FI63059B - Anordning att anvaendas vid mikrobiologiska arbeten - Google Patents

Description

rrr^w'n r<n /44V kuulutusjulkaisu jjSSf&i ^ UTLÄGG N I NGSSKRI FT 6305 9 C (45) r.ilcnUi ts^önr.c Lty 11 04 1933 ^ ^ ^ (51) Kv.ik.Wa3 C 12 M 1/00 SUOMI—FINLAND (2i) ρμμ«μμ^-νι*«ιιι·μι·ι 7918½ (22) H»k*ml*piivl—A<M6lcnJnpdtf 0Ö.06.79 ' ' (23) AHcupiivt—CiMgh«adac 08.06.79 (41) Tullut JulklMlul — Mlvit offaotllg 2.2 79

P—ttl· i> r.ki.urll»llltu. M

Patent· och ragistaratyraiaan ' amUm utta«d och utUkmtM pubticend ιι.ΐέ.οέ

(32)(33)(31) Pyydetty kuoIImu·—B«|trd prlorluc 12.06. JB

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken lyskland(DE) P 2825636.2 (71) Boehringer Mannheim GmbH., Mannheim-Waldhof, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Hans Wielinger, Mannheim, Waiter Rittersdorf, Mannheim,

Manfred Bleisteiner, Mannheim, Gerd Zimmermann, Weinheim,

Wolfgang Werner, Mannheim, Wolfgang Vömel, Mannheim,

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken lyskland(DE) (7*0 Berggren Oy Ab (5*0 Mikrobiologisissa töissä käytettävä laite - Anordning att användas vid mikrobiologista arbeten

Keksintö koskee mikrobiologisissa töissä käytettävää laitetta, joka muodostuu elatusainekartongista ja sen päällä olevasta kalvosta, joka on muovidispersiota. Elatusainekartonki ja dispersiokalvo on yhdistetty yhdeksi testiyksiköksi.

Kun ruumiinnesteistä suoritetaan mikro-organismien tutkimus, kuten esimerkiksi osoitetaan virtsassa bakteereja ja sieniä, antaa se lääkärille, mikrobiologille ym. arvokkaita vihjeitä määrättyjen sairauksien diagnoosia varten. Tätä tarkoitusta varten on viimeisten vuosien aikana kehitetty lukuisia tutkimusvälineitä bakteerien ja sienien osoittamiseksi.

Tällaisia analyysivälineitä voidaan käyttää myös lääkeaineiden, ravintoaineiden, vesien, uima-altaiden yms. tutkimiseen, joissa jotkut mikro-organismilajit ovat haitallisia tai terveydelle vahingollisia .

Mikro-organismien klassiset viljely- ja analysointimenetelmät perus tuvat siihen, että erilaisista valituista ravintoaineista ja mahdol lisesti selektiivisistä inhiboivista aineista tehdään yhdessä agar- 2 63059 agarin kanssa elatusalusta. Niin tärkeitä kuin elatusalustat ovatkin määrätyissä tapauksissa, on niillä kuitenkin työrutiinissa varjopuolensakin, varsinkin silloin kun on tutkittava kuluja säästäen suurempia koemääriä. Elatusalustat on käyttäjän omaa käyttöä varten itse valmistettava suhteellisen työläällä tavalla kuivasta pulverista. Käyttövalmiita elatusalustoja, jotka ovat paisuneessa muodossa valmiina, on myös kaupan. Nämä käyttövalmiit elatusagarit kuitenkin kuivuvat helposti, eikä niitä enää voi kostuttaa uudestaan ja ne on sen vuoksi varastoitava vesihöyrytiiviissä pakkauksissa, jotka vievät suuren tilan.

Viime aikoina on selostettu erikoisesti elintarvike- ja vesitut-kimuksia varten tarkoitettuja mikrobiologisia analyysimenetelmiä, joissa elatusainekartongit peitetään kalvosuodattimilla. Tutkittava neste suodatetaan kalvosuodattimen läpi, kalvosuodatin pannaan steriilillä vedellä kostutetun elatusainekartongin päälle tai steriiliin ravintoliuokseen kastetun suodatinkartongin päälle ja tämä yksikkö inkuboidaan petrimaljassa. Kalvosuodattimelle jääneet mikro-organismit kasvavat inkuboinnin aikana ja tulevat näkyviin bakteeripesäkkeinä.

Tämä menetelmä on käyttökelpoinen vain silloin, kun mikrobeja on vain vähän ja niitä on sen vubksi rikastettava ennen niiden osoittamista inkuboinnin avulla. Kalvosuodattimia ja elatusainekarton-keja toimitetaan erillisinä ja niitä on käsiteltävä kalvomateriaa-lin haurauden vuoksi erikoisen huolellisesti. Eräs parannus, jossa kalvosuodatin ja elatusainekartonki ovat yhdistettyinä yhdeksi yksiköksi erikoisissa kehyksissä, merkitsee jo kehitystä, (DAS 2 115 674). Kalvosuodattimen ja elatusainekartongin muodostaman yksikön valmistus erikoiseen kehykseen on kuitenkin monimutkaista ja kallista.

Edellä selostetut suodatinmenetelmät eivät sovellu lääketietelli- seen diagnostiikkaan, koska mikrobien konsentrointi suodattimen pinnalla ei ole välttämätöntä, vaan päinvastoin hyvin haitallista, koska on eristettävä suuria määriä mikrobeja, etupäässä noin 3 8 10 - 10 mikrobia/ml ruumiinnestettä.

