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Indikatorzubereitung für eine Verwendung zur quantitativen Bestimmung
von Amylass in Körperflüssigkeiten Die Lrfindung betrifft Zubereitungen zur quantitativen
Bestimmung von Amylase in Körperflässigkeiten und befasst sich mit einer Methode
zur quantitativen Bestimmung der Amylasckonzantration in Körperflüssigkeiten unter
Verwendung dieser Zubereitung. insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung
von Tetrazoliumsalzen zur Bestimmung von Serumamylase.
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Bisher war die quantitative Bes t-immung von Serumamulase einwertvolles
Mittel bei der Diagnose einer akuten pankreatischen Entzündung. Ferner war die Bestimmung
zur Entdeckung von Peritonifis, Magengeschwüren, Nierenkrankheiten, Leberkrankheiten
etc. geeignet. Die vier Gundmethoden, die zur Bestimmung von Amylase angewendet
wurden, sind folgende:
1. Durch die Abnahme der Viskosität einer
Stärkelösung, 2. durch die Abnahme der Trübung einer Stäresuspension, 3. durch Herabsetzung
der Stärker/Jod-Farbe und 4. durch die Erhöhung den Reduziervermögens einer Stärkelösung,
Die viskosimetrische Mothode sowid die Trübungsmethode sind im allgemeinen nur ven
historischem Interesse, da die erhaltenen Änderungen der physikalischen Eigenschaften
des Substrats nicht i.n notwendiger Weise e.ine spezifische Punktion für die vorhandene
Amylase sind und tatsächlich auf andere Faktoren zurückzuführen sein können, die
in der Serumpfobe vorbanden sind. Die amyloklastische Methode, die auf dem vermögen
von Stärke beruht, Jod zu binden, steht in erster T½nie in einer Beziehung zu der
Hydrolyse von Amylase mit einer Gesamikeitenlänge von weniger als 45 Glykoseeinheiten.
Da Amylase ochneller auf Amylopektin als auf Amylose wirkt und stärken verschiedenen
IJ:csprungs verschiedene Mengen an Amylopektin und hwylose enthalton, sind dabei
erhaltene analytische Werte nicht unbedingt echte Hinweise auf die Amylasekonzentration.
Ferner wurde gefunden, dass die Stärke/Jod-fHeaktion durch das Vorliegen von Serumproteiner,
insbesondere Albumin, beeinflust wird, wobei ferner die Wasserstoffionenkonzentration
sowie die Temporatur eine Rolle spielen. Diese Faktoren begrenzen die Reproduzierbarkeit,
die bei der Verwendung dieser besonderen amyloklastischen Methode erzielbar ist.
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Es wurden auch bereits verschiedene saccharogene Mothoden entwickelt,
bei deren Durchführung die Amylasekonzentration aus der Erhöhung des Reduziervermögens
eines Stäckesubeitrats bestimmt wird, das unter Verwendung eines geeigneten Indikatormaterials
gemessen wird. Saccharogene Methoden auf der Basis der Kupferreaktion, der Ferrieyanidreaktion,
der lökrinsäurereduktion sowie der Authrenreduktion erfordern im allgemeinen die
Verwendung eines proteinfreien Fultrats, zatreiche Stufen
und/oder
Warme zur Entwicklung einer stabilen Farbe. Die Dinitrosalicylsäure-Reduktion, die
von Summer im Jabre 1921 vorgeschlagen worden ist, lässt den Bedarf an einem proteinfreien
Filtrat entfallen, erfordert jedoch erhöhte Temperaturen, und zwar in der Grössenordnung
von 100°C, um zu einer geeigneten Farbentwicklung zu gelangen.
