DE69016367T2 - Selectivmedium für Pilze. - Google Patents
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-
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung und den Nachweis von Hefen, Fadenfungi und anderen klinisch signifikanten Fungi aus normalerweise sterilen Körperflüssigkeiten. Insbesondere betrifft sie ein flüssiges Kulturmedium zur Verwendung für die Gewinnung und den Nachweis klinisch signifikanter Fungi.
- Der Nachweis einer Pilzinfektion ist in einem Zeitalter von Patienten mit Gefährdungen durch ihr Immunsystem (z.B. Leber- Transplantation, Chemo-Therapie, Patienten mit Autoimmunkrankheit und erworbener Immunschwäche) immer wichtiger geworden. Unglücklicherweise existiert kein einziges Medium, das für schnelles Wachstum und den Nachweis einer breiten Reihe klinisch signifikanter Fungi geeignet ist und wirtschaftlich ist. Ein amtliches Handbuch konstatiert, daß "die meisten serologischen Pilztests (mit Ausnahme der Cryptococcus-Antigen-Untersuchung) im allgemeinen nicht hilfreich sind, um eine Diagnose über Pilzinfektionen im Patienten mit Gefährdungen durch sein Immunsystem zu machen . . . es sollte eine Reihe geeigneter Medien verwendet werden, da kein einziges Kulturmedium allein für die Gewinnung aller ethiologischer Pilzmittel ausreichend ist.", G.D. Roberts et al., "Detection and Recovery of Fungi in Clinical Specimens", Manual of Clinical Microbiology, 4. Ausgabe, Lennette, E.H. et al, Ed. (l985). Zur Gewinnung von Fungi von klinischen Mustern empfohlene Medien sind (wie auf Seite 510 empfohlen): Gehirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar, hemmender gegossener Agar, Sadhi-Agar, Hefeextrakt-Phosphat-Agar, BHI- Agar mit 5 bis 10 % Schafblut und verschiedene Spezialmedien (d.h. mycobiotischer Agar, Mycosel-Agar). Diese sind alle feste (Agar enthaltende) Medien. Die Zusammensetzung dieser Medien kann im Manual of Clinical Microbiology, Kapitel 111 (Kultur- Medien) gefunden werden. Andere Medien, die zum Wachstum von Fungi verwendet werden, sind: Sabouraud-Agar, Sabouraud- Dextrose-Agar und Malzextrakt-Agar.
- Fast alle der vielen Medien, die zur Verwendung mit Fungi beschrieben sind, sind spezialisiert, um das Wachstum nur ausgewählter Gruppen von Fungi zu ermöglichen, oder sie werden wegen ihrer Fähigkeit verwendet, die Identifizierung bestimmter Fungi zu unterstützen. Diese sind daher von den oben aufgeführten Medien, die versuchen, das Wachstum des weitestmöglichen Bereiches verschiedener Fungi-Typen zu unterstützen, ziemlich verschieden.
- Praktisch alle Kultur-Medien, die für Gewinnung, Kultivierung, Wachstum und Identifizierung von Fungi entwickelt sind, sind fest oder zweiphasig. Das Isolator -System (Dupont, Wilmington, Del) verwendet feste Medien. Mit diesem System muß die Probe in ein Zentrifugenglas überführt werden und zentrifugiert werden. Danach wird eine geringe Menge des zentrifugierten Materials auf eine Anzahl fester Medien plattiert. Das Septi- Chek -System (Roche Diagnostics, Nutley, NJ) ist ein zweiphasiges System mit einem festen Malz-Agar auf einem Spatel, der nach der Inokulation der Nährflüssigkeit mit der Probe an einer ein Nährflüssigkeits-Medium enthaltenden Flasche befestigt sein muß. Das Malz ist für Fungi optimiert, aber es ist nicht selektiv. Ein anderer Typ eines zweiphasigen Systems ist im allgemeinen als die Castaneda-Flasche bekannt. Diese Systeme sind von einer Anzahl von Herstellern erhältlich und enthalten sowohl flüssige als auch feste Medien zusammen in einer Flasche. Zweiphasige Systeme leiden an einem beträchtlichen Nachteil dadurch, daß eine ausreichende Belüftung der flüssigen Phase nicht erreicht werden kann.
