DE102006026952B4

DE102006026952B4 - Verfahren zur Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben mit Hilfe einer Durchflusszytometrie-Analyse

Info

Publication number: DE102006026952B4
Application number: DE102006026952A
Authority: DE
Inventors: Kai Michael Hourfar; Michael Dr. Schmidt; Erhard Prof. Dr. Seifried
Original assignee: Drk Blutspendedienst Bw; DRK Blutspendedienst Baden Wuerttermberg Hessen gGmbH
Current assignee: Drk Blutspendedienst Bw; DRK Blutspendedienst Baden Wuerttermberg Hessen gGmbH
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2006-06-09
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2026-06-10
Also published as: DE102006026952A1

Abstract

Verfahren zur Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend
a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
b) sterile Entnahme von Aliquoten der aus Blut abgeleiteten Proben unter Laminar-Flow-Bedingungen,
c) Zugabe der Aliquote aus b) zu einer Nährbouillon-Lösung, umfassend Fleischpepton, Casein-Pepton, Hefeextrakt, NaCl und Glukose, mit einem pH-Wert von 6,8 bis 7,8,
d) Inkubation bei 30 bis 40°C für mindestens 2 Stunden,
e) Zentrifugation der inkubierten Nährbouillon-Lösung und Verwerfen des Überstandes,
f) Rekonstitution des Pellets aus e) unter Laminar-Flow-Bedingungen in einer PBS-Lösung,
g) Entnahme von Aliquoten aus den rekonstituierten Pellets aus f) und Zugabe der Aliquote zu einer Puffer-Lösung, die Thiazol Orange enthält, und Inkubation für einige Minuten, und
h) durchflußzytometrische Bestimmung der mit Thiazol Orange markierten Bakterien in den inkubierten Aliquoten aus g).

