FI95812C - Selektiivinen sienialusta - Google Patents

Description

, 95812

Selektiivinen sienialusta Tämä keksintö koskee hiivojen, rihmasienten ja muiden kliini-5 sesti merkittävien sienten eristämistä ja toteamista tavallisesti steriileistä ruumiinnesteistä. Se koskee erityisemmin nestemäistä viljelyalustaa käytettäväksi kliinisesti merkittävien sienten eristämisessä ja toteamisessa.

10 Sieni-infektion toteamisesta on tullut yhä tärkeämpi asia immunologisesti altistettujen potilaiden aikakautena (esim. munuaissiirto-, kemoterapia-, autoimmuunisairauspotilaat ja potilaat, joilla on hankittu immuunikato). Valitettavasti ei ole olemassa yhtä erillistä alustaa, joka on sopiva laajan 15 kliinisesti merkittävän sienijoukon nopeaan kasvuun ja toteamiseen ja joka on taloudellinen. Vaikutusvaltaisessa käsikirjassa todetaan "useimmat sienten serologiset testit (lukuunottamatta kryptokokkien antigeenitestausta) ovat hyödyttömiä tehtäessä diagnoosia sieni-infektioista immunologisesti al-20 tistetuilla potilailla . . . pitäisi käyttää sopivaa alus- tasarjaa, koska yksikään erillinen kasvualusta yksistään ei ole riittävä kaikkien etiologisten sieniagenssien eristämiseksi.” Roberts, G.D. et ai. "Detection and Recovery of Fungi in Clinical Specimens," Manual of Clinical Microbiology, 4th 25 Ed., Lennette, E.H. et al., ed. (1985). Alustoja, joita suo- * sitellaan sienten eristämiseen kliinisistä näytteistä, ovat (kuten sivulla 510 on ehdotettu): Aivo-sydänuute (BHI) -agar, inhibitiivinen homeagar, Sadhi-agar, hiivauutefosfaattiagar, BHI-agar, joka sisältää 5-10 % lampaan verta, ja erilaiset 30 erikoisalustat (so. Mycobiotic agar, Mycosel agar). Nämä kaikki ovat kiinteitä (agaria sisältäviä) alustoja. Näiden alustojen koostumuksen voi löytää teoksesta Manual of Clinical Microbiology, Luku 111 (kasvualustat). Muita sienten kasvatukseen käytettäviä alustoja ovat: Sabouraud agar, Sa-35 bouraud dekstroosiagar, ja mallasuuteagar. 1 · 95812

Melkein kaikki monista jäljellä olevista, sienien kanssa käytettäväksi kuvailluista alustoista ovat erikoisalustoja, jotka mahdollistavat vain valikoitujen sieniryhmien kasvun, tai niitä käytetään, koska niillä on kyky auttaa identifioi-5 maan tiettyjä sieniä. Nämä ovat sen vuoksi melko erilaisia kuin edellä luetellut alustat, jotka on tarkoitettu edistämään kasvua, joka koskee eri lajisten sienten laajinta mahdollista joukkoa.

10 Käytännöllisesti katsoen kaikki kasvualustat, jotka on suunniteltu sienten eristämiseen, viljelyyn, kasvuun ja identifiointiin, ovat kiinteitä tai kaksifaasisia. Isolator™ System 'issä (DuPont, Wilmington, Del) käytetään kiinteitä alustoja. Tässä systeemissä näyte on siirrettävä sentrifugiput-15 keen ja sentrifugoitava. Sen jälkeen pieni tilavuusosa sent-rifugoidusta materiaalista maljataan muutamalle kiinteälle alustalle. Septi-Chek™ -systeemi (Roche Diagnostics, Nutley, NJ) on kaksifaasinen systeemi, joka sisältää kiinteää mal-lasagaria tyynyssä, joka on liitettävä pulloon, joka sisältää 20 liemialustaa, sen jälkeen, kun näyte on siirrostettu liemeen. Mallas on sienille optimaalista, mutta se ei ole selektiivinen. Toinen kaksifaasista systeemiä edustava tyyppi tunnetaan yleisesti Castaneda-pullona. Näitä systeemejä on saatavissa muutamalta valmistajalta, ja ne sisältävät yhdessä sekä nes-25 temäisiä että kiinteitä alustoja pullossa. Kaksifaasisiin .1 systeemeihin liittyy merkittävä haitta siten, että riittävää ilmastusta nestefaasissa ei voida saada aikaan.

Pelkästään nestemäisiä veriviljelyalustoja on saatavissa, 30 jotka mahdollistavat sienten kasvun ja toteamisen, mutta nämä alustat on tarkoitettu sekä sienten että bakteerien kasvatukseen ja eristämiseen. Silloin kun bakteereja on läsnä, bakteerien nopea kasvu voi peittää sienet, jotka kasvavat hitaammin.

