DE2242847A1 - Lyophilisiertes naehrmedium - Google Patents

Lyophilisiertes naehrmedium

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DE2242847A1
DE2242847A1 DE19722242847 DE2242847A DE2242847A1 DE 2242847 A1 DE2242847 A1 DE 2242847A1 DE 19722242847 DE19722242847 DE 19722242847 DE 2242847 A DE2242847 A DE 2242847A DE 2242847 A1 DE2242847 A1 DE 2242847A1
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DE
Germany
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agar
lyophilized
nutrient medium
nutrient
medium
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DE19722242847
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English (en)
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Patrick Michael Yananton
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F Hoffmann La Roche AG
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F Hoffmann La Roche AG
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

. . . - St Aug. WZ
Dr.lngJ.voiTffefWerffi ' Dr. Franz Lederer 2242847
PATENTANWAkIE
F4 HoiFmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Lyophillsiertes -.. Nährmedium
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren ,stur Erhöhung der Aufbewahrungsstabilität und der Lagerfähigkeit von Medien, welche in. Mikromethoden zur Bestimmung oder· zum Nachweis von biologisch aktiven Materialien verwendet . ' werden> > Weiter betrifft die vorliegende Erfindung verbesserte Bestimmungsmethoden unter Verwendung von l.yophilisierten Medien. Schliesslich bezieht sich;die vorliegende Erfindung auf ein lyophilisiertes Nährmedium, welches für solche Mikromethoden geeignet ist, und auf die Verwendung, eines solchen Nährmediums. , . ■
vf -
• Es sind bereits Mikromethoden zur.Bestimmung oder zum Nachweis von biologisch aktiven Materialien bekannt, worin ' kleine Reagenzgläser, Kapillarröhrchen, Schalen und' so weiter benutzt werden.
. 8ADORiGiNAl.
309810/1117 :
r 2 -
Die in diesen Methoden verwendeten Medien haben sich bisher auf flüssige Brühen oder auf Agargele, welche aus im Handel erhältlichen Pudern hergestellt werden, beschränkt. Wegen den Schwierigkeiten, die von Natur aus mit den obenerwähnten Medien verbunden sind,, und bei der Herstellung, der Sterilisierung und der Dispersion auftauchen, erhält man ein Material, welches infolge der geringen Lagerstabilität nicht kommerzielL verwertbar ist.
Es wurde erfindung gemäss festgestellt,
dass die Schwierigkeiten mit Medien, welche in Mikromethoden zur Bestimmung oder zum Nachweis von biologisch aktiven Materialien benützt werden, durch die Verwendung von lyophillsierten Medien weitgehend überwunden werden können und, dass sich hierdurch erhebliche Vorteile ergeben. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung eine Mikromethode zur Bestimmung von biologisch aktiven Materialien dadurch gekennzeichnet, dass man ein wässriges Gemisch des biologisch aktiven Materials einem lyophilisiertem Nährmedium, welches aus Agar-Agar in Kapillarröhrchen oder aus Nährbrühe in Mikrobehälter oder in Mikrotitrationsplatton besteht und einen Indikator enthält, zusetzt und das Wachstum misst.
Der Ausdruck "biologisch akcive Materialien" bezeichnet Materialien, welche eine biologische Wirkung aufweisen, die in Nährmedien gemessen und durch Indikatoren oder
anderen Mitteln sichtbar gemacht werden kann. Typische Beispiele solcher Materialien sind Bakterien, Bakterien-Enzyme, humanpathogene Bakterien, Antibiotika und dergleiohen. j
Die erfindungsgemässen 1 yophilisierten Medien können in verschiedenen biologischen Tests wie z.B. bei der Prüfung der Empfindlichkeit von Antibiotika, bei der Urtaaebestlmmung, bei der Bestimmung de* Amlnosäure-Dekarboxy
309 810/1 11 7
OWGWNAL JNSPECTED
lierung oder -.Deaminierung,. bei-Sterilitätsversuchen, bei.der Untersuchung von Wasser und dergleichen Verwendung finden. Andere Substanzen wie &.B. Antibiotika oder Hemmstoffe können dem Medium direkt zugegeben und mit ihm ' lyophilisiert werden, wobei die Aufrechterhaltung von serienmässlgeo Verdünnungen und minimalen Hemmkonzentrationen ermöglicht wird. Die Tests können beispielsweise zur Bestimmung von Mikroorganismen wie Bakterien verwendet werden, indem" man die enzymatische Gärung von verschiedenen Kohlehydraten sowie die Wirkung auf die Dekarboxylierung von Aminosäuren misst.
