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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum schnellen
Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von antimikrobiellen Resten
in Eiern.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Anwesenheit von antimikrobiellen Resten in Nahrungsmitteln und Futtermitteln
ist wegen gesundheitsbezogener Probleme und dem Anstieg von Arzneimittel-resistenten Bakterien
eine wachsende Sorge unter den Konsumenten. Antibiotika werden nicht
nur als Arzneistoff angewandt, sondern im Fall von Geflügel sicherlich
auch weit verbreitet als antimikrobielle, wachstumsfördernde
Substanzen. Es ist gut bekannt, dass Konzentrationen von antimikrobiellen
Resten in Eiern hoch sein können.
In den meisten Ländern,
wie den Ländern
der Europäischen Gemeinschaft,
Kanada und den Vereinigten Staaten sind Rest-Höchstwerte (engl.: „Maximum
Residue Levels")
(MRL) durch Gesetz geregelt.
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Testverfahren,
um antimikrobielle Reste in Körperflüssigkeiten,
wie Milch oder Urin, nachzuweisen, wie mikrobielle Inhibitionstests
(z.B. Agardiffusionstests) oder Verfahren, die selektive Bindermoleküle (z.B.
Antikörper
oder Indikatorsubstanzen) nutzen, sind gut bekannt. Beispiele für mikrobielle
Testverfahren sind in der GB-A-1467439,
EP 0005891 ,
DE 3613794 ,
CA 2056581 ,
EP 0285792 und
US 5494805 beschrieben worden. Diese
Dokumente handeln alle von gebrauchsfertigen Tests, die einen Testorganismus
nutzen. Der Testorganismus ist meist in ein Agarmedium, das einen
Indikator, eine Pufferlösung,
Nährstoffe
und Substanzen, um die Sensitivität für bestimmte antimikrobielle
Verbindungen in einer positiven oder negativen Art zu ändern, enthalten
kann, eingebettet.
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Beispiele
für geeignete
Testorganismen sind Stämme
von Bacillus, Streptococcus oder E. coli. Im Allgemeinen besteht
das Prinzip dieser Tests darin, dass wenn antibakterielle Verbindungen
in einer Probe in Konzentrationen vorhanden sind, die ausreichend
sind, das Wachstum des Testorganismus zu hemmen, die Farbe eines
Säure/Basen-
oder Redoxindikators gleich bleibt. Wenn jedoch keine Inhibition erfolgt,
wird das Wachstum des Testorganismus von der Bildung von sauren
oder reduzierten Stoffwechselprodukten begleitet, was zu einem Farbwechsel des
Indikators führt.
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Diese
Testverfahren sind für
den Nachweis von antimikrobiellen Resten in Körperflüssigkeiten geeignet. Bis jetzt
war jedoch, wegen der Anwesenheit von antimikrobiellen Substanzen,
wie Lysozym, die in Eiern natürlicherweise
in hohen Konzentrationen vorhanden sind, kein Nachweis von antimikrobiellen
Resten in Eiern möglich.
Diese inhibierenden Substanzen zeigen eine inhibierende Aktivität gegen die
Testmikroorganismen, was zu falschpositiven Ergebnissen führt.
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Im
Fall von z.B. einer Milch- oder Urinprobe können inhibierende Substanzen
wie Lysozym oder Lactoferrin durch Erwärmen der Probe z.B. auf 80 °C für 10 Minuten
(Vermunt et. al., Niederländisches Milch
und Milchprodukt Journal 47:(1) 31–40 (1993)), oder unter Verwendung
von gut bekannten Dialyseverfahren (van Wall, Archiv für Lebensmittelhygiene 29:(6)235
(1978)) inaktiviert werden. Nach dieser Vorbehandlung kann die flüssige Probe
für weiteres Testen
einfach durch Befolgen der Arbeitsvorgänge des Tests verwendet werden.
Im Fall einer Delvotest
® -Art von Test (
EP 0005891 ) kann die flüssige Probe direkt
zum Test zugefügt
werden, wonach der Test inkubiert wird.