Tämän lisäksi tunnetaan menetelmiä, joissa elatusainekartongille pannaan mikrohuokoinen kalvo siten, että kalvon materiaali tunkeutuu osittain kartongin sisään (DOS 2 320 946). Tällä menetelmällä r 63059 3 on se varjopuoli, että kalvon yläpinta, jolla mikro-organismien on määrä kasvaa, on yhtä karhea/epätasainen kuin elatusalustakartonki. Mikrobeja ei tällaisessa testissä voi nähdä ilman apukeinoja inku-boinnin jälkeen tai ne näkyvät äärimmäisen huonosti yläpinnan epätasaisuuden vuoksi. Ne on saatava näkyviin värjäämällä väreillä. Mikrobit näyttävät sen vuoksi katsojasta täysin toisenlaisilta kuin klassisessa osoitusmenetelmässä agarin päällä. Lajien visuaalinen erottaminen ei ole mahdollista. Bakteeripesäkkeitä, jotka tunkeutuvat enemmän tai vähemmän voimakkaasti elatusainekarton-kiin, ei voida käyttää ymppäämiseen helposti. Ymppääminen on kuitenkin mikrobien erottamisen ja resistenssikäyttäytymisen tutkimuksen vuoksi ehdottoman välttämätöntä.

Tunnetaan myös toinen menetelmä, joka on kehitetty eteenpäin pääasiallisesti edellä selostetusta menetelmästä. Sen tarkoituksena on poistaa tämän menetelmän varjopuolet. Testi, joka on selostettu DOS 2 320 943:ssa, on parannettu sikäli, että kalvokerroksen asemesta tai kalvokerroksen päälle on pantu geelikerros ja että gee-likerros ja. elatusainekartonki sekoittuvat toinen toisiinsa. Tällöin täytyy tarkoituksenmukaisesti lisätä myös geelikerrokseen ravinneainetta. Tällaisia geelikerroksia ei pystytä levittämään paperipinnoille kokemuksen mukaan yhtä tasaisesti ja sileästi kuin on mahdollista paisuneille agarkerroksille. Tässä menetelmässä on sen vuoksi samanlaisia varjopuolia kuin DOS 2 320 946 mukaisessa menetelmässä.

Kyseessä olevan keksinnön tehtävänä on ollut sen vuoksi kehittää bakteerien kuivaelatusalusta, joka tutkittavaan mikrobeja sisältävään liuokseen upotettaessa imee itseensä yhtä nopeasti vettä ja jonka pinta on kosteassa tilassa yhtä sileä ja tasainen kuin klassisissa agarkasvualustoissa. Mikrobeja tulee kiinnittyä pintaan niiden konsentraation kanssa ekvivalenttinen määrä upotettaessa mikrobeja sisältävään liuokseen. Mikrobien tulee muodostaa tavanmukaisen inkubointiajan kuluessa (12-24 h) pesäkkeitä, kuten on laita klassisissa agarkasvualustoissa. Näissä kuivaravintoalus-toissa on siis mikrobien lukumäärä ja laji saatava selville samalla tavoin kuin klassisissa menetelmissä. On oltava myös mahdollista testata mikrobien resistenssikäyttäytymistä.

4 63059 Tämä on keksinnön mukaan saatu aikaan laitteen avulla, joka käsittää elatusainekartongin ja bakteereita läpäisemättömän, mutta ravintoaineita läpi päästävän peitekerroksen, ja joka on tunnettu siitä, että peitekerros muodostuu veteen liukenevalla tai vedessä paisuvalla avaaja-aineella modifioidusta, veteen liukenemattomasta muovikalvosta, joka on valmistettu muovin vesidispersiosta avaaja-aineen ja muovikalvon ollessa ominaisuuksiltaan sellaisia, että ne eivät vaikuta negatiivisesti mikrobien kasvuun. Peitekerroskalvolla on tällöin seuraavat ominaisuudet.

Kalvo pysyy mikro-organismeja läpäisemättömänä.

Kalvo päästää läpi bakteerien ravintoaineita ja aineita, jotka selektiivisesti tai yleisesti hillitsevät tai ehkäisevät mikrobien kasvuna.

Kalvon pinta on sileä.

Mikrobit kiinnittyvät kalvon pinnalle niiden tutkittavassa väliaineessa olevaa konsentraatiota vastaavasti.

Dispersiomateriaaleiksi soveltuvat periaatteessa kaikki vesipitoiset muovidispersiot sillä rajoituksella, että näistä dispersioista muodostetut kalvot eivät saa vaikuttaa negatiivisesti bakteerien kasvuun. Voidaan käyttää esimerkiksi seuraavia dispersioita: vinyyliasetaatin ja akryylihappoesterin homopolymeerejä, vinyyli-priopionaatin ja vinyyliasetaatin, vinyylipropionaatin ja vinyyli-kloridin, vinyyliasetaatin ja maleiinihappoestereiden, akryyli-happoestereiden, akryylinitriilin ja vinyylipropionaatin tai butadieenin ja styrolin kopolymeerejä.

Avaaja-aineina voidaan käyttää periaatteessa kaikkia veteenliuke-nevia tai vedessä paisuvia yhdisteitä, jotka eivät vaikuta mikrobien kasvuun negatiivisesti, jotka liukenevat tai paisuvat kostutetussa kalvossa vain niin paljon, ettei kalvon rakenne hajoa niin täydellisesti, että kalvo särkyy tai syntyy niin suuria aukkoja, että mikrobit voivat tunkeutua läpi. Jos niissä tapahtuu hajaantumista aineenvaihdunnan kautta, ei tämä saa antaa mikrobeille mahdollisuutta tunkeutua kalvon läpi tai hajottaa kalvon rakennetta niin, että bakteeripesäkkeet eivät enää olisi selvästi havaittavia.

Luonnollisesti voidaan käyttää myös sellaisten aineiden seoksia, 5 63059 joilla on avaaja-aineelle sopivia ominaisuuksia. Erityistapauksissa on useamman avaaja-aineen käyttäminen kalvossa jopa eduksi.

Avaaja-aineina voidaan käyttää etupäässä seuraavia makromolekyy-lisiä aineita: polyetyleeniglykoleja, polyetyleenioksideja, poly-vinyylipyrrolidonia, polyvinyylialkoholeja, osittain saippuoitu-neita polyvinyyliestereitä, vinyylipyrrolidonin ja vinyylieste-reiden sekapolymeraatteja tai selluloosajohdannaisia, kuten hydroksialkyylisellulosaa jne. Lisäksi voidaan käyttää myös pie-nempimolekyylisiä aineita kuten sokeria, ravintosuoloja jne. tai tällaisten makro- ja mikromolekyylisten aineiden seoksia.

