DE69421085T2 - Verfahren und testsatz zum nachweis von bakteriophagen - Google Patents

Verfahren und testsatz zum nachweis von bakteriophagen

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von Bakteriophagen (Phage oder Phagen), und Testsätze zur Durchführung dieses Verfahrens. Insbesondere ermöglicht das Verfahren den Nachweis von Bakteriophagen, die spezifisch sind für eine bestimmte bakterielle Gattung, Spezies oder einen Serotyp, unabhängig davon, ob sie in isolierter Form auftreten oder als Verunreinigungen in Umweltproben oder forensischen Proben oder in Nahrungsmitteln.
  • Die WO 92/02633 beschreibt ein Verfahren für den mikrobiellen Nachweis, welches Bakteriophagen zur Infektion vorhandener Mikroben benutzt und anschließend die Bakteriophagen nachweist unter Verwendung von Reporterbakterien, die so konstruiert wurden, daß Sie ein Indikatorgen umfassen.
  • Die noch schwebende Anmeldung WO 94/06931 offenbart ein Verfahren zum Nachweis spezifischer Bakterien, das Bakteriophagen zum Lysieren bestimmter bakterieller Zellen verwendet, deren Gehalt dann nachgewiesen werden kann.
  • Wenngleich oft unerwünscht, haben Bakterien auch viele industrielle Verwendungen. Von zunehmender Wichtigkeit ist die Rolle der Bakterien auf dem Gebiet der Gentechnik und insbesondere bei der großtechnischen Produktion von Proteinprodukten aus genetisch konstruierten Bakterien. Traditionell wurden sie bei der Produktion von natürlichen Produkten durch Gärung verwendet, insbesondere bei der Produktion von Käse und Milchgärungsprodukten. Die schnelle Gärung von Lactose zu Milchsäure ist die Hauptreaktion bei der Herstellung solcher von Milch abgeleiteter Produkte, und sie wird in Gang gesetzt durch Zugabe von Starterkulturen der Spezies Milchsäurebakterien zu dem Milchsubstrat. Gelegentlich versagen diese Starterkulturen aus verschiedenen Gründen, und die normale Säureentwicklung beginnt nicht oder wird nicht aufrechterhalten.
  • Einer der wichtigsten Gründe für das Versagen der Starterkulturen ist das Vorhandensein von Bakteriophagen in der Milch, die oft aus der Molkereiumgebung stammen. Diese sind spezifische virale Mittel, die Bakterien angreifen und töten, in diesem Falle die Bakterien der Starterkultur. Die Bakteriophagen reproduzieren sich parasitär in ihren bakteriellen Wirten, was zu einer Nachkommenschaft von neuen Phagepartikeln führt, die durch Lysis der bakteriellen Zellen in die Umgebung freigesetzt werden. Eine Bakteriophageninfektion in einer Molkereianlage führt zu einer ernsten Verminderung, zu einem völligen Mißlingen der Produktion von Milchsäure durch die Starterkulturen. Viele Jahre lang ist das Problem der Phagen das schwerwiegendste gewesen, mit dem sich die Käsemacher konfrontiert sahen wegen der damit verbundenen wirtschaftlichen Verluste. Diese beinhalten die bei der Herstellung verlorene Zeit, den Verlust von Rohmaterial und von unter der Norm liegenden Produkten (vergleiche Klaenhammer (1984), Adv. Appl. Microbiol. 46, 313-25, and Heap & Lawrence (1988) Developments in Food Microbiology, Elsevier). Herkömmliche in der Milchindustrie zum Nachweis von Bakteriophagen verwendete Techniken basieren auf der traditionellen mikrobiologischen Technologie und sind sowohl arbeitsintensiv wie zeitaufwendig. Diese umfassen die Beobachtung der bakteriellen Plaques, d. h. freien Gebieten in einem Hintergrund von Bakterien, die hergestellt wurden auf Rasen von Starterkulturbakterien in Petrischalen, und das Messen der Milchsäureproduktionsrate in den Kulturen, die beide mit Umweltproben geimpft wurden. Es ist deutlich, daß die Entwicklung einer schnellen, doch einfachen Methode zum Nachweis von Bakteriophagen von ungeheurem Nutzen für die Industrie wäre.
