DE60133775T2

DE60133775T2 - Festes kulturmedium und herstellungsverfahren dafür

Info

Publication number: DE60133775T2
Application number: DE60133775T
Authority: DE
Inventors: K. Zama-shi SOTOYAMA; Y. C/O MORINAGA MILK INDUSTRY CO. LTD. Zama-shi FUKUWATARI; Y. Zama-shi YANO; K Zama-shi KIYOTAKI; M. Zama-shi NAKAGAWA; K. Zama-shi KARINO; K. Zama-shi SASAKI
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2001-08-09
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2021-08-10
Also published as: EP1357179A4; WO2002061051A1; ATE393209T1; US7176014B2; JP3712708B2; KR20030072394A; CN1250704C; DE60133775D1; EP1357179B1; AU2001277742B2; CN1487994A; KR100540864B1; HK1063644A1; CA2428999C; AU2001277742B8; CA2428999A1; US20040041123A1; NZ526740A; EP1357179A1; JPWO2002061051A1

Description

Technisches Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein festes Medium, das für die Züchtung und für Tests verschiedener Mikroorganismen usw. eingesetzt wird, und ein Verfahren zur Herstellung desselben.
Stand der Technik
Als ein Beispiel von getrockneten festen Medien ist üblicherweise ein getrocknetes festes Medium bekannt, das hergestellt wird, indem ein in eine Kunststoffschale gegossenes und verfestigtes Medium gefriergetrocknet wird ( JP 60-199886 , nachstehend als „Stand der Technik 1" bezeichnet).
Weiterhin ist ein getrocknetes festes Medium auch in Form eines Films bekannt, das ein Geliermittel wie Agar enthält und bei dem einfach im Wesentlichen der frühere Zustand vor Ausbilden des Films wiederhergestellt werden kann, indem sterilisiertes Wasser zugegeben wird ( JP 6-311880A , nachstehend als „Stand der Technik 2" bezeichnet).
Diese herkömmlichen Materialien weisen jedoch die folgenden Probleme auf.
Die vorstehend erwähnten Stand der Technik 1 und Stand der Technik 2 werden verwendet, um die Lagerstabilität von Medien zu verbessern, wobei die Medien so getrocknet werden, dass der Wassergehalt in den Zusammensetzungen des schließlich erhaltenen festen Mediums 50% oder weniger ausmacht.
Deshalb haben sie ein Problem, nämlich dass bei der Verwendung erst mal eine lange Zeitspanne von etwa drei Stunden für die vollständige Wiederherstellung der Medien erforderlich ist.
Da die getrockneten festen Medien, die gemäß den vorstehend erwähnten herkömmlichen Verfahren erhalten wurden, wie vorstehend beschrieben eine lange Zeitspanne für die Wiederherstellung benötigen, hat weiterhin eine Wiederherstellung in einer relativ kurzen Zeitspanne, wie in einer bis zehn Minuten, eine nur unzureichende Wiederherstellung zur Folge. Wenn dann solche Medien für Tests von Mikroorganismen eingesetzt werden, wird das Wachstum von Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Bacillus stearothermophilus var. calidolactis NIZO C953 usw., die wichtige Bakterienarten in Tests auf Mikroorganismen von Lebensmitteln usw. sind, aufgrund der unzureichenden Wiederherstellung des Mediums teilweise gehemmt; dies führt dann zu einer ungenauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen, wie durch die nachstehend erwähnten Testbeispiele deutlich gemacht wird.
D. h. die herkömmlichen getrockneten festen Medien haben ein Problem, nämlich dass sie für die Wiederherstellung eine lange Zeitspanne benötigen, und somit sind sie für Tests zur schnellen und genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen nicht geeignet.
Weiterhin ist bekannt, dass ein festes Medium getrocknet wird, um überschüssige Feuchtigkeit auf seiner Oberfläche nach seiner Herstellung zu entfernen. Da dieser Trocknungsprozess einen Teil des Wasser-Lösemittels aus dem in einer vorgeschriebenen Zusammensetzung hergestellten festen Medium entfernt, sollte sich der Wassergehalt des Mediums bei der tatsächlichen Kultur von Mikroorganismen signifikant von dem vorgeschriebenen Gehalt in der Zusammensetzung, welche das feste Medium kennzeichnet, unterscheiden. Einflüsse der Trocknung des Mediums auf die Kultur von Mikroorganismen können nicht ignoriert werden. Z. B. ist bekannt, dass das Wachstum von Mikroorganismen manchmal aufgrund von Trocknung usw. vermindert wird, und zwar auch dann, wenn ein Medium mehrere Wochen in einem Teströhrchen mit einem Baumwollstopfen gelagert wird. Außerdem führt eine unkontrollierte Entfernung von Wasser manchmal dazu, dass die Zusammensetzung von festen Medien instabil wird. Deshalb kann es sein, dass man bei Kulturtests von Mikroorganismen möglicherweise keine reproduzierbaren und genauen Ergebnisse erhält, insbesondere bei solchen Tests von Mikroorganismen, bei denen die Wahrscheinlichkeit groß ist, dass sie durch den Wassergehalt eines Mediums beeinträchtigt werden.
JP 8182494 beschreibt ein nicht-ionisches Wasser-absorbierendes Harz, das ein vernetztes Polymer darstellt, welches mit Agar als einen möglichen Bestandteil gemischt werden kann.
Beschreibung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines festen Mediums, welches eine außerordentlich gute Wasserabsorptionsrate aufweist, so dass die Applikation einer großen Menge einer Probe in einer kurzen Zeitspanne möglich gemacht wird, und welches für Tests zur schnellen und genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet ist, und außerdem die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung desselben.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten angesichts der vorstehend erwähnten Probleme nach dem Stand der Technik gewissenhafte Untersuchungen durch. Als Ergebnis erhielten sie ein festes Medium, indem sie die Bestandteile des festen Mediums in dem Wasser-Lösemittel lösten, dessen Menge größer ist als eine vorgeschriebene Menge, indem sie die erhaltene Lösung verfestigten und das verfestigte Medium trockneten, um Wasser in einer Menge zu entfernen, die fast gleich ist wie die überschüssige Menge des Wasser-Lösemittels. Sie haben gefunden, dass das Medium keine Wachstumshemmung von Mikroorganismen aufgrund von Trocknung verursacht. Außerdem haben sie gefunden, dass es eine außerordentlich gute Wasserabsorptionsrate aufweist, so dass die Applikation einer großen Menge einer Probe in einer kurzen Zeitspanne möglich gemacht wird, und dass es für Tests zur schnellen und genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet ist. Auf diese Weise vervollständigten sie die vorliegende Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt ein festes Medium bereit, das eine durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate von mindestens 0,05 ml/Minute aufweist (nachstehend auch als das „feste Medium der vorliegenden Erfindung" bezeichnet), welches durch ein Verfahren zur Herstellung eines festen Mediums erhalten werden kann, umfassend die Schritte: Lösen der Bestandteile des festen Mediums, die nicht das Wasser-Lösemittel sind, in dem Wasser-Lösemittel, Verfestigen der erhaltenen Lösung und Trocknen des verfestigten Mediums, um Wasser zu entfernen, wobei das Wasser in einer solchen Menge entfernt wird, dass das feste Medium nach der Entfernung des Wassers die durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate von mindestens 0,05 ml/Minute aufweisen sollte, und wobei die Menge des Wasser-Lösemittels größer ist als eine vorgeschriebene Menge um eine Menge, die annähernd gleich der Menge des zu entfernenden Wassers ist.
In dem festen Medium der vorliegenden Erfindung beträgt die Menge des zu entfernenden Wassers vorzugsweise mindestens 5% des Wasser-Lösemittels, stärker bevorzugt mindestens 30% des Wasser-Lösemittels.