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Die bisher bekannten Methoden auf der Basis der zuletzt genannten
Teehnik waren im allgemeinen durch einen begrenzten linearen Bereich eingeschränkt,
beispielsweise bis zu ungefähr 400 - 600 Somogyi-Einheiten. liegt der bei dem Angangsversuch
erhaltene Wert oberhalb dieses Bereiches, dann ist es erforderlich, das Probenmaterial
zu verdünnen und die Bestimmung zu wiederholen, um zu einem Wert innerhalb des linearen
Bereiches zu komrnen. Ä.uf der Basis des Endwertes sowie des Verdünnungsfaktors
kann die Amylasekonzentration bestimmt werden Da normale Amylasewerte von ungefähr
80 bis ungeführ 150 Somogyi-Einheiten Schwanken, betrifft die Notwendigkeit, die
Bestimmung zu wiederholen, natürlich die Patienten, die beispielsweise an einer
pankreatischen Insektion leiden. Gerade bei diesen TJeuten muss eine schnelle und
genaue diaguose gestellt werden, um eine entsprechende medikamentöse Behandlung
zur Heilung der infektion durch führen zu können. Jede durch eine wiederholte Bestimmung
entstehende Verzögerung ist daher unerwünscht.
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Die Notwendigkeit, die Bestimmung zu wiederholen, ist dann besonders
ungünstig, wenn in dem klinischen Labor eine automat-lsche Analyseeìnrichfung für
die jeweilige Bestimmung verwendet wird. Wird eine Ablesung in dem nicht linearen
Teil festgestellt, dann muss die Probeflasche besonders markiert werden, um zu einem
neuen Probealiquot zu gelangen. ist die betreffende Flasche weggeworden worden,
so wie dies normalerweise der Fall ist, dann muss eine neue Probe von dem Patienten
entnemmen werden. Daven ganz abgesehen, dass dies eine
Belästigung
der Patienten darstellt, hat auch die erneute Bestimmung eine weitere Belastung
des ohnedies überlasteten Klinikpersonals zur Folge, so dass es mancfrnal eines
grossen Aufwandes bedarf, bis ein brauchbarer Endwert dem Arzt vorliegt. Es besteht
daher ein Bedarf an einer Methode zur quantitativen Bestimmung der Amylasekonzentration
in Körperflüssigkein, die auch in dem abnormalen Bereich linear ist.
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Bei der in zunahmendem Maße s-teigenden Verwendung von automatischen
Amylseeinrichtungen bestent ferner ein Bedarf an einer Reagenazubereitung, die bei
Umgebungstemperaturen während langer Zeitspannen stabil ist, so dass eine derartige
Zubereitung nicht in nachteiliger Weise zersetzt wird, wenn sie nicht sofort oder
innerhalb einer kurzen Zeitspanne verwendet wird.
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Saccharogene Methoden auf der Basis von kolorimetrischen Bestimnlungen
wurden lange verwendet, und zwar infolge der geringen Empfindlichkeit des eingesetzten
Indiktaomaterials.
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Es war dabei notwendig, die Amulasesubetratmischung während langer
Zeitspannen zu inkubieren, um ausreichende reduzierende Zucker zu erhalten, die
für eine entsprechende Farbentwicklung erforderlich sind. Diese Inkubation ist jedoch
bei einer Verwendung von schnell arbeitenden Analyseeinrichtungen nachteilig, da
bei der Verwendung derartiger Einrichtungen die verschiedenen durchgeführten Tests
nicht durch einen langsameren Test verzögert werden können, der längere inkubationsbedingungen
erfordert. Es besteht daher ein Bedarf an einem quantitativen Amylasebestimmungsverfahren
mit einer ausreichend hohen Empfindlichkeit, durch welches die Inkubationsperiode
verkürzt werden kamm, ohne dass dabei die Reproduzierbarkeit oder die Genauigkeit
beeinflusst werden.
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Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer stabilen Zubereitung
zur
quantitativen Bestimmung von Amylase in Körperfliissigkeiten. Durch die Erfindung
wird eine neue Reagenssuberei--tung zur Bestimmung von Amylase in Körperflüssigkeiten
nach der saccharogenen Methode zur Verfügung gestellt. Die erfindungsgemässe Zubereitung
liefert Daten, die auch in dem abnormalen Bereich linear sind, Ferner besitzt diese
Zubereitung eine ausreichend hohe Empfindlichkeit, so dass kürzere Inkubationsperioden
eingehalten werden können, In der erfindungsgemässen Zubereitung wird eine Tetrazoliumverbindung
als indikatormaterial eingesetzt.
