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1. Zusammenfassung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis
von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere Thrombozyten-Konzentraten,
mit Hilfe einer Durchflusszytometrie-Analyse. Durch einen zusätzlichen
Inkubationsschritt in einer speziellen Nährbouillon ist es möglich, die
Sensitivität
der durchflußzytometrischen
Messung signifikant zu verbessern. Das Verfahren ermöglicht somit
eine schnelle generische Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten
Proben, insbesondere Thrombozytenkonzentraten, und ist somit besonders
zum Durchsuchen („Screening") von Blutspendern
geeignet. Die Sensitivität
der Durchflusszytometrie-Analyse wird signifikant von 105 CFU/ml auf 101 CFU/ml
erhöht.
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2. Hintergrund der Erfindung
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Das
virologische Restrisiko ist aufgrund der verschiedenen Maßnahmen,
wie Spenderselektion, ELISA-Testung und NAT-Testung, für die untersuchten
transfusionsrelevanten Viren auf ein bisher nicht gekanntes, unvorstellbar
geringes Maß gesunken.
So ist das Restrisiko, das in Deutschland nach Einführung der
PCR für
die drei transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV, HBV noch verbleibt,
mit 1:5,5 Mio. für
HIV, 1:4,4 Mio. für HCV
und 1:620.000 Mio. für
HBV (mit Pool-PCR) und 1:820.000 für HBV mit einer Einzelproben-PCR so gering geworden,
dass man fast von keinem wirklichen virologischen Restrisiko mehr
sprechen kann (1).
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Demgegenüber steht
jedoch ein bakterielles Restrisiko in Thrombozyten-Konzentraten
von 1:2000 bis 1:3000 (2-4). Dadurch, dass Thrombozyten-Konzentrate
bei Raumtemperatur gelagert werden, stellen sie für viele
Bakterien ein ideales Nährmedium
dar und sind somit besonders gefährdet.
Ferner unterscheiden sich bakterielle von den viralen Kontaminationen
darin, dass die Ausgangskonzentration zunächst sehr gering ist (< 10 CFU/ml). Darum
benötigt
man ein sehr sensitives Nachweisverfahren für die Bakteriendetektion.
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Tenner
et al. (J. Clin. Microbiol. 1982; 16(3): 437–442.); Hall et al. (Appl.
Microbiol. 1974; 27(1): 187–191);
Dreier et al. (J. Clin. Microbiol. 2004; 42(10): 4759–4764.)
sowie McCarthy und Senne (J. Clin. Microbiol. 1980; 11(3): 281–285.) offenbaren
verschiedene Nährstoffmedien
für die
Anreicherung von Bakterien in Blutproben.
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Mohr
et al. (Transfusion. 200; 46(1): 41–49.) offenbaren ein bakterielles
Nachweisverfahren von Thrombozytenkonzentraten basierend auf Thiazol
Orange-Färbung
und FACS. Das beschriebene FACS-Verfahren wird dabei entweder an
den aufbewahrten Thrombozytenkonzentraten selbst, und zwar kurz
vor deren Weiterverwendung, durchgeführt oder es wird vorgeschlagen,
20 bis 24 Stunden vor der Testung eine 10 bis 20 ml Probe zu entnehmen
und diese bei 37°C
zu inkubieren. Die Inkubation erfolgt dabei in Abhängigkeit
vom nachgewiesenen Bakterium auch über einen längeren Zeitraum (bis zu mehr
als 2 Tage) oder unter Zuhilfenahme von Trypticase Soy Broth. Es
werden Sensitivitäten
von 100 CFU/μl
erreicht, was einer Nachweisgrenze von lediglich 100.000 CFU/ml
entspricht.
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Des
weiteren sind im Stand der Technik sogenannte Kulturmethoden für den bakteriellen
Nachweis bekannt, wie z.B. das in Mohr et al. aufgeführte kommerzielle
BacT/ALERT Verfahren.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu entwickeln,
das eine schnelle und vor allem auch sensitive Detektion von Bakterien
in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere in Thrombozyten-Konzentraten,
zur Verfügung
stellt.
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Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
das zur Verfügung
stellen eines Verfahrens zur Detektion von Bakterien in aus Blut
abgeleiteten Proben gelöst.
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Im
ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
(a) werden aus Blut abgeleitete Proben zur Verfügung gestellt.
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Im
nächsten
Schritt (b) werden aus den Blut abgeleiteten Proben Aliquote steril
entnommen. Dies wird bevorzugt unter Laminar-Flow-Bedingungen durchgeführt.