Das feste Medium der vorliegenden Erfindung hat vorzugsweise einen Wassergehalt von mindestens 90%.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines festen Mediums bereit, umfassend die Schritte: Lösen der Bestandteile des festen Mediums, die nicht das Wasser-Lösemittel sind, in dem Wasser-Lösemittel, Verfestigen der erhaltenen Lösung und Trocknen des verfestigten Mediums, um Wasser zu entfernen, wobei das Wasser in einer solchen Menge entfernt wird, dass das feste Medium nach der Entfernung des Wassers eine durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate von mindestens 0,05 ml/Minute aufweisen sollte, und wobei die Menge des Wasser-Lösemittels größer ist als eine vorgeschriebene Menge um eine Menge, die annähernd gleich der Menge des zu entfernenden Wassers ist.
In dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung beträgt die Menge des zu entfernenden Wassers vorzugsweise mindestens 5% des Wasser-Lösemittels, stärker bevorzugt mindestens 30% des Wasser-Lösemittels.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet ein festes Medium ein Medium, das zum Zeitpunkt der Verwendung in einem festen Zustand vorliegt, z. B. ein Plattenmedium, ein Schrägkulturmedium usw., die mit einem Geliermittel wie Agar verfestigt sind.
Ein Medium ist im Allgemeinen durch seine Zusammensetzung gekennzeichnet (definiert). Somit ist die vorgeschriebene Menge eines Wasser-Lösemittels eine Menge an Wasser in einer solchen Zusammensetzung, die für die Kennzeichnung des Mediums verwendet wird. Die vorgeschriebene Menge des Wasser-Lösemittels bedeutet eine Menge an Wasser, die zugegeben wird, um jeden Bestandteil des festen Mediums, der nicht das Wasser-Lösemittel ist, zu lösen, und wenn ein Bestandteil des festen Mediums als eine wässrige Lösung angegeben ist, ist die Menge an Wasser in diesem Bestandteil nicht eingeschlossen.
Die durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate wird gemäß der folgenden Gleichung berechnet, wobei A und B, gemessen wie folgt, verwendet werden. Das Gesamtgewicht (B) einer Probenplatte (runde Form, äußerer Durchmesser: 9 cm, innerer Durchmesser: 8,6 cm (Fläche: 58,1 cm²), Menge des Mediums: 15 g) wird gemessen, und die Wasserabsorption wird gestartet, indem 10 ml Ionenaustausch-behandeltes Wasser auf das Plattenmedium zugegeben werden. Nach zehn Minuten wird das Wasser, das nicht absorbiert wurde, abgegossen, die Feuchtigkeit an der Wand der Schale wird abgetupft und das Gesamtgewicht (A) der Probenplatte nach der Wasserabsorption gemessen. Die Messung erfolgt bei 25°C. Wenn die Fläche der Probenplatte sich von der vorstehenden Fläche unterscheidet, wird der Test durchgeführt, indem Ionenaustausch-behandeltes Wasser in einer Menge von 10 ml pro vorstehend definierter Fläche verwendet wird, und das Ergebnis wird in eine Wasserabsorptionsrate pro vorstehend erwähnte Fläche umgewandelt. Wasserabsorptionsrate (ml/Minute) = (A – B)/10
Die Menge an Wasser, die durch Trocknung entfernt wird, wird berechnet, indem der Gewichtsverlust aufgrund von Trocknung gemessen wird. D. h. der Gewichtsverlust aufgrund von Trocknung, d. h. der sogenannte Wasserverlust (c), kann aus dem Gewicht des Mediums vor der Trocknung (a) und dem Gewicht des Mediums nach der Trocknung (b) gemäß der Gleichung a – b = c erhalten werden. Danach kann ein Verhältnis des entfernten Wassers, d. h. der prozentuale Anteil des durch Trocknung entfernten Wassers (e, %) aus der Gesamtmenge des zugegebenen Wasser-Lösemittels (d) und dem vorstehend erwähnten Gewichtsverlust aufgrund von Trocknung (c) gemäß der folgenden Gleichung erhalten werden. e(%) = c/d × 100
Ein Wassergehalt eines festen Mediums bedeutet ein prozentualer Anteil des Wassergehalts (%), definiert als (Wassermenge im festen Medium)/(Menge des Feststoffgehalts + Wassermenge) × 100. Hier sind sowohl die Wassermenge als auch der Feststoffgehalt als Gewicht angegeben.
Beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung
Ein Medium ist ein Nährstoff zum Züchten oder Vermehren von Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen, und außerdem stellt es ihre Wachstumsumgebung dar. Ein Medium enthält üblicherweise, als Mediumbestandteile, ein Saccharid wie Glucose und Lactose, eine Stickstoffquelle wie Aminosäuren, Pepton, Nitrate und Ammoniumsalze, anorganische Salze wie diejenigen von Kalium, Phosphor und Magnesium, einen Wachstumsfaktor wie Vitamine, usw.. Medien werden grob klassifiziert in flüssige Medien, in welchen die Mediumbestandteile einfach in Wasser-Lösemittel gelöst sind, und in feste Medien, die durch Zusatz eines Geliermittels zu flüssigen Medien verfestigt werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein festes Medium bereit, welches, wie vorstehend definiert, ein Medium (Kulturmedium) darstellt, das zum Zeitpunkt der Verwendung in einem festen Zustand vorliegt, z. B. ein Plattenmedium, ein Schrägkulturmedium oder dergleichen, das durch Verfestigung mit einem Geliermittel wie Agar hergestellt wird.
Beispiele des Geliermittels schließen Agar, Gelatine, Gellan, Carrageenan usw. ein.
Spezifische Beispiele der Zusammensetzung des festen Mediums der vorliegenden Erfindung schließen die Zusammensetzungen der folgenden Medien ein: Nähr-Agarmedium, Standard-Agarmedium, Desoxycholat-Agarmedium, E.M.B.-Medium, Endo-Medium, Plattenzahl-Agarmedium mit B.C.P., Mannit-Salz-Agar mit Eidotter, Kartoffel-Dextrose-Agarmedium, Violett-Rot-Galle-Lactose-(VRBL-)Agarmedium, Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Agarmedium, angesäuertes MRS-Medium, Medium M17, Baird-Parker-Agarmedium (ETGP-Agarmedium) usw., die in Testverfahren für Mikroorganismen definiert sind, welche beschrieben sind in dem Japanese Food Sanitation Law, der Japanischen Pharmacopoeia, dem International Diary Federation Standard (IDF Standard) usw. [„Nyuseihin Shikenhou Chukai (Commentary of Test Methods of Dairy Products)", Hrsg.: Pharmaceutical Society of Japan, S. 111–125, 10. April 1990, Kanehara Shuppan Co., Ltd. (Referenz 1); „IDF STANDARD (Verbesserte Version von 1991)"; S. 306, S. 470, S. 645–647, 25. Dezember 1991, veröffentlicht durch die International Dairy Federation of Japan (Referenz 2); „Shin Saikin Baichi-gaku Koza Ge II (Lecture of Culture Medium Science for Bacteria, Bd. 2, II)", 2. Auflg., Hrsg.: Sakazaki Toshikazu, S. 62–63, 15. August 1996, Kindai Shuppan, Co., Ltd. (Referenz 3)).
Als Referenz sind nachstehend die vorgeschriebenen Mengen der entsprechenden Bestandteile angegeben, die in den vorstehend erwähnten, in Referenz 1 beschriebenen festen Medien enthalten sind.
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Nähr-Agarmediums (pH 7,0 bis 7,4) sind 5 g Fleischextrakt, 10 g Pepton, 1 bis 2 g Natriumchlorid (NaCl), 12 bis 15 g Agar und 1000 ml (1 Liter) gereinigtes Wasser (Wasser-Lösemittel).
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Standard-Agarmediums (pH 6,8 bis 7,2) sind 2,5 g Hefeextrakt, 5 g Pepton, 1 g Glucose, 15 g Agar und 1000 ml (1 Liter) gereinigtes Wasser (Wasser-Lösemittel).
Die vorgeschriebenen Mengen jedes Bestandteils in der Zusammensetzung des festen Mediums des Desoxycholat-Agarmediums (pH 7,0 bis 7,4) sind 10 g Pepton, 10 g Lactose, 1 g Natriumdesoxycholat, 5 g Natriumchlorid (NaCl), 2 g K₂HPO₄, 0,033 g Neutralrot, 2 g Eisen(III)-ammoniumcitrat, 15 g Agar und 1000 ml (1 Liter) gereinigtes Wasser (Wasser-Lösemittel).
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des E.M.B.-Mediums (pH 6,6 bis 7,0) sind 10 g Pepton, 10 g Lactose, 2 g K₂HPO₄, 0,4 g Eosin Y, 0,065 g Methylenblau, 18 g Agar und 1000 ml (1 Liter) gereinigtes Wasser (Wasser-Lösemittel).