Eine typische klinische Situation, die insbesondere in Spitälern oder in diagnostischen Laboratorien auftritt, ist die Bestimmung von humanpathogenen Organismen bei Infektionen. Typische pathogene Organismen, welche unter Verwendung der vorliegenden Erfindung bestimmt werden können sind Bakterien, insbesondere die Bakterien der Familie Enterobacteriaceae. · ·
Im allgemeinen wird bei der Bestimmung eines pathogenen Organismus der Organismus in verschiedene Nähr-•medien, welche gegebenenfalls verschiedene biochemische Indikatoren enthalten, inkubiert. Um ein Aktivitätsprofil des Organismus zu erhalten, wird das Wachstum oder das Fehlen an Wachstum in den Medien sowie die biochemische Aktivität festgestellt. Dieses Profil ist ein Bestimrnungsfaktor und kann einzeln oder zusammen mit anderen Bestimmungsparametern zur Identifizierung des pathogenen Organismus dienen.
Die erfindungsgemässen Medien In. lyophilisierter Form zeigen mehrere eindeutige Vorteile gegenüber den auf andere V/eise hergestellten bekennten Medien. Die ljvophilisierten-
BAD ORtGINAl.
309810/1117
Materialien besitzen eiie vortreffliehe Aufbewahrung^- und Lagerungsfälligkeit. So weist z.B. ein Nährmedium, welches aus Nährbrlüie oder aus Agar-Agar besteht und ein Kohlehydrat enthält, eine Stabilität von wenigstens drei Monaten auf. In vielen Fällen wurde sogar eine Stabilität von über einem Jahr beobachtet und eine Tiefkühlung ist nicht nötig. Weiter ist die Verwendung von lyophilisierten Medien in gebrauchsfertigen Mikrosystemen auch vorteilhaft, weil die Herstellungsarbelt und die Aufbewahrung des Vorrats an Medien vermieden und Lagerplatz sowie die Verwendung von Glasartikeln vermindert werden. Kleine Mengen werden verwendet auch an Konservierungsmittel, minimale Mengen an Inokulurri werden benötigt, die Ergebnisse sind schneller ermittelt, die Anpassung an mechanische Methoden ist möglich und das System ist immer schnell verfügbar.
Die erfindungsgemässen Medien werden durch übliche Lyophilisierungsverfahren gebildet. So wird z.B. ein Agarmedium in einem Autoklaven sterilisiert, unter Verwendung von üblichen Verfahren abgekUhlt und anschliessend schnell unter Vakuum gefriergetrocknet. Bei dieser Durchführung hängen die Bedingungen vom Medium.ab. Das Autoklavenverfahren darf nicht unter so strengen Bedingungen durchgeführt werden, dass das Medium sich zersetzt oder auf andere Weise beschädigt wird.
Im allgemeinen können die Tests, in welchen lyophillsicrte Medien benützt v/erden, in kleinen Reagenzgläsern, in Serumphiolen, in Kapillarröhrchen, in Schalen oder in anderen Behältern, die sich für kleine Flüssigkeitsmengen eignen, durchgeführt werden.
Obwohl Nährmedien bestehend aus Agar-Agar oder aus Nährbi'ühe in allen Behalterarten mit Erfolg verwendet werden
30 9810/1117
(1
können, werden vorzugsweise Nährbrühen in kleinen Reagenzgläsern oder in Schalen und Agar-Agar in Kapillarröhrchen verwendet.
Der au prüfende Organismus wird den lyophilisierten Medien in Form einer wässrigen Suspension zugegeben. Die Konzentration des Organismus ist für die Durchführbarkeit des Versuchs nicht kritisch. Im allgemeinen werden jedoch
wenigstens Kr Organismen verwendet. Ein nachweisbares Wachstum erfolgt innerhalb vierundzwanzig Stunden vorausgesetzt dass einige Mikroorganismen vorhanden sind. Die Menge an Wasser, welche verwendet wird, um den lyophilisierten Medien erneut das notwendige Wasser zuzuführen ist bereits dann ausreichend, wenn sie erlaubt, die Medien welche eine vorbestimmte Konzentration an Bestandteilen aufweisen, zu dispergieren. Die biologisch aktiven Materialien werden in diesem Wasser in einer Konzentration dispergiert, welche ausreicht um sicherzustellen, dass der Test aussagekräftige Ergebnisse geben wird.
Wenn die wässrige Suspension des Organismus den lyophilisierten Medien augegeben wird, wird den Medien sofort die notwendige Menge Wasser zugeführt und diese auch gleichzeitig .angeimpft. Dies ist ein wesentlicher Vorteil, weil auf diese Weise viel Zeit· eingespart wird. Nach Inkubierung wird die Gärung, das Wachstum oder die Enzymaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind im allgemeinen nach 1 bis 8 Stunden vorhanden. Wenn man. jedoch optimale Ergebnisse erhalten will, führt man die endgültige Resultatsablesung erst ungefähr 24 Stunden nach Testbeginn durch.