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Erwärmen einer
Ei-Probe auf Temperaturen, die ausreichend sind, um inhibierende
Substanzen des Eies, wie Lysozym, zu inaktivieren, führt immer zu
einer Gerin nung der Probe. Es wurde angenommen, dass solche Proben
für eine
weitere Verarbeitung nicht mehr geeignet wären.
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Bis
jetzt müssen,
nach dem Erwärmen
auf eine Temperatur, die ausreichend ist, um andere antimikrobielle
Substanzen als antimikrobielle Reste, zu inaktivieren, die nachzuweisenden
antimikrobiellen Reste aus der geronnenen Ei-Probe extrahiert werden.
Diese Extraktionsverfahren kosten nicht nur viel Zeit und zusätzliche
Handhabung sondern, schlimmer noch, führen immer zu Verlust von mindestens einem
Teil der antimikrobiellen Reste, wenn sie in der Probe vorhanden
sind (Inglis et. al., Journal for the Association of Official Analytical
Chemists 61: (5) 1098–1102
(1978); Katz et. al., Journal of the Association of Official Analytical
Chemists 61: (5) 1103–1106
(1978); Janetschke et. al., Monatshefe für Veterinaermedizin 34: (21)
824–826
(1979); Steiner, Monatshefe für
Veterinarmedizin 45: (11) 382–386 (1990)).
Dies kann zu falschnegativen Ergebnissen und deshalb zu Antibiotika
in Konsumenten-Eiern führen,
was natürlich
aus einem Gesundheitsaspekt nicht akzeptabel ist. Außerdem sind
Labore, die Studien ausführen,
welche die Anwesenheit oder Abwesenheit von antimikrobiellen Resten
in Nahrungsmitteln betreffen, durch die Zeit begrenzt, die zur Durchführung dieser
Studien zur Verfügung
steht. Mit den gegenwärtigen,
zeitraubenden Verfahren kann nur eine sehr begrenzte Menge an Ei-Proben untersucht werden.
Weiterhin können
diese Assays nur in gut ausgestatteten Laboren und von gut ausgebildeten Personen
durchgeführt
werden, was ebenfalls ein begrenzender Faktor ist.
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Man
kann daraus folgern, dass bis heute kein geeignetes Testverfahren
für den
Nachweis von antimikrobiellen Resten in Ei-Proben erhältlich ist. Die
gegenwärtigen
Verfahren sind unzuverlässig, können sowohl
zu falschpositiven als auch falschnegativen Ergebnissen führen, was
wiederum zu nicht akzeptablen Mengen Antibiotika in der Nahrungskette
und zu wirtschaftlichen Verlusten führt.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen verlässlichen und einfach durchzuführen Ein-Schritt-Test
zum Nachweis von antimikrobiellen Resten in Eiern bereit.
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Unerwarteterweise
wurde herausgefunden, dass wenn eine Ei-Probe einem Test, der zum
Nachweis von antimikrobiellen Resten geeignet ist, zugefügt wird
und dann für
eine ausreichende Zeit bei einer ausreichenden Temperatur, um natürliche,
inhibierende Verbindungen des Eies zu inaktivieren, inkubiert wird,
der Test direkt nach dem Erwärmen
inkubiert werden kann, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von antimikrobiellen
Resten zu bestimmen.
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Es
wurde überraschenderweise
herausgefunden, dass antimikrobielle Reste direkt aus der geronnenen
Ei-Probe in das
Testsystem diffundieren. Deshalb werden zusätzliche Extraktionsverfahren, um
die antimikrobielle Reste aus der geronnenen Ei-Probe zu gewinnen,
nicht benötigt.
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Erfindungsgemäß wird daher
ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines antimikrobiellen
Restes in einem Ei bereitgestellt, wobei das Verfahren:
- (i) das Kontaktieren der Probe mit einem mikrobiellen Inhibitionstest,
der zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines antimikrobiellen
Restes in der Probe geeignet ist,
- (ii) das Erwärmen
der kontaktierten Probe und des Tests für ein ausreichendes Zeitintervall,
um eine natürliche,
inhibierende Verbindung, z.B. Lysozym, die in der Probe vorhanden
ist, zu inaktivieren, und
- (iii) das Inkubieren der kontaktierten Probe und des Tests
umfasst.