Automaattiset veriviljelysysteemit, kuten Bactec" System (Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Towson, MD) 11.

35 3 95812 sopivat hyvin sienten läsnäolon seulomiseksi nestenäytteistä. Jokainen Bactec'5'-järjestelmistä käsittää instrumentin, jossa inkuboidaan veriviljelypulloja, jotka sisältävät alustan ja näytteen, ja jossa testataan määräajoin hiilidioksidin li-5 sääntyminen, mikä osoittaa mikro-organismien läsnäolon. Bac-tec 460151 -systeemissä käytetään viljelyalustoja, jotka sisältävät Cl1-rikastettuja ravinteita. Näiden ravinteiden kulutuksesta on seurauksena kaasumaisen Cx”1oÄ:n muodostuminen kaasutilaan pullossa olevan kasvualustan pinnan yläpuolelle.

10 Instrumentti ottaa määräajoin näytteitä kaasutilan kaasusta ja ilmaisee kohonneen radioaktiivisuuden. Bactec NR-BBO11 -ja Bactec NR-TSO^ -systeemeissä käytetään ei-radiometrisiä alustoja. Näissä systeemeissä mikro-organismien kasvu todetaan mittaamalla absorbanssin lisääntyminen lähi-infrapuna-15 säteilyssä, joka kytkeytyy kohonneeseen COa-pitoisuuteen.

Bactec^-systeemeissä käytettävät alustat ylläpitävät sienten kasvua, mutta ne eivät sovi hyvin sienten kasvatukseen ja toteamiseen. Ne on ensisijaisesti suunniteltu bakteerien 20 kasvatukseen niin, että sienet eivät kasva optimaalisesti.

Joidenkin läsnä olevien bakteerien päällekasvu voi myös peittää sienten läsnäolon. Lopuksi, näytteen sisältämän veren metabolia voi peittää sienten läsnäolon kahdesta syystä.

Ensiksi, itse verisolut kuluttavat ravinteita tuottaen kohon-25 neen C02;n taustatasoja. Vaikka tämä taustahäiriö on hyväk-. syttävä ilmaistaessa paljon nopeammin kasvavia bakteereja, se ei ole hyväksyttävä yritettäessä ilmaista verrattain hitaasti kasvavia sieniä. Se on vielä ongelmallisempaa käytettäessä suurta verinäytettä (esim. 10 ml), joka on edullista 30 seulottaessa sieniverisyyttä. Toiseksi, veri inhiboi sienten kasvua.

Sen mukaisesti tarvitaan nestemäistä kasvualustaa, jossa laaja joukko kliinisesti merkittäviä sieniä kasvaa nopeasti 35 ja selektiivisesti.

» · « 4 95812 Tämä keksintö käsittää nestemäisen alustan, joka on suunniteltu edistämään erilaisten sienten kasvua, samalla kun se inhiboi muiden kuin sienimikro-organismien kasvua. Näyte, joka sisältää tavallisesti steriiliä ruumiinnestettä (kuten 5 keuhkopussi-, nivelvoide-, aivoselkäydin-, vatsaontelones-tettä, jne.) tai edullisesti verta, lisätään aseptisesti alustaan, ja astiaa inkuboidaan sitten 30° - 35°C:ssa sekoittaen jopa usean viikon kestävän ajanjakson. Elävien sienten läsnäolo ilmaistaan tarkastelemalla visuaalisesti astiasta 10 lisääntynyttä sameutta, alustan värinmuutoksia, pullottavia sulkumembraaneja tai muita organismin kasvuperusteita tai poistamalla aseptisesti pieni näyte ja suorittamalla mikroskooppinen tarkastelu tai jatkoviljely sopiville kiinteille alustoille.

15

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Sienten kasvu alustassa todetaan edullisesti automaattisilla 20 veriviljelysysteemeillä kuten Bactec"-systeemillä. BactecR NR

660:ssä ja NR 730:ssä käytettäessä, alusta voidaan pakata 50 ml:n astiaan, jossa on kaasua nesteen yläpuolella (kaasuti-lan kaasua), joka on rikastunut hiilidioksidin suhteen spesifisessä ja tunnetussa pitoisuudessa. Sienten kasvu voidaan 25 sen jälkeen todeta mittaamalla kohonneet hiilidioksiditasot.