- Es sind ausschließlich flüssige Medien aus Blutkultur erhältlich, die das Wachstum und den Nachweis von Fungi ermöglichen, aber diese Medien sind für das Wachstum und das Gewinnen sowohl von Bakterien als auch von Fungi bestimmt. Wo Bakterien vorhanden sind, kann das schnelle Wachstum der Bakterien Fungi maskieren, die langsamer wachsen. Automatisierte Blutkultur-Systeme wie das Bactec -System (Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Towson, MD) sind für das Screening flüssiger Proben auf Anwesenheit von Fungi gut geeignet. Jedes der Bactec -Systeme umfaßt ein Instrument, das Flaschen mit Blutkultur inkubiert, die ein Medium und eine Probe enthalten, und prüft die Flasche periodisch auf ein Ansteigen von Kohlendioxid, wodurch die Anwesenheit von Mikroorganismen angezeigt wird. Das Bactec 460 -System verwendet Kulturmedien mit C¹&sup4;-angereicherten Nährstoffen. Der Verbrauch dieser Nährstoffe führt zur Produktion von gasförmigen C¹&sup4;O&sub2; in einem Gasraum über dem Füllstand des Kulturmediums in der Flasche. Das Instrument nimmt periodisch vom Gas im Gasraum eine Probe und weist eine erhöhte Radioaktivität nach. Die Systeme Bactec-660 und Bactec-730 verwenden nicht-radiometrische Medien. In diesen Systemen wird das Wachstum von Mikroorganismen nachgewiesen, indem ein Anwachsen der Extinktion von Strahlung im nahen Infrarot gemessen wird, was mit einer erhöhten CO&sub2;-Konzentration verbunden ist.
- In den Bactec -Systemen verwendete Medien unterstützen das Wachstum von Fungi, sind aber für das Wachstum und für den Nachweis von Fungi nicht gut geeignet. Sie sind primär für das Wachstum von Bakterien entworfen, so daß Fungi nicht optimal wachsen. Darüber hinaus kann das Wachstum von Fungi durch ein übermäßiges Wachstum aller vorhandener Bakterien maskiert werden. Schließlich kann der Metabolismus von Blut in der Probe die Anwesenheit von Fungi aus zwei Gründen maskieren. Zunächst verbrauchen die Blutzellen selbst Nährstoffe, wodurch. Hintergrundpegel von erhöhtem CO&sub2; produziert werden. Während dieses Hintergrund-Rauschen akzeptabel ist, wenn viel schneller wachsende Bakterien nachgewiesen werden, ist es inakzeptabel, wenn versucht wird, vergleichsweise langsam wachsende Fungi nachzuweisen. Es ist sogar noch problematischer, wenn eine große Blutprobe verwendet wird (z.B. 10 ml), was wünschenswert ist, wenn auf Fungämie untersucht wird. Zweitens hemmt Blut das Wachstum von Pilzen.
- Weiterhin offenbart WO 89/00204 ein Wachstumsmedium für Hefen, das selektiv prokariotische Mikroorganismen hemmt, EP-A-0 107 070 offenbart ein Deaktivierungs-System für antimikrobielle Faktoren, das Antikoagulationsmittel und lysierende Mittel umfassen kann (falls das Lysieren von Blut erwünscht ist) und CH-A-614466 offenbart ein Verfahren zum Identifizieren von Fungi und Hefen in einem flüssigen oder festen Kulturmedium durch Durchführung einer mikroskopischen Untersuchung. Jedoch ist keines der in den vorstehenden Dokumenten aufgeführten Kulturmedien zum selektiven Kultivieren von Fungi geeignet.
- Folglich besteht eine Notwendigkeit für ein flüssiges Medium, in dem eine große Menge klinisch signifikanter Fungi schnell und selektiv wächst.
- Die vorliegende Erfindung ist ein flüssiges Medium, dadurch gekennzeichnet, daß es das Wachstum verschiedener Fungi fördert, während es das Wachstum nicht fungusartiger Mikroorganismen hemmt. Eine Probe einer normal sterilen Körperflüssigkeit (wie pleurale, synoviale, cerebral spinale, ascitische etc.) oder bevorzugt Blut wird aseptisch dem Medium hinzugefügt und die Ampulle wird dann bei 30 ºC bis 35 ºC unter Rühren für einen Zeitraum von bis zu mehreren Wochen inkubiert. Die Anwesenheit von lebensfähigen Fungi in der Ampulle mit dem Medium wird durch Sichtprüfung der Ampulle auf eine erhöhte Trübung, Farbänderungen des Mediums, ausgebeuelte Septen oder andere Anzeichen für das Wachstum von Organismen oder durch das aseptische Entfernen einer kleinen Probe und die Durchführung einer mikroskopischen Untersuchung oder einer Subkultur auf geeignete feste Medien nachgewiesen.
