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Milchkonservierungsmittel und Verfahren zu seiner anwendung Die Konservierung
von Milchproben unmittelbar nach ihrer Entnahme ist eine wesentliche Voraussetzung
für die Sicherheit, Aussagekraft und Vergleichbarkeit bakteriologischer Untersuchungsergebnisse.
Eine Erhaltung des bakteriologischen Status ist auch für hemmstoffbiologische und
zytologische Untersuchungen unerläßlich, da bei der Vermehrung saprophytärer Mikroorganismen
in der Milch Hesmatoffe gebildet und elektronische Zellzählungen durch Eiweißausflockungen
infolge Säurebildung oder Bakterienaggregationen gestört werden können.
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Unter Abwägung der Erfordernisse der Praxis und der untersuchungstechnischen
Gegebenheiten sind an eine Milchprobenkonservierung folgende Anforderungen zu stellen
: 1. Die Milchproben müssen etwa 24 Stunden unter den praktisch vorkomsenden und
häufig wechselnden Bedingungen ihrer Entnahe, Aufbewahrung und ihres Transportes
im bakteriologischen, zytologischen und hemmstoffbiologischen Status unverändert
bleiben.
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2. Die Milchproben müssen nach Ankunft in der Untersuchungsstelle
weitere 24 Stunden unter Laboratoriumsbedingungen , z. B.
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im ühlschrank, aufbewahrt werden können, um'gegebenenfalls weitergehende
Untersuchungen, Wiederholungen, Bakteriendifferenzierungen u. dgl. zu ermöglichen.
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3. Der Aufwand für die Milchprobenkonservierung muß technisch und
personell realisierbar sein.
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Grundsätzlich stehen für die Konservierung von Milchproben physikalische
und chemische Verfahren zur Verfügung. Bei der Vielzahl der in der Milch vorhandenen
Mikroorganismen mit ihren unterschiedlichen Re sistenz eigenschaften und wechselnden
Generationszeiten müssen im vorliegenden Fall mehrere Hemmfaktoren kombiniert werden.
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Kältekonservierung von Milchproben bei Temperaturen von 0 - 2° C ist
höchstens für die Dauer von 5 - 6 Stunden möglich. Die in der einschlägigen Literatur
gegebene generelle Empfehlung, "Milchproben zur bakteriologischen Untersuchung unterhalb
8° 011 aufzubewahren, vermag die anfangs gestellten Anforderungen nicht zu erfüllen.
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Die in der Literatur angegebenen chemischen Methoden zur Milchkonservierung
mit Formalin, Kaliumdichromat, Sublimat oder Borsäure können in den angegebenen
Konzentrationen und Zubereitungsformen wohl ein Verderben der Milch verhindern.
Eine Stabilisierung des bakteriologischen Status der Milch über annähernd 2 Tage
ist jedoch auf diese Weise nicht zu erreichen.
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Die eigenen Versuche waren darauf gerichtet, eine Substanz oder eine
Kombination von Substanzen zu finden, die 1. leicht dosierbar ist und möglichst
die Anwendung autonatischer Pipettierspritzen erlaubt, 2. keine ins Gewicht fallende
Verdünnung der Milchproben bewirkt,
3. die sofortige innige Vermischung
von Konservierungsmittel und Nilchprobe gewahrleistet, 4. eine Anfärbung erlaubt,
um das Erkennen konservierter Milchproben zu sichern, 5. in präparierten Probenröhrohen
nahezu unbegrenzt haltbar ist und 6. weder die elektronische Zellsählung noch den
Nachweis von Hemmstoffen beeinträchtigt.
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Insbesondere der letzte Punkt führte zu einer erheblichen Einengung
der in Betracht kommenden Substanzen.
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Erfolgversprechend verliefen Vorversuche mit der in analoger Weise
den Bakterienwuchsstoff Vitamin B 6 substituierenden Ortho-Borsäure. Die praktische
Hnsatefahigkeit dieser Substanz wird Jedoch durch ihre überaus schlechte Löslichkeit
erheblich beeinträchtigt. Durch Verwendung von Glyzerin als Lösungsvermittler wurde
es nun erfindungsgemäß möglich, eine 5 %ige Wirkstofflösung herzustellen. Wie weiter
gefunden wurde, läßt sich eine solche Lösung in ausgezeichneter Weise durch Gefriertrocknung
konservieren. Das Lyophilisat besitzt die Eigenschaft der Instantlöslichkeit. Gemäß
einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Hemmspektrum der Ortho-Borsäure
durch Zusatz von Kaliumsorbat, das die für bestimmte Mikroorganismen lebenswichtigen
Dehydrogenasen beeinflußt, erweitert.
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Nach umfangreichen Versuchen erwies sich folgendes Eonservierungsmediua
in den angegebenen Konzentrationen als optimal MEDIUM ZUR KONSERVIERUNG VON MILCHPROBEN
Ortho-Borsäure (H3BO3) 50,0 g K-Sorbat (CH3-CH=CH-CH=CH-COOK) 0,75 g Glyzerin (CH3OH-CHOH-CH3OH)
10,0 g Methylenblaulösung (1 %ig) 0,5 mg
Aqua dest. ad 1 000,0 ml
Dieses PIittel wird zweckmäßig in Mengen von 1,18 ml je 10 ml milch angewendet.