  • Der Erfinder hat jetzt eine solche Methode geschaffen, die in ihrer bevorzugten Form biolumineszierende Techniken zur Schaffung eines Lichtsignals verwendet, das die Gegenwart und die Menge einer spezifischen Bakteriophage oder eines Bakteriophagentyps in einer zu untersuchenden Probe anzeigt, wobei sich im Gegensatz zu 24 Stunden oder mehr bei vorhandenen Verfahren, innerhalb von etwa 4 bis 5 ein positives Ergebnis ergibt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Freisetzung zellulärer Komponenten von Bakterien, die mit Bakteriophagen infiziert wurden, insbesondere, wenn der Bakteriophage eine lytische Zyklusreplikation durchmacht. In diesem Zyklus übernehmen die Bakteriophagen den Stoffwechsel der Zelle und reduplizieren sich selbst, wobei am Ende des Zyklus die bakteriellen Zellwände zerreißen unter Freigabe von Nachkommenschaft und im wesentlichen des ganzen bakteriellen Zelleninhalts. Durch Messung einer oder mehrerer besonderer Komponenten, die man mit der bakteriellen Zelle verbunden vorgefunden hat und die in einem Inkubationsmedium durch die Phage für Reagenzien zugänglich gemacht worden sind, ist es möglich, die Infektion zu messen, beispielsweise durch Lysis, und unter Benutzung von Eichkurven oder anderen statistischen Methoden ist es auf diese Weise möglich, die Menge an Phagen in der ursprünglichen Probe abzuschätzen. Indem man die Probe einer Bakterie aussetzt, die ein spezifisches Ziel der Phage ist, die Gegenstand des Tests ist, und durch die Schaffung von Inkubationsbedingungen, die die Infektion dieser Bakterie durch eine spezifische Phage erlauben, ist es möglich, das Vorhandensein und die Menge einer spezifischen Phage selbst bei Vorhandensein von solchen zu bestimmen, die keine Infektion verursachen, indem man auf bestimmte zelluläre, zugänglich gemachte Komponenten hin, wie oben beschrieben, untersucht.
  • Somit liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von Zielbakteriophagen einer vorher festgelegten bakteriellen Wirtsspezifität in einem zu untersuchenden Material, indem man eine von dem Material mit den Bakterien jenes Wirtstyps abgeleitete Probe, vorzugsweise in einer flüssigen Kultur, unter solchen Bedingungen bebrütet, daß sie bei Infektion mit der Zielphage die zellulären Komponenten freisetzt, die Menge einer oder mehrerer besonderer Komponenten mißt, die von der Bakterie durch irgendeine in der Probe während der Bebrütung vorliegende Bakteriophage freigesetzt werden, und dies in Beziehung bringt zu dem Vorhandensein, der Identität und/oder der Menge der Zielbakteriophage. Vorzugsweise umfaßt die besondere Komponente oder die besonderen Komponenten Nukleotide.
  • Es ist theoretisch möglich, durch die Anwendung eines oder mehrerer der vielen in der Technik verfügbaren Prüfsysteme auf Enzymbasis, z. B. des Kaskadensystems alle Nukleotide zu messen, die durch die Zell-Lysis freigesetzt werden, welche durch die Freisetzung von neuen Phagenpartikeln verursacht wurde, wie z. B. NAD, NADP, NADH, NADPH, ATP oder ADP, cAMP oder cGMP. Beispielsweise offenbart die GB 2213261 ein auf einem Salicylat-Monooxygenase-System basierendes Verfahren, das verwendet werden kann zur Prüfung reduzierter Pyridinnukleotide, z. B. NADH oder NADPH, während andere Enzymsysteme, wie z. B. das alkalische Phosphatase-(EC 3.1.3.1)/NAD/NADP-System, in der GB 2240845 offenbart sind. Geeignete Prüfsysteme für ADP, cAMP, cGMP usw. sind den Fachleuten bekannt.