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Mit
natürlichen,
inhibierenden Verbindungen sind Verbindungen gemeint, welche den
Test stören könnten und
die natürlicherweise
in der Probe vorhanden sind, wie natürliche, inhibierende Verbindungen
beispielsweise Lysozym. Daher ist mit Stören oder Inhibieren das Verhalten
der Verbindung auf Teilen des Tests, beispielsweise dem Testmikroorganismus
gemeint.
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Die
genauen Zeit/Temperatur-Erfordernisse hängen vom z.B. Zustand der Probe
(z.B. der Starttemperatur, dem Volumen der Probe, Gesamtei, Eiweib
oder Eidotter); der Art des Tests oder des im Test verwendeten Mikroorganismus
ab (z.B. thermophile Bacillus- oder Streptomycesarten). Natürlich muss
darauf geachtet werden, dass die Wärmebehandlung die nachzuweisenden,
antimikrobiellen Reste nicht inaktiviert. Die Wärmebehandlung kann unter Verwendung
jedes im Stand der Technik bekannten Verfahrens, z.B. durch Erwärmen in
einem Wasserbad oder durch Verwendung eines Inkubators, wie unten
beschrieben, ausgeführt
werden.
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Beispielsweise
kann der Test in der folgenden Weise durchgeführt werden:
- 1.
Eine Probe des Eies wird erhalten, indem man ein Loch von z.B. ungefähr 1–2 Quadratzentimetern
in das Ei macht, den Eidotter ansticht, das Ei mit dem Loch nach
unten auf eine Flasche setzt, nachdem das Ei leer ist, wird die
Flasche geschlossen und die Probe durch Schütteln homogenisiert. Als Alternative
kann natürlich
jedes andere im Stand der Technik bekannte Verfahren, um eine Probe
des Gesamteies, Eiweißes
oder Eidotters zu erhalten, verwendet werden;
- 2. Füge
eine ausreichende Menge der zu testenden Ei- Probe unter Verwendung von gut bekannten
Verfahren einem Test zu;
- 3. Erwärme
den Test, z.B, für
ungefähr
10 Minuten bei 80 °C,
um die natürlichen,
inhibierenden Substanzen (z.B. Lysozym) zu inaktivieren, die Ei-Probe
gerinnen lassen;
- 4. Inkubiere den Test unter Befolgung der Standard-Arbeitsvorgänge des
Tests und lese das Ergebnis ab.
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Jeder
mikrobielle Inhibitionstest, der zum Bestimmen der Anwesenheit oder
Abwesenheit eines antimikrobiellen Restes in der Probe geeignet
ist, kann in einem Verfahren der Testkits der Erfindung verwendet
werden. Beispiele werden in GB-A-1467439, EP-0005891, DE-3613794, CA-2056581,
EP-028579 und
US 5,494,805 beschrieben.
Geeignete Tests sind solche, in denen ausgewählte, sensitive Mikroorganismen
verwendet werden, z.B. mikrobielle Agardiffusionstests.
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Beispiele
für geeignete,
mikrobielle Agardiffusionstests sind Tests, in denen Arten von Bacillus, Streptococcus
oder E.coli verwendet werden. Vorzugsweise werden thermophile Arten,
z.B. Bacillus stearothermophilus und Streptococcus thermophilus verwendet.
Beispiele für
bevorzugte Stämme
sind Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 (1974 hinterlegt
beim Labor für
Mikrobiologie der Technischen Universität von Delft unter der Zugangsnummer
LMD 74.1 und 1983 beim zentralen Büro für Schimmelkulturen (CBS), Baarn
unter der Zugangsnummer CBS 760.83, wo der Stamm der Öffentlichkeit
zur Verfügung
steht) und Streptococcus thermophilus T101 (DSM 4022, hinterlegt
am 3. März
1987). Beide Stämme
sind sehr sensitiv für
antimikrobielle Verbindungen, insbesondere Chemotherapeutika wie
Sulfonamidverbindungen und Antibiotika, wie Penicilline und Tetracycline.
E.coli Stämme
oder andere geeignete, gram-negative Bakterien können zum Nachweis von z.B.
Quinolonen verwendet werden.
