KR20030072394A - 고체 배지 및 이의 제조방법 - Google Patents

고체 배지 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 고체 배지의 용해수 이외의 각 성분을 용해수에 용해시키고, 수득된 용액을 고화시킨 다음, 고화된 배지를 건조시켜 물을 제거함을 포함하고, 제거되는 물의 양은, 물을 제거한 후의 고체 배지의 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상으로 되는 양이고, 용해수의 양은, 제거되는 물의 양과 거의 동량까지 소정량보다 많은 양임을 특징으로 하는 고체 배지의 제조방법에 따라 수득한, 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상인 고체 배지에 관한 것이다. 이러한 고체 배지는 건조에 기인하는 미생물의 생육 억제를 유발하지 않고, 흡수 속도가 우수하며, 단시간에 대량의 시료를 도말할 수 있고, 신속하고 정확한 미생물수의 측정시험에 최적인 것이다.

Description

고체 배지 및 이의 제조방법{Solid culture medium and method for preparing the same}
종래, 고체 배지를 건조시킨 예로서는 플라스틱제 샤레에 주입하여 고화시킨 것을 동결 진공 건조한 건조 고체 배지가 공지되어 있다[일본 특허공보 제(소)60-19988호. 이하, 종래 기술 1이라고 기재한다].
또한, 한천 등의 겔화제를 함유하고, 무균수를 첨가하면 용이하게 거의 필름화 전의 배지로 복원되는 필름상 건조 고체 배지가 공지되어 있다[일본 공개특허공보 제(평)6-311880호. 이하, 종래 기술 2라고 기재한다].
그러나, 이들의 종래 기술에는 다음에 기재된 바와 같은 문제점이 있다. 상기 종래 기술 1 및 종래 기술 2는 배지의 보존성을 향상시키기 위해 적용되는 것으로 최종적인 고체 배지 조성 중의 수분 함량이 50% 이하로 될 때까지 건조되는 점에서 사용할 때의 배지가 완전한 복원에 약 3시간이나 되는 긴 시간을 필요로 하는문제점을 갖고 있다.
또한, 상기 종래 기술에 의해 수득된 건조 고체 배지는 상기와 같이 복원에 장시간을 필요로 하기 때문에, 1 내지 10분 동안이라는 비교적 단시간의 복원으로는 복원이 불충분하고, 미생물 검사에 사용하는 경우, 후술하는 시험예의 결과에서 명백한 바와 같이 배지가 충분하게 복원되지 않기 때문에, 식품의 미생물 검사 등에서 중요한 균종인 스타필로코쿠스·아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538P, 바실러스·스테아로서모필루스·바르·칼리도락티스(Bacillus stearothermophilus var. calidolactis) NIZO C953 등의 미생물의 생육이 일부 억제되며, 정확한 미생물수를 계측할 수 없다는 문제점이 있다.
즉, 종래의 건조 고체 배지는 복원을 위해 장시간을 필요로 하고, 신속하고 정확한 미생물수의 측정 시험에는 적합하지 않다는 문제점을 갖고 있다.
또한, 고체 배지의 작성후, 배지 표면의 과잉 수분을 제거하기 위해 건조시키는 것이 공지되어 있다. 이러한 건조에서는 소정의 조성으로 작성된 고체 배지에서 용해수의 일부가 제거되기 때문에, 실제로 미생물이 배양될 때의 수분 함량은 고체 배지의 특정에 사용되는 조성에서의 양인 소정량과는 상당히 상이한 양으로 된다. 이러한 배지의 건조가 미생물의 배양에 주는 영향은 무시할 수 없는 것이다. 예를 들면, 솜마개한 시험관으로 배지를 수주간 보존하는 경우에도, 건조 등의 이유로 미생물의 생육이 나빠지는 경우가 있다는 것이 공지되어 있다. 또한, 컨트롤된 수분의 제거가 실시되지 않기 때문에, 고체 배지의 조성이 일정하게 되지 않는 경우가 있다. 따라서, 미생물의 배양 시험, 특히 배지의 수분 함량의 영향을받기 쉬운 미생물의 배양 시험에서는 재현성이 있는 정확한 결과를 수득할 수 없는 경우가 있다.
본 발명은 각종 미생물의 증식, 시험 등에 사용하는 고체 배지 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 흡수 속도가 우수하고 단시간에 대량의 시료를 도말(塗抹)할 수 있으며 신속하고 정확한 미생물수의 측정 시험에 최적인 고체 배지 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자등은, 종래 기술을 감안하여 예의 검토한 결과, 고체 배지의 각 성분을 소정량보다 많은 양의 용해수에 용해시키고, 수득되는 용액을 고화시킨 다음, 고화된 배지를 건조시켜 용해수의 과잉량과 거의 동량의 물을 제거함으로써 수득되는 고체 배지가 건조에 기인하는 미생물의 생육 억제를 유발하지 않고, 흡수 속도가 우수하며, 단시간에 대량의 시료를 도말할 수 있고, 신속하고 정확한 미생물수의 측정 시험에 최적인 고체 배지인 것을 발견하고 본 발명을 완성했다.
본 발명은 고체 배지의 용해수 이외의 각 성분을 용해수에 용해시키고, 수득된 용액을 고화시킨 다음, 고화된 배지를 건조시켜 물을 제거함을 포함하고, 제거하는 물의 양은, 물의 제거후의 고체 배지의 10분 동안의 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상으로 되는 양이고, 용해수의 양은, 제거하는 물의 양과 거의 동량까지 소정량보다 많은 양임을 특징으로 하는 고체 배지의 제조방법에 따라 수득한, 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상인 고체 배지(이하, 「본 발명의 고체 배지」라고 한다)를 제공한다.