Die Zusammensetzungen der.erfindungsgemässen Medien sind selbstverständlich je nach Testsystem \'erschieden. So besteht z.B.' ein Medium, welches für die Bestimmung des
309810/1117
Profils der Fermentationswirkung von Enterobacteriaceae verwendet wird, aus einem Nährmedium, einem Kohlehydrat, einem festen, inerten Träger (bei Verwendung von Nährbrühe, wird jedoch kein fester Träger benutzt), einem Indikator und Wasser. Es können eine Base oder eine Säure zugegeben werden, um den P„-Wert des Systems einzustellen.
Die Medien können verschiedene Mengen an Bestandteilen enthalten. Die optimale Konzentration jedes Bestandteiles in verschiedenen Medien ist dem Fachmann bekannt.
Vorteilhaft enthält z.B. ein Agar-Agar Nährmedium 0,5 Gewichtsprozent Trypticase Pepton, 1 Gewichtsprozent Kohlehydrat 1,5 Gewichtsprozent Agar-Agar, 0,0018 Gewichtsprozent an Phenylrot-Indikator und wird mit Wasser bis auf 100 ml aufgefüllt. '
Im Fall, dass eine Base oder eine Säure zum Einstellen des P„-Werts verwendet wird, wird eine anorganische Säure wie beispielsweise verdünnte Salzsäure oder eine anorganische Base wie beispielsweise Natrium- oder Kallumhydroxyd benutzt.
Der P„-Wert wird eingestellt um sicherzustellen, dass der η
zu prüfende Organismus auf den korrekten Bestandteil Im Medium einwirkt und eine Aenderung des P„-Wertes verursacht,, welche zu einer Farbänderung des Indikators führt. Bei der Prüfung des Aktivitätsprofils von z.B. Enterobacteriaceae liegt der P„-Wert in der Grössenordnung von 7,3 bis 7*8. ,
** ■ ■ ί
Das Nährmedlurn kann Je nach den bakteriologisch- j biochemischen Merkmalen, welche geprüft werden sollen, verschieden sein. So' wird z.B. der tryptleohe Abbau von Kasein und Pepton wie beispielsweise Trypticase Pepton (Baltimore Biological Laboratorien) alc Grundlage für eine Bestimmung der Kohle.hydratgärung bevorzugt. Ein pflanzliches Pepton
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wie z.B. "Phyton-Pepton" (Baltimore Chemical Laboratories) wird für die Lysindekarboxylase bevorzugt. Ein gelbildendes Pepton wie z.B. "Gelsat-Fepton" (Baltimore Biochemical Laboratories)wird für Harnstoff bevorzugt. Die Verwendung anderer Nährmedien ist für den Fachmann naheliegend. Die Kohlehydrate oder Aminosäuren, welche verwendet werden, können entsprechend dem Verwendungszweck verschieden sein. So werden z.B. Dextrose, Laktose, Sukrose, Mannit, Dulcit, Salicin, Adonit, Inosit, Sorbit, Arabinose, Raffinose, Ornithin, Lysin, Phenylalanin und dergleichen benützt.
Es können verschiedene feste inerte Träger verwendet werden, jedoch werden Materialien wie Agar-Agar, verschiedene Celluloseharze wie Karboxymethylcellulose (CMC) und dergleichen bevorzugt.
Im Fäll einer Nähr,brühe wird kein fester inerter Träger verwendet.
Das liophylisierte Medium wird mit einer Suspension der zu prüfenden Organismen angeimpft, indem man eine Oese voll, d.h. 2 oder 3 Kolonien einer Kultur auf einem bakteriologischen Medium zu einer Menge an sterilem Wasser oder Kochsalzlösung gibt, welche genügt, um das Medium auf seinen Viassergehalt vor der Liophylisierung zu bringen. Die Konzentration der Bakterien muss genügend gross sein um das
Wachstum zu gewährleisten. Mit Vorzug werden 10 Organismen verwendet. Der suspendierte Organismus wird mittels einer Pipette oder einer Spritze, (gewöhnlich in einer Menge von 0,1 ml) in kleine Reagenzgläser welche liophyllsiertes Medium (Brühe) enthalten, überführt. Im Fall einer Schale (Brühe oder Agar-Agar), werden in der Regel 0,1 ml mit einer Spritze zugegeben und im Fall eines Kn.pillarröhi*ehens (Agar-Agar), werden 0,05 ml mittels einer Spritze, einer
309810/1117
Pipette oder durch die Kapillarwirkung selbr.t zugegeben. Die Grosse des Inokulums ist nicht kritisch, da in der Regel ?A Stunden vergehen bis die Ergebnisse völlig eindeutig sind. Aus diesem Grund genügen selbst ein oder zwei Mikroorganismen. Der Grund weshalb i'Ur das Erzielen eindeutiger Resultate 24 Stunden oftmals nötig sind, ist in der Tatsache zu suchen, dass einige Organismen einige Zucker erst nach 6 Stunden fermentieren.