- Bevorzugt wird das Wachstum von Fungi im Medium durch ein automatisiertes Blutkultur-System wie dem Bactec -System nachgewiesen. Zur Verwendung im Bactec -NR 660 und NR 730 kann das Medium in eine 50 ml-Ampulle gepackt sein, wobei Gas über der Flüssigkeit steht (Gas im freien Raum), das mit Kohlendioxid einer speziellen und bekannten Konzentration angereichert ist. Das Wachstum von Fungi kann dann nachgewiesen werden, indem erhöhte Kohlendioxid-Mengen gemessen werden.
- Fungi, die im Medium der vorliegenden Erfindung wachsen können, reichen von "Hefen" bis zu dimorphen oder fadenartigen Formen. Typische Beispiele umfassen die Arten von Candida, Torulopsis, Cryptococcus, Geotrichum, Saccharomyces, Aspergillus und Histoplasma.
- Das flüssige Medium der vorliegenden Erfindung umfaßt stickstoffhaltige Nährstoffe, einen oder mehrere Zucker, ausgewählt aus der aus Glucose, Saccharose und Maltose ausgewählten Gruppe, ein Blut-Anticoagulationsmittel, eine Quelle für Eisen(III) oder Eisen(II) und eine wirksame Menge einer oder mehrerer antimikrobieller Mittel, die das Wachstum von Bakterien hemmen, ohne das Wachstum von Fungi zu hemmen. Das Medium unterscheidet sich von herkömmlichen Medien dadurch, daß das Verhältnis von Zucker zu stickstoffhaltigen Nährstoffen auf nominell 1 : 2 erhöht ist, daß es Chemikalien enthält, um das Wachstum von Fungi zu fördern (Myo-Inosit und Eisen(III)ammoniumcitrat) ünd daß es antimikrobielle Mittel enthält, wodurch das Wachstum von Bakterien gehemmt wird. Diese einmalige Kombination erzeugt zwei primäre Effekte:
- 1. Optimale Bedingungen für das Wachstum von Fungi in einem fluiden Kulturmedium und
- 2. Inhibierung von nicht fungusartigen Mikroorganismen.
- Die stickstoffhaltigen Nährstoffe können aus denen ausgewählt werden, die häufig in Medien für Bakterien verwendet werden, wie pankreatischem Casein-Aufschluß, Papain-Aufschluß von Sojabohnenmehl, pankreatischem Gelatine-Aufschluß, Kalbsgehirn- Infusion, Rinderherz-Infusion, Hefeautolysat-Extrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Extrakte von tierischen Geweben und Polypeptonen. Vorzugsweise umfassen die stickstoffhaltigen Nährstoffe Aufschlußbrühe aus Sojabohnen-Casein, Gehirn-Herz-Infusionsbrühe und Extrakt aus Hefe-Autolysat.
- Das Antikoagulationsmittel kann aus der aus Natriumpolyanetholsulfonat, Natriumamylosulfat, Natriumcitrat und Ethylendiamintetraessigsäure bestehenden Gruppe ausgewählt werden. Vorzugsweise ist das Antikoagulationsmittel Natriumpolyanetholsulfonat, da es zusätzlich zu seiner Funktion als Antikoagulationsmittel dazu dient, die antimikrobielle Wirkung von Blut auf Fungi zu vermindern.
- Die Bestandteile im Medium, die das Wachstum von nicht-fungusartigen Mikroorganismen oder spezieller von Bakterien hemmen, sind die antimikrobiellen Mittel. Im allgemeinen kann ein antimikrobielles Mittel verwendet werden, falls es für Fungi nicht schädlich ist und falls es im Medium für einen Zeitraum von einigen Monaten oder länger stabil ist. Die Anzahl vorhandener antimikrobieller Mittel ist darüber hinaus von eins bis fünf oder mehr veränderbar. Die Auswahl und die vorhandene Anzahl basieren auf der Fähigkeit, das Wachstum des weitestmöglichen Bereiches von Bakterien zu hemmen. Vorzugsweise wird eine Mischung von Chloramphenicol und Tobramycin verwendet. Diese beiden antimikrobiellen Mittel wurden wegen ihrer kombinierten Fähigkeit ausgewählt, das Wachstum einer sehr großen Anzahl sowohl gramnegativer als auch grampositiver Bakterien zu hemmen.