  • Besonders bevorzugt ist jedoch die Messung von Adenosin-Triphosphat (ATP), welches leicht messbar ist durch Prüfung mit verschiedenen Enzym/Enzymsubstrat- Kombinationen, da es ein Kofaktor in zahlreichen Substratumwandlungen ist und in relativ großen Mengen freigesetzt wird, im Vergleich zu anderen bakteriellen Nukleotiden. Für die schnelle und wirksame Bestimmung des Gehalt des freigesetzten ATP in der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung von Enzymen besonders bevorzugt, die zur Produktion von Lumineszenz führen, insbesondere des Enzyms Luciferase. Die ATP-Freisetzung ist mit im Handel erhältlichen Reagenzien quantifizierbar unter Verwendung des Verfahrens der Biolumineszenz, wobei es benutzt wird zum Antreiben der Reaktion, bei der Luciferase die Oxidation von Luciferin katalysiert mit dem Ergebnis der Lichtemission. Die Quantenleistung dieser Reaktion ist äußerst hoch, und die Menge des produzierten Lichts gibt ein Maß der ursprünglich in der Probe vorhandenen Menge ATP, bevor die Prüfreaktion erschöpft ist.
  • Zur Identifizierung oder Quantifizierung einer spezifischen Phage, die im Material in relativ hohen Konzentrationen, z. B. in Kulturen einer isolierten Phage, vorkommt, ist es möglich, lediglich die spezifische Wirtsbakterie mit einer Probe des Materials in Gegenwart oder mit anschließender Zugabe von den Komponenten-Prüfreagenzien zu inkubieren und so die Menge der durch die Prüfung freigesetzten Komponente zu messen.
  • Wo lytische Phagen angestrebt werden, platzt die spezifische, mit der Zielbakteriophage infizierte Wirtsbakterie (die Zeiten schwanken von z. B. 20 bis 60 Minuten in Abhängigkeit von der Spezies) am Ende des Replikationszyklus, die zelluläre Komponente, z. B. Nukleotide werden freigesetzt und durch die Prüfung nachgewiesen. Kontrollproben, die entweder keine Phage oder Phagen ohne Bakterien enthalten, zeigen keinen Gehaltsanstieg über den Hintergrundgehalt hinaus.
  • Für die Identifizierung, den Nachweis und/oder die Quantifizierung einer spezifischen Phage bei niedrigeren Konzentrationen, beispielsweise als Verunreinigungen in oder auf Wasser oder Nahrungsmittelmaterialien ist es notwendig, beispielsweise für ein Paar Stunden eine Anreicherung der zu prüfenden Probe vorzunehmen, um der Zielphage die Vervielfältigung bis auf einen Gehalt zu ermöglichen, bei dem die freigesetzten Komponenten, z. B. Nukleotide, oberhalb des Hintergrundniveaus nachweisbar sind. Diese Anreicherung wird vorzugsweise durchgeführt durch das Impfen einer benutzten Kultur, vorzugsweise einer log-Phasenkultur, weiterer Wirtsbakterien eines Typs, der vorzugsweise spezifisch durch die Zielbakteriophage parasitär besiedelt werden kann. Nach den Inkubationen mit der Wirtsbakterie zur Erhöhung der Phagenzahl wird eine Probe eines zellfreien phagenangereicherten Mediums mit einer Kultur der Starterorganismen, vorzugsweise in einer 10 g-Phase, gemischt und bei einer festgesetzten Temperatur eine bestimmte Zeit zur Freisetzung der Zellkomponenten bebrütet, wobei Temperatur und Zeit von den Eigenschaften der benutzten Phage-Bakterienkombination und der Komponente, z. B. dem Nukleotid, abhängig sind, dessen Freisetzung unter Verwendung eines geeigneten Prüfsystems, beispielsweise eines Enzym/Substrat-Systems, gemessen werden soll.
  • Die zu analysierende Probe sollte vorzugsweise zwecks Entfernung etwaiger Bakterien gefiltert werden, bevor sie der Anreicherungs- oder Komponentenfreisetzungsstufe zugeführt wird, um eine mögliche störende Freisetzung aufgrund der Wirkung von Nichtziel-Bakteriophagen auf verunreinigende Bakterien zu vermeiden. Für die Probenahme aus einer zu untersuchenden Umgebung können konventionelle Methoden benutzt werden, wie z. B. das Betupfen z. B. von Oberflächen oder das Probenehmen aliquoter Teile von Flüssigkeiten.