Die Art des Indikators ist nicht kritisch solange er die Aenderung des P„-Wertes, welche in einem gewissen Medium an einem bestimmten Punkt des Wachstumscyclus auftritt, wiedergibt und somit seinen Zweck erfüllt.
Bei der Durchführung mehrerer Tests hat sich gezeigt, dass geschlossene Behälter Verluste an angeimpftem Testmedium und Auftreten von Verunreinigungen wesentlich herabsetzen, wodurch aussagekräftige Ergebnisse erhalten werden.
Es können übliche Dichtungsmittel wie z.B. ein Band oder Wachs usw. verwendet v/erden.
Bei der Durchführung der Versuche muss das Testmedium inkubiert v/erden. Dies erfolgt in der Regel bei einer Temperatur von ungefähr 280C. Die Ergebnisse werden visuell beobachtet und werden als entgillt j g betrachtet, wenn die Farbe des Indikators unverändert bleibt.
Die erfindungsgemässen lyophilisierten Medien dienen zur Bestimmung von Aktivitäten, . z.B. der minimalen Hernmkonzentratiori von Antibiotika, wobei die Antibiotika zusammen mit den Testmedien 3yophiliu.icrt werden, wie z.B. Tetracyclin mit Phenyl rot
BAD ORIGINAL
309810/1117
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1
Es wird ein standardisiertes Agarmediuni, welches die folgende Bestandteile(in Gewichtsprozenten), enthält, hergestellt? · -·
0, 5 % Tryptlease
1 % . Kohlehydrat
1, 5 % Agar-Agar
0, 0018$ Phenylrotindikator
Wasser bis· auf 100 ml.
Der P„-Wert wird mittels 10$ Natriumhydroxyd auf 7,5 eingestellt.
Die Bestandteile werden bei Raumtemperatur gemischt und dann bei 118°C während 15 Minuten autoklaviert. Nach Abkühlung wird das Medium bei 500C in ein Wasserbad gebracht und Kapillarröhrchen von 75 nrni Länge mittels einer Nadel und einer Spritze gefüllt. Die Menge an Medium in jedem Kapillarröhrchen beträgt 0,05 ml. Nach Füllung werden die Kapillarröhrchen in einen auf -40°C vorgekühlten Gefriertrockner gebracht. Nach einar Stunde bei --40°, wird der Druck im Gefriertrockner vermindert bis ein Vakuum von 100 Mikrons ;(0,l mm Hg) oder weniger erreicht wird. Der Gefriertrockner wird anschliessend ?A Stunden auf 210C erhitzt. Nach Wegnahme des Vakuums werden die Kapillarröhrchen entfernt. Die Röhrchen, welche einen lyopnilisierten Agarntrang enthalten, werden in einem Exsikkator aufbewahrt.
Eine Oese voll von zu prüfenden Bakterien wird von einer Agarplatte genommen und in ^,5 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die Zellen
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werden dann zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entfernt. Das zurückbleibende Material wird erneut mit 1 ml Wasser suspendiert und gründlich geschüttelt.
Die Kapillarröhrchen werden angeimpft indem ein Röhrchen am Rand in die Suspension eingetaucht wird, wobei die Suspension durch die Kapillarkraft hochgezogen wird. Die Röhrchen werden so gefüllt dass die Suspension genau das obere Ende des Agarstranges noch bedeckt. Das Röhrchen wird dann am unteren Ende leicht verschlossen und in einem etikettierten Gestell mit weissem Hintergrund aufgestellt. Dieses Verfahren wird für jedes verwendete Kohlehydrat wiederholt.
Alle Röhrchen werden in einen Inkubator mit einer Temperatur von yj°C gebracht und werden nach 1, 2, 3, 4, 5, und 24 Stunden überprüft. Eine Farbänderung vom basichen Bereich (rot) zum sauren Dereich (gelb) ist das Zeichen für eine Gärung.
Die Ergebnisse werden in den folgenden Tabellen dargestellt. In jeder Tabelle werden folgende Bezeichnungen verwendet:
- = negativ (rote Farbe)
+ = Uebergang zu positiv (orange Farbe) + = positiv (galbe Farbe)
Als Kontrolle wurde eine BBL Phenylrot Nährbrühe (Baltimore Biological Labotatories) mit geeigneten Kohlehydraten verwendet. Die Brühe wird mit dem gleichen Inokulum wie das Testmedium angeimpft. Die erhaltenen und nachfolgend angegebenen Ergebnisse sind solche, welche nach ?Λ Stunden ständiger Inkubierung beobachtet werden. Sie zeigen die Übereinstimmung des erfindungsgemänsen Testsystems mit den Üblichen Testsystemen (bzw. der verwundeten 'KontrolleU
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ORGANISMUS
Arizona arizonac501
Kohlehydrat
Stunden.InkubIerung
Kontrollbrlihe
Dextrose T *™i Ί .r 4~ /^ c· /"Λ JuJ c** v. t* ν-* »J ν Sukrose Mannit DuIeit Salicin Adonit Inosit Sorbit Arabinose Raffinose Rhanmose
Die Ergebnisse sind nach 5 Stunden bereits vollständig.