- Das bevorzugte Medium umfaßt ein Blut lysierendes Mittel. Die Anwesenheit des lysierenden Mittels erzeugt drei Wirkungen. Es eliminiert die CO&sub2;-Produktion von Bestandteilen des Blutes selbst, es lysiert weiße Zellen, wodurch Fungi, die verschlungen worden sein könnten, freigesetzt werden, und es vermindert den hemmenden Einfluß, den Blut auf das Wachstum von vielen Fungi hat.
- Der Wert des ersten vorstehenden Einflusses besteht darin, den sogenannten "Hintergrund" von CO&sub2; zu verringern, oder das CO&sub2;, das von anderen Quellen als dem Fungus produziert wird. Wenn Blutmengen im Bereich von 5 ml oder mehr vorhanden sind, würde ein hoher Hintergrund produziert werden, wenn die Blutzellen nicht lysiert würden. Durch das Eliminieren oder das Senken des Blut-Hintergrundes wird eine günstigere Signal/Rausch-Bedingung geschaffen, wenn das Medium im Bactec -System verwendet wird, so daß das Instrument in der Lage ist, die Anwesenheit von Fungus-Wachstum mit größerer Wahrscheinlichkeit und Geschwindigkeit nachzuweisen.
- Das bevorzugte lysierende Mittel ist Saponin. Wahlweise können andere lysierende Mittel wie Detergenzien, oberflächenaktive Mittel und Enzyme verwendet werden. Typische Beispiele umfassen Triton X-100, verschiedene Tween- und Brij-Detergenzien und das proteolytische Enzym Rhozym.
- Im Fachgebiet der Formulierung von Medien werden Konzentrationen von Bestandteilen üblicherweise als prozentuale Werte von Gewicht pro Volumen (Gramm Pro 100 ml) ausgedrückt. In der folgenden Beschreibung und in den folgenden Patentansprüchen wird diese Konvention befolgt. Das Fungus-Medium der vorliegenden Erfindung umfaßt zwischen 1,0 und 3,0 Prozent (Gewicht/- Volumen) stickstoffhaltige Nährstoffe, 0,5 bis 1,0 Prozent (Gewicht/Volumen) eines Zuckers oder mehrerer Zucker, ausgewählt aus der aus Glucose, Saccharose und Maltose bestehenden Gruppe, 0,01 bis 0,125 Prozent (Gewicht/Volumen) eines Blut-Antikoagulationsmittels, eine Quelle für Eisen(III) oder Eisen(II) in einer Menge, die ausreichend ist, um ein Fungus-Wachstum zu fördern und eine wirksame Menge eines oder mehrerer antimikrobieller Mittel, die das Wachstum von Bakterien hemmen, ohne das Fungus-Wachstum zu beeinflussen. Das Verhältnis von stickstoffhaltigen Nährstoffen zu Zuckern liegt im Bereich von 1 : 1 bis 6 : 1 und bevorzugt von 2 : 1 bis 6 : 1.
- Die stickstoffhaltigen Nährstoffe umfassen praktischerweise 1,5 Prozent (Gewicht/Volumen) und werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus dem pankreatischen Aufschluß von Casein, dem Papain-Aufschluß von Sojabohnenmehl, dem pankreatischen Aufschluß von Gelatine, einer Rinderherz-Infusion, dem Extrakt von Hefe-Autolysat, Rindfleischextrakt, Malzextrakt, tierischen Gewebeextrakten und Polypepton besteht.
- Vorzugsweise umfassen die stickstoffhaltigen Nährstoffe 0,3 bis 0,7 Prozent (Gewicht/Volumen) Aufschlußbrühe aus Sojabohnen- Casein, 0,8 bis 1,2 Prozent (Gewicht/Volumen) Gehirn-Herz-Infusionsbrühe und 0,02 bis 0,6 Prozent (Gewicht/Volumen) Hefe- Autolysatextrakt. Am bevorzugtesten umfassen die stickstoffhaltigen Nährstoffe 0,5 Prozent (Gewicht/Volumen) Aufschlußbrühe aus Sojabohnen-Casein, 1,0 Prozent (Gewicht/Volumen) Gehirn-Herz-Infusionsbrühe und 0,035 Prozent (Gewicht/Volumen) Hefe-Autolysatextrakt. Jede dieser Komponenten ist von Becton Dickinson Microbiology Systems erhältlich.