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Brfindungsgemäss wird eine Fuffersubstratzubereitung zur Verfügung
gestellt, die ein Stärkesubstrat, einen Puffer, der einen Serumprobe-nsubstratlösungs-pH
von ungefähr 6 bis ungefähr 8, vorzugsweise ungefähr 6,8 bis ungefähr 7,2, aufrecht
zu erhalten vermag, und eine Amysse-aktivieronde Substanz sowie eine gepufferte
Indikatorzubereitung aus einem Puffer aufweist, der dazu in der lage ist, die Serumprobe/Stärkesubstrat-Lösung
auf einen alkalische pH zu erhöhen, der dazu ausreicht, eine etwa vorhandene Amylase
zu inaktivieren, wobei das Indikatormaterial ein Tetrazoliumsalz ist. Das zu analysierende
Serum wird mit dem gepufferten Stärkesubstrat vermischt und während einer Zeitspanne
inkubiert, die dazu ausreicht, reduzierende Zucker für eine kolorimetrische Bestimmung
zu erzeugen. Die gepufferte Indikatorzubereitung wird dann mit der Serum/Stärho-Substratlösung
vermischt. Der dabei entwickelte alkalische pH dient dazu, den Lösungs-pH auf einen
Wert zu erhöhen, an welchem die Serumamylase inaktiviert wird und eine'für eine
optische Untersuchung geeignete Farbe durch die Reaktion des Tetrazoliumindikators
mit den reduzierenden Zuckern entwickelt wird, die während der Inkubationsperiode
erzeugt worden sind.
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Die Tetrazoliumsalze sind von einer derartig hohen Empfind-
Lichkeit
gegenber den während der Inkubationsperiode erzeugten reduzierenden Zuckern, dass
die Inkubationspeiode gegenüber den Perioden wesentlich verkürzt werden kann, die
bisher bei der Durchführung saccharogener Methoden eingehalten werden mussten. Während
bekannte Methoden Inkubationsperioden in der Grössenordnung v-on 30 - 60 Minuten
erforderten, ist nur eine Inkubat-ionsperiode in der Grössenordnung von ungefähr
10 bis ungefähr 20 Minuten erforderlich, wenn die erfindungsgeines; sen Te trazoliu'iiindikatoren
verwendet werden. Diese erhöhte empfindlichkeit, die sich in kürzeren Inkubationsperioden
zu erkennen gibt, macht die erfindungsgemässe Zubereitung sehr geeignet für eine
Verwendung in schnell arbeitenden automatischen Analyseeinrichtungen. Geeignete
Tetrazoliumindikatoren sind die Materialien der Formel
worin R1 für Phenyl, Naphthyl, p-Jodphenyl oder 3-Methoxyphenyl steht, R2 Wasserstoff
oder eine Nitrogruppe ist, R3 Wasserstoff oder eine Nitrogruppe bedeutet und n 1
oder 2 ist, Steht n für 2, dann ist die zweite Hälfte der Verbindung ein Spiegelbild
der ersten Hcilfte, wobei die Bindung zwischen den Hälften zwischen den R1-westen
varläuft, wie aus der gestrichelten Linie hervorgeht. Steht u für 1, dann verläuft
die gestriclcl-te Linieubindung von R1 zu Wasserstoff. Unter diese allgemeine formel
fallende Telrasoliumsalze, die sich für eine Dnrchführung der Erfindung als geeignet
erwienen haben, sind Meotetrazoliumchlorid, Tetrazoliumblau,
Yetrazoliumviolatt,
m-Nitrotetrazoliumblan, p-Nitrotetrzoliumblau, Jednitrotetrazoliumchlorid und Triphenyltetrazoliumchlorid.
