JP2019058088A - レジオネラ属菌の検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】レジオネラ属菌の回収率が高く、検査者の熟練度が塗抹培養法ほど要求されない、検水をろ過したメンブレンフィルターを培地に直接貼付する工程を有するレジオネラ属菌の検査方法において、メンブレンフィルター上でレジオネラ属菌がコロニーを形成しやすく、また、夾雑微生物による検出不能の割合を抑制することが可能なレジオネラ属菌の検査方法を提供する。【解決手段】検水をメンブレンフィルターでろ過する工程、前記メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、と接触させた粉末活性炭を重層する工程、前記メンブレンフィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付する工程、および、前記レジオネラ属菌用の選択培地を培養する工程、を有するレジオネラ属菌の検査方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、レジオネラ属菌の検査方法に関する。

レジオネラ属菌はグラム陰性桿菌であり、レジオネラ症の原因微生物である。レジオネラ属菌は土壌中などに広く生息しており、水利用設備の水に入り込み、大量に増殖してレジオネラ症の感染源となるために大きな杜会問題となっている。したがって、レジオネラ症を防止するためには水利用設備の適切な衛生管理が必要である。たとえば浴場設備の浴槽水では旧厚生省による「公衆浴場における水質基準等に関する指針」において、レジオネラ属菌は不検出（１０ＣＦＵ／１００ｍＬ（ミリリットル）未満）であることと定められており、このような厳密な衛生管理のために行うレジオネラ属菌の検査には高い精度が求められる。

一般にレジオネラ属菌の検査方法には遠心分離またはメンブレンフィルターろ過により検水（試料水）を１００倍に濃縮し、その濃縮液を酸処理または熱処理後に、レジオネラ属菌の選択培地に塗抹して培養することでレジオネラ属菌を検出する塗抹培養法、もしくは酸処理または熱処理した検水をメンブレンフィルターでろ過し、そのメンブレンフィルターを選択培地に貼付して培養するフィルター貼付法がある（非特許文献１）。

塗抹培養法では濃縮操作時および塗抹操作時のレジオネラ属菌の回収率が低いことが知られている。検査の精度向上のためにはこれらの工程で回収率を上げることが求められ、検査者の熟練度が検査結果に影響しやすい。また、１００倍濃縮液０．１ｍＬを培地に接種するので、検出下限は１０ＣＦＵ／１００ｍＬとなるが、これ以上の高感度でレジオネラ属菌を検出するためには複数枚の培地に接種するなどの作業が必要となり、検査効率が低下する。

一方、フィルター貼付法は検水をメンブレンフィルターでろ過して選択培地に直接貼り付けるため、検査者の熟練度は塗抹培養法ほどは要求されず、高い回収率の検査を行うことができる。また、ろ過する検水の量を調整することで感度調整が自在である。しかし、メンブレンフィルター上にレジオネラ属菌以外の夾雑微生物が発育しやすく、それらのコロニーによりレジオネラ属菌の検出ができなくなる場合（検出不能）があり、この場合には再検査を行うなどの対応が必要となる。また、レジオネラ属菌はメンブレンフィルター上にコロニーを形成しにくく、このため、不検出となる場合がある。

中原俊隆編、「レジオネラ症防止指針」、第４版、公益財団法人日本建築衛生管理教育センター、平成２９年７月、ｐ.３２〜３８，ｐ１２６，ｐ１２７

本発明は、レジオネラ属菌の回収率が高く、検査者の熟練度が塗抹培養法ほどは要求されない、検水をろ過したメンブレンフィルターを培地に直接貼付する工程を有するレジオネラ属菌の検査方法において、メンブレンフィルター上でレジオネラ属菌がコロニーを形成しやすく、また、夾雑微生物による検出不能の割合を抑制することが可能なレジオネラ属菌の検査方法を提供することを目的とする。

本発明のレジオネラ属菌の検査方法は上記課題を解決するため、検水をメンブレンフィルターでろ過する工程、前記メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、と接触させた粉末活性炭を重層する工程、前記メンブレンフィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付する工程、および、前記レジオネラ属菌用の選択培地を培養する工程、を有することを特徴とする。

前記レジオネラ属菌の発育に必要な成分が、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、および、α−ケトグルタル酸から選択される少なくとも１つを含むものとすることができる。

前記レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分を、グリシン、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、アムホテリシンＢ、ナタマイシンから選択される少なくとも１つを含むものとすることができる。

前記レジオネラ属菌用の選択培地としては、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、を含む寒天平板培地を用いることができる。