- Die bevorzugte Zucker-Komponente ist eine Mischung aus Glucose und Saccharose. Bevorzugt wird 0,5 bis 1,0 Prozent (Gewicht/- Volumen) einer Mischung von Glucose und Saccharose verwendet. Die bevorzugte Mischung umfaßt zwischen 0,4 und 0,8 Prozent (Gewicht/Volumen) Saccharose und 0,05 bis 0,3 Prozent (Gewicht/Volumen) Glucose. In der meistbevorzugten Formulierung werden 0,6 Prozent (Gewicht/Volumen) Saccharose und 0,1 Prozent (Gewicht/Volumen) Glucose verwendet. Das bevorzugte Antikoagulationsmittel ist Natriumpolyanetholsulfonat. Vorzugsweise enthält das Fungus-Medium 0,01 bis 0,125 Prozent (Gewicht/Volumen) Antikoagulationsmittel. Meistbevorzugt wird 0,025 Prozent (Gewicht/Volumen) Natriumpolyanetholsulfonat verwendet. Natriumpolyanetholsulfonat ist kommerziell von Biosynth, Skokie, IL, erhältlich. Andere geeignete Antikoagulationsmittel umfassen Natriumamylosulfat, Natriumcitrat und Ethylendiamintetraessigsäure.
- Eisen wird eingeschlossen, um das Fungus-Wachstum zu fördern. Das Eisen ist als Eisen(III) oder als Eisen(II) vorhanden. Eisen(III)ammoniumsulfat ist in einer Menge von 0,0001 Prozent (Gewicht/Volumen) bevorzugt. Wahlweise kann jede andere organische oder anorganische Quelle für Eisen(III) oder Eisen(II) verwendet werden. Zum Beispiel können Eisen(III)ammoniumsulfat, Eisen(III)chlorid und Eisen(II)sulfat substituiert werden.
- Myo-Inosit ist ein Alkohol, der das Wachstum gewisser Pilze fördert, insbesondere von Cryptococcus neoformans. Er wird vorzugsweise mit einem Anteil von 0,05 Prozent (Gewicht/- Volumen) hinzugefügt.
- Die Antibiotika sind vorhanden, um das Bakterien-Wachstum zu hemmen. Während Chloramphenicol und Tobramycin bevorzugt sind, kann durch andere Antibiotika, die Fungi nicht hemmen, substituiert werden. Zum Beispiel kann Chloramphenicol durch Ciprofloxicin, Norfloxicin oder Ofloxacin substituiert werden und Tobramycin kann durch Gentamicin oder Amikacin substituiert werden. Wahlweise können Mischungen jedes der Vorstehenden verwendet werden.
- Eine Ausführungsform des Mediums umfaßt ein Mittel, wodurch Blutzellen lysiert werden. Geeignete lysierende Mittel umfassen Saponin, Triton X-100 und verschiedene Tween- und Brij-Detergenzien. Vorzugsweise wird Asponin mit einem Anteil von 0,1 bis 0,4 Prozent (Gewicht/Volumen) verwendet. Meistbevorzugt ist Saponin mit einem Anteil von 0,24 Prozent (Gewicht/Volumen) vorhanden.
- Eine besonders bevorzugte Zusammenstellung für das Medium der vorliegenden Erfindung ist zum Gebrauch in automatisierten Bactec -Blutkultur-Systemen geeignet. Wenn das Medium mit einem radiometrischen Bactec -System verwendet werden soll, wird eine ¹&sup4;Kohlenstoff-Quelle verwendet, wie dies im U.S.-Patent Nr. 3 858 045 aufgezeigt wird. Wenn das Medium mit einem nichtradiometrischen Bactec -System verwendet werden soll, wird der Raum über dem Medium in der Flasche mit einer Mischung von CO&sub2; und Luft gefüllt, so daß die im Gleichgewicht befindliche Konzentration von CO&sub2; in der Flasche 1,0 bis 3,5 Prozent beträgt.
- Wenn das Medium mit einer konventionellen Blutprobe von nicht mehr als 5 ml verwendet werden soll, wird eine 50 ml-Flasche mit 30 ml Medium gefüllt. Wenn das Fungus-Medium ein Blut lysierendes Mittel enthält, kann es verwendet werden, um größere Blutproben bis zu 10 ml zu prüfen. Bei einer größeren Blutprobe kann die Zeit zum Nachweis der Anwesenheit eines Fungus signifikant reduziert werden, falls ein Blut lysierendes Mittel vorhanden ist. Wenn eine große Blutprobe untersucht wird, sollte eine 50 ml-Flasche 25 ml Medium enthalten.