Description

1. Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere Thrombozyten-Konzentraten, mit Hilfe einer Durchflusszytometrie-Analyse. Durch einen zusätzlichen Inkubationsschritt in einer speziellen Nährbouillon ist es möglich, die Sensitivität der durchflußzytometrischen Messung signifikant zu verbessern. Das Verfahren ermöglicht somit eine schnelle generische Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere Thrombozytenkonzentraten, und ist somit besonders zum Durchsuchen („Screening") von Blutspendern geeignet. Die Sensitivität der Durchflusszytometrie-Analyse wird signifikant von 10⁵ CFU/ml auf 10¹ CFU/ml erhöht.
2. Hintergrund der Erfindung
Das virologische Restrisiko ist aufgrund der verschiedenen Maßnahmen, wie Spenderselektion, ELISA-Testung und NAT-Testung, für die untersuchten transfusionsrelevanten Viren auf ein bisher nicht gekanntes, unvorstellbar geringes Maß gesunken. So ist das Restrisiko, das in Deutschland nach Einführung der PCR für die drei transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV, HBV noch verbleibt, mit 1:5,5 Mio. für HIV, 1:4,4 Mio. für HCV und 1:620.000 Mio. für HBV (mit Pool-PCR) und 1:820.000 für HBV mit einer Einzelproben-PCR so gering geworden, dass man fast von keinem wirklichen virologischen Restrisiko mehr sprechen kann (1).
Demgegenüber steht jedoch ein bakterielles Restrisiko in Thrombozyten-Konzentraten von 1:2000 bis 1:3000 (2-4). Dadurch, dass Thrombozyten-Konzentrate bei Raumtemperatur gelagert werden, stellen sie für viele Bakterien ein ideales Nährmedium dar und sind somit besonders gefährdet. Ferner unterscheiden sich bakterielle von den viralen Kontaminationen darin, dass die Ausgangskonzentration zunächst sehr gering ist (< 10 CFU/ml). Darum benötigt man ein sehr sensitives Nachweisverfahren für die Bakteriendetektion.
Tenner et al. (J. Clin. Microbiol. 1982; 16(3): 437–442.); Hall et al. (Appl. Microbiol. 1974; 27(1): 187–191); Dreier et al. (J. Clin. Microbiol. 2004; 42(10): 4759–4764.) sowie McCarthy und Senne (J. Clin. Microbiol. 1980; 11(3): 281–285.) offenbaren verschiedene Nährstoffmedien für die Anreicherung von Bakterien in Blutproben.
Mohr et al. (Transfusion. 200; 46(1): 41–49.) offenbaren ein bakterielles Nachweisverfahren von Thrombozytenkonzentraten basierend auf Thiazol Orange-Färbung und FACS. Das beschriebene FACS-Verfahren wird dabei entweder an den aufbewahrten Thrombozytenkonzentraten selbst, und zwar kurz vor deren Weiterverwendung, durchgeführt oder es wird vorgeschlagen, 20 bis 24 Stunden vor der Testung eine 10 bis 20 ml Probe zu entnehmen und diese bei 37°C zu inkubieren. Die Inkubation erfolgt dabei in Abhängigkeit vom nachgewiesenen Bakterium auch über einen längeren Zeitraum (bis zu mehr als 2 Tage) oder unter Zuhilfenahme von Trypticase Soy Broth. Es werden Sensitivitäten von 100 CFU/μl erreicht, was einer Nachweisgrenze von lediglich 100.000 CFU/ml entspricht.