Kalvon raakamassan kokoomukseen on tarkoituksenmukaista lisätä kostutusainetta. Tämän kautta paranevat kalvon ominaisuudet ja samalla se vaikuttaa selektiivisesti joidenkin lajien kasvuun ja estää mikrobien ei-haluttua käyttäytymistä inkuboinnin aikana, kuten esimerkiksi Proteus-bakteerien liiallista rönsyilyä. Kostutusai-neina voidaan käyttää kaikkia mikrobiologiassa tavallisesti käytettyjä aineita kuten natriumdodekyylisulfaattia, natriumheptade-kyylisulfaattia, N-setyyli-N,N,N-trimetyyliammoniumbromidia, poly-oksietyleenisorbitaani-mono-oleaattia jne.

Koska mikrobien kasvu on ratkaisevasti riippuvainen myös viljely-alustan pH-arvosta, jonka päällä tai jossa ne kasvavat, säädetään kalvomassan pH-arvo tavanomaisten puskurien (esimerkiksi Sörensen-puskurin) avulla halutulle tasolle. Suolakonsentraatio valitaan tällöin sellaiseksi, että osmoottiset olosuhteet vastaavat mikrobien tyydyttävän kasvun vaatimuksia.

Avaajien (makromolekyylisten aineiden), kostutusaineiden ja puskurien lisäksi voidaan kalvoon lisätä myös selektiivisiä estoaineita tai antibiootteja, niin että tällaisen kokoomuksen avulla voidaan mikrobien kasvua ehkäistä selektiivisesti tai määrätä antibioottien minimi-estokonsentraatio.

Näitä kalvoja valmistetaan ennestään tunnetulla tavalla seuraavasti:

Muovidispersio sekoitetaan avaaja-aineen liuoksen kanssa homogeeniseksi. Tämän joukkoon sekoitetaan muut aineosat kuten kostutus-aineet, puskurit, estoaineet ym. Kalvon raaka-ainemassoissa voivat 6 63059 dispersiopolymeerien ja avaaja-aineiden määräsuhteet vaihdella välillä 50:1 - 1:5. Liuottimen lisääminen riippuu massan halutusta viskositeetista, mikä voi olla edelleenkäsittelymenetelmästä riippuen hyvin erilainen. Muiden lisäaineiden konsentraatio riippuu asetetuista vaatimuksista ollen välillä 0-15 %, edullisesti 1-5 % muovipeitekerroksesta.

Itse kalvoja valmistetaan tavalliseen tapaan siten, että kalvon raaka-ainemassa esimerkiksi sivellään, levitetään tai ruiskutetaan tunnetulla tavalla kerroksen paksuuden ollessa 10-1000^,um alustalle, johon kalvon raaka-ainemassa ei sitoudu liian lujasti. Kuivuttua tai kuivumistapahtuman aikana kalvo vedetään alustalta pois tai nostetaan siltä ja valmistetaan sen jälkeen edelleen.

Jotta kalvot voitaisiin stabiloida pitkittäis- ja poikittaissuunnas-sa tapahtuvaa venymistä vastaan, voidaan niitä valmistaa siten, että kalvon raaka-ainemassa pannaan tukielimen päälle, esimerkiksi kankaan, verkon tms. päälle, joka on inertin alustan päällä. Parhaana pidettyjä tukielimiä ovat kaupasta saatavat muoviverkot, jotka ovat polyamidia, polyesteriä, polyetyleeniä tms., jotka tunnetaan esimerkiksi nimellä Miillergaze, ja joiden paksuus on noin 10-200 ^um.

Tällaisia tuettuja kalvoja voidaan valmistaa myös siten, että tukielin impregnoidaan tai päällystetään kalvon raaka-ainemassalla ja mahdollisesti tämän jälkeen säädetään kalvon paksuus kaapimalla. Kun tällaiset kalvot yhdistetään ennestään tunnettujen elatusainekartonkien kanssa testisysteemeiksi, saadaan testilaite, joka vastaa täysin asetettuja vaatimuksia.

Elatusainekartonkeja valmistetaan tunnetulla tavalla siten, että suo-datinpapereita tai vastaavia muita imukykyisiä kantajakerroksia kastellaan mikrobiologiassa tavanomaisesti käytettyjen ravinto-aineseosten liuoksilla ja kuivataan tämän jälkeen. Tällä tavoin voidaan valmistaa useita ominaisuuksiltaan erilaisia elatusaine-kartonkejrf. ftäitä ovat esimerkiksi: Mac Conkeyn ravintoalusta, CLED-ravintoalusta, Slanezin ja Bartleyn ravintoalusta, Chinablau-laktoosi-ravintoalusta, Endo-ravintoalusta, Wilson-Blairin vis-muttisulfiitti-ravintoalusta, Cetrimid-ravintoalusta, CaSO-ravinto-alusta, Miiller-Hintonin ravintoalusta, Sabourand-ravintoalusta jne.

63059 7 Käyttövalmis testilaite voi olla eri tavoilla valmistettu. Seuraa-vassa esitetään mallit, jotka ovat osoittautuneet parhaimmiksi.

Vapaakantoinen kalvo tai kalvo, joka on jäykistetty tukielimen avulla, pannaan elatusainekartongin päälle. Mikro-organismien osoittamista varten kastetaan elatusainekartonki ja kalvo tutkittavaan, mikrobeja sisältävään liuokseen. Molemmat pannaan toistensa päälle asetettuina petrimaljaan ja inkuboidaan siinä 12-24 h ajan. Analysoitavat mikrobit tulevat näkyviin pesäkkeinä tunnetulla tavalla.