- Ein weiteres Verständnis des Fungus-Mediums und seiner Leistungsfähigkeit zum schnellen Nachweis der Anwesenheit von Fungi kann aus den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen entnommen werden.
- In diesem Experiment wurden das Wachstum und der Nachweis von vierzehn verschiedenen Fungus-Stämmen in verschiedenen Blut- Kulturmedien verglichen. In jedem Fall wurde eine Flasche, die ein Medium enthielt, mit einer Probe konserviertem Blut und mit einem bekannten Fungus inokuliert. Die Medien waren die standardmäßigen BACTEC -NR6A (nicht-radiometrisch, erhältlich von Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems) und zwei verschiedene Zusammenstellungen des Fungus-Mediums der vorliegenden Erfindung. In jedem Fall enthielt das Fungus-Medium:
- 0,5 % (Gew./Vol.) Sojabohnen-Casein-Aufschlußbrühe,
- 1,0 % (Gew./Vol.) Gehirn-Herz-Infusionsbrühe,
- 0,035 % (Gew./Vol.) Extrakt von Hefe-Autolysat,
- 0,6 % (Gew./Vol.) Saccharose,
- 0,1 % (Gew./Vol.) Glucose,
- 0,05 % (Gew./Vol.) myo-Inositol
- 0,025 % (Gew./Vol.) Natriumpolyanetholsulfonat,
- 0,0001 % (Gew./Vol.) Eisen(III)ammoniumsulfat,
- 0,005 % (Gew./Vol.) Chloramphenicol, und
- 0,001 % (Gew./Vol.) Tobramycin.
- Der erste Satz von Flaschen mit Fungus-Medium (in Tabelle 1 als FM bezeichnet) enthielt 30 ml Medium und eine Blutproben-Größe von 4 ml. Das Fungus-Medium enthielt kein lysierendes Mittel. Der zweite Satz von Flaschen mit Fungus-Medium (in Tabelle 1 als HBV-FM bezeichnet) enthielt 25 ml Medium. Diese Flaschen wurden mit Blutproben von 4 ml und 10 ml geprüft. Das im zweiten Flaschensatz verwendete Fungus-Medium enthielt 0,24 Prozent (Gewicht/Volumen) Saponin.
- Die Größe des Fungus-Inokulums betrug in allen Fällen zwischen 5 und 95 c.f.u. pro Ampulle. Alle Ampullen wurden bei 35 ºC ± 1 ºC inkubiert und wurden die ersten 48 Stunden der Inkubation auf einem Orbital-Schüttelapparat bei 280 ± 20 U./Min. gerührt. Die Ampullen wurden die ersten beiden Tage zweimal pro Tag und danach insgesamt sieben Tage lang einmal pro Tag auf einem BACTEC 660-Instrument geprüft.
- Ampullen wurden als instrumentenpositiv angesehen, wenn der Wachstumswert (GV) 20 überstieg oder im Vergleich zur vorherigen Ablesung um mehr als 10 anstieg.
- Tabelle 1: TTD = Zeitdauer bis zum Nachweis (in Tagen) auf dem BACTEC -Instrument. GV = Wachstumswert für die Ampullen, wenn sie instrumentenpositiv wurden (GV zum Zeitpunkt der Positivität). ND = Kein Nachweis (durch GV auf dem BACTEC 660), und + = Subkultur Positiv (eine Subkultur auf einer Agarplatte zeigte, daß die Ampulle lebende Fungi enthielt, obwohl das Wachstum nicht vom BACTEC -Instrument nachgewiesen wurde). Alle dargestellten Werte sind der Durchschnitt von Ampullen in zweifacher Ausführung. TABELLE 1 BLUT ORGANISMUS MEDIUM MENGE Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis BLUT ORGANISMUS MEDIUM MENGE Candida rugosa Torulopsis glabrata Saccaromyces cerevisae Cryptococcus neoformans Geotrichum sp.