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Bacillus
stearothermophilus var. calidolactis 0953 und Streptococcus thermophilus
T101 sind schnell wachsend und haben den Vorteil, dass sie thermophil
sind. Beispielsweise ist die optimale Wachstumstemperatur des Bacillus
Stammes von 50° bis
70 °C. Der
Testorganismus ist deswegen für einen
erfindungsgemäßen Test
sehr geeignet, da er durch das Erwärmen, um die natürlichen,
inhibierenden Verbindungen, welche in der Ei-Probe vorhanden sein
können,
zu inaktivieren, nicht abgetötet wird.
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Wenn
der Testorganismus ein Bacillus Stamm ist, wird er vorzugsweise
in der Form einer Sporensuspension in das Agarmedium eingebaut, welche
vor dem Erstarren durch bekannte Verfahren (siehe beispielsweise
GB-A-1467439) hergestellt und in das Agarmedium eingebaut werden
kann. Wenn der Testorganismus ein Streptococcus Stamm ist, werden
die Bakterien vorzugsweise in der Form von bakteriellen Zellen in
das Agarmedium eingebaut, welche gemäß bekannter Verfahren (siehe
beispielsweise
EP 0285792 )
hergestellt werden können. Die
Konzentration des Testorganismus im Agarmedium beträgt vorzugsweise
zwischen 10
5 und 10
10 Kolonie-bildende
Einheiten pro ml Agarmedium.
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Geeignete
Nährstoffe,
um eine Vermehrung des Testorganismus in der Abwesenheit von antimikrobiellen
Resten zu ermöglichen,
sind beispielsweise assimilierbare Kohlenstoffquellen (z.B. Lactose, Glucose
oder Dextrose), assimilierbare Stickstoffquellen (z.B. Pepton) und
Quellen von Wachstumsfaktoren, Vitaminen und Mineralien (z.B. Hefe-Extrakt).
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Das
Wachstum des Testmikroorganismus kann unter Verwendung gut bekannter
Verfahren nachgewiesen werden, vorzugsweise durch Farbwechsel des
Agarmediums der Testprobe. Typischerweise wird ein Farbindikator,
vorzugs weise ein Säure-Basen-
oder ein Redoxindikator, verwendet. Beispiele für geeignete Säure-Basenindikatoren
schließen
Bromcresolpurpur und Phenolrot ein. Beispiele für geeignete Redoxindikatoren
schließen
Brilliantschwarz, Methylenblau, Toluidinblau und Nilblau ein. Außerdem können Kombinationen
von zwei oder mehreren Indikatoren verwendet werden.
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Wahlweise
kann die Sensitivität
des Tests durch Zugabe von bestimmten Substanzen verändert werden,
durch Ändern
der Testbedingungen, wie pH oder Konzentrationen von Puffersubstanzen
oder Agar oder durch Variieren der Volumenverhältnisse von Agar und Ei-Probe.
Beispiele für
Substanzen, die dem Testsystem zugefügt werden können, um die Sensitivität zu ändern, sind
Nukleoside wie Adenosin, oder Antifolate, wie Trimethoprim, Ormethoprim oder
Tetroxoprim, welche die Sensitivität des Testorganismus gegenüber Sulfonamidverbindungen
verbessern. Salze der Oxalsäure
oder Flußsäure können zugefügt werden,
um die Sensitivität
gegenüber Tetracyclinen
zu verbessern. Cystein kann zugefügt werden, um die Sensitivität gegenüber Penicillinen zu
vermindern.
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Die
Menge an Ei-Probe (Gesamt-Ei, Eiweiß oder Eidotter von jeder Art,
vorzugsweise Geflügel), die
zum Test hinzugefügt
werden muss, hängt
vom Testsystem ab. Für
mikrobielle Diffusionstests werden dem Test typischerweise von 0,01
bis 1,0 ml, vorzugsweise von 0,05 bis 0,5 ml unter Verwendung gut bekannter
Verfahren zugefügt.