30981 0/1117
bad
OHGAWTSMUS Edwards i_c 3.1a tar da
■Stunden Tnkublerung
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Salicin Adonit Inosit Sorbit Arabinose Raffinose Rhamnose
I 2 2 A
KontrollbrUlie
Die Ergebnisse sind nach 5 Stunden bereits vollständig.
309810/ 1117
BAD OR(GfNAL
ORGANISMUS
Escherlchia ooli 11775
Kohlehydrat
S t unden Jnkub ie rung;
1 Kon trollbrühe
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Salicin Adonit Inosit Sorbit Arabinose Raffinose Rhamnose
Die Ergebnisse, sind nach 1 Stunde bereits-vollständig.
3 0 9 810/1117
Kohlehydrat
Dextrose LaW-tose
ORGANISMUS Enterobacter aerogenes 50363
Stunden Inkublerunp; I £ 2 i 1 §. 24
Mannit Dulcit Salicin Adonit Inosit Sorbit Arabinose Raffinose Rharanose
KontrollbrUhe
Die Gärung von Inosit erfolgt erst nach 6 Stunden.
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ORGAHISWJs • En t e r ob ac te r Glpac ae
Kohlehydrat
Dextrose Laktose Sukrose · Mannit DuIeit SaIiein Adonit In ο fiit Sorbit Arabinose Raffinose Rhamnose Stunden Ink_ubierun,p;
ι £ ι i 5 6 £i
Kontrollbrühe
• +
Die Gärung von Inosit.erfolgt erst nach β Stunden.
309810/ 1117 BAD ORIGINAL
ORGANISMUS
K le brio] la pneur/ion j a ο 80J! 7
Kohlehydrat
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Salicin Adonit Inosit Sorbit Arabinose Raffinose Rhamnose
Stunden Inkublerung
£ 2 4 ^ 6 2J1,
KontroUbrUhe
Die Gärung von Inosit und Raffinose erfolgt erst nach 6 Stunden.
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ORGANISMUS
Proteus inirabilis 15146
Kohlehydrat
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Salicin Adonit , Inosit Sorbit Arabinose Raffinose Rhamnose
Stunden Inkubierung 1 2 5 4 5 6 2i
KontrollbrUhe
Die Ergebnisse sind nach 3 Stunden bereits vollständig.
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Kohlehydrat
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Sallcin Adonit Inosit Sorbit Arabinose Raffinose Rhamnose
ORGANISMUS Providencla alcallfaoiens
Stunden Inkubierung i. 2 j5 i £ 6 24 Kontrollbrühe
Die Gärung von Adonit erfolgt erst nach 6 Stunden.
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ORGANISMUS Saliiionella newport
Kohlehydrat
Stunden Inkubierung I 2 ^ I ^ 6 2l Kon.tr öl Ibrühc
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Salioin Adonit Inosit Sorbit Arabinose Raffinose Rhainnose
"Die Ergebnisse sind nach 4 Stunden vollständig.
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- wo -
Kohlehydrat
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Salicin Adonit Inos'it Sorbit Arabinose Raffinose Rharnnose
ORGANISMUS
Shigella dysentorjae
Stunden Inkubierung
Z 1 I 1 §. £i Kon tr öl Ihr Uh e
+■+
Die Ergebnisse sind nach 3 Stunden bereits vollständig.
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BAD ORIGINAL
-PJ. -
Beispiel 2
Es wurden standardisierte Kohlehydrat-Medien, welche die folgenden Bestandteile (in Gewichtsprozente) enthalten, hergestellt:
a) 0,5 <fo Trypticase Pepton
1 $ Kohlehydrat
0,0018 % Phenylrotindikator
Wasser bis auf 100 ml.
Der P„-Wert wird mittels 10^ Natriumhydroxid auf 7,8 eingestellt.
b) 0,5 # Trypticase Pepton
1 $> Kohlehydrat
2,5 $> Agar-Agar
0,0018 % Phenylrotindikator'
Der Pu-Wert wird mittels 10$ Natriumhydroxid auf 7,8 eingestellt.