Wegen seiner ungewöhnlichen Empfindlichkeit, Löslichkeit und Stabilität ist Neotetrazoliumchlorid
der gegenwärtig bevorzugte Indikator, Wie vorsteht erwähnt, weist die gepufferte
Substratzubereitung ein im wesentlichen reines stärkesubstrat in Kombination mit
einem Amylaseaktivator, wie beispielsweise Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, sowie
einen Puffer auf, der dazu geeignet ist, einen geeigneten pH für die Amylaseaktivität
zu entwickeln. Die Stärke sollte im wesentlichen vollstandig bei der angegebenen
Konzentration in destilliertem Wasser bei der Inkubationstemperatur, vorzugsweise
37°C, löslich sein.
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Ein Beispiel für einen Puffer, der zur Einstellung des gewünschten
pH-Bereiches von ungefähr 6 bis ungefähr 8 und vorzugsweise ungefähr 6,8 bis ungefähr
7,2 geeignet ist, besteht aus tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan in Kombination mit
tris- (Hydroxyme tilyl ) -aminomethan-Hyd.rochlorid in geeigneten Konzentrationen.
Andere Puffer, die zur Erzielung des gewünschten pi geeignet sind, wie beispielsweise
Phosphatpuffer und imidazolpuffer, können ebenfalls verwendet werden.
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Die Indikatorzubereitung weist das vorstehend erwähnte Tetrazoliumsalz
in Kombination mit einer Pufferzubereitung auf, die dazu geeignet ist, die Serumprobesubstratlösung
auf einen erhöhten pH zu bringen, und zwar auf einen pH, der dazu ausreicht, 1.
die Amylaseaktivität zu beenden und 2. eine geeignete Farbontwicklung zu ermöglichen*
Ein geeigneter Puffer besteht aus Lithiumhydroxyd und Diäthylamin-Hydrochlorid in
solchen Mengen, dass ein pH von wenigstens 10 und vorzugsweise in der Grössenordnung
von ungefähr 12 - 12,5 erzielt wird.
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Während der Analyse wird das aktivierte gepufferte Stärkesubs
-trat
mit dem Serumaliquet vermischt und während etwa 10 - 20 Minuten zur Erzeugung von
reduzierenden Zuckern durch die hydrolytische Wirkung der Amylase auf das stärkesubstrat
inkubiert. Der gepufferte Te trazoliumindikator wird dann zugesetzt. Der Puffer
erhöht den Lösungs-pH auf einen derartigen Wert, dass das Ämylaseenzym inaktiviert
wird. Nach der Inkubation während einer Zeitspanne von ungefähr 2 - 15 Minuten,
und zwar je nach den Umgebungstemperaturbedingungen, wird die optische Dichte bei
560 m abgelesen. Ein weiterer Vorteil, der ei der Verwendung des Tetrazoliumsalzes
als Indikatorma-terial auftritt, besteht darin, dass beide Reak tionen (d.h. die
hydrolytische Wirkung der Amylase auf das Starkesubstrat und die Farbentwicklung)
bei 3700 durchgeführt werden können. Es ist nicht erforderlich, die Reaktionsmischung
auf Siedetemperaturen zu erhitzen, um zu einer Farbentwicklung zu gelangen. Dies
ist ein erheblicher Vorteil, da eine Amylasebestimmung möglich ist, welche unter
Verwendung automatisch arbeitender Analysesysteme durchgeführt werden kann, in denen
andere Analysetests bei 37°C ausgeführt werden. Da die Farbentwicklung mit der Temperatur
schwankt, ist die vorstehend erwähnte Inkubationsmethode für die Farbeutwicklung
diejenige, welche einer Temperatur von 37°C entspricht. Bei der Auwendung von anderen
Temperaturen können andere Farbentwicklungszeiten geeignet sein.
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Ferner kann gegebenenfalls eine Geschwindigkeitsbestimmung in der
Weise durchgeführt werden, dass optische Dichtemessungen entweder kontinuierlich
oder periodisch, beispielsweise alle 40 Sekunden, durchgeführt werden. Eine entspreschende
Korrektur der Geschwindigkeits-Reaktions-Werte liefert die genaue Serumamulaschanzentration.