. Sienet, joita voidaan kasvattaa tämän keksinnön mukaisessa alustassa, kuuluvat "hiivoihin", dimorfisiin tai rihmastollisiin muotoihin. Tyypillisiin esimerkkeihin kuuluvat Candi-30 da-, Torulopsis-. Cryptococcus-. Geotrichum-. Saccharomv-ces-, Aspergillus- ja Histoplasma-laiit.

Tämän keksinnön mukainen nestemäinen alusta sisältää typpira-vinteita, yhden tai useamman sokerin, valikoituna ryhmästä, 35 johon kuuluvat glukoosi, sakkaroosi ja maltoosi, veren hyyty mistä ehkäisevää ainetta, ferri- tai ferroraudan lähteen ja tehokkaan määrän yhtä tai useampaa antimikrobista ainetta, joka inhiboi bakteerien kasvua inhiboimatta sienten kasvua.

Alusta poikkeaa tavanomaisista alustoista siinä, että sokerin 11 95812 5 suhdetta typpiravinteisiin on kasvatettu nimelliseksi suhteeksi 1:2, se sisältää sienten kasvua stimuloivia kemikaaleja (myoinositoli ja ferriammoniumsitraatti), ja se sisältää antimikrobisia aineita bakteerien kasvun inhiboimiseksi. Tämä 5 tunnusomainen yhdistelmä saa aikaan kaksi primaarivaikutusta .· 1. Optimaaliset olosuhteet sienten kasvulle nestemäisessä kasvualustassa, ja 2. Muiden kuin sienimikro-organismien inhibition.

10

Typpiravinteet voidaan valikoida ravinteista, joita usein käytetään bakteerialustoissa, kuten kaseiinin pankreaasihyd-rolysaatti, soijajauhon papaiinihydrolysaatti, gelatiinin pankreaasihydrolysaatti, vasikan aivojen uute, härän sydämen 15 uute, hiiva-autolysaattiuute, lihauute, mallasuute. eläinku-dosuutteet ja polypeptonit. Typpiravinteet käsittävät edullisesti soijapapu-kaseiinihydrolysaattiliemen, aivo-sydänuute-liemen ja hiiva-autolysaattiuutteen.

20 Veren hyytymistä ehkäisevä aine {antikoagulantti) voidaan valikoida ryhmästä, johon kuuluvat natriumpolyanetolisulfo-naatti, natriumamylosulfaatti. natriumsitraatti ja etyleeni-diamiinitetraetikkahappo. Antikoagulantti on edullisesti natriumpolyanetolisulfonaatti, koska antikoagulanttitoiminnan 25 lisäksi se toimii veren sieniin kohdistuvan antimikrobisen . vaikutuksen alentamiseksi.

Antimikrobiset aineet ovat alustan aineosia, jotka inhiboivat muiden kuin sienimikro-organismien kasvua, erityisemmin bak-30 teerien kasvua. Antimikrobista ainetta voidaan yleensä käyttää, jos siitä ei ole haittaa sienille, ja jos se on pysyvä alustassa tai usean kuukauden käsittävän ajanjakson tai kauemmin. Läsnä olevien antimikrobisten aineiden lukumäärä vaih-telee myös yhdestä viiteen tai useampaan. Läsnä olevien ai-35 neiden valinta ja lukumäärä perustuu kykyyn inhiboida mahdollisimman laajan bakteerijoukon kasvua. Edullisesti käytetään kloramfenikolin ja tobramysiinin seosta. Nämä kaksi antimik- 6 95812 robista ainetta valittiin niiden yhdistetyn kyvyn perusteella inhiboida hyvin suuren bakteerimäärän kasvua käsittäen sekä gram-negatiiviset että gram-positiiviset bakteerit.

5 Edullinen alusta sisältää verta liuottavaa ainetta. Lyyttisen aineen läsnäolo saa aikaan kolme vaikutusta. Se eliminoi C02:n muodostumisen itse veren komponenteista, se hajottaa valkosoluja vapauttaen siten kaikki sienet, jotka ovat saattaneet joutua solujen sisään, ja se vähentää inhibitiivistä 10 vaikutusta, joka verellä on monen sienen kasvulle.

Ensimmäisen edellä olevan vaikutuksen merkitys on siinä, että se alentaa niin sanottua C03;n "taustaa", eli sitä C02.-n tasoa, joka on muodostunut muista kuin sienilähteistä. Kun 15 läsnä on veritilavuuksia tasolla 5 ml tai enemmän, muodostuisi korkea taustataso, ellei verisoluja hajotettaisi. Eliminoimalla tai vähentämällä veren aiheuttamaa taustaa, tuotetaan edullisempi signaalin suhde taustahäiriöön tila, kun alustaa käytetään Bactec^-systeemissä, niin että instrumen-20 tiliä on mahdollista ilmaista sienikasvun läsnäolo suuremmalla varmuudella ja nopeudella.