Des weiteren sind im Stand der Technik sogenannte Kulturmethoden für den bakteriellen Nachweis bekannt, wie z.B. das in Mohr et al. aufgeführte kommerzielle BacT/ALERT Verfahren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu entwickeln, das eine schnelle und vor allem auch sensitive Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere in Thrombozyten-Konzentraten, zur Verfügung stellt.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zur Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben gelöst.
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens (a) werden aus Blut abgeleitete Proben zur Verfügung gestellt.
Im nächsten Schritt (b) werden aus den Blut abgeleiteten Proben Aliquote steril entnommen. Dies wird bevorzugt unter Laminar-Flow-Bedingungen durchgeführt.
Im nächsten Schritt (c) werden die Aliquote (aus Schritt b) zu einer Nährbouillon-Lösung zugegeben. Die Nährbouillon-Lösung umfasst Fleischpepton, Casein-Pepton, Hefeextrakt, NaCl und Glukose und hat einen pH-Wert von 6,8 bis 7,8.
Im nächsten Schritt (d) erfolgt eine Inkubation der Nährbouillon-Lösung, mit den zugegebenen Aliquoten, bei 30 bis 40°C für mindestens 2 Stunden.
Im nächsten Schritt (e) wird eine Zentrifugation der inkubierten Nährbouillon-Lösung durchgeführt und die Überstande werden verworfen.
Im nächsten Schritt (f) erfolgt eine Rekonstitution des Pellets (aus Schritt e) in einer PBS-Lösung. Dies wird bevorzugt unter Laminar-Flow-Bedingungen durchgeführt.
Im nächsten Schritt (g) werden Aliquote aus den rekonstituierten Pellets (aus Schritt f) entnommen. Diese Aliquote werden zu einer Puffer-Lösung, die Thiazol Orange enthält, zugegeben. Es erfolgt Inkubation für einige Minuten.
Anschließend erfolgt in Schritt (h) eine durchflußzytometrische Bestimmung der mit Thiazol Orange markierten Bakterien in den inkubierten Aliquoten (aus Schritt g).
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:

a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
b) sterile Entnahme von Aliquoten der aus Blut abgeleiteten Proben unter Laminar-Flow-Bedingungen,
c) Zugabe der Aliquote aus b) zu einer Nährbouillon-Lösung, umfassend Fleischpepton, Casein-Pepton, Hefeextrakt, NaCl und Glukose, mit einem pH-Wert von 6,8 bis 7,8,
d) Inkubation bei 30 bis 40°C für mindestens 2 Stunden,
e) Zentrifugation der inkubierten Nährbouillon-Lösung und Verwerfen des Überstandes,
f) Rekonstitution des Pellets aus e) unter Laminar-Flow-Bedingungen in einer PBS-Lösung,
g) Entnahme von Aliquoten aus den rekonstituierten Pellets aus f) und Zugabe der Aliquote zu einer Puffer-Lösung, die Thiazol Orange enthält, und Inkubation für einige Minuten, und
h) durchflußzytometrische Bestimmung der mit Thiazol Orange markierten Bakterien in den inkubierten Aliquoten aus g).