Jos mikrobit halutaan määrittää kvantitatiivisesti, on tarkoituksenmukaista valmistaa kalvo siten, että tukielimeksi valitaan kudottu verkko, jossa on määrätyin välein, esimerkiksi 0,5 cm:n välein, erilailla värjättyjä lankoja. Jos sellainen kalvo kastetaan yhdessä elatusainekartongin kanssa mikrobeja sisältävään nesteeseen ja inkuboidaan sen jälkeen, saadaan pesäkkeiden lukumäärästä pintayksikköä kohti hyvin helposti selville mikrobien lukumäärä tilavuusyksikköä kohti. Eräässä erikoisen yksinkertaisesti valmistettavassa laitteessa pannaan elatusainekartonki jäykän folion päälle, pannaan jonkin verran leveämpi palanen edellä selostettua testikalvoa sen päälle ja hitsataan tai liimataan kalvon ylimenevät osat siten folion päälle, että elatusainekartonki jää folion ja kalvon väliin muodostuneeseen koteloon lujasti kiinni. Tämä testiliuska, jonka leveys on tarkoituksen mukaisesti 0,5-5 cm, ja jossa testialue on etupäässä neliön muotoisena, valmistetaan käyttöä varten seuraavasti: se sinetöidään tai liimataan folioiden tai liimapaperien väliin ja steriloidaan tavalliseen tapaan. Näin saadaan käyttövalmis kuiva-elatusalusta erittäin tilaasäästävässä muodossa. Tämä elatusalusta on sitä paitsi vielä olennaisesti kauemmin säilyvä kuin elatusaineagarit, koska se ei voi kuivua ja herkät elatus-aineet ovat kuivassa tilassa selvästi pysyvämpiä kuin paisuneessa agarissa. Ennen käyttöä otetaan testilaite foliopakkauksesta pois. «Mikrobien osoittamiseksi esimerkiksi virtsassa, kastetaan testilaite* tuoreeseen puhtaasti otettuun keskivirtsaan, pannaan inkubointiastiaän ja inkuboidaan. Mahdollisesti voi pakkauskin toimia inkubointiastiana. Vertailutaulukoiden avulla voidaan ilmoittaa mikrobien lukumäärä ml kohti virtsaa. On tarkoituksenmukaista, että ei käytetä ainoastaan yhtä yleisravintoalustaa vaan δ 6 30 5 9 yhdistetään useampia selektiivisiä ravintoalustoja ja/tai selektiivisiä ravintoalustoja testiyksiköiksi.

Antibiogrammaa varten käytetään sellaista laitetta, joka sisältää yhden yleiselatusainekartongin (esimerkiksi Miiller-Hintonin elatusalustan) , kostutetaan se steriilillä vedellä, sivellään tälle lastalla testattavien mikrobien lietettä ja pannaan päälle an-tibioottilevyjä, esimerkiksi DIN 58 940 mukaan. Inkuboinnin jälkeen arvioidaan tulos tavalliseen tapaan.

Mikrobien resistenssikäyttäytymistä voidaan tutkia myös siten, että määrätään minimaalinen estokonsentraatio (MHK). Menetellään seuraavalla tavalla:

Antibiootit lisätään halutuissa vahvuuksissa suoraan kalvon massaan ja valmistetaan näin valmistetuista kalvoista testiliuskoja. Tätä varten pannaan elatusainekartonki, jossa on yleis-ravinto-alusta,folion päälle ja sinetöidään vastaava antibioottia sisältävä kalvo sen päälle kuten edellä on selostettu. Antibiootteja voidaan mahdollisesti lisätä myös elatusainekartonkiin.

Jotkut antibiootit ovat ainoastaan suhteellisen kapealla pH-alueella pitemmän aikaa stabiileja, ja sellaisella pH-alueella, joka ei vastaa mikrobien kasvulle optimaalista aluetta. Tällaisten aineiden MHK:n määräämiseksi keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetaan kalvoja seuraavalla tavalla ja niistä valmistetaan edelleen testiliuskoja kuten edellä on selostettu.

Jonkin edellä selostetun antibioottivapaan kalvon päälle pannaan toinen kalvo, joka sisältää haluttua antibioottia. Toisen kalvon puskurikapasiteetti säädetään siten, että tutkittavaan vesipitoiseen näytteeseen kastettaessa ensimmäisen kalvon tai elatusalustan puskuri saa aikaan mikrobien kasvulle optimaalisen pH-arvon. Toinen kalvo voi olla valmistettu samasta kalvon raaka-ainemassasta kuin ensimmäinen kalvo sillä erotuksella, että sillä on toinen, antibioottia vastaava pH-arvo. Mutta ei ole välttämätöntä, että muovidispersio ja avaaja-aine ovat molemmissa kalvoissa identtiset.

Voidaan menetellä myös siten, että toinen kalvo, johon lisätään 9 63059 antibiootti, valmistetaan mikrobien kasvun suhteen inertistä, vesiliukoisesta tai vedessä paisuvasta kalvonmuodostaja-aineesta. Kalvon muodostamiseen käytetään etupäässä samoja aineita, joita voidaan käyttää myös avaaja-aineina.

Lisäksi voivat tietenkin antibiootteja sisältävän kalvon ja elatus-ainekartongin pH-arvot olla erilaiset, niin että elatusainekar-tongin puskuri vasta kostutuksen jälkeen säätää myös kalvon pinnalle mikrobien kasvulle optimaalisen pH-arvon.

Sillä toimenpiteellä, että antibiootit lisätään suoraan kalvoon tai elatusainekartonkiin ja nämä yhdistetään yhdeksi testiyksi-köksi MHK:n määräämistä varten, on seuraavia etuja: ei ole enää tarpeen panna antibioottilevyjä agarlevyjen päälle. Ilman tähän asti välttämätöntä mikrobien viljely-välivaihetta voidaan testata suoraan näytteestä mikrobien resistenssikäyttäytymistä. Uuden menettelytavan ansiosta säästetään MHK:n määrityksessä tähän asti välttämätön, monimutkainen menetelmä, jossa antibiootit annostellaan jokaista tutkimussarjaa varten uudestaan ravinto-liuoksiin. Lopuksi on mikrobien kasvuneston arviointi olennaisesti helpompaa: enää ei ole tarpeen arvioida ravintoliuoksen samentumisastetta, vaan kalvon pinnalta voidaan suoraan arvioida mikrobien kasvu ja luokitella se.

Kyseessä olevaa keksintöä valaistaan lähemmin seuraavissa esimerkeissä .