Nach Zugabe der Ei-Probe wird der Test erwärmt, um die natürlichen, antimikrobiellen
Verbindungen, die in der Probe vorhanden sind, z.B. Lysozym der
Ei-Probe, zu inaktivieren. Vorzugsweise wird der Test für von 2
bis 20 Minuten bei von 70 °C
bis 100 °C
erwärmt,
weiter bevorzugt wird der Test für
von 10 bis 15 Minuten bei von 75 °C
bis 85 °C
oder für
von 2 bis 6 Minuten bei ungefähr
100 °C erwärmt. Jede
andere Zeit/Temperatur-Behandlung,
die ausreichend ist, um die natürlichen,
inhibierenden Verbindungen des Eies zu inaktivieren ohne die nachzuweisenden
antimikrobielle Reste zu inaktivieren, kann verwendet werden.
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Nach
der Wärmebehandlung
wird der Test unter Befolgung der Anweisungen des Testherstellers
inkubiert. Die Inkubationszeit des Tests ist von den Umständen abhängig. Im
Falle eines Agardiffusionstests unter Verwendung von Bacillus stearothermophilus
wird der Test in einem Wasserbad oder einem Heizblock bei von 60 °C bis 70 °C, vorzugsweise bei
von 62 °C
bis 65 °C
inkubiert. Typischerweise können
Ergebnisse nach 1,5 bis 4 Stunden, vorzugsweise von 2,5 bis 3,5
Stunden erhalten werden.
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Herkömmliche,
mikrobielle Inhibitionstests, die zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung geeignet sind, schließen
die kommerziellen Produkte Delvotest®, Premi®test
und BR-test® (erhältlich von DSM
N.V. Holland) den ADM Copan®test (Copan, Italien)
und den Charm®AIM
test (Charm, USA) ein. Inaktivierung der natürlichen, inhibierenden Verbindungen,
die in der Ei-Probe
vorhanden sind, z.B. Lysozym, wird vorzugsweise durch Erwärmen, beispielsweise
für von
5 bis 15 Minuten bei beispielsweise von 75 °C bis 85 °C erzielt. Als Alternative kann
jede andere Temperatur/Zeit-Behandlung, die ausreichend ist, um
die Wirkungen zu erzielen, verwendet werden.
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Inkubatoren,
die geeignet sind die Wärmebehandlungen,
wie in dieser Erfindung beschrieben, durchzuführen können in solch einer Weise gebaut werden,
dass nachdem die Testeinheiten in den Inkubator gestellt wurden,
Wärme-
und Inkubationsbehandlungen wie oben beschrieben durchgeführt werden
können.
Die erste Wärmebehandlung,
um die inhibierenden Verbindungen zu inaktivieren und wahlweise,
um eine feste Matrix zu bilden und/oder die Sporen zu aktivieren,
wird bei einer höheren
Temperatur durchgeführt,
wonach die Inkubation des Tests bei einer niedrigeren Temperatur
fortgesetzt werden kann. Wahlweise kann der Inkubator nach der Inkubation
des Tests auf eine Temperatur herunterkühlen, die ausreichend ist,
um den Test zu stoppen.
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Ein
Beispiel für
solch einen Inkubator ist ein Heizblock, in welchen Testeinheiten
(z.B. Ampullen) gestellt werden können. Beispielsweise im Falle
eines herkömmlichen,
mikrobiellen Agardiffusionstests unter Verwendung eines Bacillus
stearothermophilus Stamms kann der Inkubator/Heizblock eine Anzahl von
für das
darin Hineinstellen von Testampullen oder Testplatten (z.B. Delvotest® oder
Premi®Test) geeigneten
Löchern
enthalten. Nach dem Hineinstellen der Ampullen oder Platten erwärmt der
Inkubator den Test auf eine Temperatur von z.B. von 75 °C bis 85 °C für z.B. von
10 bis 20 Minuten, wonach der Inkubator auf eine niedrigere Temperatur
von 62 °C
bis 65 °C
für von
1,5 bis 4 Stunden (Inkubation des Tests) schaltet. Natürlich hängen die
genauen Zeit/Temperaturintervalle von vielen Faktoren ab und werden
sich je nach Art des Tests unterscheiden. Diese Erfindung schließt alle
Inkubatoren ein, die in der Lage sind, eine Vor-Inkubation bei einer
bestimmten Temperatur für
eine bestimmte Zeit, direkt gefolgt von einer Inkubation bei geringerer
Temperatur für
einen bestimmten Zeitraum durchzuführen. Wahlweise kann der Inkubator
nach der Inkubation des Tests auf eine Temperatur herunterkühlen, die
ausreichend ist, um den Test zu stoppen.