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Endo-Mediums (pH 7,0 bis 7,4) sind 10 g Pepton, 3 g Fleischextrakt, 10 g Lactose, 1,6 g Na₂SO₃, 0,1 g basisches Fuchsin, 15 g Agar und 1000 ml (1 Liter) gereinigtes Wasser (Wasser-Lösemittel).
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Plattenzähl-Agarmediums mit B.C.P. (pH 6,0 bis 7,0) sind 2,5 g Hefeextrakt, 5 g Pepton, 1 g Glucose, 1 g Tween 80, 0,1 g L-Cystein, 0,06 g Bromcresol-Purpur, 15 g Agar und 1000 ml (1 Liter) gereinigtes Wasser (Wasser-Lösemittel).
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Mannit-Salz-Agars mit Eidotter [pH 7,2 bis 7,6, wobei 50 bis 60 ml einer frischen Eidotterlösung (erhalten durch Lösen von Eidotter in der gleichen Menge physiologischer Kochsalzlösung) nach Sterilisation mit Hochdruck-Dampf und vor Gießen des Mediums in die Platte zugegeben werden] sind 2,5 g Fleischextrakt, 10 g Pepton, 10 g Mannit, 75 g Natriumchlorid (NaCl), 0,025 g Phenolrot, 15 g Agar und 1000 ml (1 Liter) gereinigtes Wasser (Wasser-Lösemittel).
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Kartoffel-Dextrose-Agars (pH 5,6 bis 5,7) sind 200 g Kartoffelaufguss, 20 g Glucose, 15 g Agar und 1000 ml (1 Liter) gereinigtes Wasser (Wasser-Lösemittel).
Nachstehend sind die vorgeschriebenen Mengen der entsprechenden Bestandteile angegeben, die in den in Referenz 2 beschriebenen festen Medien enthalten sind.
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Violett-Rot-Gallensalz-Lactose-(VRBL-)Agarmediums (pH 7,4 ± 0,1) sind 7 g Pepton, 3 g Hefeextrakt, 10 g Lactose (C₁₂H₂₂O₁₁·H₂O), 5 g Natriumchlorid (NaCl), 1,5 g Gallensäuresalz, 0,03 g Neutralrot, 0,002 g Kristallviolett, 12 bis 18 g Agar und 1000 ml (1 Liter) Wasser (Wasser-Lösemittel).
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Agarmediums (pH 6,6) sind 5 g Hefeextrakt, 20 g Glucose (C₆H₁₂O₆), 0,1 g Chloramphenicol (C₁₁H₁₂Cl₂N₂O₅) oder Oxytetracyclin (C₂₂H₃₀N₂O₁₁), 12 bis 15 g Agar und 1000 ml (1 Liter) Wasser (Wasser-Lösemittel).
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des angesäuerten MRS-Mediums (eingestellt auf pH 5,4 mit Essigsäure) sind 10 g Pepton 1 (Trypsin-gespaltenes Produkt aus Casein), 10 g Fleischextrakt, 5 g Hefeextrakt (Pulver), 20 g Glucose (C₆H₁₂O₆), 1 ml Tween 80 (Sorbitanmonooleat), 2 g Dikaliumhydrogenorthophosphat (K₂HPO₄), 5 g Natriumacetat-Trihydrat (CH₃CO₂Na·3H₂O), 2 g Diammoniumcitrat (C₆H₆O₇(NH₄)₂), 0,2 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO₄·7H₂O), 0,05 g Mangansulfat-Tetrahydrat (MnSO₄·4H₂O), 9 bis 18 g Agar und 1000 ml (1 Liter) Wasser (Wasser-Lösemittel).
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Mediums M17 [pH 7,1 bis 7,2, wobei Lactose (C₁₂H₂₂O₁₁) als eine sterilisierte wässrige 10% Lactoselösung (C₁₂H₂₂O₁₁) nach der Sterilisation mit Hochdruck-Dampf und vor Gießen des Mediums in eine Platte zugegeben wird], sind 2,50 g Pepton 1 (Trypsin-gespaltenes Produkt aus Casein), 2,50 g Pepton 2 (Pepsingespaltenes Produkt aus Fleisch), 5,00 g Pepton 3 (Papain-gespaltenes Produkt aus Sojabohnen), 2,50 g Hefeextrakt (Pulver), 5,00 g Fleischextrakt, 19,00 g ß-Glycerophosphorsäure-Salz (Dinatriumsalz, C₆H₇O₆PNa₂), 0,25 g Magnesiumsulfat- Heptahydrat (MgSO₄·7H₂O), 0,50 g Ascorbinsäure (C₆H₈O₆), 5 g Lactose (C₁₂H₂₂O₁₁), 9 bis 18 g Agar und 1000 ml (1 Liter) Wasser (Wasser-Lösemittel).
Nachstehend sind die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile angegeben, die in den in Referenz 3 beschriebenen festen Medien enthalten sind.
Die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Baird-Parker-Agarmediums (ETGP-Agar-Medium, pH 6,8, wobei 10 ml einer wässrigen 1% Kaliumtelluritlösung und 50 ml einer 50% Eidotteremulsion nach Sterilisation mit Hochdruck-Dampf und vor Gießen des Mediums in eine Platte zugegeben werden) sind 10 g Pepton, 5 g Fleischextrakt, 1 g Hefeextrakt, 5 g Lithiumchlorid, 12 g Glycin, 10 g Natrriumpyruvat, 17 g Agar und 1000 ml (1 Liter) gereinigtes Wasser (Wasser-Lösemittel).
Das Verfahren zur Herstellung eines festen Mediums der vorliegenden Erfindung wird hier nachstehend erklärt.
In dem Verfahren zur Herstellung eines festen Mediums der vorliegenden Erfindung kann die Lösung der Bestandteile des festen Mediums in dem Wasser-Lösemittel und die Verfestigung der Lösung in gleicher Weise wie bei der Herstellung üblicher fester Medien durchgeführt werden, mit der Ausnahme, dass die Menge des Wasser-Lösemittels größer ist als seine vorgeschriebene Menge und dass Wasser nach der Verfestigung durch Trocknung entfernt wird. Z. B. können die vorgeschriebenen Mengen von Mediumbestandteilen, die in der Literatur usw. beschrieben sind oder die als Zusammensetzung eines festen Mediums neu identifiziert (definiert) wurden, in dem Wasser-Lösemittel gelöst werden; nach Einstellen des pH-Werts, sofern dies erforderlich ist, kann ein Geliermittel zu der Lösung zugegeben werden; und das Gemisch kann erhitzt werden, um das Geliermittel zu lösen, sodann kann es sterilisiert, in ein Gefäß wie eine Schale gegossen und verfestigt werden.
Die Menge an Wasser, die entfernt werden soll, ist eine solche Menge, so dass die durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate des festen Mediums nach der Entfernung von Wasser mindestens 0,05 ml/Minute ergeben sollte. Obwohl diese Menge abhängig von der Zusammensetzung des Mediums (insbesondere abhängig von dem Geliermittel) variieren kann, kann sie bestimmt werden, indem Medien hergestellt werden, die Wasser-Lösemittel in verschiedenen überschüssigen Mengen enthalten, und indem ihre durchschnittlichen 10-Minuten-Wasserabsorptionsraten in einer Weise, wie in dem nachstehend erwähnten Testbeispiel 3 beschrieben, gemessen werden.
Die Menge an Wasser, die entfernt werden soll, ist vorzugsweise mindestens 5% des Wasser-Lösemittels, stärker bevorzugt mindestens 30% des Wasser-Lösemittels.
Wenn Wasser in der vorstehend erwähnten Weise aus einem festen Medium, das unter Verwendung einer vorgeschriebenen Menge an Wasser-Lösemittel hergestellt wurde, entfernt wird, kann es sein, dass die in dem festen Medium enthaltene Menge an Wasser nach der Entfernung von Wasser signifikant reduziert ist, dies kann dann zu einer Wachstumshemmung von Mikroorganismen aufgrund von Trocknung führen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Menge des Wasser-Lösemittels in dem festen Medium vorher so bestimmt, dass sie größer als die vorgeschriebene Menge ist, so dass nach dem Entfernen von Wasser in dem festen Medium noch Wasser in einer Menge enthalten ist, die der vorgeschriebenen Menge entspricht. Deshalb ist die Menge des Wasser-Lösemittels größer als die vorgeschriebene Menge um eine Menge, die annähernd gleich der Menge des zu entfernenden Wassers ist. Die Menge, die annähernd gleich der Menge des zu entfernenden Wassers ist, bedeutet hier die Menge, bei welcher die Menge, die durch Subtrahieren der zu entfernenden Menge an Wasser von der Menge des gesamten zugegebenen Wasser-Lösemittels, einschließlich der vorgeschriebenen Menge und der zusätzlichen Menge an Wasser, erhalten wird, im Wesentlichen gleich (üblicherweise 97 bis 103%) zu der vorgeschriebenen Menge an Wasser werden sollte.