  • In Abhängigkeit von der Biologie des ausgewählten Phage/Wirt-Paares hat das Verfahren das Potential großer Spezifität und noch weiterer Empfindlichkeit und Schnelligkeit. Unter Verwendung der vorher genannten ATP- Prüfmethode hat der Erfinder Phagen-Nachweissysteme entwickelt, die für Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella, E. coli und Pseudomonaden spezifisch sind. Der Fachmann wird bemerken, daß es keine Einschränkung für die Anwendung des vorliegenden Verfahrens gibt, abgesehen von der Verfügbarkeit der notwendigen spezifischen Phage/Bakterie-Paarungen. Für die bevorzugte Lumineszenz-Prüfmethode, bei der die Freisetzung von ATP gemessen wird, wird die Testprobe, phagenangereichert oder nicht, mit der Bakterienkultur, vorzugsweise als 10 g-Phase, in einem Luminometerröhrchen gemischt und für eine geeignete Zeit bebrütet. Diese wird im allgemeinen 30-60 Minuten betragen in Abhängigkeit von dem Phage/Bakteriensystem. Nach oder während dieses Zeitraumes, vorzugsweise danach, wird das freigesetzte ATP mit Hilfe einer lichtproduzierenden Prüfung, z. B. dem Luciferase/Luciferin-Reaktionssystem gemessen, um eine Lichtmenge zu erzeugen, die in einem Luminometer nachgewiesen und zu der Menge ATP in Beziehung gesetzt wird.
  • In allen Fällen können vorteilhafterweise Kontrollen durchgeführt werden zum Vergleich der Hintergrund- Komponenten-Niveaus, z. B. der Nukleotid-Niveaus, beispielsweise in Proben des Mediums der 10 g-Phasenkultur ohne die Bakterien und/oder bebrütet mit Bakterien und einer bekannten Menge der Phage, wodurch die Herstellung von Eichkurven ermöglicht wird. Diese Kontrollen können den Wettstreit mit anderen Wirten verschiedener Spezifität zur vollständigeren Bestimmung der Eigenschaften verschiedener Phagentypen in der Probe beinhalten. Ähnlich können mehrere bakterielle Typen bei einer Inkubation verwendet werden, wenn das Verfahren benutzt wird, um eine Anzahl von Phagentypen auszusondern, für die keine übliche Bakterie spezifisch genug ist.
  • Der Fachmann wird feststellen, daß der Bereich der verfügbaren Bakterien und der Bakteriophagen, für die sie spezifisch sind, ungeheuer groß ist. Beispielsweise ist eine Liste von Phagentypen, die von American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, von dieser Seite als "Catalogue of Bacteria & Bacteriophages" veröffentlicht. Andere Hinterlegungsstellen veröffentlichen ebenfalls in ihren Katalogen gleichwertige Daten, und dies kann zur Identifizierung möglicher Phage-"Reagenzien" für das vorliegende Verfahren benutzt werden. Bakterien können unter anderem in wäßriger Lösung oder in einer gefriergetrockneten Form z. B. auf Mikrotiterplatten verwendet werden. Auf diese Weise kann Plattenluminometrie angewendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zielt insbesondere auf die Quantifizierung lytischer Phagen, d. h. solcher, die zur Lysis der Testbakterien führen, aber es kann jede Phage nachgewiesen werden, die die Freisetzung zellulärer Komponenten durch seine Wirkung verursacht.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch Testsätze zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese sind dadurch charakterisiert, daß sie eine Bakterie, die nach ihrer Fähigkeit ausgewählt ist, mit einer Zielbakteriophage spezifisch infiziert zu werden, d. h. einem Typ oder Typen, deren Nachweis, Identifizierung und/oder Quantifizierung gewünscht wird, in Kombination mit einigen oder allen Reagenzien umfassen, die auf spezifische Weise mit dem vorher dargestellten erfindungsgemäßen Verfahren verbunden sind.