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Im
nächsten
Schritt (c) werden die Aliquote (aus Schritt b) zu einer Nährbouillon-Lösung zugegeben. Die
Nährbouillon-Lösung umfasst
Fleischpepton, Casein-Pepton, Hefeextrakt, NaCl und Glukose und
hat einen pH-Wert von 6,8 bis 7,8.
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Im
nächsten
Schritt (d) erfolgt eine Inkubation der Nährbouillon-Lösung, mit
den zugegebenen Aliquoten, bei 30 bis 40°C für mindestens 2 Stunden.
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Im
nächsten
Schritt (e) wird eine Zentrifugation der inkubierten Nährbouillon-Lösung durchgeführt und die Überstande
werden verworfen.
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Im
nächsten
Schritt (f) erfolgt eine Rekonstitution des Pellets (aus Schritt
e) in einer PBS-Lösung. Dies wird
bevorzugt unter Laminar-Flow-Bedingungen durchgeführt.
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Im
nächsten
Schritt (g) werden Aliquote aus den rekonstituierten Pellets (aus
Schritt f) entnommen. Diese Aliquote werden zu einer Puffer-Lösung, die
Thiazol Orange enthält,
zugegeben. Es erfolgt Inkubation für einige Minuten.
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Anschließend erfolgt
in Schritt (h) eine durchflußzytometrische
Bestimmung der mit Thiazol Orange markierten Bakterien in den inkubierten
Aliquoten (aus Schritt g).
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfaßt
die folgenden Schritte:
- a) zur Verfügung stellen
von aus Blut abgeleiteten Proben,
- b) sterile Entnahme von Aliquoten der aus Blut abgeleiteten
Proben unter Laminar-Flow-Bedingungen,
- c) Zugabe der Aliquote aus b) zu einer Nährbouillon-Lösung, umfassend
Fleischpepton, Casein-Pepton, Hefeextrakt, NaCl und Glukose, mit
einem pH-Wert von 6,8 bis 7,8,
- d) Inkubation bei 30 bis 40°C
für mindestens
2 Stunden,
- e) Zentrifugation der inkubierten Nährbouillon-Lösung und
Verwerfen des Überstandes,
- f) Rekonstitution des Pellets aus e) unter Laminar-Flow-Bedingungen
in einer PBS-Lösung,
- g) Entnahme von Aliquoten aus den rekonstituierten Pellets aus
f) und Zugabe der Aliquote zu einer Puffer-Lösung, die Thiazol Orange enthält, und
Inkubation für
einige Minuten, und
- h) durchflußzytometrische
Bestimmung der mit Thiazol Orange markierten Bakterien in den inkubierten
Aliquoten aus g).
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Erfindungsgemäß handelt
es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben oder
um Bestandteile des Blutes enthaltende Proben, insbesondere handelt
es sich um Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende
Proben. Die zelluläre
Blutbestandteile enthaltenden Proben sind dabei ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Thrombozyten enthaltenden Proben, Thrombozyten-Konzentraten, Einzelproben
aus Pool-Thrombozyten-Konzentraten
oder Thrombozyten-Apherese-Konzentraten.
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Das
Verfahren eignet sich zum Screening von Einzelproben aus Pool-Thrombozyten-Konzentraten als auch
von Apherese-Konzentraten. Von jeder für das Screening vorgesehenen
Probe wird ein Aliquot von mindestens 3 ml unter Laminar-Flow-Bedingungen
steril entnommen Bevorzugterweise haben die Aliquote, die in Schritt
b) steril entnommen werden, ein Volumen von mindestens 3 ml. Andere
geeignete Volumina sind für den
Fachmann leicht zu bestimmen.
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In
einer besonderen Ausführungsform
umfasst die Nährbouillon-Lösung bezogen
auf einen Liter
- – 7 bis 8,5 g Fleischpepton,
weiter bevorzugt 7,8 g Fleischpepton,
- – 7
bis 8,5 g Casein-Pepton, weiter bevorzugt 7,8 g Casein-Pepton,
- – 2
bis 3,5 g Hefeextrakt, weiter bevorzugt 2,8 g Hefeextrakt,
- – 5
bis 6,5 g NaCl, weiter bevorzugt 5,6 g NaCl und
- – 1,5
bis 2,5 g Glukose, weiter bevorzugt 2,0 g Glukose.
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In
einer besonderen Ausführungsform
hat die Nährbouillon-Lösung einen
pH-Wert von 7,3 ± 0,2.
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Bevorzugt
beträgt
das Volumen der Nährbouillon-Lösung in
Schritt c) 10 ml und das Gesamtvolumen aus Nährbouillon-Lösung und
Aliquot der zu untersuchenden Probe bei der Inkubation 13 ml.