Saponiini on edullinen lyyttinen aine, jota käytetään. Muita liuottavia aineita ovat vaihtoehtoisesti detergentit, surfak-25 tantit ja entsyymit. Tyypillisiä esimerkkejä ovat Triton X-. 100, erilaiset Tween- ja Brij-detergentit ja proteolyyttinen entsyymi Rhozyme.

Alalla, jossa formuloidaan alustoja, aineosien pitoisuuksia 30 ilmaistaan tavallisesti paino/tilavuus-prosentteina (gram- maa/100 ml). Seuraavassa kuvauksessa ja patenttivaatimuksissa käytetään tätä sääntöä. Tämän keksinnön mukainen sienialusta sisältää 1,0 - 3,0 prosenttia (paino/tilavuus) typpiravinteita, 0,5 - 1,0 prosenttia (paino/tilavuus) yhtä tai useampaa 35 sokeria, jotka valitaan ryhmästä, johon kuuluvat glukoosi, sakkaroosi ja maltoosi, 0,01 - 0,125 prosenttia (paino/tilavuus) veren antikoagulanttia, sienten kasvun stimuloimiseksi li 7 95812 tehokkaan määrän ferri- tai ferrorautaa ja tehokkaan määrän yhtä tai useampaa antimikrobista ainetta, joka inhiboi bakteerien kasvua vaikuttamatta sienten kasvuun. Typpiravinteiden suhde sokereihin asettuu alueelle 1.1 - 6:1 ja edullises-5 ti 2:1 - 6:1.

Typpiravinteet käsittävät sopivasti 1,5 prosenttia (paino/ti-lavuus) ja valitaan ryhmästä, johon kuuluvat kaseiinin pank-reaasihydrolysaatti, soijajauhon papaiinihydrolysaatti, gela-10 tiinin pankreaasihydrolysaatti, vasikan aivojen uute, härän sydämen uute, hiiva-autolysaattiuute, lihauute, mallasuute, eläinkudosuutteet ja polypeptonit.

Typpiravinteet käsittävät edullisesti 0,3 - 0,7 prosenttia 15 (paino/tilavuus) soijapapu-kaseiinihydrolysaattilientä, 0,8 - 1,2 prosenttia (paino/tilavuus) aivo-sydänuutelientä ja 0,02 - 0,6 prosenttia (paino/tilavuus) hiiva-autolysaattiuutetta. Edullisimmin typpiravinteet käsittävät 0,5 prosenttia (paino/tilavuus) soijapapu-kaseiinihydrolysaattilientä, 1,0 pro-20 senttiä (paino/tilavuus) aivo-sydänuutelientä ja 0.035 prosenttia (paino/tilavuus) hiiva-autolysaattiuutetta. Kutakin näistä komponenteista on saatavissa Becton Dickinson Microbiology Systems’iltä.

25 Edullinen sokerikomponentti on seos, joka sisältää glukoosia ** ja sakkaroosia. Edullisesti käytetään 0,5 - 1,0 prosenttia (paino/tilavuus) seosta, joka sisältää glukoosia ja sakkaroosia. Edullinen seos sisältää 0,4 - 0,8 prosenttia (paino/tilavuus) sakkaroosia ja 0,05 - 0,3 prosenttia (paino/tilavuus) 30 glukoosia. Edullisimmassa formulaatiossa käytetään 0,6 prosenttia (paino/tilavuus) sakkaroosia ja 0.1 prosenttia (pai-.. no/tilavuus) glukoosia.

Natriumpolyanetolisulfonaatti on edullinen antikoagulantti.

35 Sienialusta sisältää edullisesti 0,01 - 0,125 prosenttia (paino/tilavuus) antikoagulanttia. Edullisimmin käytetään 0,025 prosenttia (paino/tilavuus) natriumpolyanetolisulfo- 8 95812 naattia. Natriumpolyanetolisulfonaattia on saatavissa Bio-synth'iltä, Shokie, IL. Muihin sopiviin antikoagulantteihin lukeutuvat natriumamylosulfaatti, natriumsitraatti ja ety-leenidiamiinitetraetikkahappo.

5

Rautaa lisätään sienikasvun edistämiseksi. Rauta on läsnä ferri- tai ferrorautana. Ferriammoniumsulfaatti määränä 0,0001 prosenttia (paino/tilavuus) on edullinen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää mitä tahansa muuta orgaanista tai epä-10 orgaanista ferri- tai ferrorautalähdettä. Esimerkiksi ferriammoniumsulfaatti, ferrikloridi ja ferrosulfaatti voidaan asettaa tilalle.