Üblicherweise beträgt die zusätzliche Menge des Wasser-Lösemittels 5 bis 150%, wenn die Menge des Wasser-Lösemittels (die vorgeschriebene Menge des Wasser-Lösemittels) in einer in der Literatur usw. beschriebenen Zusammensetzung oder in einer Zusammensetzung, die als Zusammensetzung eines festen Mediums neu identifiziert wurde, als 100% genommen wird. Diese Menge des Wasser-Lösemittels wird zusätzlich zu der vorgeschriebenen Menge an Wasser formuliert. Dadurch wird die Produktion des festen Mediums der vorliegenden Erfindung, welches eine vorgeschriebene Menge an Wasser enthält und eine ausreichende Wasserabsorptionsrate aufweist, als ein Endprodukt, das durch Entfernen des Wasser-Lösemittel durch Trocknung erhalten wird, möglich gemacht.
Wenn ein Agar als Geliermittel eingesetzt wird, beträgt die Konzentration des zugegebenen Agars vorzugsweise 1,0 bis 3% (bezogen auf Gewicht), wenn die vorstehend angegebene vorgeschriebene Menge von Wasser-Lösemittel als 100% genommen wird. Weiterhin wird das Erhitzen zum Auflösen vorzugsweise bei einer Temperatur von 100°C oder höher durchgeführt, da Agar bei einer solchen Temperatur vollständig gelöst wird. Wenn das Erhitzen 15 Minuten oder länger bei 121°C durchgeführt wird, kann gleichzeitig mit der Auflösung auch noch die Sterilisation erreicht werden. Die Sterilisation kann in einer herkömmlichen Weise unter Verwendung eines Hochdruck-Dampfsterilisations-Verfahrens oder dergleichen durchgeführt werden.
Wenn Schalen als Gefäße verwendet werden, wird das feste Medium vorzugsweise in jede Schale in einer Menge eingegossen, so dass die Menge des festen Mediums in jeder Schale nach der Entfernung von Wasser durch Trocknung 10 bis 30 ml ergeben sollte.
Beispiele des Trocknungsverfahrens zur Entfernung von Wasser aus dem Medium schließen ein Trocknungsverfahren unter vermindertem Druck, Vakuumverdampfungs-Verfahren, Warmluft-Trocknungsverfahren, Infrarot-Trocknungsverfahren, Hochfrequenz-Trocknungsverfahren usw. ein. Jedoch ist das Verfahren nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Das feste Medium der vorliegenden Erfindung hat eine durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate von mindestens 0,05 ml/Minute gemäß der vorstehend erwähnten Definition. Wenn das feste Medium eine Wasserabsorption von mindestens 0,5 ml in zehn Minuten pro Platte der Standardgröße, wie vorstehend definiert, zeigt, wird es dadurch möglich gemacht, eine große Menge einer Probe in einer kurzen Zeitspanne auf das feste Medium zu applizieren. Ein festes Medium, das eine durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate von mindestens 0,05 ml/Minute aufweist, kann durch Trocknung des Mediums hergestellt werden, wobei eine solche geeignete Menge an Wasser, wie vorstehend beschrieben, entfernt wird. Die Menge an Medium pro exponierter Fläche (Fläche, die mit Luft in Kontakt steht) des festen Mediums kann eine solche Menge sein, dass die durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate im vorstehenden Bereich erhalten werden kann. Wenn die Menge des Mediums zu klein ist, kann es möglich sein, dass keine ausreichende durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate erhalten wird.
Da das feste Medium der vorliegenden Erfindung das Wasser-Lösemittel in einer Menge, die nach der Entfernung von Wasser annähernd gleich der vorgeschriebenen Menge ist, enthält, wird auf diesem Medium keine Wachstumshemmung von Mikroorganismen, die durch Trocknung zustande kommt, festgestellt. Dies ist deshalb der Fall, weil eine vorgeschriebene Menge an Wasser-Lösemittel in einer Zusammensetzung, die ein festes Medium kennzeichnet, so bestimmt wird, dass ein Mikroorganismus, der gezüchtet werden soll, wachsen kann. Alternativ ist es deshalb der Fall, weil ein Medium ausgewählt wird, das eine Zusammensetzung aufweist, welche keine Wachstumshemmung eines Mikroorganismus, der gezüchtet werden soll, verursacht.
Das feste Medium hat vorzugsweise einen Wassergehalt von mindestens 90%. Ein solcher Wassergehalt macht die Kultur von Mikroorganismen möglich, die einen hohen Wassergehalt benötigen. Da z. B. das Wachstum eines Mikroorganismus wie Staphylococcus aureus ATCC 6538P in einem Wassergehalt von weniger als 90% annähernd vollständig gehemmt wird, wie in den nachstehend erwähnten Testbeispielen gezeigt wird, ist es erforderlich, in dem festen Medium einen Wassergehalt von mindestens 90% zu halten, um den Mikroorganismus züchten zu können.
Weiterhin ist das feste Medium der vorliegenden Erfindung für die Züchtung von Mikroorganismen geeignet, die relativ empfindlich gegenüber Trocknung sind, die jedoch für Tests von Lebensmitteln usw. auf Mikroorganismen wichtig sind, wie Staphylococcus aureus ATCC 6538P und Bacillus stearothermophilus var. calidolactis NIZO C953, ohne dass bei ihnen eine Wachstumshemmung verursacht wird. Wie vorstehend beschrieben, wird das feste Medium der vorliegenden Erfindung bis zu einem Zustand getrocknet, bei welchem es das Wasser-Lösemittel in einer Menge enthält, die größer ist als die vorgeschriebene Menge. Deshalb behält es eine ausreichende Wasserabsorptionsrate bei und verursacht keine Wachstumshemmung aufgrund von Trocknung.
Um das Verfahren zur Herstellung eines festen Mediums der vorliegenden Erfindung noch besser verständlich zu machen, wird es erklärt, indem als Beispiel ein Verfahren zur Herstellung des in der vorstehend erwähnten Referenz 1 beschriebenen Standard-Agarmediums angegeben wird.
So sind die vorgeschriebenen Mengen der Bestandteile in der Zusammensetzung des festen Mediums des Standard-Agarmediums 2,5 g Hefeextrakt, 5 g Pepton, 1 g Glucose, 15 g Agar und 1000 ml gereinigtes Wasser (Wasser-Lösemittel), wie in Referenz 1 beschrieben.
Deshalb werden die Bestandteile von 2,5 g Hefeextrakt, 5 g Pepton und 1 g Glucose in dem Wasser-Lösemittel gelöst, dessen Menge vorzugsweise 5 bis 150% (50 bis 1500 ml) größer ist als die vorgeschriebene Menge (1000 ml), so dass eine gelöste Lösung in einer Menge von etwa 1050 ml bis 2500 ml erhalten wird. Die gelöste Lösung wird auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7,2 eingestellt. 15 g Agar werden zu der Lösung zugegeben, und das Gemisch wird durch das Hochdruck-Dampf-Sterilisationsverfahren 15 Minuten auf 121°C erhitzt, so dass das Ganze gleichzeitig gelöst und sterilisiert wird.
Das sterilisierte Medium wird in einer Menge von 16 bis 38 g pro Schale keimfrei in Schalen gegossen und durch Abkühlen verfestigt. Das verfestigte Medium wird sodann durch das Trocknungsverfahren unter vermindertem Druck bei einem Druck von 10³ Pa unter Verwendung eines Trockners (LABCONCO) getrocknet, um Wasser-Lösemittel zu entfernen.
Durch das vorstehend erwähnte Verfahren zur Entfernung von Wasser durch Trocknung wird die zusätzliche Menge an Wasser entfernt, wodurch ein festes Medium hergestellt wird, das die durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate von mindestens 0,05 ml/Minute aufweist.
Das durch das vorstehende Verfahren produzierte feste Medium verursacht keine Wachstumshemmung von Mikroorganismen, die durch Trocknung zustande kommt. Außerdem zeigt es eine außerordentlich gute Wasserabsorptionsrate und macht deshalb die Applikation einer großen Menge einer Probe in einer kurzen Zeitspanne möglich, und es ist für Tests zur schnellen und genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele noch ausführlicher erklärt. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