본 발명의 고체 배지에서는 제거하는 물의 양이 용해수의 5% 이상인 것이 바람직하고, 용해수의 30% 이상인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 고체 배지는 수분 함량이 90% 이상인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 고체 배지의 용해수 이외의 각 성분을 용해수에 용해시키고, 수득되는 용액을 고화시킨 다음, 고화된 배지를 건조시켜 물을 제거함을 포함하고, 제거되는 물의 양은 물의 제거후의 고체 배지의 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상으로 되는 양이고, 용해수의 양은 제거되는 물의 양과 거의 동량까지 소정량보다 많은 양임을 특징으로 하는 고체 배지의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에서는 제거되는 물의 양이 용해수의 5% 이상인 것이 바람직하고, 용해수의 30% 이상인 것이 보다 바람직하다.
본 명세서에서 고체 배지란, 한천 등의 겔화제로 고화시킨 평판, 경사면 배지 등을 사용할 때의 고체형의 배지를 의미한다.
용해수의 소정량이란, 배지는 일반적으로 이의 조성에 따라 특정(정의)되지만 당해 배지의 특정에 사용되는 조성에서의 물의 양이다. 용해수의 소정량이란, 고체 배지의 물 이외의 성분을 용해시키기 위해 배합되는 물의 양을 의미하고, 고체 배지의 성분에 수용액으로 되는 성분이 있는 경우에는 이러한 성분 중의 물의 양은 포함되지 않는다.
10분간 평균 흡수 속도란, 시료 평판[원형, 외부직경 9cm, 내부직경 8.6cm(면적: 58.1cm2), 배지량 15g]의 총중량(B)을 측정하고, 평판 배지 위에 이온교환수1Oml를 첨가하여 흡수를 개시하며, 1O분 경과시점에서 미흡수의 물을 폐기하여 샤레 벽면에 부착되어 있는 수분을 닦아 내고, 흡수 처리후의 시료 평판의 총 중량(A)을 측정하며, 다음 일반식에 의해 산출되는 흡수 속도이다. 측정은 25℃에서 실시된다. 시료 평판의 면적이 상기 면적과 다른 경우에는 상기 면적당 10ml로 되는 양의 이온교환수를 사용하여 시험을 실시하고, 상기 면적당 흡수 속도로 환산한다.
흡수 속도(ml/분)= (A-B)/10
건조에 따른 물의 제거량은 건조 감량의 측정에 의해 산출된다. 즉, 건조전의 배지 중량(a) 및 건조후의 배지 중량(b)에서 건조 감량, 소위 감수량(減水量)(c)는 a-b= c에 의해 구한다. 이어서, 용해수의 총 배합량(d)와 감수량(c)로부터 물의 제거량, 즉 물의 건조 제거 백분률(e)(%)을 다음 일반식에 의해 구한다.
e(%)= c/d×1OO
고체 배지의 수분 함량이란, 고체 배지 중의 수분량/(고형분량+수분량)×100으로 구한 수분 함량 백분률(%)을 의미한다. 또한, 수분량 및 고형분량은 모두 중량이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
배지는 세균, 효모 또는 곰팡이 등의 미생물을 생육 및 번식시키는 영양물이고, 또한 이의 생육 장소이다. 통상적인 배지는 배지 성분으로서 미생물의 생육에필요한 성분인 글루코스, 유당 등의 당류, 아미노산, 펩톤, 질산염, 암모늄염 등의 질소원, 칼륨, 인, 마그네슘 등의 무기염류, 비타민 등의 생육 인자를 함유하고 있다. 또한, 배지는 단순히 배지 성분을 용해수에 용해시킨 액체 배지와 액체 배지에 겔화제를 첨가하여 고화시킨 고체 배지로 대별되어 있다. 본 발명은 고체 배지를 제공하는 것이고, 본 발명의 고체 배지란, 상기 정의한 바와 같이, 한천 등의 겔화제로 고화시킨 평판, 경사면 배지 등을 사용할 때에 고체형의 배지(배양기)이다.
겔화제로서는 한천, 젤라틴, 젤란 검, 카라기난 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 고체 배지의 조성을 구체적으로 예시하면 하기의 조성을 들 수 있다. 일본 식품 위생법, 일본국 약국방, 국제 낙농연맹의 규격 기준(IDF STANDARD) 등의 미생물 시험법 등으로 규정되어 있는 보통 한천 배지, 표준 한천 배지, 디옥시콜레이트 한천 배지, EMB 배지, 엔도 배지, BCP 첨가 플레이트 카운트 한천 배지, 난황 첨가 만니톨 식염 한천 배지, 감자 덱스트로스 한천 배지, 바이올렛 레드 담즙산염 유당(VRBL) 한천 배지, 효모 추출물-포도당-클로람페니콜 한천 배지, 산성 MRS 배지, M17 배지, 바이르드-파커(Baird-Parker) 한천 배지(ETGP 한천 배지) 등[일본 약학회편, 「유제품 시험법·주해」, 가네하라슛판가부시키가이샤, 제111 내지 125페이지, 평성 2년 4월 10일(문헌1), 「IDF STANDARD(1991년 개정판)」, 사단법인 일본 국제낙농연맹 발행, 제306페이지, 제470페이지, 제645 내지 647페이지, 평성 3년 12월 25일(문헌2), 사카자키 도시카즈 감수, 「신 세균배지학 강의·하Ⅱ(제2판)」, 가부시키가이샤 긴다이슛판, 제62 내지 63페이지, 1996년 8월15일(문헌3)]이다.