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben oder um Bestandteile des Blutes enthaltende Proben, insbesondere handelt es sich um Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende Proben. Die zelluläre Blutbestandteile enthaltenden Proben sind dabei ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Thrombozyten enthaltenden Proben, Thrombozyten-Konzentraten, Einzelproben aus Pool-Thrombozyten-Konzentraten oder Thrombozyten-Apherese-Konzentraten.
Das Verfahren eignet sich zum Screening von Einzelproben aus Pool-Thrombozyten-Konzentraten als auch von Apherese-Konzentraten. Von jeder für das Screening vorgesehenen Probe wird ein Aliquot von mindestens 3 ml unter Laminar-Flow-Bedingungen steril entnommen Bevorzugterweise haben die Aliquote, die in Schritt b) steril entnommen werden, ein Volumen von mindestens 3 ml. Andere geeignete Volumina sind für den Fachmann leicht zu bestimmen.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Nährbouillon-Lösung bezogen auf einen Liter

– 7 bis 8,5 g Fleischpepton, weiter bevorzugt 7,8 g Fleischpepton,
– 7 bis 8,5 g Casein-Pepton, weiter bevorzugt 7,8 g Casein-Pepton,
– 2 bis 3,5 g Hefeextrakt, weiter bevorzugt 2,8 g Hefeextrakt,
– 5 bis 6,5 g NaCl, weiter bevorzugt 5,6 g NaCl und
– 1,5 bis 2,5 g Glukose, weiter bevorzugt 2,0 g Glukose.

In einer besonderen Ausführungsform hat die Nährbouillon-Lösung einen pH-Wert von 7,3 ± 0,2.
Bevorzugt beträgt das Volumen der Nährbouillon-Lösung in Schritt c) 10 ml und das Gesamtvolumen aus Nährbouillon-Lösung und Aliquot der zu untersuchenden Probe bei der Inkubation 13 ml.
Bevorzugt wird die Inkubation in Schritt d) bei 37°C für mindestens 2 Stunden und bis zu 8 Stunden durchgeführt.
Bevorzugterweise erfolgt die Rekonstitution der Pellets in Schritt f) in 1 ml PBS-Lösung. Die PBS-Lösung hat bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8,0, weiter bevorzugt einen pH von 7,4.
Bei der Puffer-Lösung, die Thiazol Orange enthält, und in Schritt g) verwendet wird, handelt es sich bevorzugt um eine Puffer-Lösung, dier zur Lyse bzw. zur Permeabilisierung von Bakterien geeignet ist. Geeignete Lyse-Puffer kann der Fachmann herstellen. In einer besonderen Ausführungsform wurde die Thiazol Orange-enthaltende Lösung von BD, Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgien zur Verfügung gestellt. Bei Thiazol Orange handelt es sich um einen fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff.
Andere geeignete Farbstoffe sind Pico Green.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden bei der Färbung in Schritt g) 100 μl Aliquote mit 450 μl Puffer-Lösung, die Thiazol Orange enthält, inkubiert. Diese Inkubation in Schritt g) erfolgt bevorzugt für mindestens 5 min und bis zu 60 min.
Bei der durchflußzytometrischen Bestimmung in Schritt h) handelt es sich bevorzugt um FACS (Fluoreszenz-aktiviertes Cell Sorting)-Analyse.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt, die Detektion der Bakterien Klebsiella oxytoca, Salmonella choleraesuis, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis und Escherichia coli. Da eine von der Bakterienspecies unabhängige Färbung der Bakterien-DNA erfolgt, lassen sich mit der beschriebenen Methode alle bekannten Bakterien nachweisen.
Eine Differenzierung nach der Bakterienspecies erfolgt nicht. Es erfolgt somit der simultane Nachweis von allen in der Probe vorhanden Bakterien.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Verwendung einer speziellen Nährbouillon (Heipha Diagnostik, Heidelberg, Deutschland) und eines speziellen Färbepuffers (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgien), der das Fluorophor Thiazol Orange enthält. Die nachfolgende Detektion kann mit jedem FACS-Analysegerät (z. B. BD FACScan, BD Bioscience, San Jose, CA, USA) durchgeführt werden.
Es konnte gezeigt werden, dass sich Bakterien mit Hilfe einer FACS-Analyse in Thrombozyten-Konzentraten nachweisen lassen. Ohne spezielle Vorinkubation schwankt die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens zwischen 10⁵ CFU/ml für Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens und Staphylococcus epidermidis, 10⁴ CFU/ml für Salmonella choleraesuis und Staphylococcus aureus und 10³ CFU/ml für Escherichia coli.
Durch die spezielle erfindungsgemäße Vorinkubation in einer Nährbouillon konnte für alle untersuchten Bakterien gezeigt werden, dass sich die Sensitivität des Nachweisverfahrens erhöht. Somit stellt gerade die Kombination aus einer Vorinkubation in einer Nährbouillon mit der FACS-Analyse ein für das Bakterien-Screening in Thrombozyten-Konzentraten mögliches neues Verfahren dar. Der schnelle Nachweis erlaubt einer späte Probenziehung (24 Stunden bis 36 Stunden nach Herstellung der Thrombozyten-Konzentrate), ohne dass sich dadurch die Freigabe der Thrombozyten-Konzentrate wesentlich verzögert.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Figuren und Beispielen illustriert. Die beschriebenen Beispiele/Figuren zeigen, dass die erfindungsgemäße Kombination für die Untersuchung von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere Thrombozyten- Konzentraten, bestehend aus einer Vorinkubation in einer speziellen Nährbouillon sowie einer Färbung der Bakterien mit einem Puffer, der Thiazol Orange enthält, wie dem BD-Puffer (Anfärbung mit Thiazol Orange), die Sensitivität der FACS-Analyse signifikant von 10⁵ CFU/ml auf 10 CFU/ml erhöht.
Figuren
1. Messung der analytischen Sensitivität ohne Vorinkubation bei 37°C.
Gezeigt wird der Prozentsatz an positiven, fraglich positiven und negativen Proben, die mit der FACS-Methode analysiert wurden, ohne dass eine Vorinkubation bei 37°C erfolgte.
2. Messung der analytischen Sensitivität mit Vorinkubation bei 37°C.
Gezeigt wird die Anzahl an positiven, fraglich positiven und negativen Proben mit Vorinkubation bei 37°C.
Beispiele
Materialien
1. Reagenzien