  • So umfassen die erfindungsgemäßen Testsätze vorzugsweise
  • (a) eine Bakterie, ausgewählt nach seiner Fähigkeit, spezifisch durch die Bakteriophagen infiziert und dadurch zur Freisetzung zellulärer Komponenten veranlaßt zu werden, und mindestens eins
  • (b) der Reagenzien zur Durchführung der Prüfung auf eine zelluläre Komponente, die durch Einwirkung der Bakteriophage auf die Bakterie freigesetzt wird, und
  • (c) eine Bakterie zur Unterstützung des Wachstums der Zielbakteriophage.
  • Daher sind die erfindungsgemäßen Testsätze solche, bei denen die für die Prüfung notwendigen Reagenzien zur Prüfung der Menge des von der Bakterie freigesetzten Nukleotids dienen, vorzugsweise sind es Reagenzien, die Luciferin und Luciferase enthalten. Die für die Durchführung der Hochempfindlichkeitsprüfung der Bakteriophagen optimierten Testsätze umfassen Bakterien der obigen Komponente (c), die dieselben sein können wie die der Komponente (a), aber auch weniger spezifisch mit Parasiten besiedelte Bakterien sein können, die aber trotzdem in der Lage sind, eine schnellere Replikation der Phage zu unterstützen oder eine größere Menge der Phage zu produzieren.
  • Das Verfahren und die Testsätze der vorliegenden Erfindung werden jetzt im einzelnen zur Erläuterung nur mit Bezug auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele dargestellt. Die große Vielfalt der verfügbaren Optionen wird der Fachmann leicht an Hand des allgemeinen oben beschriebenen und im einzelnen weiter unten ausgeführten Verfahrens und der verfügbaren Typen von Bakterie/Phage-Paarungen und z. B. Nukleotidprüfungen feststellen können.
    • Beispiel 1: Testsatz zum Nachweis von Bakteriophagen, die spezifisch sind für bakterielle Starterkulturen in der Molkerei und in Molkereiprodukten.
  • Ein erfindungsgemäßer Testsatz umfaßt geeigneterweise die weiter unten mit einem "Sternchen" markierten Punkte und wird wahlweise ergänzt durch irgendeine andere Ausrüstung oder Reagenzien, die unten als für das Verfahren notwendig angegeben sind.
  • Benötigte Ausrüstung: Sterile Baumwolltupfer; Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,8 um; Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,22 um; sterile 5 ml Spritzen; sterile Universalflaschen oder Bijouflaschen; Zentrifugenröhrchen; Luminometer (Modell LB953 Autolumat; Berthold Instruments UK Ltd, St. Albans, Hertfordshire); Polystyrol-Luminometerröhrchen (Sarstedt, Beaumont Leys, Leicester).
  • Benötigte Reagenzien: Sterile Pepton/Salzlösung (lg pro Liter/ 8,5 g pro Liter bzw. 8,5 g pro Liter destilliertem Wasser); M17-Brühe (Unipath Limited, Basingstocke), *Adenosin-5'-triphosphat-Prüfmischung, die Luciferin/Luciferase und Verdünnungspuffer enthält (Sigma Chemical Company Limited, Poole, Dorset); sterile 10%ige Milchsäure; *Vorratskultur von Starterkulturbakterien (vergleiche Bulletin of the IDF 263/1991, Chapter 2).
    • Beispiel 2: Verfahren zur Bestimmung von Bakteriophagen, die spezifisch sind für bakterielle Starterkulturen (A) in der Molkerei und (B) in Molkereiprodukten. A: Molkereiausrüstungsmethode:
  • Probenahme: Ein steriler, in. sterilem destilliertem Wasser angefeuchteter Baumwolltupfer wurde benutzt, um eine Fläche der Ausrüstung (0,5 qm) zu betupfen und dann in 5 ml steriler Pepton/Salzlösung gerührt. Die Pepton/Salzlösung wurde dann durch einen Spritzenfilter einer Porengröße von 0,8 um in einen sterilen Behälter filtriert, dann durch einen Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,22 um wieder in einen zweiten Behälter filtriert. Wenn der Bakteriophagentiter niedrig erwartet wurde, wurde ein Phagenanreicherungsschritt durchgeführt.