또한, 참고로 문헌 1에 기재된 각 고체 배지의 각 성분의 각 소정량을 나타낸다. 보통 한천 배지(pH 7.0 내지 7.4)의 고체 배지 조성은 고기 추출물 5g, 펩톤 10g, 염화나트륨(NaCl) 1 내지 2g, 한천 12 내지 15g 및 정제수(용해수) 10OOml(1리터)가 각 성분의 각 소정량이다.
표준 한천 배지(pH 6.8 내지 7.2)의 고체 배지 조성은 효모 추출물 2.5g, 펩톤 5g, 글루코스 1g, 한천 15g 및 정제수(용해수) 1000ml(1리터)가 각 성분의 각 소정량이다.
데옥시콜레이트 한천 배지(pH 7.0 내지 7.4)의 고체 배지 조성은 펩톤 10g, 유당 10g, 데옥시콜산나트륨 1g, 염화나트륨(NaCl) 5g, K2HPO42g, 뉴트럴 레드 0.033g, 시트르산철암모늄 2g, 한천 15g 및 정제수(용해수) 1000ml(1리터)가 각 성분의 각 소정량이다.
EMB 배지(pH 6.6 내지 7.0)의 고체 배지 조성은 펩톤 10g, 유당 10g, K2HPO42g, 에오딘Y 0.4g, 메틸렌 블루 0.065g, 한천 18g 및 정제수(용해수) 1000ml(1리터)가 각 성분의 각 소정량이다.
엔도 배지(pH 7.0 내지 7.4)의 고체 배지 조성은 펩톤 10g, 고기 추출물 3g, 유당 10g, Na2SO31.6g, 염기성 푸크신 0.1g, 한천 15g 및 정제수(용해수) 10OOml(1리터)가 각 성분의 각 소정량이다.
BCP 첨가 플레이트 카운트 한천 배지(pH 6.0 내지 7.0)의 고체 배지 조성은효모 추출물 2.5g, 펩톤 5g, 글루코스 1g, 트윈 80 1g, L-시스테인 0.1g, 브롬크레졸 퍼플 0.06g, 한천 15g 및 정제수(용해수) 1OOOml(1리터)가 각 성분의 각 소정량이다.
난황 첨가 만니톨 식염 한천 배지[pH 7.2 내지 7.6, 신선 난황액(난황을 동일량의 생리 식염수로 용해시킨 것) 50 내지 60ml는 고압 증기 멸균후 평판으로 하기 전에 혼화한다]의 고체 배지 조성은 고기 추출물 2.5g, 펩톤 10g, 만니톨 10g, 염화나트륨(NaCl) 75g, 페놀 레드 0.025g, 한천 15g 및 정제수(용해수) 1000ml(1리터)가 각 성분의 각 소정량이다.
감자 덱스트로스 한천 배지(pH 5.6 내지 5.7)의 고체 배지 조성은 감자 침출액 200g, 글루코스 20g, 한천 15g 및 정제수(용해수) 100Oml(1리터)가 각 성분의 각 소정량이다.
다음에 문헌 2에 기재된 각 고체 배지의 각 성분의 각 소정량을 나타낸다.
바이올렛 레드 담즙산염 유당(VRBL) 한천 배지(pH 7.4±0.1)의 고체 배지 조성은 펩톤 7g, 효모 추출물 3g, 유당(C12H22011·H20) 10g, 염화나트륨(NaC1) 5g, 담즙산염 1.5g, 중성 홍(紅) 0.03g, 크리스탈바이올렛 0.002g, 한천 12 내지 18g 및 물(용해수) 1000ml가 각 성분의 각 소정량이다.
효모 추출물-포도당-클로람페니콜 한천 배지(pH 6.6)의 고체 배지 조성은 효모 추출물 5g, 포도당(C6H1206) 2Og, 클로람페니콜(C11H12Cl2N2O5) 또는 옥시테트라사이클린(C22H3ON2O11) O.1g, 한천 12 내지 15g 및 물(용해수) 1000ml가 각 성분의 각 소정량이다.
산성 MRS 배지(아세트산에 의해 pH 5.4로 조정)의 고체 배지 조성은 펩톤 1(카제인의 트립신 분해물) 1Og, 고기 추출물 10g, 효모 추출물(분말) 5g, 글루코스( C6H12O6) 2Og, 트윈 8O(Sorbitan mono-oleate) 1ml, 오르토인산수소이칼륨(K2HPO4) 2g, 아세트산나트륨 3수화물(CH3CO2Na·3H2O) 5g, 시트르산이암모늄[C6H6O7(NH4)2] 2g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4·7H20) O.2g, 황산망간 4수화물(MnS04·4H20) 0.O5g, 한천 9 내지 18g 및 물(용해수) 10OOml가 각 성분의 각 소정량이다.
M17 배지[pH 7.1 내지 7.2, 유당(C12H22011)은 10% 유당(C12H22011) 멸균 수용액으로서, 고압 증기 멸균후 평판으로 하기 전에 혼화한다]의 고체 배지 조성은 펩톤 1(카제인의 트립신 분해물) 2.50g, 펩톤 2(고기의 펩신 분해물) 2.50g, 펩톤 3(대두의 파파인 분해물) 5.00g, 효모 추출물(분말) 2.50g, 고기 추출물 5.00g, β-글리세롤인산염(이나트륨염)(C6H7O6PNa2) 19.OOg, 황산마그네슘 7수염(MgS04·7H20) O.25g, 아스코르브산(C6H806) O.50g, 유당(C12H22011) 5g, 한천 9 내지 18g 및 물(용해수) 10OOml가 각 성분의 각 소정량이다.