Gegebenenfalls kann die Reaktion bis zur Beendigung durchgeführt werden, worauf
die Reaktionsmischung verdünnt wird und dann eine einzige optische Dic1ltemessung'durchgef'ithrt
wird. Durch eine entsprechende Berechnung kaun die Serumamylasckonzentration nach
dieser Eethode ermittelt werden
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen
Verfahrens ist es zweckmässig, eine Serumreagens-Blindprobe zu verwenden, die in
Kombination mit entsprechenden elektronischen Analyseeinrichtungen eingesetzt wird,
um die Wirkung der Serurnprobe und des Reagens es auf die vorstehend beschriebenen
optischen Dichtemessungen zu kompensieren. Dies wird am besten in der Weise bewerkstelligt,
dass das Serum und das Reagens unter Bedingungen zugesetzt worden, welche eine amylas
einduzierte hydrolytische wirkungs auf das Stärkesubstrat verhindern. Beispielsweise
kann man, ansta-tt das stärkesubstrat direkt dem Serumaliquot unter gepufferten
Bedingungen, welche eine Amylas eaktivität begünstigen würden, zuzusetzen, die Stärke
in der Blindprobe gleichzeitig mit der gepufferten Indikatorzubereitung zusetzen,
die wegen ihrer stark alkalischen Natur eine Amylaseaktivitäl- inhibiert, Andere
Methoden zur Erzielung des gleichen Ergebnisses lassen sich ebenfalls anwenden.
Andere dem Reaktionsgefüss zugesetzte Reagentien werden dem blindprobengefäss zugesetzt,
und zwar zu einem Zeitpunkt, der nicht später ist, als der Zeitpunkt, an welchem
die optische Dichteablesungen an der Blindprobenreaktionsmischung durchgeführt werden.
Die Blindprobenmethode kompensiert daher denjenigen Teil der optischen Dichtemessung
auf der Testseite, welcher der Serumprobe sowie den zur durchführung der Testmethode
eingesetzten Reagentien zuzuschreiben ist. Werner beseitigt die vorstehend erwähnte
Serumreagens-Blindprobe den Bedarf an einem proteinfreien Filtrat, da die optischen
Dichte messungen an der Blindprobe vorliegende Proteinsubstanzen kompensieren und
die Serumproteine nicht die Analyse beeinflussen, wie dies bei der stärke/Jod-Resktion
der Fall ist.
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Die Reagenszubereitungen können in Bosungsform, in Porm von Pulvern
oder in Form von Tabletten, je nach Bedarf, hergestellt werden. Derzeit werden Tabletten
gegenüber pulverisier-ten Materialien bevorzugt, und zwar wegen der gegenüber Reaktionen
begrenzen Oberfläche und der damit verbundenen erhöhten Stabili-
Es
wurde gefunden, dass Tergitol NP-44 (Union Carbide Gorp., New York, New York) der
Indikatorzubereitung zugesetzt werden kann, um die Bildung eines Niederschlags zu
verhindern, wenn der Indikator mit einem Glukosestandard vermischt wird.
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Tergitel NP-44 ist ein 4-Nonyl phenylpolyäthylemmonoglykol-Polymeres
das in einem 1 :40-Molverhältnis aus 4-Nintylphenyl und Äthylenoxyd in einem allsalischen
Katalysatorsyatem herge stellt wird. Die Polymerisation wird zu einem zeitpunkt
beendet, an welchen das Verhältnis der Äthoxydeinheiten zu den Nonylpneyloxyenhieten
40:1 beträgt. Das erhaltene polymers Produkt ist ein klebriges und schuppiges Material,
das bei 18°C weich wird und bei 19,8°C zu einer trüben Flüssigkeit schmilzt. Yergitol
Np-44 ist ein nicht-ienisches Detargens mit sowohl hydrophoben als auch hydrophilen
Eigenschaften. Wie vorstehend erwähnt, wirkt es dahingehend, die optische Klarheit
der Indikatorzubereitung aufrecht zu erhal-tell, wenn diese in Verbindung mit Glukosestandards
verwendet wird. Es beseitigt die Notwendigkeit, das Detergens direkt den Glukosestandards
zuzusetzen, beispielsweise in dem Kliniklabor, und ermöglicht die Herstellung eines
einzigen Materials, das in zweckmässiger Weise mit sowohl Serumproben als auch Glukosestandards
verwendet werden kann. Die Verwendung dieses Additivs ist besonders vorteilhaft
bei einem Einsatz automatisch arbeitender Analysesysteme, bei denen es zweckmässig
ist, die Anzahl der verschiedenen Reagentien zu begrenzen.