Myoinositoli on polyolialkoholi, joka edistää tiettyjen sien-15 ten kasvua, erityisesti Cryptococcus neoformansin. Sitä sisällytetään edullisesti tasolla 0,05 prosenttia (paino/tilavuus ) .

Antibiootteja on läsnä bakteerien kasvun inhiboimiseksi.

20 Vaikka kloramfenikoli ja tobramysiini ovat edullisia, muita antibiootteja, jotka eivät inhiboi sieniä voidaan asettaa tilalle. Kloramfenikoli esimerkiksi voidaan korvata kipro-floksisiinilla, norfloksisiinilla tai ofloksasiinilla, ja tobramysiini voidaan korvata gentamisiinilla tai amikasiinil-25 la. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kaikkien edellisten seoksia.

. . s

Yksi alustan suoritusmuoto sisältää aineen verisolujen liuottamiseksi . Sopivia liuottavia aineita ovat saponiini, Triton 30 X-100 ja erilaiset Tween- ja Brij-detergentit. Saponiinia käytetään edullisesti tasolla 0,1 - 0,4 prosenttia (paino/ti-. lavuus). Edullisimmin saponiinia on läsnä tasolla 0,24 prosenttia (paino/tilavuus).

35 Tämän keksinnön mukaisen alusta erityisen edullinen koostumus sopii käytettäväksi automatisoiduissa Bactec^-veriviljelysys-teemeissä. Kun alustaa on tarkoitus käyttää radiometrisen

It 9 95812

Bactecw-systeemin yhteydessä, mukaan lisätään ^hiilenlähde. kuten US-patentissä n:o 3 858 045 on selitetty. Kun alustaa on tarkoitus käyttää ei-radiometrisen Bactec^-systeemin yhteydessä, alustan yläpuolinen tila pullon sisällä täytetään 5 seoksella, joka sisältää COs.-a ja ilmaa siten, että tasapainotettu COa-pitoisuus pullossa on 1,0 - 3,5 prosenttia.

Kun alustaa on tarkoitus käyttää tavanomaisen verinäytteen kanssa, jonka tilavuus ei ole yli 5 ml, 50 ml:n pullo täyte-10 tään 30 ml :11a alustaa. Kun sienialusta sisältää verta liuottavaa ainetta, sitä voidaan käyttää suurempien verinäytteiden testaamiseksi, aina 10 ml .-aan saakka. Suuremman verinäytteen yhteydessä voidaan vähentää merkittävästi aikaa sienten läsnäolon ilmaisemiseksi, jos verta liuottavaa ainetta on läsnä.

15 Kun suurta verinäytettä testataan, 50 ml:n pullon tulisi sisältää 25 ml alustaa.

Lisäkäsityksen, koskien sienialustaa ja sen kykyä nopeasti ilmaista sienten läsnäolo, voi saada seuraavista ei-rajoitta-20 vista esimerkeistä.

Esimerkki 1 Tässä kokeessa vertailtiin neljäntoista eri sienikannan kasvua ja toteamista useassa veriviljelyalustassa. Kussakin 25 tapauksessa pulloon, joka sisälsi alustaa, siirrostettiin . ihmisen pankkiverinäytettä ja tunnettua sientä. Alustoina oli normaali BACTEC1* NR6A (ei-radiometrinen, saatavissa Bec-ton Dickinson Diagnostic Instrument Systems’iltä) ja kaksi erilaista tämän keksinnön mukaista sienialustakoostumusta.

30 Kussakin tapauksessa sienialusta sisälsi: 0,5 prosenttia (paino/tilavuus) soijapapu-kaseiinihydroly-saattilientä, 35 1,0 prosenttia (paino/tilavuus) aivo-sydänuutelientä, 0,035 prosenttia (paino/tilavuus) hiiva-autolysaattiuutetta, 10 95812 0,6 prosenttia (paino/tilavuus) sakkaroosia, 0,1 prosenttia (paino/tilavuus) glukoosia, 5 0,05 prosenttia (paino/tilavuus) myoinositolia, 0,025 prosenttia (paino/tilavuus) natriumpolyanetolisulfo-naattia, 10 0,0001 prosenttia (paino/tilavuus) ferriamraoniumsitraattia.

0,005 prosenttia (paino/tilavuus) kloramfenikolia ja 15 0,001 prosenttia (paino/tilavuus) tobramysiiniä.

Ensimmäinen sarja sienialustapulloja (merkittynä FM taulukossa 1) sisälsi 30 ml alustaa ja verinäytettä 4 ml. Sienialusta ei sisältänyt lyyttistä ainetta. Toinen sarja sienialustapul-20 loja (merkittynä HBV-FM taulukossa 1) sisälsi 25 ml alustaa.