다음에 문헌 3에 기재된 각 고체 배지의 각 성분의 각 소정량을 나타낸다.
바이르드-파커 한천 배지(ETGP 한천 배지)[pH 6.8, 아텔루르산칼륨 1% 수용액 10ml 및 난황 50% 유액 50ml는 고압 증기 멸균후 평판으로 하기 전에 혼화한다]의 고체 배지 조성은 펩톤 10g, 고기 추출물 5g, 효모 추출물 1g, 염화리튬 5g, 글리신 12g, 피루브산나트륨 10g, 한천 17g 및 정제수(용해수) 1000ml가 각 성분의 각 소정량이다.
다음에 본 발명의 고체 배지의 제조방법에 관해서 설명한다.
본 발명의 고체 배지의 제조방법에서는 용해수의 양이 소정량보다 많은 양이고 고화 후에 건조시켜 물을 제거하는 것 이외에는 통상적인 고체 배지의 제조와 동일하게 고체 배지의 각 성분의 용해수에의 용해 및 고화를 실시하는 것이 양호하다. 예를 들면, 고체 배지 조성으로서 문헌 등에 기재되어 있거나 새롭게 특정(정의)된 소정량의 각 배지 성분을 용해수에 용해시키고, 필요에 따라, pH를 조정하고, 상기 용해액에 겔화제를 첨가하여 가열 용해시키며, 멸균하여 샤레 등의 용기에 분주하고, 고화시키는 것이 양호하다.
제거하는 물의 양은 물을 제거한 후에 고체 배지의 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상으로 되는 양이다. 이러한 양은 배지 조성(특히 겔화제)에 따라 변화될 수 있지만, 하기 시험예 3에 기재된 바와 동일한 방법에 따라 각종 과잉량의 용해수를 함유하는 배지를 작성하여 10분간 평균 흡수 속도를 측정함으로써 정할 수 있다.
제거하는 물의 양은 바람직하게는 용해수의 5% 이상이고, 보다 바람직하게는 용해수의 30% 이상이다.
소정량의 용해수를 사용하여 작성한 고체 배지에 대해 이러한 물의 제거를 실시하는 경우, 물을 제거한 후의 고체 배지에서 물의 양은 상당히 적어지고, 건조에 기인하는 미생물의 생육 억제가 확인되는 경우가 있다. 본 발명에서는 고체 배지의 용해수의 양을 미리 소정량보다 많게 함으로써 물의 제거후에 소정량에 상당하는 물의 양이 고체 배지에 함유되도록 한다. 따라서, 용해수의 양은 제거하는 물의 양과 거의 동량까지 소정량보다 많게 한다. 여기서, 거의 동량이란, 이와 같이 많게 한 양을 소정량에 가한 용해수의 총 배합량으로부터 제거하는 물의 양을 뺀 양이 소정량과 거의 동량(통상적으로는 97 내지 103%)으로 되는 양이다.
통상적으로는, 용해수의 추가량은 고체 배지 조성으로서 문헌 등에 기재되어 있거나 새롭게 특정된 조성에서의 용해수량(용해수의 소정량)을 100%로 정의하는 경우에 이의 5 내지 150%이고, 이러한 양의 용해수를 용해수의 소정량에 추가하여 과잉량으로 배합한다. 이에 따라, 용해수의 건조 제거 조작의 결과물로서 소정의 수분을 함유하고, 또한 충분한 흡수 속도를 갖는 본 발명의 고체 배지를 조제할 수 있다.
겔화제로서 한천을 사용하는 경우에는 한천의 첨가농도는, 상기 용해수의 소정량을 100%로 하여, 이의 1.0 내지 3%(중량)이 바람직하다. 또한, 가열 용해는 한천을 충분하게 용해시키기 때문에 100℃ 이상이 바람직하고, 121℃에서 15분 이상 가열하면 용해와 함께 멸균할 수 있다. 멸균은 통상적인 방법에 따라 고압 증기 멸균법 등에 의해 실시할 수 있다.
용기로서 샤레를 사용하는 경우에는 건조 제거후의 고체 배지의 양이 10 내지 30ml의 범위인 양을 분주하는 것이 바람직하다.
배지로부터 물을 제거하기 위한 건조 제거방법으로서는 감압 건조법, 진공 건조법, 온풍 건조법, 적외선 건조법, 고주파 건조법 등을 예시할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 고체 배지는 상기 정의에 따른 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상이다. 상기 정의에 기재된 바와 같이 표준 크기의 고체 배지 1평판당 10분 동안에 0.5ml 이상의 흡수가 있으면, 고체 배지에 단시간에 대량의 시료를 도말할 수 있게 된다. 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상인 고체 배지는 배지를 건조시켜 상기와 같은 적당량의 물을 제거함으로써 제조할 수 있다. 또한, 고체 배지의 노출면적(공기에 접촉되는 면적)당의 배지량은 상기한 범위의 10분간 평균 흡수 속도가 수득되는 양이면 양호하다. 배지량이 너무 적으면, 충분한 10분간 평균 흡수 속도가 수득되지 않는 경우가 있다.
본 발명의 고체 배지는 물을 제거한 후에 거의 소정량의 용해수를 함유하기 때문에, 건조에 기인하는 미생물의 생육 억제가 확인되지 않는다. 고체 배지의 특정에 사용되는 조성에서 용해수의 소정량은 배양하고자 하는 미생물이 생육되도록 정해지기 때문이다. 또는, 배양하고자 하는 미생물에 대해 생육 억제가 확인되지 않는 조성의 배지가 선택되기 때문이다.