  • Anreicherung: 8 ml einer frischen M17-Brühe wurde mit 1 ml der 10 g-Phasenkultur der Starterorganismen geimpft, 1 ml des Bakteriophagenfiltrats wurde hinzugefügt und die Mischung bei einer geeigneten Temperatur 4 Stunden lang (20 bis 22ºC für mesophile Starterkulturen und 42ºC für thermophile Starterkulturen) bebrütet. Diese angereicherte Kultur wurde in einen Zentrifugenröhrchen übertragen und rotiert, um Bakterien zu entfernen (5000 g, 20 Minuten lang), bevor der Überstand durch einen Spritzenfilter einer Porengröße von 0,22 um in ein steriles Gefäß filtriert wurde.
  • Prüfung: 50 ul der M17-Brühe, die wie oben angegeben auf 22ºC oder 42ºC je nach Wirtsstarterkultur gehalten wurde, wurden in alle 80 Polystyrol-Luminometerröhrchen in dem Luminometer gefüllt, die auf die gleiche Temperatur vorgewärmt waren. 50 ul der 10 g-Phasen- Starterkultur wurden in jedes zweite Röhrchen als Negativkontrolle eingebracht, und 0,5 ml des "Phagen- Filtrats" aus der Anreicherungs- oder Probenahmestufe wurden zu 4,5 ml der restlichen Kultur hinzugefügt, und 50 ul davon wurden in jedes der restlichen Luminometerröhrchen eingebracht. Die Lichtmessung wurde mit 100 ul Luciferin/Luciferase-Reagenz begonnen, die in jedes Röhrchen eingespritzt wurden, und die Lichtabgabe wurde über Zeiträume von 60 Sekunden gemessen. Lichtmessungsmaxima (Zählungen pro Sekunde) wurden gegen die Zeit für die Proberöhrchen und die negativen Kontrollröhrchen graphisch dargestellt.
  • Ergebnis: Ein ahnährend 5-facher Anstieg des freien ATP-Gehalts der Testproben gegenüber den Negativkontrollen zeigte das Vorhandensein von starterspezifischen Phagen in der Testprobe an.
    • B. Mokereiproduktmethode:
  • Probenahme: Flüssigkeiten erforderten keine besondere Vorbehandlung; Pulver wurden vorteilhafterweise in einem geeigneten Volumen (z. B. Verdünnung 1 : 10) sterilen Wassers aufgelöst; Feststoffe, wie Käse wurden mit dem neunfachen ihres Gewichts Pepton/Salzlösung gemischt und dann homogenisiert. Der pH-Wert aller Proben wurde dann aseptisch auf 4, 5 bis 4,7 eingestellt, um Kasein auszufällen. 0,3 ml sterile 10%ige Milchsäure wurden zu 10 ml Milch oder Molke hinzugefügt; die Benutzung einer pH-Elektrode wurde wegen des Risikos der Verunreinigung vermieden, wenn sie nicht im Autoklaven behandelt war. Die Proben wurden bei 5.000 g 20 Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand wurde durch einen Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,22 um in einen sterilen Behälter filtriert, um große Partikel und Bakterien zu entfernen. Wie unter (A) weiter oben, wurde der Bakteriophagentiter in diesem sterilen Filtrat durch einen Anreicherungsschritt erhöht, wenn man befürchtete, daß er niedrig war. Die Anreicherung und die Lichtmessungstufen wurden wie in der Methode (A) weiter oben beschrieben durchgeführt.