- Die vorhergehenden Experimente zeigen, daß die FM- und die HBVFM-Medien in Bezug auf höhere GV's und/oder schnellere TTD's für die meisten der geprüften Fungi besser als das standardmäßige BACTEC NR6A-Medium sind. Diese Organismen wurden ausgewählt, weil sie die am häufigsten aus klinischen Blutproben isolierten Fungi darstellen.
- Die (wie oben beschriebene) Zusammenstellung eines Fungus-Mediums wurde gegen ein normales BACTEC NR6A-Blutkultur-Medium und zwei (2) verschiedene zweiphasige, üblicherweise für Blutkulturen verwendete Kultur-Medien auf TTD geprüft. Wie zuvor beschrieben, werden zweiphasige Medien im allgemeinen für das Kultivieren von Fungi aus Blutproben als besser als alle flüssigen Medien betrachtet. Die beiden Zweiphasen-Flaschen waren:
- 1. Castaneda "S", hergestellt von Diagnostics Pasteur, enthaltend Sabouraud-Dextroseagar und -Brühe. Unselektiv (keine antimikrobiellen Mittel vorhanden).
- 2. Hemoline Sabouraud Diphasique, hergestellt von bioMerieux, enthaltend sowohl Agar als auch Brühe. Ist für Fungi selektiv, da es 0,01 % Gentamicin enthält, um das Wachstum von Bakterien einzuschränken.
- Alle Bestimmungen wurden in zweifacher Ausfertigung ausgeführt. Die Inocula betrugen insgesamt zwischen 5 und 50 c.f.u. pro Flasche oder Ampulle. Es wurde menschliches Blut, 5 ml in BAC- TEC NR6A und Fungus-Medium (FM) und 10 ml in die Zweiphasen- Flaschen, wie von den Herstellern gefordert, gegeben. Alle Kulturen wurden bei 35 ºC + 1 ºC inkubiert und das BACTEC NR6A und die Fungus-Medien wurden die ersten 48 Stunden lang durch Orbital-Schütteln bei 280 ± 20 U./Min. gerührt. Die Positivität auf dem BACTEC NR6A und den Fungus-Medien wurde durch Ablesung auf einem BACTEC 660-Instrument unter Verwendung einer Schwelle und eines Delta- (Wechsel von einer Ablesung zur nächsten) GV von 10 erhalten. Für die Zweiphasen-Flaschen wurde die Positivität auf eine Sichtprüfung von Kolonien, die an der Agar- Oberfläche wuchsen, oder auf eine Trübheit in der Brühe oder auf beides bezogen.
- Geprüfte Organismen umfaßten drei Bakterienstämme (die letzten in Tabelle 2), um die selektive Funktion des FM- und Hemoline- Mediums zu zeigen. In Tabelle 2 ist die TTD (Zeitraum bis zum Nachweis) in Stunden angegeben. NG = Kein Wachstum am Ende der Prüfung nach sieben Tagen vorhanden. TABELLE 2 TTD IN STUNDEN MEDIUM Organismus HEMOLINE CASTANEDA Candida albicans Candida parapsilosis Candida tropicalis Torulopsis glabrata Geotrichum sp. Cryptococcus neoformans Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Escherichia coli
- Aus diesen Daten kann ersehen werden, daß die FM im allgemeinen schneller als das zweiphasige Medium ist, um die geprüften repräsentativen Fungi nachzuweisen. Die FM verhinderte darüber hinaus das Wachstum von Bakterien (die letzten drei Organismen), was ein Vorteil ist, der im regulären BÄCTEC NR6A oder in der Zweiphasen-Flasche von Castaneda nicht vorhanden ist.
Claims (10)
1. Flüssiges Medium zur Kultivierung von Fungi, umfassend
(a) 1,0 bis 3,0 % (Gew./Vol.) stickstoffhaltige
Nährstoffe,
(b) 0,5 bis 1,0 % (Gew./Vol.) eines Zuckers oder mehrere
Zucker,
(c) 0,01 bis 0,125 % (Gew./Vol.) eines
Blut-Antikoagulationsmittels,
(d) eine Quelle für Eisen(III)- oder Eisen(II)-Ionen in
einer das Pilzwachstum fördernden Menge und
(e) eine wirksame Menge eines oder mehrerer
antimikrobieller Mittel zur Hemmung des Bakterienwachstums,
ohne das Pilzwachstum zu beeinflussen,
wobei das Verhältnis der stickstoffhaltigen Nährstoffe zu
dem bzw. den Zucker(n) l : 1 bis 6 : 1 beträgt.