고체 배지의 수분 함량은 90% 이상인 것이 바람직하다. 이에 따라, 높은 수분 함량을 요구하는 미생물도 배양할 수 있다. 예를 들면, 후술하는 시험예의 결과에서도 명백한 바와 같이, 최종적인 고체 배지 조성중의 수분 함량을 90% 미만으로 하는 경우, 스타필로코쿠스·아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538P 등의 미생물의 생육이 거의 완전하게 억제되기 때문에, 이러한 미생물을 배양하기 위해서는 고체 배지의 수분 함량을 90% 이상으로 하는 것이 필요하다.
또한, 비교적 건조에 약하고 식품의 미생물 검사 등에서 중요한 균종인 스타필로코쿠스·아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538P, 바실러스·스테아로서모필루스·바르·칼리도락티스(Bacillus stearothermophilus var. calidolactis) NIZO C953 등의 미생물의 생육 억제를 일체 야기시키지 않고서 배양하기 위해서는 본 발명의 고체 배지가 적합하다. 본 발명의 고체 배지는, 상기한 바와 같이, 고체 배지의 용해수의 양을 소정량보다 많게 배합하여 건조시킴으로써 충분한 흡수 속도를 유지하고, 또한 건조에 기인하는 미생물의 생육 억제가 유발되지 않는다.
본 발명의 고체 배지의 제조방법의 이해를 한층 용이하게 하기 위해, 상기 문헌 1에 기재된 표준 한천 배지의 제조방법을 예로서 설명한다.
즉, 표준 한천 배지의 고체 배지 조성은 문헌 1에 기재된 바와 같이 효모 추출물 2.5g, 펩톤 5g, 글루코스 1g, 한천 15g 및 정제수(용해수) 1000ml가 각 성분의 각 소정량이다.
따라서, 효모 추출물 2.5g, 펩톤 5g 및 글루코스 1g의 각 배지 성분을, 용해수의 소정량(10OOml)을 10O%로 하여, 이러한 양보다 바람직하게는 5 내지 150%(50 내지 1500ml) 많게 배합한 용해수에 용해시켜 약 1050ml 내지 2500ml의 용해액을 수득한다. 상기 용해액의 pH를 6.8 내지 7.2로 조정하고, 한천 15g을 첨가하고, 고압 증기 멸균법에 의해 121℃에서 15분 동안 가열하여 용해와 동시에 멸균한다.
멸균처리가 완료된 배지를 무균적으로 샤레에 1장당 16 내지 38g 분주하여냉각 고화시키고, 후고화된 배지를 건조기(LABCONCO사제)를 사용하여 103Pa의 압력으로 감압 건조법에 의해 건조시켜 용해수를 제거한다.
상기 건조 제거에 의해 용해수가 과잉으로 배합된 양의 물을 제거하고, 또한 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상인 고체 배지를 조제한다.
상기 방법에 따라 제조된 고체 배지는 건조에 기인하는 미생물의 생육 억제가 유발되지 않고, 흡수 속도가 우수하며, 단시간에 대량의 시료를 도말할 수 있고, 신속하고 정확한 미생물수의 측정 시험에 최적인 고체 배지이다.
다음에 실시예를 기재하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예로 한정되는 것이 아니다.
실시예 1
효모 추출물(오리엔탈고보사제) 2.5g, 펩톤(디프코사제) 5g 및 글루코스(와코쥰야쿠고교사제) 1g을, 공지된 고체 배지 조성에서 용해수(정제수)의 소정량(10OOml)을 10O%로 하여, 이러한 양에 추가하여 용해수(정제수)의 양을 20%(200ml) 많게 배합한 용해수 1200ml에 용해시키고, 약 1200ml의 용해액을 수득한다. 상기 용해액의 pH를 0.1mol/l 수산화나트륨 용액을 사용하여 7.2로 조정하고, 한천(이나쇼쿠힝고교사제) 15g을 첨가하며, 오토클레이브(이와타테이료기카이세이사쿠쇼사제)를 사용하여 121℃에서 15분 동안 가열하고, 용해와 동시에 멸균한다.
멸균 처리 완료의 고체 배지를 무균실 내에서 직경 9cm의 플라스틱제 샤레(에이켄기자이사제)에 1장당 18g 분주하고, 냉각 고화시키며, 고화된 배지를 건조기(LABCONCO사제)를 사용하여 103Pa의 압력으로 감압 건조법에 의해 건조시키고, 물 3ml를 제거한다. 그 결과, 배지량 15g의 고체 배지 평판이 수득된다.
상기 물의 제거는 소정량에 추가하여 많게 배합된 용해수의 양(200ml)의 전량에 상당하는 물, 즉 용해수(정제수)의 총 배합량(1200ml)를 100%으로 하여, 약 17%(200ml)의 물을 건조에 의해 제거한 것을 나타낸다.
따라서, 물의 제거에 의해 고체 배지의 수분 함량은 약 98%로 조정된다.
상기 방법에 따라 제조된 고체 배지(표준 한천 배지) 평판은, 하기 시험방법으로 시험한 결과, 10분간 평균 흡수 속도는 0.15ml/분이고, 대량의 시료를 도말할 수 있으며, 건조에 기인하는 미생물의 생육 억제가 확인되지 않는 신속하고 정확한 미생물수의 측정 시험에 최적인 고체 배지이다.