2,5 g Hefeextrakt (Oriental Yeast), 5 g Pepton (Difco) und 1 g Glucose (Wako Pure Chemical Industries) wurden in 1200 ml Wasser-Lösemittel gelöst, das 20% (200 ml) überschüssiges Wasser zusätzlich zu der vorgeschriebenen Menge an Wasser-Lösemittel (gereinigtes Wasser, 1000 ml), genommen als 100%, in einer bekannten Zusammensetzung des festen Mediums enthält, so dass etwa 1200 ml einer gelösten Lösung erhalten wurden. Die Lösung wurde unter Verwendung einer 0,1 Mol/l Natriumhydroxid-Lösung auf pH 7,2 eingestellt. 15 g Agar (Ina Shokuhin Kogyo) wurden zu der Lösung zugegeben, und die Gemische wurden unter Verwendung eines Autoklauen (Iwatate Iryo Kikai Seisakusho) 15 Minuten bei 121°C erhitzt, so dass die Lösung und die Sterilisation gleichzeitig erfolgten.
Das sterilisierte feste Medium wurde in einem sterilen Raum jeweils in einer Menge von 18 g pro Schale in eine Kunststoffschale mit einem Durchmesser von 9 cm (Eiken Kizai) gegossen, durch Abkühlen verfestigt und bei einem Druck von 10³ Pa gemäß dem Trocknungsverfahren unter vermindertem Druck unter Verwendung eines Trockners (LABCONCO) getrocknet, wobei 3 ml des Wassers entfernt wurden. Als Ergebnis wurden Platten mit dem festen Medium erhalten, die jeweils 15 g Medium enthielten.
Die vorstehend erwähnte Entfernung von Wasser entsprach einer Entfernung der gesamten Menge des Wasser-Lösemittels (200 ml), die zusätzlich zu der vorgeschriebenen Menge an Wasser formuliert worden war, d. h. der Entfernung von etwa 17% (200 ml) der Gesamtmenge (1200 ml) des zugegebenen Wasser-Lösemittels (gereinigtes Wasser), die als 100% genommen wurde, durch Trocknung.
Somit war der Wassergehalt des festen Mediums durch die vorstehend erwähnte Entfernung von Wasser auf etwa 98% eingestellt worden.
Die, wie vorstehend beschrieben, hergestellten Platten mit dem festen Medium (Nähr-Agarmedium) wurden durch das nachstehend beschriebene Verfahren getestet, wobei gefunden wurde, dass sie die durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate von 0,15 ml/Minute aufwiesen. Es wurde gefunden, dass das Medium ein festes Medium ist, das die Applikation einer großen Menge einer Probe in einer kurzen Zeitspanne möglich macht und das keine, durch Trocknung verursachte Wachstumshemmung zeigt, so dass es für Tests zur schnellen und genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet ist.
Beispiel 2
2,5 g Fleischextrakt (Merck), 10 g Pepton (Difco), 75 g Natriumchlorid (Wako Pure Chemical Industries), 10 g Mannit (Wako Pure Chemical Industries) und 0,025 g Phenolrot (Wako Pure Chemical Industries) wurden in 1066 ml Wasser-Lösemittel gelöst, welches 6,6% (66 ml) überschüssiges Wasser zusätzlich zu der vorgeschriebenen Menge von Wasser-Lösemittel (gereinigtes Wasser, 1000 ml), genommen als 100%, in einer bekannten Zusammensetzung des festen Mediums enthält, so dass etwa 1066 ml einer gelösten Lösung erhalten wurden. Die gelöste Lösung wurde unter Verwendung einer 0,1 Mol/l Natriumhydroxid-Lösung auf pH 7,4 eingestellt. 15 g Agar (Ina Shokuhin Kogyo) wurden zu der Lösung zugegeben, und das Gemisch wurde unter Verwendung eines Autoklaven (Iwatate Iryo Kikai Seisakusho) 15 Minuten bei 121°C erhitzt, so dass die Lösung und die Sterilisation gleichzeitig erfolgten.
Das sterilisierte feste Medium wurde in einem sterilen Raum jeweils in einer Menge von 16 g pro Schale in eine Kunststoffschale mit einem Durchmesser von 9 cm (Eiken Kizai) gegossen, durch Abkühlen verfestigt und bei einem Druck von 10³ Pa gemäß dem Trocknungsverfahren unter vermindertem Druck unter Verwendung eines Trockners (LABCONCO) getrocknet, wobei etwa 1 ml des Wasser-Lösemittels entfernt wurde. Als Ergebnis wurden Platten mit festem Medium erhalten, die jeweils 15 g Medium enthielten.
Die vorstehend erwähnte Entfernung von Wasser entsprach einer Entfernung der gesamte Menge des Wasser-Lösemittel (66 ml), die zusätzlich zu der vorgeschriebenen Menge an Wasser formuliert worden war, d. h. der Entfernung von etwa 6% (66 ml) der Gesamtmenge (1066 ml) des zugegebenen Wasser-Lösemittels (gereinigtes Wasser), die als 100% genommen wurde, durch Trocknung.
Somit war der Wassergehalt des festen Mediums durch die vorstehend erwähnte Entfernung von Wasser auf etwa 90% eingestellt worden.
Die, wie vorstehend beschrieben, hergestellten Platten mit dem festen Medium (Mannit-Salz-Agar mit Eidotter) wurden durch das nachstehend beschriebene Verfahren getestet, wobei gefunden wurde, dass sie die durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate von 0,07 ml/Minute aufwiesen. Es wurde gefunden, dass das Medium ein festes Medium ist, das die Applikation einer großen Menge einer Probe in einer kurzen Zeitspanne möglich macht und das keine, durch Trocknung verursachte mikrobielle Wachstumshemmung von Staphylococcus-Bakterien zeigt, so dass es für Tests zur schnellen und genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet ist.
Beispiel 3
Ein festes Medium mit einer neuen Zusammensetzung wurde hergestellt, indem eine Zusammensetzung eines bekannten festen Mediums modifiziert wurde.
10 g Pepton (Difco), 5 g Fleischextrakt (Merck) und 2 g Natriumchlorid (Wako Pure Chemical Industries) wurden in 1200 ml Wasser-Lösemittel gelöst, das 33,3% (300 ml) überschüssiges Wasser zusätzlich zu einer vorgeschriebenen Menge von 900 ml, genommen als 100%, die zu einer geringeren Menge als die vorgeschriebene Menge von Wasser-Lösemittel (gereinigtes Wasser, 1000 ml) modifiziert worden war, in einer bekannten Zusammensetzung des festen Mediums enthält, so dass etwa 1200 ml einer gelösten Lösung erhalten wurden. Die gelöste Lösung wurde unter Verwendung einer 0,1 Mol/l Natriumhydroxid-Lösung auf pH 7,0 eingestellt. 15 g Agar (Ina Shokuhin Kogyo) wurden zu der Lösung zugegeben, und das Gemisch wurde unter Verwendung eines Autoklaven (Iwatate Iryo Kikai Seisakusho) 15 Minuten bei 121°C erhitzt, so dass die Lösung und die Sterilisation gleichzeitig erfolgten.
Das sterilisierte feste Medium wurde in einem sterilen Raum jeweils in einer Menge von 20 g pro Schale in eine Kunststoffschale mit einem Durchmesser von 9 cm (Eiken Kizai) gegossen, durch Abkühlen verfestigt und bei einem Druck von 10³ Pa gemäß dem Trocknungsverfahren unter vermindertem Druck unter Verwendung eines Trockners (LABCONCO) getrocknet, wobei 5 ml des Wasser-Lösemittels entfernt wurden. Als Ergebnis wurden Platten mit festem Medium erhalten, die jeweils 15 g Medium enthielten.
Die vorstehend erwähnte Entfernung von Wasser entsprach einer Entfernung der gesamten Menge (300 ml) an Wasser, die zusätzlich zu der vorgeschriebenen Menge an Wasser formuliert worden war, d. h. der Entfernung von etwa 25% (300 ml) der Gesamtmenge (1200 ml) des zugegebenen Wasser-Lösemittels (gereinigtes Wasser), die als 100% genommen wurde, durch Trocknung.
Somit war der Wassergehalt des festen Mediums durch die vorstehend erwähnte Entfernung von Wasser auf etwa 96% eingestellt worden.
Die, wie vorstehend beschrieben, hergestellten Platten mit dem festen Medium (Nähr-Agarmedium) wurden durch das nachstehend beschriebene Verfahren getestet, wobei gefunden wurde, dass sie die durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate von 0,17 ml/Minute aufwiesen. Es wurde gefunden, dass das Medium ein festes Medium ist, das die Applikation einer großen Menge einer Probe in einer kurzen Zeitspanne möglich macht und das keine, durch Trocknung verursachte Wachstumshemmung von Mikroorganismen zeigt, so dass es für Tests zur schnellen und genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet ist.
Testbeispiel 1
Dieser Test wurde durchgeführt, um die vorliegende Erfindung mit dem Stand der Technik zu vergleichen, wobei die Ergebnisse von mikrobiellen Wachstumstests als Indizes verwendet wurden.
(1) Herstellung von Proben
Jede der folgenden drei Arten von Proben wurde in fünffacher Ausführung hergestellt:

Probe 1: Festes Medium, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung.
Probe 2: Festes Medium, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 1 des Stands der Technik 1, mit der Ausnahme, dass der Typ des Mediums zu dem Nähr-Agarmedium geändert wurde, 15 ml des Mediums in jede Schale gegossen wurden, 15 ml Wasser für die Wiederherstellung (sterilisiertes Wasser) verwendet wurden, das feste Medium fünf Minuten wiederhergestellt wurde und überschüssiges Wasser für die Wiederherstellung (freies Wasser) durch Abgießen verworfen wurde.
Probe 3: Festes Medium, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 1 des Stands der Technik 2, mit der Ausnahme, dass der Typ des Mediums zu dem Nähr-Agarmedium geändert wurde, 15 ml des Mediums in jede Schale gegossen wurden, 15 ml Wasser für die Wiederherstellung (sterilisiertes Wasser) verwendet wurden, das feste Medium fünf Minuten wiederhergestellt wurde und überschüssiges Wasser für die Wiederherstellung (freies Wasser) durch Abgießen verworfen wurde.

(2) Testverfahren
Das mikrobielle Wachstum auf jeder Probe wurde durch das folgende Testverfahren untersucht.
Als Teststämme wurden Staphylococcus aureus ATCC 6538P, erhalten von der American Type Culture Collection, die eine Hinterlegungsstelle von Mikroorganismen ist, und Bacillus stearothermophilus var. calidolactis NIZO C953, erhalten von dem Niederländischen Institut für Molkereiforschung (Nederlands Instituut voor Zuivelonderzoek, NIZO), verwendet.
Eine solche Verdünnung jedes Teststamms wurde hergestellt, dass, wenn 0,1 ml der Verdünnung auf eine Standard-Agarmedium-Platte appliziert wurde, die von Wasser-Lösemittel in der vorgeschriebenen Menge, definiert in der bekannten Zusammensetzung des festen Mediums wie sie war, ohne jeglichen Trocknungsprozess hergestellt worden war und bei 37°C für 48 Stunden inkubiert worden war, 100 Kolonien des Teststamms erhalten werden sollten.
Die Zusammensetzung des festen Mediums des Standard-Agarmediums besteht aus 2,5 g Hefeextrakt, 5 g Pepton, 1 g Glucose, 15 g Agar und 1000 ml (vorgeschriebene Menge des Wasser-Lösemittels) von gereinigtem Wasser.
Die Verdünnung des Teststamms in einer Menge von 0,1 ml wurde auf eine Platte von jeder Probe aufgetragen und 48 Stunden bei 37°C inkubiert, und anschließend wurde die Anzahl von erschienenen Kolonien durch visuelle Begutachtung bestimmt. Der Test wurde in fünffacher Ausführung durchgeführt, und ein Durchschnitt der Anzahl von Kolonien wurde berechnet.
(3) Testergebnisse
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 1 dargestellt. Wie aus den in Tabelle 1 dargestellten Ergebnissen deutlich ersichtlich ist, wurde gefunden, dass Probe 1 gemäß der vorliegenden Erfindung besser ist als die Proben 2 und 3 nach dem Stand der Technik, da Staphylococcus aureus ATCC 6538P und Bacillus stearothermophilus var. calidolactis NIZO C953, die wichtige Bakterien für Tests von Lebensmitteln usw. auf Mikroorganismen sind, mit Probe 1 ohne jegliche Wachstumshemmung nachgewiesen werden konnten und die Anzahl von Mikroorganismen genau und schnell gemessen werden konnte.
Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse wurde gefunden, dass die getrockneten festen Medien der herkömmlichen Techniken eine lange Zeitspanne für die Wiederherstellung benötigten, und somit waren sie nicht für Tests zur schnellen und genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet.
Außerdem wurden annähernd gleiche Ergebnisse erhalten, wenn der Test unter Änderung des Typs des Mediums, der Menge des Mediums, die in jede Schale gegossen wurde, der Menge des Wassers (sterilisiertes Wasser) für die Wiederherstellung von getrocknetem festem Medium und der Zeit für die Wiederherstellung von getrocknetem festem Medium (innerhalb des Bereichs von einer bis zehn Minuten) wiederholt wurde. Tabelle 1