2. Flüssiges Medium nach Anspruch 1, worin die
stickstoffhaltigen Nährstoffe eine Mischung aus einem oder mehreren
stickstoffhaltigen Nährstoff(en) umfassen, die aus der aus
dem pankreatischen Aufschluß von Casein, dem
Papain-Aufschluß von Sojabohnenmehl, dem pankreatischen Aufschluß
von Gelatine, einer Rinderherz-Infusion, dem Extrakt von
Hefe-Autolysat, Rindfleischextrakt, Malzextrakt,
tierischem Gewebeextrakt und Polypepton bestehenden Gruppe
ausgewählt sind.
3. Flüssiges Medium nach Anspruch 1, worin die Zucker eine
Mischung aus einem oder mehreren Zucker(n) umfassen, die
aus der aus Glucose, Saccharose und Maltose bestehenden
Gruppe ausgewählt sind.
4. Flüssiges Medium nach Anspruch 1, worin das
Blut-Antikoagulationsmittel aus der aus Natriumpolyanetholsulfonat,
Natriumamylosulfat, Natriumcitrat und
Ethylendiamintetraessigsäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
5. Flüssiges Medium nach Anspruch 1, worin die Quelle für
Eisen(III)- oder Eisen(II)-Ionen aus der aus
Eisen(III)ammoniumsulfat, Eisen(III)-chlorid und Eisen(II)-sulfat
bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
6. Flüssiges Medium nach Anspruch 4, worin die Quelle für
Eisen(III)- oder Eisen(II)-Ionen Eisen(III)-ammoniumsulfat
ist.
7. Flüssiges Medium nach Anspruch 1, worin die
antimikrobiellen Mittel eine Mischung aus einem oder mehreren
antimikrobiellen Mittel(n) umfaßt, die aus der aus
Chloramphenicol und Tobramycin bestehenden Gruppe ausgewählt
sind.
8. Flüssiges Medium nach Anspruch 1, weiterhin umfassend eine
wirksame Menge myo-Inosit.
9. Verfahren zum selektiven Kultivierung von Fungi, umfassend
(a) das Hinzufügen einer Probe einer sterilen
Körperflüssigkeit zu einem flüssigen Medium, das
(I) stickstoffhaltige Nährstoffe,
(II) einen oder mehrere Zucker,
(III) ein Blut-Antikoagulationsmittel,
(IV) eine Quelle für Eisen(III)- oder Eisen(II)-
Ionen,
(V) ein oder mehrere antimikrobielle Mittel und
(VI) ein Blut lysierendes Mittel,
(VII) myo-Inosit
umfaßt,
(b) das Inkubieren der Mischung bei 30 ºC bis 35 ºC unter
Rühren während 2 Wochen,
(c) das visuelle Überwachen der Mischung auf Anzeichen
eines Wachstums von Organismen, und
(d) das Durchführen einer mirkoskopischen Untersuchung
der Mischung auf die Anwesenheit lebensfähiger Fungi.
10. Verfahren zur selektiven Kultivierung von Fungi, umfassend
(a) das Hinzufügen einer Probe einer sterilen
Körperflüssigkeit zu einem flüssigen Medium, das
(I) 0,5 % (Gew./Vol.)
Sojabohnen-Casein-Aufschlußbrühe,
(II) 1,0 % (Gew./Vol.) Gehirn-Herz-Infusionsbrühe,
(III) 0,035 % (Gew./Vol.) Extrakt von Hefe-Autolysat,
(IV) 0,6 % (Gew./Vol.) Saccharose,
(V) 0,1 % (Gew./Vol.) Glucose,
(VI) 0,025 % (Gew./Vol.) Natriumpolyanetholsulfonat,
(VII) 0,0001 % (Gew./vol.) Eisen(III)-ammoniumsulfat,
(VIII) 0,05 % (Gew./Vol.) myo-Inosit,
(IX) 0,005 % (Gew./Vol.) Chloramphenicol,
(X) 0,001 % (Gew./Vol.) Tobramycin und
(XI) 0,24 % (Gew./Vol.) Saponin,
umfaßt,
(b) das Inkubieren der Mischung bei 30 ºC bis 35 ºC unter
Rühren während 2 Wochen,
(c) das visuelle Überwachen der Mischung auf Anzeichen
eines Wachstums von Organismen, und
(d) das Durchführen einer mirkoskopischen Untersuchung
der Mischung auf die Anwesenheit lebensfähiger Fungi.
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