Esimerkki 1 Kalvojen valmistus

Sopivien kalvojen valmistukseen voidaan käyttää mitä erilaisempia muovidispersioita ja avaaja-aineita. Nämä kummatkin sekoitetaan yhdessä apuaineiden kanssa kalvon raakamassaksi. Avaaja-aineet ovat veteenliukenevia, suhteelisen vähän paisuvia, suurimolekyy-lisiä aineita.

Seuraavassa osoitetaan, kuinka monia kombinaatiomahdollisuuksia on raaka-aineiden suhteen valmistettaessa sopivia kalvoja.

Avaaja-aineet liuotetaan sekoittaen veteen, tähän lisätään muovi-dispersio seuraavissa taulukoissa ilmoitettuina määrinä. Seos 63059 10 hämmennetään homogeeniseksi. Sen jälkeen lisätään 1 g kostutus-ainetta. Kostutusaineen valinta tapahtuu mikrobien mukaan, jotka halutaan osoittaa, esimerkiksi natriumdodekyylisulfaattia gram-negatiivisen flooran estoon, polyoksietyleenisorbitaanioleaattia laktobasillien osoitukseen ja mikrobien liiallisen kasvun estoon, natriumheptadekyylisulfaattia grampositiivisen flooran estoon ja kolimuotoisten mikrobien rikastamiseen tarkoitettuihin alustoihin N-setyyli-N,N,N-trimetyyliammoniumbromidia Pseudomonaksen selektiiviseen viljelyyn. Tämän lisäksi lisätään vielä 1 ml puskuroitua keittosuolaliuosta (kokoomus: 92 g Ν32ΗΡ0^·21^0, 21,1 g KHjPO^, 7,65 g NaCl 1000 ml:ssa H20) ja sen jälkeen säädetään 0,1-n natron-lipeällä pH-arvoon 6,9-7,5.

Taulukko, josta käy esiin dispersio-, avaaja-aine- ja vesimäärät Dispersio:

Akryylihappoestereiden homopolymeerejä 60 g 50 g 50 g

Avaaja-aine:

Hydroksipropyylimetyyliselluloosa 4 g

Etyleeniglykolin ja etyleenioksidin kopolymeerejä 18 g

Polyvinyylipyrrolidoni 24 g

Vesi 30 ml 26 ml 31 ml

Dispersio:

Vinyyliasetaatin ja vinyylipropionaatin kopolymeerejä 62g 54g 45g 50g 90g 50g 90g 50g 48g 48g

Avaaja-aine:

Polyetyleenioksidi 9g 4g 4g

Polyvinyylipyrrolidoni 16g 14g

Etyleenioksidin ja etyleeniglykolin kopolymeerejä 22g

Vinyyliasetaatin ja vinyylipyrrolidonin kopolymeerejä llg 5g

Polyvinyylialkoholi 5g 5g

Osittain saippuoitunut polyvinyyliasetaatti 5g 5g

Vesi 22ml 36ml 32ml 33ml 13ml 13ml 50ml 50ml 33ml 27ml · r .

11 63059

Dispersio:

Butadieenin ja styrolin kopolymeerejä 52g 74g 62g 62g

Avaaja-aine:

Polyvinyylipyrrolidoni 16g 16g

Etyleeniglykolin ja etyleeni- oksidin kopolymeerejä 16g

Vinyyliasetaatin ja vinyyli- pyrrolidonin kopolymeerejä 16g

Vesi 22ml 22ml 22ml 47ml

Dispersio:

Vinyyliasetaatin homopolymeerejä 62g 62g

Avaaja-aine:

Polyvinyylipyrrolidoni 20g

Vinyyliasetaatin ja vinyyli- pyrrolidonin kopolymeerejä 16g

Vesi 26ml 47ml

Dispersio:

Akryylinitriilin, akryylihappo-esterin ja vinyylipropionaatin kopolymeerejä 78g 92g 78g

Avaaja-aine;

Polyvinyylipyrrolidoni 16g 16g

Etyleeniglykolin ja etyleeni- oksidin kopolymeerejä 16g

Vesi 22ml 22ml 23ml

Dispersio:

Maleiinihappoesterin ja vinyyliasetaatin kopolymeerejä 58g 60g 60g

Avaaja-aine:

Polyvinyylipyrrolidoni 13g

Polyetyleenioksidi 16g

Vinyyliasetaatin ja vinyyli- pyrrolidonin kopolymeerejä 16g

Vesi 18ml 62ml 47ml

Dispersio:

Vinyylikloridin homopolymeerejä 62g 63059 12

Avaaja-aine;

Polyetyleenioksidi 16g

Vesi 62ml

Dispersio:

Vinyylikloridin ja vinyyli-propionaatin kopolymeerejä 52g

Avaaja-aine:

Polyvinyylipyrrolidoni 15,7g

Vesi 22ml

Kalvon raakamassa levitetään ennestään tunnetulla tavalla inertin alustan päälle kerroksen paksuuden ollessa 300 ,um ja kuivataan 50-70 C:ssa. Kuivattu kalvo leikataan haluttuun kokoon ja käsitellään edelleen.

Esimerkki 2

Testiliuskan valmistus mikrobien lukumäärän määräämiseksi virt- sasta ja mikrobien karkeaa erotusta varten_ 62 g dispersiota, joka on vinyyliasetaatin ja vinyylipropionaatin kopolymeraattia, sekoitetaan liuoksen kanssa, jossa on 16 g poly-vinyylipyrrolidonia 22 ml:ssa vettä. Sen jälkeen lisätään kuten esimerkissä 1 on selostettu, 1 ml puskuroitua fysiologista keitto-suolaliuosta ja 1 ml polyoksietyleenisorbitaanimono-oleaattia sekoittaen ja säädetään pH natronlipeän avulla arvoon 7,3.

Polyetyleenifolion päälle pannaan nailonverkko, jonka paksuus on 50 ,um, sen päälle levitetään kalvomassa kerrokseksi, jonka pak-

* O

suus on 350 ^,um. Kuivataan 60 C:ssa ja vedetään näin tuettu kalvo folion päältä pois ja leikataan se 6 cm levyisiksi nauhoiksi.