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Das
in dieser Erfindung beschriebene Verfahren ist sehr einfach durchzuführen, so
dass Personen, die diesen Test ausführen, nicht besonders ausgebildet
oder geschult werden müssen.
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Beispiel 1
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Herstellung einer Gesamtei-Probe
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Um
eine Ei-Probe zur Untersuchung auf die Anwesenheit oder Abwesenheit
von antimikrobiellen Resten zu erhalten, wurde ein Loch von ungefähr 1–2 cm2 in das Ei gemacht, der Eidotter wurde angestochen
und das Ei wurde mit dem Loch nach unten auf eine Flasche gesetzt,
wobei das Eiweiß und
der Eidotter in die Flasche tropfen konnten. Nachdem das Ei geleert
war, wurde die Flasche verschlossen und die Probe durch Schütteln homogenisiert.
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Beispiel 2
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Inaktivierung
von natürlichen,
inhibierenden Verbindungen des Eies und Untersuchung der Probe auf
Delvotest
® Proben
von 5 Eiern (doppelt), die keine antimikrobiellen Reste enthielten,
wurden gemäß des in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens erhalten. Um die natürlichen,
inhibierenden Verbindungen, die in der Ei-Probe vorhanden sind,
zu inaktivieren, wurden 100 μl
von jeder der 5 Proben auf Delvotest
® Ampullen
zugefügt.
Der Test wurde gemäß der Verfahren
hergestellt, die in der
EP 0005891 beschrieben sind,
wobei die Nährstoffe
im Agar vorhanden waren. Nach Erwärmen für 10 Minuten bei 80 °C in einem Wasserbad,
wurden die Ampullen sofort in ein Wasserbad bei 64 °C gestellt
und unter Befolgung der Herstelleranweisungen inkubiert. Nach 140
Minuten änderte
sich die Farbe aller Tests von Purpur nach gelb, was anzeigt, dass
keine antimikrobielle Reste vorhanden waren.
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Kontrollproben
wurden nicht auf 80 °C
für 10 Minuten
erwärmt,
sondern direkt auf die Ampulle gesetzt. Diese Tests blieben für mindestens
4 Stunden pupur.
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Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, dass natürliche, inhibierende Verbindungen
in der Ei-Probe den Test inhibierten, was zu falschpositiven Ergebnissen
führte.
Wenn die Probe wie oben beschrieben erwärmt wurde, war die Aktivität der natürlichen,
inhibierenden Verbindungen beseitigt und falschpositive Ergebnisse
wurden nicht mehr beobachtet.
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Beispiel 3
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Bestimmung der Sensitivität des Delvotests® gemäß des in
dieser Erfindung beschriebenen Verfahrens unter Verwendung von versetzten
Proben
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Ei-Proben
wurden unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens
erhalten. Die Proben wurden durch Zugabe von Penicillin G (0 und 4
ppb) oder Sulphadiazin (0 und 100 ppb) versetzt. Die Ei-Proben wurden
Delvotest® Ampullen
(siehe Beispiel 2) gemäß des in
dieser Erfindung beschriebenen Verfahrens zugefügt: für 10 Minuten bei 80 °C erwärmt und
dann unmittelbar in ein Wasserbad bei 64 °C gestellt und unter Befolgung
der Herstellerinstruktionen inkubiert. Die Ergebnisse wurden ausgelesen,
sobald die Farbe zu Gelb wechselte (nach 140 Minuten). Die Proben,
die kein Penicillin G (0 ppb) oder Sulphadiazin (0 ppb) enthielten,
waren negativ, während
die Proben, die mit 4 ppb Penicillin G und 100 ppb Sulphadiazin
versetzt waren, Purpur (positiv) blieben.
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Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, dass das in dieser Erfindung beschriebene
Verfahren zum Nachweis von antimikrobiellen Resten in Ei-Proben geeignet
ist.