– Nährbouillon (Heipha Diagnostika, Heidelberg, Deutschland) (Artikel-Nummer: 303r) enthaltend: 7,8 g Fleischpepton (meat peptone), 7,8 g Caseinpepton, 2,8 g Hefeextrakt, 5,6 g NaCl, 2,0 g Glukose, pH 7,3 ± 0,2 Angaben beziehen sich auf einen Liter.

Die Nährbouillon ist klar und gelblich gefärbt und als Traubenzucker-Bouillon erhältlich (bei Heipha Diagnostika).

– BD-Färbepuffer (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgien) enthaltend: Thiazol Orange sowie einen Lysepuffer zur Permeabilisierung der Bakterien
– PBS-Verdünnungspuffer (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) Katalognummer 14190–094, pH 7,4

2. Geräte

– Durchflusszytometer (Flowcytometer) z. B. BD FACScan, BD Bioscience, San Jose, CA, USA
– Brutschrank z. B Thermo Electron B20, Langenselbold, Deutschland
– Zentrifuge z. B. Multifuge SR3, Kendro, Langenselbold, Deutschland

Beispiel 1 Beschreibung des Verfahrensablaufs
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt folgende Schritte:
1. Probenziehung unter Sterilbedingungen
Das Verfahren eignet sich besonders zum Screening von Einzelproben aus Pool-Thrombozyten-Konzentraten als auch von Apheresekonzentraten. Von jeder für das Screening vorgesehenen Probe werden bevorzugt mindestens 3 ml unter Laminar-Flow-Bedingungen steril entnommen und der oben beschriebenen Nährbouillonlösung zugefügt, die anschließend für mindestens 2 Stunden bei 37°C inkubiert wird.
2. Zentrifugation des Gesamtvolumens
Nach der Inkubation wird die gesamte Flüssigkeit (13 ml) bei 6000 × g für mindestens 10 min zentrifugiert und der Überstand verworfen.
3. Auflösen in PBS und Inkubation mit Thiazol Orange
Das Pellet wird in 1 ml PBS, pH 7,4 ebenfalls unter Laminar-Flow-Bedingungen rekonstituiert. Von dieser Lösung werden anschließend 100 μl mit 450 μl BD-Lösung (siehe oben) für mindestens 5 Minuten inkubiert
4. FACS Analyse
Die Suspension wird anschließend mit einem Durchflußzytometer (FL1 (BP 515–545 nm), FL2 (BP 572–595 nm) und FL3 (LP > 650) bestimmt. Zur Einstellung der Fluoreszenz (FL1) wird zunächst eine Positivkontrolle und anschließend eine Negativkontrolle gemessen. Die Negativkontrolle wird dabei so eingestellt, dass weniger als 50 Dots in der „Region of Interest" liegen. Die Negativkontrolle wird mindestens zweimal bestimmt.
5. Auswertung
Proben mit weniger als 50 Dots in der „Region of Interest" werden als negativ gewertet. Proben mit mehr als 100 Dot in der „Region of Interest" werden als positiv gewertet. Proben, die zwischen 50 und 100 Dots in der „Region of Interest" haben sind fraglich reaktiv und werden nach weiteren 2 Stunden Inkubation im Brutschrank erneut bestimmt.
Beispiel 2 Messung der analytischen Sensitivität ohne Vorinkubation bei 37°C.
Untersucht wurden Thrombozyten-Konzentrate, die mit 6 unterschiedlichen Bakterienstämmen einer Konzentration zwischen 10⁶ CFU/ml und 10¹ CFU/ml „gespikt" (versetzt) wurden, und zwar Klebsiella oxytoca, Salmonella choleraesuis, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis und Escherichia coli. Unmittelbar nach dem „Spiken" erfolgte die FACS-Analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben. Jede Konzentration wurde 5 mal bestimmt.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der FACS-Untersuchungen. Die Bakterienkonzentrationen wurden durch eine Inkubation auf Blutagar-Platten bestimmt (5, 6). Tabelle 1:

	10⁶ CFU/ml (Anzahl)	10⁵ CFU/ml (Anzahl)	10⁴ CFU/ml (Anzahl)	10³ CFU/ml (Anzahl)	10² CFU/ml (Anzahl)	10¹ CFU/ml (Anzahl)
Klebsiella oxytoca	310 ±40	116 ±20	81 ±11	71 ±8	77 ±11	51 ±7
Salmonella cholerasuis	1,431 ±112	862 ±53	113 ±20	65 ±14	60 ±10	47 ±7
Serratia marcescens	624 ±76	185 ±71	65 ±15	63 ±11	44 ±10	43 ±7
Staphylococcus aureus	2,217 ±201	243 ±57	146 ±35	94 ±13	47 ±6	49 ±6
Staphylococcus epidermidis	637 ±72	285 ±64	99 ±10	81 ±11	68 ±8	43 ±4
Escherichia coli	1,580 ±305	328 ±87	193 ±17	111 ±18	77 ±13	43 ±5

Die 1 zeigt den Prozentsatz an positiven, fraglich positiven und negativen Proben, die mit der FACS-Methode analysiert wurden, ohne dass eine Vorinkubation bei 37°C erfolgte.
Beispiel 3 Messung der analytischen Sensitivität mit Vorinkubation bei 37°C
Untersucht wurden Thrombozyten-Konzentrate, die mit 6 unterschiedlichen Bakterienstämmen einer Konzentration von 10² CFU/ml und 10¹ CFU/ml „gespikt" (versetzt) wurden, und zwar Klebsiella oxytoca, Salmonella choleraesuis, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis und Escherichia coli.
Die gespikten Thrombozyten-Konzentrate wurden für 2 bis 8 Stunden in 10 ml der oben beschriebenen Nährbouillon von Heipha Diagnostik, Heidelberg bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben, wie in Beispiel 1 beschrieben, zentrifugiert, rekonstituiert und mit Thiazol Orange-Puffer inkubiert. Danach erfolgte die FACS-Analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Tabelle 2 und 2 zeigen, dass durch die Vorinkubation die analytische Sensitivität signifikant erhöht wurde. Alle Proben, die mit einer Konzentration von 10² CFU/ml gespikt wurden, waren nach einer Vorinkubationszeit von 4 Stunden positiv und alle Proben, die mit einer Konzentration von 10¹ CFU/ml gespikt wurden, waren nach einer Vorinkubationszeit von 6 Stunden positiv. Tabelle 2:

	2 Stunden Vorinkubation		4 Stunden Vorinkubation		6 Stunden Vorinkubation		8 Stunden Vorinkubation
	10¹ CFU/ml (Anzahl)	10² CFU/ml (Anzahl)	10¹ CFU/ml (Anzahl)	10² CFU/ml (Anzahl)	10¹ CFU/ml (Anzahl)	10² CFU/ml (Anzahl)	10¹ CFU/ml (Anzahl)	10² CFU/ml (Anzahl)
Klebsiella oxytoca	137 ±34	537 ±62	468 ±72	738 ±119	656 ±117	2,288 ±237	21,484 ±2703	51,655 ±2977
Salmonella cholerasuis	132 ±12	1,670 ±167	278 ±45	2,466 ±291	1,186 ±172	4,356 ±876	1,727 ±158	7,782 ±1,518
Serratia marcescens	104 ±20	725 ±74	203 ±24	1,678 ±256	681 ±93	2,494 ±447	2,532 ±254	23,707 ±6,381
Staphylococcus aureus	56 ±12	105 ±14	115 ±21	134 ±15	238 ±38	305 ±80	515 ±112	1,914 ±369
Staphylococcus epidermidis	43 ±6	104 ±16	112 ±12	132 ±17	338 ±80	1,467 ±226	718 ±136	35,136 ±10,170
Escherichia coli	63 ±13	328 ±79	144 ±27	1,083 ±233	3,464 ±485	4,244 ±812	16,416 ±2,997	25,710 ±5,936

Referenzen

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Claims

Verfahren zur Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben, b) sterile Entnahme von Aliquoten der aus Blut abgeleiteten Proben unter Laminar-Flow-Bedingungen, c) Zugabe der Aliquote aus b) zu einer Nährbouillon-Lösung, umfassend Fleischpepton, Casein-Pepton, Hefeextrakt, NaCl und Glukose, mit einem pH-Wert von 6,8 bis 7,8, d) Inkubation bei 30 bis 40°C für mindestens 2 Stunden, e) Zentrifugation der inkubierten Nährbouillon-Lösung und Verwerfen des Überstandes, f) Rekonstitution des Pellets aus e) unter Laminar-Flow-Bedingungen in einer PBS-Lösung, g) Entnahme von Aliquoten aus den rekonstituierten Pellets aus f) und Zugabe der Aliquote zu einer Puffer-Lösung, die Thiazol Orange enthält, und Inkubation für einige Minuten, und h) durchflußzytometrische Bestimmung der mit Thiazol Orange markierten Bakterien in den inkubierten Aliquoten aus g).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben, Bestandteile des Blutes enthaltende Proben, insbesondere Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende Proben handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zelluläre Blutbestandteile enthaltenden Proben ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Thrombozyten enthaltenden Proben, Thrombozyten-Konzentraten, Einzelproben aus Pool-Thrombozyten-Konzentraten oder Thrombozyten-Apherese-Konzentraten.
Verfahren nach einem der oben genannten Ansprüche, wobei die Aliquote, die in Schritt b) steril entnommen werden, ein Volumen von mindestens 3 ml haben.
Verfahren nach einem der oben genannten Ansprüche, wobei die Nährbouillon-Lösung 7,8 g Fleischpepton, 7,8 g Casein-Pepton, 2,8 g Hefeextrakt, 5,6 g NaCl und 2,0 g Glukose bezogen auf einen Liter umfasst und einen pH-Wert von 7,3 ± 0,2 hat.
Verfahren nach einem der oben genannten Ansprüche, wobei das Volumen der Nährbouillon-Lösung in Schritt c) 10 ml beträgt.
Verfahren nach einem der oben genannten Ansprüche, wobei die Inkubation in Schritt d) bei 37°C für mindestens 2 Stunden und bis zu 8 Stunden erfolgt.
Verfahren nach einem der oben genannten Ansprüche, wobei die Rekonstitution in Schritt f) in 1 ml PBS-Lösung erfolgt.
Verfahren nach einem der oben genannten Ansprüche, wobei in Schritt g) 100 μl Aliquote mit 450 μl Puffer-Lösung, die Thiazol Orange enthält, inkubiert werden.
Verfahren nach einem der oben genannten Ansprüche, wobei die Inkubation in Schritt g) für mindestens 5 min erfolgt.
Verfahren nach einem der oben genannten Ansprüche, wobei die Bakterien Klebsiella oxytoca, Salmonella choleraesuis, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis und Escherichia coli detektiert werden.