실시예 2
고기 추출물(머크사제) 2.5g, 펩톤(디프코사제) 10g, 염화나트륨(와코쥰야쿠고교사제) 75g, 만니톨(와코쥰야쿠고교사제) 10g 및 페놀 레드(와코쥰야쿠고교사제) 0.025g을, 공지된 고체 배지 조성에서 용해수(정제수)의 소정량(10OOml)을100%로 하여, 이러한 양에 추가하여 용해수(정제수)의 양을 6.6%(66ml) 많게 배합한 용해수 1066ml에 용해시키고, 약 1066ml의 용해액을 수득한다. 상기 용해액의 pH를 0.1mol/l 수산화나트륨 용액을 사용하여 7.4로 조정하고, 한천(이나쇼쿠힝고교사제) 15g을 첨가하며, 오토클레이브(이와타테이료기카이세이사쿠쇼사제)를 사용하여 121℃에서 15분 동안 가열하고, 용해와 동시에 멸균한다.
멸균 처리 완료의 고체 배지를 무균실 내에서 직경 9cm의 플라스틱제 샤레(에이켄기자이사제)에 1장당 16g 분주하여 냉각 고화시키고, 고화된 배지를 건조기(LABCONCO사제)를 사용하여 103Pa의 압력으로 감압 건조법에 의해 건조시키며, 용해수 약 1ml를 제거한다. 그 결과, 배지량 15g의 고체 배지 평판을 수득한다.
상기 물의 제거는 소정량보다 많게 배합한 용해수의 양(66ml)의 전량에 상당하는 물, 즉 용해수(정제수)의 총 배합량(1066ml)을 100%로 하여, 약 6%(66ml)의 물을 건조에 의해 제거한 것을 나타낸다.
따라서, 상기 용해수를 제거함으로써 고체 배지의 수분 함량은 약 90%로 조정된다.
상기 방법에 따라 제조된 고체 배지(만니톨 식염 한천 배지) 평판은, 하기 시험방법으로 시험한 결과, 10분간 평균 흡수 속도는 0.07ml/분이고, 대량의 시료를 도말할 수 있으며, 스타필로코쿠스속의 건조에 기인하는 미생물의 생육 억제가 확인되지 않는 신속하고 정확한 미생물수의 측정 시험에 최적인 고체 배지이다.
실시예 3
공지된 고체 배지의 조성을 개변한 신규 조성의 고체 배지를 작성한다.
펩톤(디프코사제) 10g, 고기 추출물(머크사제) 5g 및 염화나트륨(와코쥰야쿠고교사제) 2g을, 공지된 고체 배지 조성에서 용해수(정제수)의 소정량(1000ml)보다 적은 900ml를 소정량으로 하고 이러한 양을 100%로 하여, 이러한 양에 추가하여 용해수(정제수)의 양을 약 33.3%(300ml) 많게 배합한 용해수 1200ml에 용해시키고, 약 1200ml의 용해액을 수득한다. 상기 용해액의 pH를 0.1mol/l 수산화나트륨 용액을 사용하여 7.0으로 조정하고, 한천(이나쇼쿠힝고교사제) 15g을 첨가하며, 오토클레이브(이와타테이료기카이세이사쿠쇼사제)를 사용하여 121℃에서 15분 동안 가열하고, 용해와 동시에 멸균한다.
멸균 처리 완료된 고체 배지를 무균실 내에서 직경 9cm의 플라스틱제 샤레(에이켄기자이사제)에 1장당 20g 분주하여 냉각 고화시키고, 고화된 배지를 건조기(LABCONCO사제)를 사용하여 1O3Pa의 압력으로 감압 건조법에 의해 건조시키며, 용해수 5ml를 제거한다. 그 결과, 배지량 15g의 고체 배지 평판을 수득한다.
상기 물의 제거는 소정량보다 많게 배합한 용해수의 양(300ml)의 전량에 상당하는 물, 즉 용해수(정제수)의 총 배합량(1200ml)을 100%로 하여, 약 25%(300ml)의 용해수를 건조에 의해 제거한 것을 나타낸다.
따라서, 상기 용해수의 제거에 의해 고체 배지의 수분 함량은 약 96%로 조정된다.
상기 방법에 따라 제조된 고체 배지(보통 한천 배지) 평판은, 하기 시험방법으로 시험한 결과, 10분간 평균 흡수 속도는 0.17ml/분이고, 대량의 시료를 도말할 수 있으며, 건조에 기인하는 미생물의 생육 억제가 확인되지 않는 신속하고 정확한 미생물수의 측정 시험에 최적인 고체 배지이다.
시험예 1
본 시험은 미생물 생육 시험의 결과를 지표로 하여 종래 기술과 본 발명을 비교하기 위해 실시한다.
(1) 시료의 조제
다음에 기재된 3종류의 시료를 5회 반복하여 조제한다.
시료 1: 본 발명의 실시예 1과 동일한 방법에 따라 제조한 고체 배지.
시료 2: 배지의 종류를 표준 한천 배지로 변경하고 배지의 분주량 및 건조 고체 배지의 복원수(멸균수)의 양을 각각 15ml로 하여 건조 고체 배지의 복원 시간을 5분 동안으로 하며 여분인 복원수(유리수)를 경사하여 방출하는 것을 제외하고는 종래 기술 1의 실시예 1과 동일한 방법에 따라 제조한 고체 배지.
시료 3: 배지의 종류를 표준 한천 배지로 변경하고 배지의 분주량 및 건조 고체 배지의 복원수(멸균수)의 양을 각각 15ml로 하여 건조 고체 배지의 복원 시간을 5분 동안으로 하며 여분인 복원수(유리수)를 경사하여 방출하는 것을 제외하고는 종래 기술 2의 실시예 1과 동일한 방법에 따라 제조한 고체 배지.
(2) 시험 방법
각 시료의 미생물 생육을 다음 시험 방법에 따라 시험한다.
