoculum aus neutralem Medium in. derartiger Weise zugibt, daß nur die Reagenzzone, die die Zusammensetzung (ii) enthält, In die Suspension eintaucht, wobei im folgenden die Reagenzzone, die die Zusammensetzung (i) enthält, mit der Suspension befeuchtet wird, man die Suspension über einen Zeitraum von etwa einer Stunde bei einer Temperatur von etwa 37"C inkubiert, man die Suspension auf die Bildung von Klurr.p.en untersucht und man die Suspension weiter inkubiert über einen zusätzlichen Zeitraum von etwa 3 bis etwa 5 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37°C und man die Reagenzzone, die die Zusammensetzung (i) enthält, auf einen Farbwechsel untersucht.

17· Verwendung des diagnostischen Reagenz gemäß Anspruch 2 für ein Verfahren zur Unterscheidung von Staphylokokken, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Inoculum aus Staphylokokken-Isolationsmedium auf die Reagenzzone'des diagnostischen Reagenz, die die Zusammensetzung (i) enthält, aufbringt, man in folgenden diese Reagenzzone mit Salzlösung befeuchtet, man danach das diagnostische Reagenz zu einer Salzlösungssuspension eines Inoculum von Staphylokokkum-Isolationsmedium in einer derartigen

U 09 8 4 47 1739 ^{BAD 0R!QäislAL}

Weise gibt, daß die Reagenzzone, die die Zusammensetzung (ii) enthält, in die Suspension eintaucht, man die Suspension über einen Zeitraum von etwa einer Stunde bei einer Temperatur von etwa 37°C inkubiert, man das Reagenz auf die Bildung von Klumpen hin untersucht und man weiterhin die Suspension während einer zusätzlichen Zeitdauer von etwa 3 bis etwa 5 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37°C inkubiert und man die Reagenzzone, die die Zusammensetzung (i) enthält, auf eine Farbänderung untersucht.

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