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Zur praktischen Verwendung wird das neue Mittel lyophilisiert.
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Die Gefriertrocknung erfolgt zweckmäßigerweise in sog. Einwegkunststoffröhrchen,
die ihrerseits zur Entnahme der zu untersuchenden Milchprobe dienen.
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Eine ausreichende Durchmischung von Milch und Lyophilisat wird durch
5 -lOmaliges Schwenken der Röhrchen erreicht. Die Bildung von Nestern des neuen
Mittels in der Milch ist praktisch ausgeschlossen.
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Die Haltbarkeit des lyophilisierten Konservierungsmediums beträgt
bei ordnungsgemäßer Gefriertrocknung mindestens mehrere Monate.
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Das Konservierungsmittel erlaubt eine bis zu 24-stündige Aufbewahrung
von Mischproben in einem Temperaturbereich von ca. 5 -200 C. Dabei sind kurzfristige
Temperaturüber- bzw. -unterschreitungen ohne Belang.
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Bei der varianzanalytischen Auswertung von 350 Proben, die 24 Stunden
lang bei 200 C aufbewahrt wurden, konnte ein auf die Konservierung, Stichprobenentnahme
und Zählfehler zuruckzuführender Varianzanteil an der Gesamtvarianz von 4,67 * ermittelt
werden. Der Xorrelationskoeffizient zwischen dem Ausgangswert und dem 24-Stunden-Wert
wurde nach logarithmischer Transformation der Werte mit r = + 0,95 errechnet.
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200 der vorstehend naher charakterisierten 350 Proben wurden weitere
24 Stunden bei 6° o aufbewahrt. Nach insgesamt also 48-stündiger Konservierung der
Proben ergab sich folgendes Bild
Der auf die Konservierung, Stichprobenentnahme
und Zählfehler zurückzuführende Varianzanteil beträgt jetzt 5,47 und der Korrelationskoeffizient
zwischen 0- und 48-Stunden-Werten r = + 0,95.
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Die geometrischen Nittelwerte sind 252 000 vor der Konservierung,
259 000 nach 48-stündiger Aufbewahrung.
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Die in Feldversuchen erhaltenen guten Konservierungsergebnisse konnten
in einem Reinkulturentest bestätigt werden, in dem 112 aus Milchproben isolierte
psychrotrophe und mesotrophe Stämme überprüft wurden.
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ÜBERSICHT DER AUF WACHSTUMSHEMMUNG DURCH DAS ORTHO-BORSÄURE-KALIUMSORBAT-GLYZERIN-METHY
-LENBLAU-MEDIUM GEPRÜFTEN BAKTERIEN-STÄMME: (24 Std. / 200 C) B e X ei c h n u n
g Anzahl Stämme Pseudosonaden 16 Ooliforme Keime 32 Streptokokken (einschl. Enterokokken)
18 Mikrokokken 37 Lactobazillen 1 Sonstige 8 TOTAL 112 Zur bei 3 coliformen Stämmen
konnte nach 24-stündiger Bebrütung ein schwaches Wachstun festgestellt werden.
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Zur Prüfung, wie weit etwa in der Milch vorhandene Hemmstoffe durch
das neue Konservierungsmittel bei der Aufbewahrung beeinflußt werden, wurde der
igar-Diffusionstest mit Bac. stearothermophilus
var. calidolactis
unter Verwendung von Brillantschwarz als Indikator verwendet.
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Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse BEURTEILUNG VON MILCHPROBEN VOR UND
NACH DER KONSERVIERUNG MIT HILFE DES BRILLANTSCHWARZ-REDUKTIONSTESTERS Behandlung
der Proben Reaktions- Unkonserviert Konserviert stufe O h 24 h 48 h 1 1 003 1 001
1 001 993 2 9 11 12 21 3 23 23 22 21 TOTAL 1 035 1 035 1 035 1 035 1 = Vollständige
Reduktion ("negativ") 2 = Unvollständ. Reduktion ("fraglich") 2 = Keine Reduktion
("positiv") Tabelle 2 Die als positiv bezeichneten Proben verhalten sich über den
Beobachtungszeitraum von 48 Stunden annähernd konstant. Ein Additionseffekt zwischen
dem Konservierungsmedium und evtl. in der Milch vorhandenen Antibiotikahemmstoffen
konnte nicht ermittelt werden.
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Es ist dagegen zu erwarten, daß der Henistofftest durch die Nilchprobenkonservierung
sicherer gestaltet wird, da durch die Hemmung des Bakterienwachstums eine mögliche
Hemmstoffproduktion unterbunden wird.
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Diese Ergebnisse im Hemstofftest dürften entscheidend auf die durch
Glyzerinzusatz und Gefriertrocknung erreichte gute Löslichkeit des Konservierungsmediums
zurückzuführen sein, da hierdurch die Toleranzgrenze überschreitende Hemmstoffkonzentrationen
infolge unvollständiger Löslichkeit vermieden werden. Borsäure in tablettierter
oder pulverisierter Form löst sich in der Milchprobe nicht vollständig und stört
dadurch den Hemmstoffnachweis.
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Schließlich wird auch die elektronische Zellzöhlung durch die Konservierung
der Mllchproben mit dem beschriebenen Medium nicht beeinflußt, wie entsprechende
Untersuchungen ergeben haben.
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Patentansprüche