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Bevorzugt
wird die Inkubation in Schritt d) bei 37°C für mindestens 2 Stunden und
bis zu 8 Stunden durchgeführt.
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Bevorzugterweise
erfolgt die Rekonstitution der Pellets in Schritt f) in 1 ml PBS-Lösung. Die
PBS-Lösung
hat bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8,0, weiter bevorzugt
einen pH von 7,4.
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Bei
der Puffer-Lösung,
die Thiazol Orange enthält,
und in Schritt g) verwendet wird, handelt es sich bevorzugt um eine
Puffer-Lösung,
dier zur Lyse bzw. zur Permeabilisierung von Bakterien geeignet
ist. Geeignete Lyse-Puffer kann der Fachmann herstellen. In einer
besonderen Ausführungsform
wurde die Thiazol Orange-enthaltende Lösung von BD, Becton Dickinson,
Erembodegem-Aalst, Belgien zur Verfügung gestellt. Bei Thiazol
Orange handelt es sich um einen fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff.
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Andere
geeignete Farbstoffe sind Pico Green.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden bei der Färbung
in Schritt g) 100 μl
Aliquote mit 450 μl Puffer-Lösung, die
Thiazol Orange enthält,
inkubiert. Diese Inkubation in Schritt g) erfolgt bevorzugt für mindestens
5 min und bis zu 60 min.
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Bei
der durchflußzytometrischen
Bestimmung in Schritt h) handelt es sich bevorzugt um FACS (Fluoreszenz-aktiviertes
Cell Sorting)-Analyse.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
erlaubt, die Detektion der Bakterien Klebsiella oxytoca, Salmonella choleraesuis,
Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis
und Escherichia coli. Da eine von der Bakterienspecies unabhängige Färbung der
Bakterien-DNA erfolgt, lassen sich mit der beschriebenen Methode
alle bekannten Bakterien nachweisen.
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Eine
Differenzierung nach der Bakterienspecies erfolgt nicht. Es erfolgt
somit der simultane Nachweis von allen in der Probe vorhanden Bakterien.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
beruht auf der Verwendung einer speziellen Nährbouillon (Heipha Diagnostik,
Heidelberg, Deutschland) und eines speziellen Färbepuffers (Becton Dickinson,
Erembodegem-Aalst, Belgien), der das Fluorophor Thiazol Orange enthält. Die
nachfolgende Detektion kann mit jedem FACS-Analysegerät (z. B.
BD FACScan, BD Bioscience, San Jose, CA, USA) durchgeführt werden.
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Es
konnte gezeigt werden, dass sich Bakterien mit Hilfe einer FACS-Analyse
in Thrombozyten-Konzentraten nachweisen lassen. Ohne spezielle Vorinkubation
schwankt die Sensitivität
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zwischen 105 CFU/ml für Klebsiella oxytoca, Serratia
marcescens und Staphylococcus epidermidis, 104 CFU/ml
für Salmonella
choleraesuis und Staphylococcus aureus und 103 CFU/ml
für Escherichia
coli.
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Durch
die spezielle erfindungsgemäße Vorinkubation
in einer Nährbouillon
konnte für
alle untersuchten Bakterien gezeigt werden, dass sich die Sensitivität des Nachweisverfahrens
erhöht.
Somit stellt gerade die Kombination aus einer Vorinkubation in einer
Nährbouillon
mit der FACS-Analyse ein für
das Bakterien-Screening in Thrombozyten-Konzentraten mögliches
neues Verfahren dar. Der schnelle Nachweis erlaubt einer späte Probenziehung
(24 Stunden bis 36 Stunden nach Herstellung der Thrombozyten-Konzentrate), ohne
dass sich dadurch die Freigabe der Thrombozyten-Konzentrate wesentlich
verzögert.
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Die
vorliegende Erfindung wird in den folgenden Figuren und Beispielen
illustriert. Die beschriebenen Beispiele/Figuren zeigen, dass die
erfindungsgemäße Kombination
für die
Untersuchung von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere
Thrombozyten- Konzentraten,
bestehend aus einer Vorinkubation in einer speziellen Nährbouillon
sowie einer Färbung
der Bakterien mit einem Puffer, der Thiazol Orange enthält, wie
dem BD-Puffer (Anfärbung
mit Thiazol Orange), die Sensitivität der FACS-Analyse signifikant
von 105 CFU/ml auf 10 CFU/ml erhöht.
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Figuren
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1. Messung
der analytischen Sensitivität
ohne Vorinkubation bei 37°C.