시험 균주로서 미생물 기탁기관인 어메리컨·타입·컬처·콜렉션에서 분양된 스타필로코쿠스·아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538P 및 네델란드 낙농연구소(NIZO)로부터 분양된 바실러스·스테아로서모필루스·바르·칼리도락티스 (Bacillus stearothermophilus var. calidolactis) NIZO C953을 사용한다.
공지된 고체 배지 조성에 의한 소정량의 용해수를 사용하고, 즉 공지된 고체 배지 조성의 용해수량을 그대로 사용하여, 건조 공정을 부가하지 않고 종래와 같이 통상적인 방법으로 제조한 표준 한천 배지의 1평판에 0.1ml 도말하며, 37℃에서 48시간 동안 배양하는 경우에 상기 시험 균주의 100개의 집락(集落)이 수득되는 각 시험 균주의 희석액을 제조한다.
또한, 표준 한천 배지의 고체 배지 조성은 효모 추출물 2.5g, 펩톤 5g, 글루코스 1g, 한천 15g 및 정제수 1000ml(용해수의 소정량)이다.
각 시료의 1평판에 시험 균주의 희석액을 0.1ml 도말하고, 37℃에서 48시간 동안 배양하여 집락수를 육안으로 관찰한다. 한편, 시험은 5회 실시하여 집락수의 평균치를 산출한다.
(3) 시험결과
본 시험의 결과는 표 1에 기재된 바와 같다. 표 1에서 명백한 바와 같이,종래 기술의 시료 2 및 시료 3과 비교하여, 본 발명의 시료 1이 식품의 미생물 검사 등에서 중요한 균인 스타필로코쿠스·아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538P 및 바실러스·스테아로서모필루스·바르·칼리도락티스(Bacillus stearothermophilus var. calidolactis) NIZO C953의 생육이 일체 억제되지 않고서 검출되고, 신속하고 정확한 미생물수의 계측을 할 수 있는 점에서 우수한 것으로 판명됐다.
이상의 결과에서, 종래 기술의 건조 고체 배지는 복원을 위해 장시간을 필요로 하며, 신속하고 정확한 미생물수의 측정 시험에는 적합하지 않은 것이 판명됐다.
한편, 배지의 종류, 배지의 분주량 및 건조 고체 배지의 복원수(멸균수)의 양 및 건조 고체 배지의 복원 시간을 1 내지 10분 동안의 범위로 적절하게 변경하여 시험했지만, 거의 동일한 결과가 수득되었다.
시료 번호 스타필로코쿠스 아우레우스ATCC 6538P의 집락수 바실러스 스테아로서모필루스NIZO C953의 집락수
1 102 98
2 35 38
3 40 53
시험예 2
본 시험은 미생물 생육 시험의 결과를 지표로 하여 고체 배지의 적정한 수분 함량을 조사하기 위해 실시한다.
(1) 시료의 제조
다음에 기재한 2종류의 시료를 각각 5회 반복하여 제조한다.
시료 4: 건조시켜 용해수를 제거하고 고체 배지의 수분 함량을 90%로 하는 것을 제외하고는 본 발명의 실시예 2와 동일한 방법에 따라 제조한 고체 배지.
시료 5: 건조시켜 용해수를 제거하고 고체 배지의 수분 함량을 80%로 하는 것을 제외하고는 본 발명의 실시예 2와 동일한 방법에 따라 제조한 고체 배지.
(2) 시험 방법
각 시료의 미생물 생육을, 시험 균주로서 스타필로코쿠스·아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538P만을 사용하는 것을 제외하고는 상기 시험예 1의 시험 방법과 동일한 방법에 따라 시험한다.
또한, 건조에 따르는 고체 배지의 수분 함량의 변화는 건조 감량에 의해 모니터한다. 즉, 건조 전의 배지 중량(a) 및 건조 후의 배지 중량(b)로부터 건조 감량, 소위 감수량(c)을 a-b= c에 의해 구한다. 이어서, 용해수의 총 배합량에서 감수량(c)을 빼서 잔존하는 수분량을 구한다. 이러한 잔존 수분량 및 수분 함량의 정의에 근거하여 건조 후의 수분 함량을 구하고, 건조에 따르는 고체 배지의 수분 함량의 변화를 모니터한다.
또한, 만니톨 식염 한천 배지의 고체 배지 조성은 고기 추출물 2.5g, 펩톤 10g, 염화나트륨 75g, 만니톨 10g, 페놀 0.025g, 한천 15g 및 정제수 1000ml(용해수의 소정량)이다.
(3) 시험결과
본 시험의 결과는 표 2에 기재된 바와 같다. 표 2로부터 명백한 바와 같이, 고체 배지의 수분 함량을 80%, 소위 90% 미만으로 하는 경우, 스타필로코쿠스·아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538P의 생육이 거의 완전하게 억제되는 점으로부터 미생물수가 측정 불가능하게 되고, 정확한 미생물수의 계측을 위해서는 수분 함량이 90% 이상인 것이 필요한 것으로 판명됐다.
한편, 배지의 종류를 적절하게 변경하고 수분 함량을 변경하여 시험했지만, 거의 동일한 결과가 수득되었다.
시료 번호 스타필로코쿠스 아우레우스ATCC 6538P의 집락수
4 97
5 0
시험예 3
본 시험은 흡수 속도시험의 결과를 지표로 하여 고체 배지 조성으로서 문헌 등에 기재되어 있는 용해수량을 100%로 하여 이러한 용해수의 적정한 제거량(%)을 조사하기 위해 실시한다.