200 ^um:n paksuisen kalvon päälle, jonka suuruus on 2 x 12 cm, pannaan vierekkäin kaksi elatusainekartonkia, joiden koko on 2 x 2 cm ja joissa on Ca-SO elatusainetta ja Mac-Conkey elatus-ainetta. Molempien elatusainekertonkien päälle pannaan kalvo ja kiinnitetään se liimalla folioon. (Ks. kuvioita 1 ja 2). Juuri selostetun menetelmän mukaan valmistetaan toinen testiliuska, johon pannaan viljelyväliaineiksi elatusainekartongit, joissa on Pseudomonas-selektiivistä ja enterokokki-selektiivistä viljely-väliainetta. Molemmat testiliuskat yhdistetään liimaamalla yh- 63059 13 deksi testiliuskaksi. (Ks. kuvioita 1 ja 2). Testiliuskan suojaamiseksi kontaminaatiolta ja kosteudelta se sinetöidään kiinni yksitellen polyetyleeni-liimapaperilla ja steriloidaan tavanmukaisen menetelmän avulla (kuvio 2). Kun suoritetaan mikrobien analyysi virtsasta, otetaan testiliuska pakkauksesta, kastetaan se tuoreeseen keskivirtsaan ja inkuboidaan inkuboimisastiassa 12-24 h ajan 37°C:ssa. Virtsan patogeeniset mikrobit osoittavat tällaisten testiliuskojen päällä samanlaista kasvukäyttäytymistä kuin vastaavien klassisten agarviljelysalustojen päällä.

Kuviossa 1, joka esittää keksinnön mukaista testiliuskaa, jossa on kaksi testialuetta, merkitsee 1 elatusainekartonkia, 2 sen päällä olevaa kalvoa ja 3 foliota, josta pidetään kiinni ja joka toimii alustana.

Kuvio 2 esittää sivukuvaa yksitellen kiinnisinetöidystä keksinnön mukaisesta testiliuskasta, jossa on 2 testialuetta sekä etu- että takapuolella. Kuten kuviossa 1, on elatusainekartonki merkitty l:llä, 2 tarkoittaa kalvoa ja 3 foliota, johon tartutaan, 4 tarkoittaa pakkausta, johon liuskat on sinetöity tiiviisti.

Esimerkki 3

Mikrobien lukumäärän määrittäminen ja eri lajien erottaminen Kalvot, jotka on valmistettu esimerkin 1 mukaan, leikataan neliöiksi, joiden sivun pituus on 5 cm.

Petrimaljaan pannaan samankokoisia elatusainekartonkeja ja kostutetaan ne steriilillä vedellä. Viljelyaineina voidaan käyttää kaikkia mikrobiologiassa tunnettuja ravintoaine- tai ravintoaine-estoaineseoksia.

Mikrobien lukumäärää määrättäessä otetaan parhaiten yleisviljely-ainetta, kuten esimerkiksi: Ca-SO-elatusaine. Mikrobien tunnistamiseen otetaan elektiivistä tai selektiivistä viljelyainetta kuten esimerkiksi Mac-Concey-elatusainetta grampositiivisen flooran voimakkaaseen estoon. Slanezin ja Bartleyn enterokokki-selektiivinen elatusalusta, Pseudomonas-elektiivinen elatus-alusta, Salmonellojen selektiivinen elatusalusta Wilsonin ja Blairin mukaan.

63059 14

Kostutetuille elatusainekartongeille pannaan kalvot, joiden kostutusaineet on valittu siten, että ne vastaavat vastaavia elatusalustoja ja lastan avulla jaetaan tarkoin pipetoitu määrä mikrobisuspensiota.

12-48 h inkuboimisajan jälkeen lämpötilassa 30-37°C voidaan laskemalla pesäkkeet määrätä mikrobien lukumäärä ja identifioida mikrobien kasvukäyttäytymisestä eri elatusalustoissa niiden laji.

Esimerkki 4

Virtsainfektioiden diagnoosi

Virtsatieinfektion diagnoosiin käytetään esimerkin 1 mukaista testiliuskaa. Kalvon kostutusaine valitaan kuten esimerkissä 3 elatusalustan mukaan. Leikataan elatusainekartonkeja, joiden suuruudeksi tulee 2,5 x 2,5 cm, pannaan ne 2,5 x 10 suuruisen folion päälle ja sinetöidään kalvo kuumasinetöintivalssin kanssa siten, että se on tiiviisti elatusainekartongin päällä. On tarkoituksenmukaista ottaa yksi elatusainekartonki, jossa on CLED-viljelyainetta ja toinen, jossa on Mac-Concey-viljelyainetta ja sen jälkeen pannaan ne vierekkäin. Jos tällainen testiliuska kastetaan tuoreeseen keskivirtsaan ja inkuboidaan se, niin saadaan kaikkien virtsan patogeenisten mikrobien suhteen, joita ovat ennen kaikkea seuraavat: kolibakteerit, enterokokit, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus morganii, Proteus rettgeri, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Klebsiella, Aerobacter aerogenes, Staph, aureus, Citrobacter, sama tulos kuin jos käytettäisiin klassista agarviljelyä. Selostetun testisysteemin suuri etu agariin nähden on se, että testiliuskat on pakattu steriilisti, ne säilyvät vuosia ja tarvitsevat vain murto-osan agarin varastotilasta ja myös niiden hävittäminen polttamalla on vähemmän monimutkaista.

Esimerkki 5

Antibiogrammojen valmistaminen

Esimerkin 4 mukaan viljeltyjen mikrobien resistenssikäyttäyty-misen tutkimisessa menetellään seuraavalla tavalla:

Ympätään tavallisella tavalla pesäkkeitä silmukan avulla, sus-pendoidaan ne steriiliin keittosuolaliuokseen ja otetaan siitä 15 63059 0,1 ml jatkokäsittelyä varten. Tätä varten kostutetaan pyöreä elatusainekartonki, jossa on esimerkiksi Miiller-Hinton-elatus-ainetta, steriilin veden avulla, peitetään se saman kokoisella kalvolla, mikrobien suspensio jaetaan sen päälle lastan avulla ja pannaan päälle antibiootti-testilevyjä DIN 58 940. Testile-vyjen painaminen ei ole, päin vastoin kuin agaria käytettäessä, tarpeen, koska nämä kiinnittyvät itsestään testiliuskan kosteaan pintaan. Inkuboinnin jälkeen todettiin kaikilla virtsan patogeenisillä mikrobeilla, kaikilla lisätyillä antibiooteilla inkuboi-taessa, tavanomaisilla agar-viljelyalustoilla suoritetun inkuboinnin kanssa identtistä resistenssikäyttäytymistä.