本発明のレジオネラ属菌の検査方法は、検水をメンブレンフィルターでろ過する工程、メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、と接触させた粉末活性炭を重層する工程、メンブレンフィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付する工程、および、レジオネラ属菌用の選択培地を培養する工程、を有する構成により、メンブレンフィルター上でレジオネラ属菌がコロニーを形成しやすく、また、夾雑微生物による検出不能の割合を抑制することができるので、レジオネラ属菌の検査精度の向上が可能となる。

以下に本発明のレジオネラ属菌の検査方法について説明する。
＜検水＞
本発明のレジオネラ属菌の検査方法において、検査対象となる検水は特に限定されないが、検査方法のベースとなるフィルター貼付法自体に、メンブレンフィルター上にレジオネラ属菌以外の夾雑微生物が発育しやすいと云う性質があるため、たとえば給湯・給水系等の比較的微生物汚染度の低い検水であることが好ましい。

＜レジオネラ属菌の発育に必要な成分＞
レジオネラ属菌の発育に必要な成分としては、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、および、α−ケトグルタル酸が挙げられ、本発明では、これらから選択される少なくとも１つをレジオネラ属菌の発育に必要な成分として用いる。なお、必要に応じてｐＨ緩衝成分やその他の栄養素等を併用してもよい。

＜レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分＞
レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分としては、グリシン、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、アムホテリシンＢ、ナタマイシン等が知られており、本発明では、これらから選択される少なくとも１つをレジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分として用いることができる。なお、必要に応じて他の抗菌剤、抗真菌剤、抗生物質等を併用してもよい。

＜選択培地＞
本発明で用いるレジオネラ属菌用の選択培地としては、レジオネラ属菌の発育に必要な成分のうち、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、の３成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分の少なくとも１つを必須成分として含有する選択培地を用いる。さらに、必要に応じて、レジオネラ属菌の発育阻害物質を吸着・除去する成分、たとえば粉末活性炭や、ｐＨ緩衝成分、その他の栄養素等を含んでいてもよい。

なお、入手が容易な選択培地の例としてはＧＶＰＣ寒天培地、ＷＹＯα寒天培地、ＣＡＴα寒天培地、ＭＷＹ寒天培地、ＣＣＶＣ寒天培地、ＰＡＣ寒天培地、ＰＡＶ寒天培地、ＧＶＰＮ寒天培地などが挙げられるが、本発明ではこれらに限定されず、これら培地の各成分の配合量を調整した培地であってもよく、および／または、本発明の効果を妨げない範囲で他の成分を添加した培地であってもよい。また、選択培地として必ずしも寒天培地である必要はなく、液体培地をたとえば脱脂綿やガーゼ等に含ませて用いてもよい。

＜検水の前処理、および、検水のろ過＞
検水の前処理は、たとえば、以下の方法で行う。即ち、２０〜１００ｍＬの検水に対して等量の酸性緩衝液、たとえば塩酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ２．２）や酸性リン酸緩衝液（ｐＨ２．２、たとえば、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液と０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム水溶液とを適宜混合して調製）を同量混合した後、１０〜２０分間室温下に置く。

その後、滅菌したニトロセルロース、ミックスドセルロースエステル、ポリカーボネート、ポリ四フッ化エチレン、あるいは、ポリフッ化ビニリデン等により構成された、孔径が０．４５μｍや０．２μｍなどのメンブレンフィルターで吸引ろ過する。ろ過後、滅菌脱イオン水でろ過ファネル内を洗浄し、再度吸引ろ過する。後述するように、判定はメンブレンフィルター上に粉末活性炭が重層された状態で行われるので、メンブレンフィルターの色には特に制限がない。なお、本発明におけるメンブレンフィルターのろ過面とは、ろ過時の検水の流れ方向上流の面を云う。

上記では検水と同量の酸性緩衝液を混合して前処理を行ったが、この操作は、検水のｐＨを２．２付近まで低下させて、レジオネラ属菌以外の微生物を殺菌することを目的とするものであり、検水のｐＨを２．２付近まで低下させることができれば、混合する酸性緩衝液は必ずしも同量である必要はない。また、先に検水のみをメンブレンフィルターで吸引ろ過し、次いで滅菌脱イオン水によりろ過ファネル内を洗浄したのち、ろ過ファネルに酸性緩衝液を注いで１０〜２０分、室温で放置した後に吸引ろ過を行ってもよく、この場合には酸性緩衝液の使用量を削減することができる。

＜各成分と接触させた粉末活性炭の調製方法＞
レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、接触させた粉末活性炭は、たとえばレジオネラ属菌用の選択培地の調整方法と同様の方法で調製することができる。