Die Bestandteile der Nährbrühe und des Agarmediums ■ werden bei Raumtemperatur gemischt und dann bei 118°C während 15 Minuten autoklaviert. Nach Abkühlung werden von jedem Medium 0,1 ml in eine Reihe von Vertiefungen einer Mikrotitrationsplatte pipettiert. Die mit Medium versehenen Platten werden in einen auf -40°C vorgekühlten Gefriertrockner gebracht. Im Gefriertrockner wird ein Vakuum von 100-Mikrons (0,1 mm.Hg) oder weniger· angelegt. Der Gefriertrockner wird
anschliessend während 24 Stunden auf 21°C erhitzt. Nach ι
Wegnahme des Vakuums werden die Platten entfernt. Jede
Vertiefung wird dann mit einem Plastikband dicht verschlossen.
Die nachfolgend aufgeführten und auf TSA Platten aufgebrachten Organismen werden während 24 Stünden bei 380C inkubiert.
, . 3 0 9 810/1117 original inspected
1. Arizona hinshawii 195-66
2. E. coli 0126
3. E. coli ATCC 11775
\. E. hafniae ATCC 13537
5. E. cloacae ATCC 13047
6. E. tarda ATCC 15469
7. K. pneumoniae ATCC 8047
8. P. vulgaris ATCC 638O
9. S. flexneri LA
10. S. typhimurium ATCC 13311
11. S. newport
12. S. marcescens 5966
Eine Oese voll von jedem Organismus wird in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert'. 0,1 ml jeder Suspension werden dann mittels einer Nadel und einer Spritze in jede Mikrovertiefung, welche das lyophilisierte Medium enthält, eingebracht. Für jedes Kohlehydrat wird eine Serie von acht gefüllten Vertiefungen mit einem bestimmten Organismus angeimpft. Die Platten werden dann bei 380C inkubiert und nach 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 24 Stunden nachgeprüft. Eine Farbänderung vom basischen Bereich (rot) zum säuren Bereich (gelb) ist das Zeichen fUr eine Gärung.
Die Reaktionen in den Vertiefungen der Mikrotitrationsplatte sind klar und deutlich und die Reaktionsgeschwindigkeit ist bei Medien, welche Agar-Agar enthalten und bei denjenigen, welche kein Agar-Agar enthalten, praktisch ohne bedeutsamen Unterschied. j.
Die Ergebnisse werden in den folgenden Tabellen dargestellt. In jeder Tabelle werden die folgenden Bezeichnungen verwendet: !
+ » positiv; - = negativ; + = Uebergang von negativ zu
positiv.
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ORIGINAL INSPECTED Mikrotitratlonsplatten-Technik
Organismus . Medium
Arizona hinshawii 195-66 Agar
Kohlehydrat Stunden Inkubierung
JL 2 1 4 5 6
Dextrose .++++++
Laktose _______
Sukrose ______
Mannit' ' + + +-++■ +
Dulcit ______
Inosit ______
Sorbit . + + + +
Raffinose . ' ______
30981 0/1117
Mi kroti trat j on spi a tten-Technik
Organismus Medium
Arizona hinshawii 195-66 Brühe
Kohlehydrat Stunden Inkubierung
Dextrose ++++++
Laktose ______
Sukrose ______
Mannit + + + + + +.
Dulcit ______
Inosit ______
Sorbit - - + + +.+
Raffinose ______
3098 10/1117
Mikrot it-rat ions plat ten~Technik
Organismus Medium
Escherichiä ooli 11775 Agar
Kohlehydrat . Stunden Inkubierung
Dextrose ^ + + + + + +
Sukrose __-....-_
Mannit -- + + + +
Dulcit -
Inosit -
Sorbit -- + + + +
Raffinose -
309810/1117
Mi kroll trat l on;s pi at ten -Te chrilk Or^anismun Medium
E. coll 11775 Kohlehydrat
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Inosit Sorbit Raffinose BrUhe • Stunden Inkubierung
2 2 i
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Mikr ο t i tr a ti on s pi at ton-Te chn ik
OrganiRmu« Medium
E. coli 0126 . Agar
Kohlehydrat Stunden Inkubierung
12 2 I υ Λ
Dextrose + + + + + +
Laktose -+++++
Sukrose -+++++
Mannit . + + + + + +
Dulcit - - - - - -
Inosit . ___..__
Sorbit ______
Raffinose -- + + + +
0 9 8 10/1117
MikrotiIralionsplatten-Technik Organismus Medium
E. coli 0126
KohJ.ehydrat
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Inosit Sorbit Raffinose BrUhe
Stunden Inkublerun^
I 2 1 υ .5. 6
^ ~ T T
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-.3S-
Mikr ο ti t r at i ons pJL at t en -Te chnik
Organismus Medium
Edwardsiella tarda 15469 Agar
Kohlehydrat Stunden Inkubierung
λ 2, 1 I 1 §.