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Ubt keine nachteilige Wirkung auf die Serumproben oder auf die unter
ihrer Verwendung erhaltenen Anaylsewerte aus. Andere feste nicht-ionische Detergentien,
die in zweckmässiger Weise auf geringe Feuchtigkeitsgehalte getrocknet wer den können,
können anstelle des vorstehend erwähnten Tergitel NP-44 ebenfalls geeignet sei Die
felgenden Beispiels erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
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Beispiel 1 Geeignete Reagenszubereitungen für eine Verwendung zur
Durchführung der vorliegenden Erfindung sind folgende: (a) Puffer-Substratzubereitung:
Stärke Z(Zulkowsky) 24,0 mg Natriumchlorid 0,878 mg Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
0,862 mg Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan- 0,5378 mg Hydrochlorid (b) Puffer-Indil-Latorzubereitung
Lithiumhydroxyd 5,49 mg Diäthylamin-Hydro chlorid 20,77 mg Neotetrazoliumchlorid
0,268 mg Die unter (a) beschriebene Puffer-Substratzuhereitung wird 1/2 ml Wasser
zugesetzt und mit 10 ul des nicht verdünnten Serums vermischt. Nach einer geeigneten
Inkubation während ungefahr 15 Minuten wird die Raktionsmischung mit der Puffer-Indikatorzubereitung
(b) vermischt. Nach einer weiteren Inlmbation zur Erzielung einer entsprechenden
Farbentwicklung werden periodisch bei 560 m,u optische Dichtemessungen durchgeführt.
Eine lineare Beziehung zwischen der optischen Dichte und der Amylasekonzentration
wird beobachtet. Die entsprechende Blindprobenbestimmung ist identisch mit der vorstehend
beschriebenen Testmethode, mit ddr Ausnahme, dass die gepufferte Substratzubereitung
dem Testgefäss gleichzeitig mit der gepufferten Indikatorzubereitung zugesetzt wird.
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Beispiel 2 Eine Pufferzubereitung wird in der Weise hergestellt, dass
258,6 mg Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 1613,4 mg Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid
und 2634 mg Natriumchlorid 100 ml destilliertem Wasser zugesetzt werden. 50 ml
der
vorstehend geschilderten Pufferzubereitung werden 1,8 g Stärke (Zylkowsky), 29,4
mg Poylvinylpyrollidon (PVP-15), 15,0 mg Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht
von 400 (PEG-4000) und 100 ml destilliertem Wasser zugesetzt.
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Ein Diäthylamin-Hydrochlorid- und Lithiumhydroxyd-Reagesn wird in
der Weise hergestellt, dass 4,35 g Diäthylamin-Hydrochlorid und 1,96 g Lithiumhydroxyd
in 50 ml destilliertem Wasser gelöst werden. Zum 25 ml dieser Lösung werden 2,0614
g Kaliumehloris, 0,280 g PEG-4000 und 0,280 g Tergitel NP-44 zugesetzt.
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Die Indikatorzubereitung wird in der Weise hergestellt, dass 50 mg
Hestetrazoliumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser gelöst werden Eine geeignete
Analysemethode, die auf der Erfindung basiert und zu deren Durchführung die vorstehend
erwähnten Lösungen Dingeseizt werden, ist folgende: 25 ml Gerum odcr Glukosestandard
werden 2 ml der gepufferten Stärkesubstratzubereitung zugesetzt, worauf während
einer Zeitspanne von 20 Minuten bei 3700 inkubiert wird.