Probe Nr. Anzahl der Kolonien von Staphylococcus aureus ATCC 6538P Anzahl der Kolonien von Bacillus stearothermophilus NIZO C953

1 102 98

2 35 38

3 40 53
Testbeispiel 2
Dieser Test wurde durchgeführt, um den geeigneten Wassergehalt in einem festen Medium zu bestimmen, wobei die Ergebnisse des mikrobiellen Wachstumstest als Indizes verwendet wurden.
(1) Herstellung von Proben
Jede der folgenden zwei Arten von Proben wurde in fünffacher Ausführung hergestellt:

Probe 4: Festes Medium, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung, mit der Ausnahme, dass Wasser-Lösemittel durch Trocknung entfernt wurde, so dass der Wassergehalt des festen Mediums 90% ergeben sollte.
Probe 5: Festes Medium, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung, mit der Ausnahme, dass Wasser-Lösemittel durch Trocknung entfernt wurde, so dass der Wassergehalt des festen Mediums 80% ergeben sollte.

(2) Testverfahren
Das mikrobielle Wachstum auf jeder Probe wurde in gleicher Weise wie beim Testverfahren des vorstehend erwähnten Testbeispiels 1 untersucht, mit der Ausnahme, dass als Teststamm nur der vorstehend erwähnte Staphylococcus aureus ATCC 6538P verwendet wurde.
Die Änderung des Wassergehalts in dem festen Medium durch Trocknung wurde hinsichtlich des durch Trocknung verursachten Gewichtsverlusts überwacht. D. h. der Gewichtsverlust durch Trocknung, d. h. der sogenannte Wasserverlust (c), wurde aus dem Gewicht des Mediums vor der Trocknung (a) und dem Gewicht des Mediums nach der Trocknung (b) anhand der Gleichung a – b = c erhalten. Danach wurde der Gehalt an restlichem Wasser durch Subtrahieren des vorstehenden Wasserverlusts (c) vom Gewicht des insgesamt zugegebenen Wasser-Lösemittels erhalten. Der Wassergehalt nach der Trocknung wurde aufgrund der Definitionen des restlichen Wassergehalts und des vorstehend erwähnten Wassergehalts erhalten, wodurch die Änderung des Wassergehalts des festen Mediums durch Trocknung überwacht wurde.
Die Zusammensetzung des festen Mediums des Mannit-Natriumchlorid-Agarmediums besteht aus 2,5 g Fleischextrakt, 10 g Pepton, 75 g Natriumchlorid, 10 g Mannit, 0,025 g Phenolrot, 15 g Agar und 1000 ml (vorgeschriebene Menge des Wasser-Lösemittels) gereinigtes Wasser.
(3) Testergebnisse
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 2 dargestellt. Wie aus den in Tabelle 2 dargestellten Ergebnissen deutlich ersichtlich ist, war das Wachstum von Staphylococcus aureus ATCC 6538P annähernd vollständig gehemmt, wenn der Wassergehalt des festen Mediums 80%, d. h. weniger als 90%, betrug, so dass es unmöglich war, die Anzahl von Mikroorganismen zu zählen, folglich wurde gefunden, dass ein Wassergehalt von mindestens 90% erforderlich war, um die Anzahl genau messen zu können.
Außerdem wurden annähernd gleiche Ergebnisse erhalten, wenn der Test wiederholt wurde, wobei der Typ des Mediums und der Wassergehalt verschiedenartig verändert wurden. Tabelle 2