Dextrose -+++++
Laktose ______
Sukrose ' ______
Mannit ______
Duloit - - -
Inosit ______
Sorbit _______
Raffinose - - - -■-■>-
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Mikroti tratiοη.ρρΐatten-Techriik Organismus Medium
Edwardsiella.tarda 15^69 Brühe
Kohlehydrat Stunden Inkubierung
Dextrose + + + + + +
Laktose ____--
Sukrose ------
Mannit ------
Dulcit ------
, Inosit - - -
Sorbit ------
Raffinose ------
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Mlkroti-trationsplatt-en-Technik
Organismus ' Medium
Enterobacter hafniae 13537 . Agar
Kohlehydrat ' Stunden Inkubierung
I 2 · £ 4 5. 6
Dextrose - + + + + +
Laktose ______
Sukrose ______
Mannit - · - ' - + + +
Dulcit ______
Inosit ______
Sorbit - -· - - -
Raffinose . ______
3 0 9 8 10/1117
Organismus Medium
E. hafniae 13337 Brühe
Kohlehydrat Stundeη Inkübierung
1 2 2 i ' _> 6
Dextrose - + + + + +
Laktose ______
Sukrose ______
Mannit ____ + +
Dulcit - - - -
Inosit ______
Sorbit ______
Raffinose ______
309810/ 1117
Mikrotitrationsplatten-Technlk Organismus Medium
Enterobacter cloacae 1J5O47 Agar .
Kohlehydrat Stunden Inkubierung
JL 2 2 4 £ 6
Dextrose + + + + ·+ +
Laktose . + + +" + '+ +
Sukrose ++++++ Mannit . ' - + + + + +
Dulcit . ------ _
Inosit ---.„-_
Sorbit - . + + + + +
Raffinose -.+++++
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Mikrotitrationsplatten-Tenhnik Organismus Medium
E. cloacae 13047 BrUhe
Kohlehydrat Stunden Inkubierung
12 2 4^6
Dextrose + + +'++.+
Laktose + + + + + +
Sukrose 4 + + + + +
Mannit - + + + + 4-
Dulcit - - - -
Inosit - ■ -
Sorbit - + 4· + + +
Raffinose + 4· + 4- 4·
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■55-
Mj.krotitrationsplatten-Technik Organismus Medium
Klebsieila pneumoniae 8047 Agar Kohlehydrat . Stunden Inkubierung
I 2 1 i 5. 6
Dextrose - + + + + + Laktose .------
Sukrose - + + + + +
Mannit -- + + + +
Dulcit ..---_- Inosit · -_-._ + +
.Sorbit --++++
Raffinose - - - - ■■+ +
309810/1 1 17
- 56 -
Mikrοti trationsplatten-Technik
Organismus Medium
Klebsieila pneumoniae 80^7 Brühe
Kohlehydrat Stunden Inkubierun^
I 2 1 I .._> 6
Dextrose ++++++
Laktoso „_____
Sukrose -+.+ + + +
Mannit - + + + + +
Dulcit ______
Inosit ~ - ~ - t ±
Sorbit - + + + +
Raffinose ____++
3 0 9 8 10/1117
Mikrotltrationsplatten-Technik
Organismus. Medium
Proteus vulgaris 6380 Agar
Kohlehydrat Stunden Inkubierun^
JL g ' 2 i ÜL §.
Dextrose - + + + + +
Laktose ------
Sukrose -+++++
Mannit - -
• DuI dt . ____--
Inosit ------
Sorbit . ------
Raffinose - - - - -
309810/1 1 17
Mlkrnt i t rat ions olat ten-Te chnik
Organ! s Γη u r. Me d ium
Proteus vulgaris 638O Brühe
Kohlehydrat . Stunden Inkubierung
L 2 2 i ü £
Dextrose -+++++
Laktose ------
Sukroae -+++++
Mannit __-_-_
Dulclt _--___
Inosit ■-'----■_
Sorbit .----.--
Raffinose ______
309810/1117
Mikrotitrationsplat ten-Te chni k Organismus Medium
Salmonella newport Brühe
Kohlehydrat ' S.tunden Inkubierun^
1.2 2 . i 5. 6
Dextrose ++++++
Laktose
Sukrose - - ~ -
Mannit ' + + +
Duloit ' -_---.-
Inosit ______
Sorbit -___++
Raffinose ______
ORlCHNAL INSPECTED
3 O 9 8.1 O / 1 11 7
Mikrotitrationsplatton-Technlk Organismus Medium
Salmonella nevrport Agar
Kohlehydrat Stunden Inkub1er ung
1 2 1 I 5
Laktose Sukrose Mannit Dulcit Inosit Sorbit Raffinose
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Mikrotitra-tionsplatten-Technik Organismus Medium
Shigella flexneri LA Agar
Kohlehydrat Stunden Inkublerung
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Inosit Sorbit Raffinose
I 2. 2 i
309810/1117
ORKWNAL INSPECTED
- HZ -
Mikroti tr at ionsplatten--Technik Organismus . Medium
Shigella flexneri Brühe
Kohlehydrat Stunden Inkublerung
I 2 2 1 1 §.