Claims (21)

1. Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von Zielbakteriophagen einer bestimmten bakteriellen Wirtsspezifität in einem zu untersuchenden Material, bei dem man eine Probe bebrütet, die von dem Material mit Bakterien des Wirtstyps unter solchen Bedingungen abgeleitet wurde, daß die Bakterien bei Infektion mit der Zielphage lysiert werden und so ihre Zellbestandteile freisetzen, die Menge einer oder mehrerer bestimmter, von der Bakterie freigesetzter Bestandteile mißt und dies mit dem Vorhandensein, der Identität und/oder der Menge der Zielbakteriophage in Beziehung bringt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der oder die gemessenen besonderen Zellbestandteile ein oder mehrere Nukleotide umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die gemessene (n) Komponente(n) ein oder mehrere von NAD, NADP, NADH, NADPH, ATP oder ADP, CAMP oder cGMP sind.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem das Nukleotid unter Benutzung eines Prüfsystems auf Enzymbasis gemessen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Prüfsystem ein Enzym-Kaskadenprüfsystem ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Komponente ATP ist und die Prüfung eine enzymische Reaktion verwendet, die zu Lumineszenz führt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Prüfsystem das Luciferin/Luciferase-System ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Stufe des Bebrütens der Probe mit den Wirtsbakterien durch Mischen der Probe mit einer Kultur aus Wirtsbakterien durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Schritt des Inkubierens der Probe mit den Wirtsbakterien in Gegenwart von oder mit anschlienßender Zugabe von besonderen Komponentenprüfreagenzien durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem Luciferin/Luciferase-Reaktionsreagenzien verwendet werden und die Menge des abgegebenen Lichtes während und/oder am Ende der Inkubation gemessen wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 10, bei dem die Bakteriophage in der Probe vor Zugabe zu den Stufen der Komponetenfreisetzung und Messung angereichert wird, indem man sie mit einer Kultur aus Bakterien eines Typs, der durch die Zielbakteriophage parasitär besiedelt werden kann und sich dabei vervielfältigen kann, inkubiert.
12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Anreicherungsinkubation 1-4 Stunden lang durchgeführt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die Anreicherungsstufe durch Hinzufügen der Probe zu einer log-Phasen-Kultur der Wirtsbakterien durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Anreicherungs- und Komponentenfreisetzunginkubationen unter Verwendung einer Anzahl von Wirtsbakterientypen verschiedener Spezifität durchgeführt werden, wobei die Freisetzung der Komponente eine Anzahl der Bakteriophagentypen anzeigt.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die zu analysierende Probe zwecks Entfernung irgendwelcher Bakerien filtriert wird, bevor sie der Anreicherungs- oder Komponentenfreisetzungsstufe hinzugefügt wird.
16. Ein Testsatz zum Nachweis, zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von Bakteriophagen mit
(a) einer Bakterie, die nach ihrer Eigenschaft ausgewählt wurde, durch Zielbakteriophagen spezifisch infiziert und lysiert werden zu können, um dadurch zelluläre Komponenten freizusetzen, und mindestens einem
(b) der Reagenzien, die notwendig sind zur Durchführung einer Prüfung auf Zellbestandteile, die durch die Einwirkung der Bakteriophage auf die Bakterien freigesetzt wurden, und
(c) einer Bakterie zur Unterstützung der Replikation des Bakteriophagen;
vorausgesetzt, daß der besagte Testsatz keine Bakteriophagen enthält.
17. Testsatz nach Anspruch 16, bei dem die für die Durchführung der Prüfung auf Zellbestandteile benötigten Reagenzien zur Prüfung eines durch Lysis der Bakterien freigesetzten Nukleotids dienen.
18. Testsatz nach Anspruch 17, bei dem die Reagenzien Luciferin und Luciferase umfassen.
19. Verwendung eines Testsatzes mit
(a) einer Bakterie, die ausgewählt wurde nach ihrer Eigenschaft, durch Zielbakteriophagen spezifisch infiziert und lysiert werden zu können, um dadurch Zellkomponenten freizusetzen, und mindestens einem
(b) der Reagenzien, die nötig sind zur Durchführung einer Prüfung auf Zellbestandteile, die durch die Einwirkung der Bakteriophagen auf die Bakterien freigesetzt wurden, und
(c) einer Bakterie zur Unterstützung der Replikation des Bakteriophagen; und wahlweise
(d) einer Probe des Zielbakteriophagen;
für den Nachweis, die Identifizierung und/oder Quantifizierung der Bakteriophagen.
20. Verwendung eines Testsatzes nach Anspruch 19, bei dem die zur Durchführung der Prüfung nach Zellkomponenten notwendigen Reagenzien der Prüfung eines durch Lysis der Bakterien freigesetzten Nukleotids dienen.
21. Prüfsatz nach Anspruch 20, bei dem die Reagenzien Luciferin und Luciferase umfassen.
DE69421085T 1993-08-18 1994-07-29 Verfahren und testsatz zum nachweis von bakteriophagen Expired - Lifetime DE69421085T2 (de)

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DE69421085D1 DE69421085D1 (de) 1999-11-11
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