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Gezeigt
wird der Prozentsatz an positiven, fraglich positiven und negativen
Proben, die mit der FACS-Methode analysiert wurden, ohne dass eine
Vorinkubation bei 37°C
erfolgte.
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2. Messung
der analytischen Sensitivität
mit Vorinkubation bei 37°C.
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Gezeigt
wird die Anzahl an positiven, fraglich positiven und negativen Proben
mit Vorinkubation bei 37°C.
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Beispiele
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Materialien
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1. Reagenzien
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- – Nährbouillon
(Heipha Diagnostika, Heidelberg, Deutschland) (Artikel-Nummer: 303r)
enthaltend:
7,8
g Fleischpepton (meat peptone),
7,8 g Caseinpepton,
2,8
g Hefeextrakt,
5,6 g NaCl,
2,0 g Glukose,
pH 7,3 ± 0,2 Angaben
beziehen sich auf einen Liter.
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Die
Nährbouillon
ist klar und gelblich gefärbt
und als Traubenzucker-Bouillon erhältlich (bei Heipha Diagnostika).
- – BD-Färbepuffer
(Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgien)
enthaltend:
Thiazol
Orange
sowie einen Lysepuffer zur Permeabilisierung der Bakterien
- – PBS-Verdünnungspuffer
(Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland)
Katalognummer 14190–094, pH
7,4
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2. Geräte
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- – Durchflusszytometer
(Flowcytometer)
z. B. BD FACScan, BD Bioscience, San Jose,
CA, USA
- – Brutschrank
z.
B Thermo Electron B20, Langenselbold, Deutschland
- – Zentrifuge
z.
B. Multifuge SR3, Kendro, Langenselbold, Deutschland
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Beispiel 1 Beschreibung des Verfahrensablaufs
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst bevorzugt folgende Schritte:
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1. Probenziehung unter Sterilbedingungen
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Das
Verfahren eignet sich besonders zum Screening von Einzelproben aus
Pool-Thrombozyten-Konzentraten
als auch von Apheresekonzentraten. Von jeder für das Screening vorgesehenen
Probe werden bevorzugt mindestens 3 ml unter Laminar-Flow-Bedingungen
steril entnommen und der oben beschriebenen Nährbouillonlösung zugefügt, die anschließend für mindestens
2 Stunden bei 37°C
inkubiert wird.
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2. Zentrifugation des Gesamtvolumens
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Nach
der Inkubation wird die gesamte Flüssigkeit (13 ml) bei 6000 × g für mindestens
10 min zentrifugiert und der Überstand
verworfen.
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3. Auflösen in PBS und Inkubation mit
Thiazol Orange
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Das
Pellet wird in 1 ml PBS, pH 7,4 ebenfalls unter Laminar-Flow-Bedingungen
rekonstituiert. Von dieser Lösung
werden anschließend
100 μl mit
450 μl BD-Lösung (siehe
oben) für
mindestens 5 Minuten inkubiert
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4. FACS Analyse
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Die
Suspension wird anschließend
mit einem Durchflußzytometer
(FL1 (BP 515–545
nm), FL2 (BP 572–595
nm) und FL3 (LP > 650)
bestimmt. Zur Einstellung der Fluoreszenz (FL1) wird zunächst eine
Positivkontrolle und anschließend
eine Negativkontrolle gemessen. Die Negativkontrolle wird dabei
so eingestellt, dass weniger als 50 Dots in der „Region of Interest" liegen. Die Negativkontrolle
wird mindestens zweimal bestimmt.
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5. Auswertung
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Proben
mit weniger als 50 Dots in der „Region of Interest" werden als negativ
gewertet. Proben mit mehr als 100 Dot in der „Region of Interest" werden als positiv
gewertet. Proben, die zwischen 50 und 100 Dots in der „Region
of Interest" haben
sind fraglich reaktiv und werden nach weiteren 2 Stunden Inkubation
im Brutschrank erneut bestimmt.
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Beispiel 2 Messung der analytischen Sensitivität ohne Vorinkubation
bei 37°C.
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Untersucht
wurden Thrombozyten-Konzentrate, die mit 6 unterschiedlichen Bakterienstämmen einer Konzentration
zwischen 106 CFU/ml und 101 CFU/ml „gespikt" (versetzt) wurden,
und zwar Klebsiella oxytoca, Salmonella choleraesuis, Serratia marcescens,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis und Escherichia
coli. Unmittelbar nach dem „Spiken" erfolgte die FACS-Analyse,
wie in Beispiel 1 beschrieben. Jede Konzentration wurde 5 mal bestimmt.