Dextrose Laktose Sukrose Mannit Dulcit Inosit Sorbit Raffinose
309810/1117
Mikrotitratj onsplatten-Technik
Organ! SmUS 1 . · Medium Serratia marcescens' 5966 Agar
Kohlehydrat Stunden-Inkubierung
I 2 1 .i" ^ 6
Dextrose -+++++
Laktose ______
Sukrose - + + +
Mannit --"++++
Dulcit _____>
Inosit - - - + +
Sorbit -___++
Raffinose · --■-__._
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7242847
2: illl&a£.rlzTj IAUI1IiIi
Medi urn
Serratja marceaccns ^f)GG Brühe Kohlehydrat S_t_ur)don Inkt'.biei
I £ 1 i
Dextrose +-}· + +
Laktose -
Sukrose + + +
Mannit +
Dulcit -
Inosit
Sorbit -
Raffinone -
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'I1S -
Mikr et.11 r at 1 onjspjji _t t_en -Te qhnijc
Organ i .qmu? . Modiiirn
Salmonella typhlmuriurr. \y-)W Agar
Kohlehydrat Stunden Inkubierung
Ig 1 i £ 6
Dextrose ' - + + + + +
Laktose »-__-_
Sukroae
Mannit - + ' + + 4- +
Duloit ---- + +
Inosit - --._--.-.
Sorbit ■ --++++
Raffinose ______
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Claims (1)

  1. Pat e 'jt.a η B-prU Cj1U?
    1. Mikromcthüde zur Bestimmung von biologisch aktiven Materialien, dadurch gekennzeichnet, dass nmn oin wässriges Gemisch des biologisch aktiven Materials einem lyophilisierten Nährmedium, welches aus Agar-Agar in Kapillari'öhrchen odor aus NährbrUhe in Mikrobehälter oder in Mikrotltrationsplatten besteht und einen Indikator enthält, zusetzt und das Wachstum misst.
    2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    dass das Nährmediuni au£j Agar-Agar, welches Kohlehydrate enthält, besteht.
    3. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mährmedium aus Agar-Agar, welches Aminosäuren enthält, besteht;
    4. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium aus einer NährbrUhe, welche Kohlehydrate enthält, besteht.
    5· Methode nach .Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium aus einer NährbrUhe, welche Amino säuren enthält, besteht.
    6. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 5i dadurch gekennzeichnet, das» das Nährmedium ein Antibiotikum enthält.
    7. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die biologisch aktiven Materialien humanpathogene Bakterien sind.
    309810/1117 ^ΜΙβΙΝΑί
    8. Mathode nach Anspruch 7, dadurch
    gekennzeichnet, dass die biologisch-aktiven Materialien En t er ob cc teri ac cae sind.
    (9) Lyophilisiertes Nährmediuni zur Bestimmung von biologisch aktiven Materialien in einer Mikromethode, enthaltend Agar-Agar in Kapillarröhrchen oder NahrbrUhe in Mikrobehälter oder in Mikroti trati nnsn] atten und einen Indikator, welcher für die Messung des durch die Zugabe eines wässrigen Gemisches eines.biologisch aktiven Materials · verursachten Wachstums geeignet, ist. ■ ' ·
    10. Lyophilisiertes Nährmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Agar-Agar,. welches Kohlehydrate enthält, besteht.
    11. Lyophilisiertes Nährmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Agar-Agar, welches Aminosäuren enthält, besteht.
    12. Lyophilisiertes Nährmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Nährbriihe, welche Kohle-'hydrate enthält, besteht.
    IJ). Lyophilisiertes Nährmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Nährbrühc, welche Aminosäure enthält, besteht.
    I2I. Lyophilisiertes Nährmedium nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Agar-Agar oder die Nährbriihe ein Antibiotikum enthalten.
    Vl. Lyoi i;ii:i rjiei'Len J^ihrnuidi ur. nar.h einem der. Ansprüche .9 bi:; .T'i, o.;..d'·' ch p,ekc;iin/,o1 ohr-ot, i'hi;·.; o:> zur Bestimmung
    30 9 810/1117
    BAD ORIGINAL
    _. -Ί /■: „
    22428Α7
    von humanpatho^oinen Bakterien vervrendet wird.
    16. Lycjjhilisierl.es Nänrnicdj um nach Anspruch IS, dadui'ci) gokeln.·7«? j ohnet, dans es zur Bestimmung von Jinterobacteriacene verv.'cnuet wird.
    17. Verv/endunß des lyophili.sierten Nährmediunis gemäss einem der Ansprüche 9 his l6 in einer Mikrornethode gernäss einem der Ansprüche 1 bis ö.
    30981 0/1117
    8AD ORlQfNAL
DE19722242847 1971-09-02 1972-08-31 Lyophilisiertes naehrmedium Ceased DE2242847A1 (de)

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