Esimerkki 6

Minimi-estokonsentraation määrääminen 62 g vinyyliasetaatin ja vinyylipropionaatin kopolymeraatin dispersiota, 16 g polyvinyylipyrrolidonia 22 ml:an vettä liuotettuna, 1 ml esimerkissä 1 selostettua fosfaattipuskuria ja 1 g poly-etyleenisorbitaani-mono-oleaattia sekoitetaan homogeeniseksi ja pH-arvo säädetään natronlipeällä arvoon 7,3. Tähän kalvon raaka-massaan sekoitetaan DIN 58 940 mukaiset antibiootit nousevina määrinä, nimittäin 2,0 ^,ug, 20 yUg, 200 ^ug, 2,0 mg ja 20 mg/100 g.

Näin valmistetut raakamassat sivellään 350 ^um paksuiseksi kerrokseksi kuten esimerkissä 2 on selostettu nailonverkon päälle, jonka paksuus on noin 60 ^,um ja lankojen paksuus 40 ^um, ja tämän jälkeen kuivataan 50°C:ssa. Näin saaduista "antibioottikalvoista” valmistetaan testiliuskoja. Jäykän folion päälle pannaan 2,5 x 2,5 cm suuruisia elatusainekartonkeja, joissa on Ca-SO-viljely-ainetta. Elatusainekartonkien päälle sinetöidään kiinni "anti-bioottikalvot". Voidaan valmistaa joko jokaiselle antibiootille ja jokaiselle konsentraatiolle eri testiliuska tai panna yhden testiliuskan päälle kalvoja, joissa on samaa antibioottia eri konsentraatioissa.

Jos testil*iuskoja kastetaan esimerkiksi mikrobeja sisältävään φ virtsaan tai tuodaan mikrobisuspensioita testialueille ja inku-boidaan ne tavalliseen tapaan, voidaan ilman vaikeuksia määrätä minimi-estokonsentraatio ja arvioida tämän perusteella mikrobien resistenssi ja valita oikea terapeuttinen toimenpide.

16 63059 Tämän kanssa rinnakkain suoritetut minimi-estokonsentraation määritykset kliinisen menetelmän mukaan ravintoliuosten avulla, jota seurasi nefelometrinen analysointi, osoittivat että keksinnön mukaisen ja klassisen menetelmän tuloksista voidaan tehdä samat terapeuttiset johtopäätökset.

Esimerkki 7

Minimi-estokonsentraation määritys antibiooteilla, jotka ovat jollakin muulla pH-alueella stabiilimpia kuin mikrobien optimaa- lisen kasvun pH-alueella_ a) Toinen dispersiosta tehty kalvo

On tunnettua, että esimerkiksi kefatsoliini on pH-alueella 5,2-5,6 kauemman aikaa stabiili kuin pH-alueella 7,0-7,5, joka on virtsan patogeenisten mikrobien optimaalinen pH-alue. Tässä tapauksessa valmistetaan kaksikerros-kalvoja. Tällöin menetellään seuraavalla tavalla:

Esimerkin 2 mukaiselle antibioottivapaalle kalvolle pannaan 35 ^um:n paksuudelta esimerkin 6 mukaisesti kerros kalvon raaka-massaa, jonka pH on natronlipeällä säädetty arvoon 5,2-5,6 ja johon on lisätty nousevia määriä kefatsoliinia. Tällöin sekoitetaan seuraavia määriä antibioottia 100 g:a kohti kalvon raaka-massaa: 20 yug, 200 ^ug, 2,0 mg, 20 mg ja 200 mg.

Jatkotoimenpiteet, kuivaaminen, testiliuskan valmistus, samoin kuin virtsoissa ja mikrobisuspensioissa olevien mikrobien resis-tenssikäyttäytymisen testaus suoritetaan kuten esimerkissä 6 on selostettu.

Rinnakkain suoritetut klassisen menetelmän mukaiset minimi-estokonsentraation määritykset antoivat samat tulokset kuin on selostettu esimerkissä 6.

Näin valmistetuissa "kaksikerros-kalvoissa" on vielä 12 kk:n kuluttua jäljellä enemmän kuin 95 % niiden sisältämän kefatsoliinin aktiivisuudesta, kun taas kalvossa, jossa kefatsoliinia on pH-arvoon 7,0 asti, on aktiivisuus laskenut alle 50 %:n.

63059 17 b) Toinen kalvo kalvonmuodostaja-aineista, jotka eivät ole dispersioita_

Toinen, antibiootteja sisältävä kalvo voi olla muodostettu dispersioiden asemesta ainoastaan kalvonmuodostaja-aineesta, joka vapauttaa antibiootin inkubointivaiheen aikana.

20 g etyleenioksidin homopolymeeriä liuotetaan 100 mitan vettä, sen lisäksi lisätään 1 g polyoksietyleenisorbitaanioleaattia, liuoksen pH-arvo säädetään vaadittuun pH-arvoon 5,2-5,6 suolahapon avulla ja kohdassa a) ilmoitetut määrät kefatsoliinia lisätään joukkoon ja sekoitetaan homogeeniseksi.

Lopputyöskentely ja sellaisten testilaitteiden kanssa saadut tulokset ovat samat kuin on selostettu kohdassa a).

Esimerkki 8

Testiliuskat, joissa kalvo sisältää makromolekyylisten avaaja- aineiden lisäksi myös ravintoaineita_ 62 g vinyyliasetaatin ja vinyylipropionaatin kopolymeraatin dispersiota sekoitetaan 37 g:n kanssa liuosta, joka sisältää 37 g polyvinyylipyrrolidonia, 13,0 g sek.natriumfosfaattia, 2,3 g prim.kaliumfosfaattia 500 ml:an vettä liuotettuna ja lisäksi 2,0 g laktoosia ja 1,0 g polyoksietyleenisorbitaani-mono-oleaattia.