具体的には、まず、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分のうちで、高圧蒸気滅菌が可能な成分と、粉末活性炭と、を水に懸濁、溶解した混合液を調製する。この混合液をたとえば１２１℃、２０分間の条件で滅菌した後、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分のうちで、加熱により分解や析出を起こす成分を少量の水に溶解し、フィルター滅菌して添加する。

このようにして調製された混合液中の粉末活性炭は、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、と接触させた状態になっている。

混合液中のレジオネラ属菌の発育に必要な成分、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、および、粉末活性炭の配合比率は特に限定されず、フィルター貼付法による培養の結果、レジオネラ属菌がコロニーを形成しやすく、また、夾雑微生物による検出不能の割合を抑制するために有効な比率をあらかじめ検討して決定するが、たとえば、レジオネラ属菌の選択培地中の各成分の配合比率と同一とすることができる。

レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、と接触させた粉末活性炭の別の調製方法としては、各成分を含有する液体を調製しておき、粉末活性炭を充填したカラムに、上記液体を通液する方法、フィルター貼付法で検査に用いるメンブレンフィルターに、予め粉末活性炭を重層しておき、そのメンブレンフィルターで上記液体をろ過する方法等を取ることができるが、本願発明はこれらに限定されず、要は、粉末活性炭をレジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、と接触させることができれば、いかなる方法も採用することができる。

＜各成分と接触させた粉末活性炭の重層と選択培地への貼付＞
レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、接触させた粉末活性炭の重層方法としては、たとえばろ過による重層、塗布による重層などが挙げられる。以下、ろ過および塗布による重層について具体的に説明する。

（ａ）各成分と接触させた粉末活性炭のろ過による重層
まず、ろ過により各成分と接触した粉末活性炭を重層する方法について説明する。この方法では、レジオネラ属菌の発育に必要な成分とレジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と粉末活性炭とを含む混合液を、検水をろ過したメンブレンフィルターで吸引ろ過することで、これら各成分と接触させた粉末活性炭をメンブレンフィルターのろ過面に捕捉させたのち、ろ過面とは反対の面を選択培地に貼付する。ろ過する混合液の量はあらかじめ検討して決定するが、メンブレンフィルターのろ過面全体を粉末活性炭が覆う程度とすることが好ましい。なお、この重層方法は次に説明する、塗布による粉末活性炭の重層方法よりもより容易にかつ均一に粉末活性炭を重層することができるので好ましい。

（ｂ）各成分と接触させた粉末活性炭の塗布による重層
塗布による重層方法では、各成分と接触した粉末活性炭を検水のろ過面に塗布し、乾燥する。塗布は検水をろ過したメンブレンフィルターの培地への貼付前に行ってもよく、あるいは、貼付後に行ってもよい。

なお、検水をメンブレンフィルターでろ過する工程と、メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、と接触させた粉末活性炭を重層する工程と、の順番は特に限定されず、検水をろ過した後に粉末活性炭を重層しても、粉末活性炭を重層したメンブレンフィルターで検水をろ過しても、何れであっても構わない。

＜培養、および、判定＞
検水をろ過したろ過面に、各成分と接触させた粉末活性炭を重層したメンブレンフィルターが貼付された選択培地を、ろ過面（各成分と接触させた粉末活性炭層側）が下となるようにシャーレを裏返しした状態で３６±１℃で５〜１０日間程度培養する。培養終了後、従来のフィルター貼付法と同様にして判定を行う。具体的にはメンブレンフィルター上に発育したレジオネラ属菌が疑われる淡黄灰色湿潤コロニーを数える。これらコロニーに対してＬ−システイン要求性確認試験を実施し、Ｌ−システイン要求性のあるコロニーをレジオネラ属菌とする。

以上、本発明について、好ましい実施形態を挙げて説明したが、本発明のレジオネラ属菌の検査方法は、上記実施形態の構成に限定されるものではない。

当業者は、従来公知の知見に従い、本発明のレジオネラ属菌の検査方法を適宜改変することができる。このような改変によってもなお、本発明のレジオネラ属菌の検査方法の構成を具備する限り、もちろん、本発明の範疇に含まれるものである。

以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明のレジオネラ属菌の検査方法は、この実施例に限定されない。

＜実施例：本発明のレジオネラ属菌の検査方法による検討＞
各地の浴槽水２６試料を検水とした。それぞれの検水２０ｍＬに酸性リン酸緩衝液（ｐＨ２．２）を等量加えて、室温で１０分間酸処理した後に、ミックスドセルロースエステル製（アドバンテック社製）、直径４７ｍｍ、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、５０ｍＬの滅菌脱イオン水でろ過ファネル内を洗浄したのち、吸引ろ過してメンブレンフィルターに残存する酸性緩衝液成分を除去した。