Nämä pullot testattiin 4 ml: n ja 10 ml .· n verinäytteillä.

Toisessa pullosarjassa käytetty sienialusta sisälsi 0,24 prosenttia (paino/tilavuus) saponiinia.

25 Sienisiirroksen koko oli välillä 5-95 pesäkkeen muodostavaa ♦. yksikköä (c.f.u.) pulloa kohti kaikissa tapauksissa. Kaikkia pulloja inkuboitiin 35° +_ l°C:Bsa ja sekoitettiin pyörivällä ravistelijalla nopeudella 280 + 20 rpm ensimmäiset 48 inku-bointituntia. Pullot testattiin ΕΛαΤΕΟ* 660 -instrumentilla 30 kahdesti päivässä kahtena ensimmäisenä päivänä ja kerran päivässä sen jälkeen kaikkiaan seitsemän päivän ajan.

Pulloja pidettiin instrumenttipositiivisina, jos kasvuarvo (Growth Value, GV) ylitti 20 tai kohosi enemmän kuin 10:llä 35 edelliseen lukemaan nähden.

It 95812 li

Taulukossa 1 TTD = aika toteamiseen (päivissä) BACTEC'5'-instrumentilla . GV = kasvuarvo pulloilla, kun ne tulivat instru-menttipositiivisiksi (GV positiivisuushetkellä). ND = ei todettu (GV:n avulla BACTEC” 660:llä), ja + = jatkoviljelyssä 5 positiivinen (jatkoviljely agarmaljalle osoitti, että pullo sisälsi eläviä sieniä, vaikkakaan kasvua ei todettu BACTEC*'-instrumentilla). Kaikki esitetyt arvot ovat kahden rinnak-kaispullon keskiarvoja.

10 15 20 25 30 35

Taulukko 1 12 95812

Veren

Organismi Alusta tilavuus TTD GV

5 Candida albicans n:o 61 6A 4 ml 1,0 25 FM 4 ml 1,0 71 HBV-FM 4 ml 1,0 29 HBV-FM 10 ml 1,8 224

Candida albicans n:o 399 6A 4 ml 1,0 43 10 FM 4 ml 1,0 168 HBV-FM 4 ml 1,0 111 HBV-FM 10 ml 1,0 78

Candida albicans n:o 497 6A 4 ml 1.0 37 FM 4 ml 1,0 172 15 HBV-FM 4 ml 1.0 72 HBV-FM 10 ml 1,0 49

Candida albicans 6A 4 ml 1,0 30 n:o 10231 FM 4 ml 1.0 71 HBV-FM 4 ml 1,0 31 20 HBV-FM 10 ml 1,8 224

Candida tropicalis 6A 4 ml 0,8 53 n:o 229 FM 4 ml 0,8 223 HBV-FM 4 ml 0,8 68 HBV-FM 10 ml 0,8 84 25 Candida tropicalis 6A 4 ml 1,0 49 n.’O 407 FM 4 ml 1,0 112 HBV-FM 4 ml 1,0 66 HBV-FM 10 ml 1,0 87

Candida parapsilosis 6A 4 ml 1,8 54 30 FM 4 ml 1,8 43 HBV-FM 4 ml 1,8 160 HBV-FM 10 ml 1,8 115

Candida rugosa 6A 4 ml ND + FM 4 ml 3,2 27 35 HBV-FM 4 ml 3,0 22 HBV-FM 10 ml 4,0 30

II

95812 13

Veren

Organismi Alusta tilavuus TTD GV

Torulopsis glabrata n:o 156 6A 4 ml 1,8 34 FM 4 ml 1,8 25 5 HBV-FM 4 ml 1.8 185 HBV-FM 10 ml 1,8 183

Torulopsis glabrata n:o 231 6A 4 ml 1,8 42 FM 4 ml 1,8 130 HBV-FM 4 ml 1,0 36 10 HBV-FM 10 ml 1,8 152

Saccharomyces cerevisiae 6A 4 ml 1,0 43 n:o 414 FM 4 ml 1,0 223 HBV-FM 4 ml 1.0 173 HBV-FM 10 ml 1,0 155 15 Cryptococcus neoformans 6A 4 ml 5,0 18 n: o 369 FM 4 ml 4,0 35 HBV-FM 4 ml 3.0 20 HBV-FM 10 ml 3,0 30

Cryptococcus neoformans 6A 4 ml ND + 20 n:o 695 FM 4 ml 4,0 26 HBV-FM 4 ml 3,0 29 HBV-FM 10 ml 3,0 33

Geotrichum sp. n.o 230 6A 4 ml 1,0 48 FM 4 ml 0,8 24 25 HBV-FM 4 ml 0,8 50 HBV-FM 10 ml 1,0 95

Edellä oleva koe osoittaa, että FM- ja HBV-FM -alustat ovat 30 parempia kuin normaali BACTECR NR6A -alusta, ilmaistuna korkeampina GV-arvoina ja/tai nopeampina TTD-arvoina useimmille testatuille sienille. Näitä organismeja käytettiin, koska ne edustavat sieniä, joita yleisimmin on eristetty kliinisistä verinäytteistä.