Kalvon raakamassasta valmistetaan kalvoja, kuten esimerkissä 2 on selostettu, ja valmistetaan testiliuskoja liittämällä yhteen elatusainekartongin kanssa, joka on kastettu yleisviljelyväliai-neeseen.

Virtsan patogeeniset mikrobit esiintyvät sellaisissa testiliuskoissa osittain selvemmin muodostuneina pesäkkeinä kuin klassisissa agar-viljelyalustoissa.

Esimerkki 9

Testiliuskat, joissa kalvoon lisätään vain ravintoaineita avaaja-aineiksi_

Valmistetaan seuraavan kokoomuksen omaavaa kalvon raakamassaa.

100 g:an vinyyliasetaatin ja vinyylipropionaatin kopolymeraatin dispersiota lisätään sekoittaen 10 ml 0,7 mol fosforipuskuria, johon on liuotettu 1,5 g glukoosia ja 1,5 g laktoosia. Sen jälkeen

Claims (3)

63059 18 sekoitetaan joukkoon 1,0 g polyoksietyleenisorbitaani-mono-oleaattia ja kalvon raakamassan pH säädetään natronlipeän avulla arvoon 7,3. Tällä kalvon raakamassalla valmistetaan testiliuskoja esimerkissä 8 selostetulla tavalla. Virtsan patogeenisistä mikrobeista kasvaa näillä testiliuskoilla Pseudomonas aeruginosa selvästi paremmin kuin useimmat muut, joten tämän testin avulla voidaan suorittaa tämän mikrobin koetutkimus.

1. För användning vid mikrobiologiska tester avsedd anordning, som innefattar en näringsmedelkartong och ett för bakterier ogenom-trängligt, men för näringsmedel genomträngligt täckskikt, k ä n-netecknad av att täckskiktet utgörs av en med ett vatten-lösligt eller i vatten svällande öppningsmedel modifierad vatten-olöslig plastfilm, som är framställd ur en vattendispersion av plasten, varvid öppningsmedlet och plastfilmen har sädana egen-skaper, att de icke inverkar negativt pä mikrobernas tillväxt.

1. Mikrobiologisissa testeissä käytettävä laite, joka käsittää elatusainekartongin ja bakteereita läpäisemättömän, mutta ravintoaineita läpi päästävän peitekerroksen, tunnettu siitä, että peitekerros muodostuu veteen liukenevalla tai vedessä paisuvalla avaaja-aineella modifioidusta, veteen liukenemattomasta muovikalvosta, joka on valmistettu muovin vesidispersiosta avaaja-aineen ja muovikalvon ollessa ominaisuuksiltaan sellaisia, että ne eivät vaikuta negatiivisesti mikrobien kasvuun.

2. Anordning enligt patentkravet 1, kännetecknad av att som öppningsmedel används polyetylenglykoler, polyetylen-oxider, polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkoholer, delvis för-tvälade polyvinylestrar, sampolymerisat av vinylpyrrolidon och vinylestrar eller cellulosaderivat, säsom hydroxialkylcellulosa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että avaaja-aineena käytetään polyetyleeniglykoleja, poly-etyleenioksideja, polyvinyylipyrrolidonia, polyvinyylialkoholeja, osittain saippuoituneita polyvinyyliestereitä, vinyylipyrrolidonin ja vinyyliestereiden sekapolymeraatteja tai selluloosajohdannai-sia, kuten hydroksialkyyliselluloosaa.

3. Patenttivaatimusten 1-2 mukainen laite, tunnettu siitä, että käytetään muovikalvoa, joka on vinyyliasetaatin tai akryylihappoestereiden homopolymeeri, vinyylipropionaatin ja vinyyliasetaatin, vinyylipropionaatin ja vinyylikloridin, vinyyliasetaatin ja maleiinihappoestereiden, akryylinitriilin, akryylihappoestereiden ja vinyylipropionaatin tai butadieenin ja styreenin kopolymeeri, ja kalvon paksuus on edullisesti 10-1000 ^um.

4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen laite, tunnettu siitä, että avaaja-ainetta ja muovia on painosuhteessa 5:1 - 1:50.

5. Patenttivaatimusten 1-4 mukainen laite, tunnettu siitä, että kalvo sisältää tukielimenä muoviverkon, jonka paksuus on eduliiisesti 30-200 yUm. 19 6305 9

6. Patenttivaatimusten 1-5 mukainen laite, tunnettu siitä, että peitekerros sisältää lisäksi kostutusaineita, puskureita, suoloja tai ravintoaineita.

7. Patenttivaatimusten 1-6 mukainen laite, tunnettu siitä, että peitekerros sisältää joidenkin mikro-organismien kasvua estäviä ja/tai edistäviä aineita.

8. Patenttivaatimusten 1-7 mukainen laite, tunnettu siitä, että elatusainekartonki sisältää lisäksi kostutusaineita, kosteuden säilymistä edistäviä aineita, paisumista edistäviä aineita, puskureita, suoloja tai antibiootteja.

9. Patenttivaatimusten 1-8 mukaisen laitteen käyttö mikrobien lukumäärän määrittämiseen ja niiden erottamiseen, tunnettu siitä, että laite kastetaan tutkittavaan liuokseen, pyyhkäistään nesteen ylimäärä pois, inkuboidaan sen jälkeen tavalliseen tapaan ja lasketaan muodostuneet bakteeripesäkkeet, tai tunnistetaan lajit mikrobien erilaisen kasvukäyttäytymisen mukaan erilaisilla elatusalustoilla.

3. Anordning enligt patentkraven 1-2, kännetecknad av att en plastfilm används, som bestär av en homopolymer av vinylacetat eller akrylsyraestrar, en kopolymer av vinylpropionat och vinylacetat, vinylpropionat och vinylklorid, vinylacetat och maleinsyraestrar, akrylnitril, akrylsyraestrar och vinylpropionat