次に、配合量を表１に示すレジオネラ属菌の発育に必要な成分とレジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と粉末活性炭とを含む混合液５ｍＬを各メンブレンフィルターでろ過した。この操作により、各メンブレンフィルター上にはレジオネラ属菌の発育に必要な成分およびレジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と接触した粉末活性炭が重層された状態となった。

各メンブレンフィルターを、ろ過面を上にしてセーフティーキャビネット内の滅菌したろ紙上に置いて余分な水分を除去したのち、レジオネラ属菌用の選択培地であるＧＶＰＣ寒天培地（直径９０ｍｍ）にろ過面を上にして貼付した。貼付後、ろ過面が下側となるようにシャーレを裏返しした状態で、３７℃のインキュベーター内で８日間培養し、出現した細菌コロニーのうちレジオネラ属菌が疑われるコロニーに対してＬ−システイン要求性確認試験を実施して、Ｌ−システイン要求性のあるコロニーをレジオネラ属菌とした。なお、この手法の検出下限は５ＣＦＵ／１００ｍＬである。

＜比較例１：従来のフィルター貼付法による検討＞
上記の２６の検水について、酸性緩衝液成分の除去後にレジオネラ属菌の発育に必要な成分とレジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と粉末活性炭とを含む混合液のろ過を行わないこと以外は上記実施例と同様にして培養後、判定を行った。

＜比較例２：塗抹培養法による検討＞
上記の２６の検水について塗抹培養法による検討を行った。各検水４００ｍＬを遠心沈殿（６４００×ｇ、３０分間）して上清を除去した後、４ｍＬの滅菌脱イオン水で再懸濁して１００倍濃縮液を調製した。調製したそれぞれの濃縮液０．５ｍＬに酸性リン酸緩衝液（ｐＨ２．２）を等量加えて、室温で１０分間酸処理した後に、ｎ数を２とするために、２枚のＧＶＰＣ寒天培地（培地Ａおよび培地Ｂ）にそれぞれ０．２ｍＬずつ、酸処理を行った濃縮液を塗抹した。その後、実施例と同様に培養したのち、判定を行った。なお、この手法の検出下限は５ＣＦＵ／１００ｍＬである。

＜検討結果＞
実施例、比較例１および比較例２でのレジオネラ属菌の検査結果を表２に示す。
なお、表２中、「Ｒ」はレジオネラ属菌の検出数、「Ｏ」はレジオネラ属菌以外の夾雑微生物の検出数、「ＯＧ」はレジオネラ属菌以外の夾雑微生物のコロニーにより検出不能となったことを、それぞれ表す。

表２から理解されるように、２６の検水について各検査方法でレジオネラ属菌の検査を行った結果、実施例では８サンプルからレジオネラ属菌が検出（検出率３１％）し、比較例１の従来のフィルター貼付法では１サンプル（同４％）、および、比較例２の塗抹培養法では３サンプルからレジオネラ属菌が検出された（同１２％）。このように、本発明の検査方法による実施例では、従来技術の検査方法による比較例１および比較例２に比して高い検出率が得られ、メンブレンフィルター上でレジオネラ属菌がコロニーを形成しやすいことが理解される。

また、夾雑微生物による汚染状況については、レジオネラ属菌以外の夾雑微生物のコロニーに覆われて、レジオネラ属菌の検査が阻害されたもの、すなわち検出不能となったサンプルは、本発明の実施例の検査方法では２サンプル、比較例１（従来のフィルター貼付法）では６サンプル、比較例２（塗抹培養法）では１サンプルであった。このことから、従来のフィルター貼付法に比べ本発明の実施例の検査方法では検出不能の発生が少ないことが確認された。

また、検出不能となるほどではなかったが夾雑微生物による汚染が観察されたサンプルの数が実施例では８サンプルであり、比較例１の１１サンプルに比して少ないことも理解される。

Claims (4)

1. 検水をメンブレンフィルターでろ過する工程、
   前記メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、と接触させた粉末活性炭を重層する工程、
   前記メンブレンフィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付する工程、および、
   前記レジオネラ属菌用の選択培地を培養する工程、
   を有することを特徴とするレジオネラ属菌の検査方法。
2. 前記レジオネラ属菌の発育に必要な成分が、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、および、α−ケトグルタル酸から選択される少なくとも１つを含むものであることを特徴とする請求項１に記載のレジオネラ属菌の検査方法。
3. 前記レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分が、グリシン、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、アムホテリシンＢ、ナタマイシンから選択される少なくとも１つを含むものであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のレジオネラ属菌の検査方法。
4. 前記レジオネラ属菌用の選択培地が、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、を含む寒天平板培地であることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のレジオネラ属菌の検査方法。