Esimerkki 2

Sienten alustakoostumus (kuten edellä on kuvailtu) testattiin 35 14 95812 TTD:n osalta vertaamalla normaaliin BACTEC'5' NR6A -verivilje-lyalustaan ja kahteen (2) eri kaksifaasiseen viljelyalustaan, joita käytetään yleisesti veriviljelmille, Kuten aikaisemmin on kuvailtu, kaksifaasisia alustoja pidetään yleensä parempi-5 na kuin kaikkia nestemäisiä alustoja sienten viljelyä varten verinäytteistä. Kyseiset kaksi kaksifaasista pulloa olivat: 1. Castaneda ”S", valmistajana Diagnostics Pasteur, sisältäen Sabouraud-dekstroosiagaria ja lientä. Ei-selektiivinen (anti- 10 mikrobisia aineita ei läsnä).

2. Hemoline Sabouraud Diphasique, valmistajana BioMerieux, sisältäen sekä agaria että lientä. Selektiivinen sienille, koska se sisältää 0,01 % gentamisiinia bakteerien kasvun 15 rajoittamiseksi.

Kaikki määritykset suoritettiin kahtena rinnakkaisena. Siir roksen määrä oli välillä 5-50 pesäkettä muodostavaa yksikköä (c.f.u.) kaikkiaan pulloa tai pikkupulloa kohti. Ihmisen 20 verta lisättiin, 5 ml BACTEC'' NR6A- ja sienialustaan (FM), ja 10 ml kaksifaasisiin pulloihin, kuten valmistajat ilmoittivat. Kaikkia viljelmiä inkuboitiin 35*» +_ iec, ja BACTEC” NR6A- ja sienialustoja ravisteltiin pyörivällä ravistelijalla nopeudella 280 +_ 20 rpm ensimmäiset 48 tuntia. Positiivisuus 25 BACTECr* NR6A- ja sienialustalla määritettiin ottamalla luke- ·. mia BACTEC* 660 -instrumentilla, käyttäen kynnysarvoa 20 ja GV:n muutosarvoa 10 (muutos lukemasta seuraavaan). Kaksifaa-sisten pullojen osalta positiivisuus perustui agarin pinnalla kasvaneiden pesäkkeiden visuaaliseen tarkasteluun tai liemen 30 sameuteen, tai molempiin.

Testattuihin organismeihin kuului kolme bakteerikantaa (viimeiset taulukossa 2) FM- ja Hemoline-alustojen selektiivisen toiminnan osoittamiseksi. Taulukossa 2, TTD (aika toteami-35 seen) annetaan tunteina). NG = ei kasvua testauksen lopussa seitsemän päivän jälkeen.

Il 15 95812

Taulukko 2.

TTD tunteina Alustat 5 Organismi_NR6A FM Hemoline Castaneda

Candida albicans n:o 61 42 42 42 42

Candida albicans n:o 399 25 25 42 42

Candida albicans n:o 497 25 25 66 66 10 Candida parapsilosis n:o 491 42 42 42 42

Candida tropicalis n:o 407 25 25 42 42

Torulopsis glabrata n:o 156 90 42 42 42

Torulopsis glabrata n.· o 231 66 42 42 42

Geotrichum sp. n:o 230 25 25 42 42 15 Cryptococcus neoformans n:o 691 90 90 114 102

Cryptococcus neoformans n:o 696 42 42 90 102

Pseudomonas aeruginosa n:o 27853 25 NG NG 42

Staphylococcus aureus n:o 29213 18 NG NG 25

Escherichia coli n:o 25922 18 NG NG 25 20 Näistä tuloksista voidaan nähdä, että FM on yleisesti nopeampi kuin kaksifaasiset alustat ilmaistaessa tyypillisiä testattuja sieniä. FM esti myös bakteerien kasvua (kolme vii-25 meistä organismia), mikä on etu, jota ei ole läsnä tavallisessa BACTEC''1 NR6A: ssa tai kaksif aasisessa Castaneda-pullos-sa.