Probe Nr. Anzahl der Kolonien von Staphylococcus aureus ATCC 6538P

4 97

5 0
Testbeispiel 3
Dieser Test wurde durchgeführt, wobei die Ergebnisse des Absorptionsraten-Tests als Indizes verwendet wurden, um eine geeignete Menge an Wasser-Lösemittel, die entfernt werden soll (%), zu bestimmen, wenn eine in der Literatur usw. als Zusammensetzung eines festen Mediums beschriebene Menge von Wasser-Lösemittel als 100% genommen wurde.
(1) Herstellung von Proben
Jede der folgenden vier Arten von Proben wurde in fünffacher Ausführung hergestellt:

Probe 6: Festes Medium, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung, mit der Ausnahme, dass Wasser-Lösemittel nicht zusätzlich zur vorgeschriebenen Menge formuliert wurde und dass keine Entfernung von Wasser-Lösemittel durch Trocknung durchgeführt wurde.
Probe 7: Festes Medium, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung, mit der Ausnahme, dass 2,5% der vorgeschriebenen Menge an Wasser-Lösemittel zusätzlich formuliert wurden und dass 2,5% der Gesamtmenge an Wasser-Lösemittel durch Trocknung entfernt wurden.
Probe 8: Festes Medium, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung, mit der Ausnahme, dass 5% der vorgeschriebenen Menge an Wasser-Lösemittel zusätzlich formuliert wurden und dass 5% der Gesamtmenge an Wasser-Lösemittel durch Trocknung entfernt wurden.
Probe 9: Festes Medium, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung, mit der Ausnahme, dass 40% der vorgeschriebenen Menge an Wasser-Lösemittel zusätzlich formuliert wurden und dass 30% der Gesamtmenge an Wasser-Lösemittel durch Trocknung entfernt wurden.

(2) Testverfahren
Die Wasserabsorptionsrate jeder Probe wurde durch das folgende Testverfahren bestimmt. Die Bestimmung erfolgte bei 25°C.
Das Gesamtgewicht von Probenplatte (B) wurde gemessen, danach wurden 10 ml durch Ionenaustausch behandeltes Wasser auf ein Plattenmedium (runde Form, äußerer Durchmesser: 9 cm, innerer Durchmesser 8,6 cm (Fläche: 58,1 cm²), Menge des Mediums: 15 g) zugegeben, wodurch die Wasserabsorption gestartet wurde; nach zehn Minuten wurde das Wasser, das nicht absorbiert worden war, abgegossen; Feuchtigkeit an der Wand der Schale wurde abgetupft; und das Gesamtgewicht der Probenplatte nach der Wasserabsorption (A) wurde gemessen. Danach wurde die durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate nach der folgenden Gleichung berechnet: Wasserabsorptionsrate (ml/Minute) = (A – B)/10
Weiterhin wurde der prozentuale Anteil des durch Trocknung entfernten Wasser-Lösemittels (e) aus der Gesamtmenge des formulierten Wasser-Lösemittels (d), die als 100% genommen wurde, und dem Wasserverlust (c), überwacht und berechnet in gleicher Weise wie in Testbeispiel 2, gemäß der folgenden Gleichung erhalten. e(%) = c/d × 100
(3) Testergebnisse
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 3 dargestellt. Wie aus den in Tabelle 3 dargestellten Ergebnissen deutlich ersichtlich ist, ergab die Wasserabsorptionsrate mindestens 0,05 ml/Minute, wenn mindestens 5% des Wasser-Lösemittels durch Trocknung des Mediums entfernt worden waren, und deshalb wurde es möglich, eine große Menge einer Probe in einer kurzen Zeitspanne zu applizieren. Somit wurde gefunden, dass es erforderlich ist, mindestens 5% des Wasser-Lösemittels zu entfernen, um Tests für eine schnelle Messung der Anzahl von Mikroorganismen zu erhalten. Wenn weiterhin mindestens 30% des Wasser-Lösemittels entfernt wurden, betrug die Wasserabsorptionsrate mindestens 0,2 ml/Minute, und deshalb wurde es möglich, eine größere Menge der Probe in einer kurzen Zeitspanne zu applizieren. Somit wurde gefunden, dass es bevorzugt ist, mindestens 30% des Wasser-Lösemittels zu entfernen, um Tests für eine schnelle Messung der Anzahl von Mikroorganismen zu erhalten.
Außerdem wurden annähernd gleiche Ergebnisse erhalten, wenn der Test wiederholt wurde, wobei der Typ des Mediums verschiedenartig verändert wurde. Tabelle 3

Probe Nr. durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate (ml/Minute)

6 0,02

7 0,04

8 0,06

9 0,2
Industrielle Anwendbarkeit
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung sind wie folgt.

1) Das feste Medium der vorliegenden Erfindung, das durch das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, zeigt eine außerordentlich gute Wasserabsorptionsrate, so dass die Applikation einer großen Menge einer Probe in einer kurzen Zeitspanne möglich gemacht wird, und es ist für Tests zur schnellen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet.
2) Da das feste Medium der vorliegenden Erfindung, das durch das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, die Applikation einer großen Menge einer Probe möglich macht, stellt es eine hohe Genauigkeit für den Nachweis von Mikroorganismen bereit und ist deshalb für Tests zur genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet.
3) Da das feste Medium der vorliegenden Erfindung, das durch das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, keine Wachstumshemmung aufgrund von Trocknung zeigt, ist es für Tests zur genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet.
4) Ein festes Medium mit einer außerordentlich guten Wasserabsorptionsrate, welches die Applikation einer großen Menge einer Probe in einer kurzen Zeitspanne möglich macht und für Tests zur schnellen und genauen Messung der Anzahl von Mikroorganismen geeignet ist, kann durch das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines festen Agar-Mediums für Mikroorganismen, umfassend die Schritte: Lösen der Bestandteile des festen Agar-Mediums in einem Wasser-Lösemittel, Verfestigen der erhaltenen Lösung und Trocknen des verfestigten Mediums, um Wasser zu entfernen, wobei mindestens 5% des Wasser-Lösemittels entfernt werden, so dass das feste Medium nach Entfernen des Wassers einen Wassergehalt von mindestens 90% und eine durchschnittliche 10-Minuten-Wasserabsorptionsrate von mindestens 0,05 ml/Minute hat, berechnet für eine Fläche des Mediums, die 58,1 cm² bei einem Gewicht von 15 g ist, und wobei die Menge des Wasser-Lösemittels größer ist als die vorgeschriebene Menge um eine Menge, die annähernd gleich der Menge des entfernten Wassers ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge des entfernten Wassers mindestens 30% des Wasser-Lösemittels ist.