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Tabelle
1 zeigt die Ergebnisse der FACS-Untersuchungen. Die Bakterienkonzentrationen
wurden durch eine Inkubation auf Blutagar-Platten bestimmt (5, 6). Tabelle 1:
| 106
CFU/ml
(Anzahl) | 105
CFU/ml
(Anzahl) | 104
CFU/ml
(Anzahl) | 103
CFU/ml
(Anzahl) | 102
CFU/ml
(Anzahl) | 101
CFU/ml
(Anzahl) |
Klebsiella
oxytoca | 310
±40 | 116
±20 | 81
±11 | 71
±8 | 77
±11 | 51
±7 |
Salmonella cholerasuis | 1,431
±112 | 862
±53 | 113
±20 | 65
±14 | 60
±10 | 47
±7 |
Serratia
marcescens | 624
±76 | 185
±71 | 65
±15 | 63
±11 | 44
±10 | 43
±7 |
Staphylococcus aureus | 2,217
±201 | 243
±57 | 146
±35 | 94
±13 | 47
±6 | 49
±6 |
Staphylococcus
epidermidis | 637
±72 | 285
±64 | 99
±10 | 81
±11 | 68
±8 | 43
±4 |
Escherichia
coli | 1,580
±305 | 328
±87 | 193
±17 | 111
±18 | 77
±13 | 43
±5 |
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Die 1 zeigt
den Prozentsatz an positiven, fraglich positiven und negativen Proben,
die mit der FACS-Methode analysiert wurden, ohne dass eine Vorinkubation
bei 37°C
erfolgte.
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Beispiel 3 Messung der analytischen Sensitivität mit Vorinkubation
bei 37°C
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Untersucht
wurden Thrombozyten-Konzentrate, die mit 6 unterschiedlichen Bakterienstämmen einer Konzentration
von 102 CFU/ml und 101 CFU/ml „gespikt" (versetzt) wurden,
und zwar Klebsiella oxytoca, Salmonella choleraesuis, Serratia marcescens,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis und Escherichia
coli.
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Die
gespikten Thrombozyten-Konzentrate wurden für 2 bis 8 Stunden in 10 ml
der oben beschriebenen Nährbouillon
von Heipha Diagnostik, Heidelberg bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden
die Proben, wie in Beispiel 1 beschrieben, zentrifugiert, rekonstituiert
und mit Thiazol Orange-Puffer inkubiert. Danach erfolgte die FACS-Analyse,
wie in Beispiel 1 beschrieben.
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Tabelle
2 und
2 zeigen, dass durch die Vorinkubation die analytische
Sensitivität
signifikant erhöht wurde.
Alle Proben, die mit einer Konzentration von 10
2 CFU/ml
gespikt wurden, waren nach einer Vorinkubationszeit von 4 Stunden
positiv und alle Proben, die mit einer Konzentration von 10
1 CFU/ml gespikt wurden, waren nach einer
Vorinkubationszeit von 6 Stunden positiv. Tabelle 2:
| 2 Stunden
Vorinkubation | 4 Stunden
Vorinkubation | 6 Stunden
Vorinkubation | 8 Stunden
Vorinkubation |
| 101
CFU/ml
(Anzahl) | 102
CFU/ml
(Anzahl) | 101
CFU/ml
(Anzahl) | 102
CFU/ml
(Anzahl) | 101
CFU/ml
(Anzahl) | 102
CFU/ml
(Anzahl) | 101
CFU/ml
(Anzahl) | 102
CFU/ml
(Anzahl) |
Klebsiella
oxytoca | 137
±34 | 537
±62 | 468
±72 | 738
±119 | 656
±117 | 2,288
±237 | 21,484
±2703 | 51,655
±2977 |
Salmonella
cholerasuis | 132
±12 | 1,670
±167 | 278
±45 | 2,466
±291 | 1,186
±172 | 4,356
±876 | 1,727
±158 | 7,782
±1,518 |
Serratia
marcescens | 104
±20 | 725
±74 | 203
±24 | 1,678
±256 | 681
±93 | 2,494
±447 | 2,532
±254 | 23,707
±6,381 |
Staphylococcus
aureus | 56
±12 | 105
±14 | 115
±21 | 134
±15 | 238
±38 | 305
±80 | 515
±112 | 1,914
±369 |
Staphylococcus
epidermidis | 43
±6 | 104
±16 | 112
±12 | 132
±17 | 338
±80 | 1,467
±226 | 718
±136 | 35,136
±10,170 |
Escherichia
coli | 63
±13 | 328
±79 | 144
±27 | 1,083
±233 | 3,464
±485 | 4,244
±812 | 16,416
±2,997 | 25,710
±5,936 |
-
Referenzen
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