30 35

Claims (2)

95812 1. Nestemäinen alusta sienten viljelemiseksi selektiivisesti, tunnettu siitä, että alusta sisältää: 5 (i) 0,5 % (paino/tilavuus) soijapapu-kaseiinihydrolysaatti- lientä; (ii) 1,0 % (paino/tilavuus) aivo-sydänuutelientä; (iii) 0,035 % (paino/tilavuus) hiiva-autolysaattiuutetta; (iv) 0,6 % (paino/tilavuus) sakkaroosia; 10 (v) 0,1 % (paino/tilavuus) glukoosia; (vi) 0,025 % (paino/tilavuus) natriumpolyanetolisulfonaat-tia; (vii) 0,0001 % (paino/tilavuus) ferriammoniumsulfaattia; (viii) 0,05 % (paino/tilavuus) myoinositolia; 15 (ix) 0,005 % (paino/tilavuus) kloramfenikolia; (x) 0,001 % (paino/tilavuus) tobramysiiniä; ja (xi) 0,24 % (paino/tilavuus) saponiinia. 2. Menetelmä sienten viljelemiseksi selektiivisesti, tun-20 nettu siitä, että se käsittää: (a) steriiliä ruumiinnestettä sisältävän näytteen lisäämisen nestemäiseen alustaan, joka sisältää: (i) 0,5 % (paino/tilavuus) soijapapu-kaseiinihydrolysaatti- 25 lientä; (ii) 1,0 % (paino/tilavuus) aivo-sydänuutelientä; (iii) 0,035 % (paino/tilavuus) hiiva-autolysaattiuutetta; (iv) 0,6 % (paino/tilavuus) sakkaroosia; (v) 0,1 % (paino/tilavuus) glukoosia; 30 (vi) 0,025 % (paino/tilavuus) natriumpolyanetolisulfonaat-tia; (vii) 0,0001 % (paino/tilavuus) ferriammoniumsulfaattia; (viii) 0,05 % (paino/tilavuus) myoinositolia; (ix) 0,005 % (paino/tilavuus) kloramfenikolia; 35 (x) 0,001 % (paino/tilavuus) tobramysiiniä; ja (xi) 0,24 % (paino/tilavuus) saponiinia, li 95812 (b) seoksen inkuboinnin noin 30° - noin 35°C:ssa ja sekoittamisen noin kahden viikon ajan; (c) mainitun seoksen visuaalisen tarkastelun organismin kas- 5 vun osoituksena; ja (d) mikroskooppisen tarkastelun suorittamisen mainitusta seoksesta elävien sienten läsnäolon osalta. 10 Patentkrav

1. Flytande substrat för selektiv odling av svampar, kän-netecknat av att substratet innehäller: (i) 0,5 % (vikt/volym) sojaböna-kaseinhydrolysatlag; 15 (ii) 1,0 % (vikt/volym) hjärna-hjärtaextraktlag; (iii) 0,035 % (vikt/volym) jästautolysatextrakt; (iv) 0,6 % (vikt/volym) sackaros; (v) 0,1 % (vikt/volym) glukos; (vi) 0,025 % (vikt/volym) natriumpolyanetolsulfonat,- 20 (vii) 0,0001 % (vikt/volym) ferriammoniumsulfat; (viii) 0,05 % (vikt/volym) myoinositol; (ix) 0,005 % (vikt/volym) kloramfenikol; (x) 0,001 % (vikt/volym) tobramycin; och (xi) 0,24 % (vikt/volym) saponin. 25

: 2. Förfarande för selektiv odling av svampar, kännetecknat av att det innefattar: (a) tillsättning av ett prov innehällande steril kropps-30 vätska tili ett flytande substrat, som innehäller: (i) 0,5 % (vikt/volym) sojaböna-kaseinhydrolysatlag; \ (ii) 1,0 % (vikt/volym) hjärna-hjärtaextraktlag; (iii) 0,035 % (vikt/volym) jästautolysatextrakt; (iv) 0,6 % (vikt/volym) sackaros; 35 (v) 0,1 % (vikt/volym) glukos; (vi) 0,025 % (vikt/volym) natriumpolyanetolsulfonat; (vii) 0,0001 % (vikt/volym) ferriammoniumsulfat; (viii) 0,05 % (vikt/volym) myoinositol; 95812 (ix) 0,005 % (vikt/volym) kloramfenikol; (x) 0,001 % (vikt/volym) tobramycin; och (xi) 0,24 % (vikt/volym) saponin, 5 (b) inkubering av blandningen vid cirka 30° - cirka 35°C, och omrörning under cirka tva veckorstid; (c) en visual granskning av nämnda blandning för indikering av organismens växt; och 10 (d) utföring av en mikroskopisk granskning av nämnda blandning för närvaro av svampar. « li