(1) 시료의 제조
다음에 기재된 4종류의 시료를 각각 5회 반복하여 제조한다.
시료 6: 용해수를 소정량보다 많게 배합하지 않고 용해수의 건조 제거를 실시하지 않는 것을 제외하고는 본 발명의 실시예 1과 동일한 방법에 따라 제조한 고체 배지.
시료 7: 용해수를 소정량의 2.5% 많게 배합하고 이러한 용해수의 총 배합량의 2.5%를 건조 제거한 것을 제외하고는 본 발명의 실시예 1과 동일한 방법에 따라 제조한 고체 배지.
시료 8: 용해수를 소정량의 5% 많게 배합하고 이러한 용해수의 총 배합량의 5%를 건조 제거한 것을 제외하고는 본 발명의 실시예 1과 동일한 방법에 따라 제조한 고체 배지.
시료 9: 용해수를 소정량의 40% 많게 배합하고 이러한 용해수의 총 배합량의 30%를 건조 제거한 것을 제외하고는 본 발명의 실시예 1과 동일한 방법에 따라 제조한 고체 배지.
(2) 시험 방법
각 시료의 흡수 속도를 다음 시험 방법에 따라 시험한다. 또한, 측정은 25℃에서 실시한다.
시료 평판의 총 중량(B)를 측정하고, 평판 배지[원형, 외부직경 9cm, 내부직경 8.6cm(면적: 58.1cm2), 배지량 15g] 위에 이온교환수 10ml를 첨가하여 흡수를 개시하며, 10분 경과시점에서 미흡수의 물을 폐기하여 샤레 벽면에 부착되어 있는 수분을 닦아내고, 흡수 처리후의 시료 평판의 총 중량(A)을 측정하며, 다음 일반식에 의해 10분간 평균 흡수 속도를 산출한다.
흡수 속도(ml/분)= (A-B)/10
또한, 용해수의 건조 제거 백분률(e)은, 용해수의 총 배합량(d)을 1OO%로 하여, 상기 시험예 2와 동일한 방법으로 모니터하여 구한 감수량(c)로부터 다음 일반식에 의해 구한다.
e(%)= c/d×1OO
(3) 시험결과
본 시험의 결과는 표 3에 기재된 바와 같다. 표 3으로부터 명백한 바와 같이, 배지를 건조시키고 용해수의 5% 이상을 제거하는 경우, 흡수 속도가 0.05ml/분 이상으로 되는 점으로부터 단시간에 대량의 시료를 도말할 수 있게 되고, 따라서 신속한 미생물수의 측정을 위해서는 용해수의 5% 이상을 제거하는 것이 필요한 것으로 판명됐다. 또한, 용해수의 30% 이상을 제거하는 경우, 흡수 속도가 0.2ml/분 이상으로 되는 점으로부터 단시간에 한층 대량의 시료를 도말할 수 있게 되고, 따라서 신속한 미생물수의 측정을 위해서는 용해수의 30% 이상을 제거하는 것이 바람직한 것으로 판명됐다.
또한, 배지의 종류를 적절하게 변경하여 시험했지만, 거의 동일한 결과가 수득되었다.
시료 번호 10분간 평균 흡수 속도(ml/분)
6 0.02
7 0.04
8 0.06
9 0.2
본 발명에 따라 수득되는 효과는 다음과 같다.
1) 본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 본 발명의 고체 배지는 흡수 속도가 우수하고 단시간에 대량의 시료를 도말할 수 있으며 신속한 미생물수의 측정 시험에 최적이다.
2) 본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 본 발명의 고체 배지는 대량의 시료를 도말할 수 있기 때문에, 미생물의 검출 정밀도가 높고 정확한 미생물수의 측정 시험에 최적이다.
3) 본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 본 발명의 고체 배지는 건조에 기인하는 미생물의 생육 억제가 확인되지 않기 때문에, 정확한 미생물수의 측정 시험에 최적이다.
4) 본 발명의 제조방법에 따라 흡수 속도가 우수하고 단시간에 대량의 시료를 도말할 수 있으며 신속하고 정확한 미생물수의 측정 시험에 최적인 고체 배지를 제조할 수 있다.

Claims (7)

  1. 고체 배지의 용해수 이외의 각 성분을 용해수에 용해시키고, 수득된 용액을 고화시킨 다음, 고화된 배지를 건조시켜 물을 제거함을 포함하고,
    제거되는 물의 양은, 물을 제거한 후의 고체 배지의 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상으로 되는 양이고,
    용해수의 양은, 제거되는 물의 양과 거의 동량까지 소정량보다 많은 양임을 특징으로 하는 고체 배지의 제조방법에 따라 수득한, 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상인 고체 배지.
  2. 제1항에 있어서, 제거되는 물의 양이 용해수의 5% 이상인 고체 배지.
  3. 제1항에 있어서, 제거되는 물의 양이 용해수의 30% 이상인 고체 배지.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 고체 배지의 수분 함량이 90% 이상인 고체 배지.
  5. 고체 배지의 용해수 이외의 각 성분을 용해수에 용해시키고, 수득된 용액을 고화시킨 다음, 고화된 배지를 건조시켜 물을 제거함을 포함하고,
    제거되는 물의 양이, 물을 제거한 후에 고체 배지의 10분간 평균 흡수 속도가 0.05ml/분 이상으로 되는 양이고,
    용해수의 양이, 제거되는 물의 양과 거의 동량까지 소정량보다 많은 양임을 특징으로 하는 고체 배지의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 제거되는 물의 양이 용해수의 5% 이상인 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 제거되는 물의 양이 용해수의 30% 이상인 제조방법.
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