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0,5 ml der Diäthylamin-Hydrochlorid/Lithiumhydroxyd-Lösung und 0,3
ml der Neotetrazoliumchloridlösung werden der inkubierten Serumprobe/Stärkesubstrat-Mischung
zugesetzt, worauf nach einer Inkubation während einer Zeitspanne von 5 Minuten bei
37"0 die optischen Dichtemessungen bei 560 mu durchgeführt werden. Gleichzeitig
wird eine Reagensblindprobenbestimmung durchgeführt. Die Blindprobenbestimmung unterscheidet
sich von der Testmethode nur dadurch, dass das gepufferte Stärkesubstrat nach Beendigung
der Testinkubationsperiode zugesetzt wird, d.h. zusammon mit der Diäthylamin-Hydrochlorid-
und Neotetrazolium-Lösung, und zwe
im Gegensatz zu der Testmethode,
bei deren Durchführung das Vermischen des gepufferten Stärkesubstrats mit dem Serum
die Inkubationsperiode startet.
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Die bei der Durchführung der vorstehend geschilderten Methode erhaltenen
Ergebnisse werden im Einblick auf folgende übliche Methode überprüft, zu deren Durchführung
die nachstehend angegebenen frisch hergestellten Lösungen verwendet werden: 0,1
molarer rhosphatpuffer (pH = 7,0): 4,55 g Kaliumdihydrogenphosphat und 0,35 g dinatriumhydrogenphosphat
werden in 700 - 800 ml destilliertem Wasser gelöst, worauf der pH auf 7,0 eingestellt
wird. Das Volumen wird unter Verwendung von destilliertem Wasser auf 1000 ml eingestellt,
stärkesubstrat: 1,5 g lösliche Stärke werden in 140 ml Phosphatpuffer gelöst.
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10 %iges (Gewicht/Volumen) Natriumwolframat: 10,00 g Natriumwolframat
(Dihydrat) werden in siedendem destilliertem Wasser gelöst, worauf das Volumen auf
100 ml eingestellt wird.
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Alkalische Salzlösung: 50 g wasserfre ies Natriumearbonat, 50 g Rochelle-Salz,
40 g Natriumbicarbonat und 400 g wasserfreies Natriumsulfat werden in der angegebenen
Reihenfolge in 1600 rnl destilliertem Wasser gelöst, werauf das Volumen auf 2000
ml eingestellt wird.
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Saures Kupferreagens: 150 g Kupfer(II)-sulfat (Pentahydrat) werden
in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst, worauf 0,5 ml konzentrierte Schweielsäure
zugesetzt werden Alkalisches Kupferreagens: 4 ml des sauren Kupferreagenses werden
in einen kalibrierten 100 ml-Zylinder gegeben, worauf eine Ve rdütxinung auf 100
ml un-ter Verwendung der alkalischen Saalzlösung erfolgt.
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Araenßmolybdat-Farbreagens: 100 g Ammoniumparamolybdat (Tetrahydrat)
werden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst werauf 84 ml konzentrierte Schwefelsäure
zugesetzt werden.
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Dann werden 12 g Natriumorthoarsenat (Heptahydrat) zugesetzt, die
zuvor in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst worden sind. E3 wird vermischt und
auf 2000 ml unter Verwendung von destilliertem Wasser eingestellt.
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0,2 ml Salzlösung (0,85 % Natriumchlorid) werden jede der drei Reagensgläser
zugesetzt, von denen eines mit "Test", das zweite mit "Blindprobe" und das dritte
mit "Standard" beschriftet ist. 2,1 ml Stärkesubstratlösung werden nur den "Standard"-
und "Test"-Reagensgläsern zugesetzt. Ein 100 µl Serumaliquet wird nur dem "Blindprohen"-Reagensglas
zugesetzt. Alle Reagaensgläser werden während einer Zeitspanne von ungefähr4 n Minuten
bei 40°C in einem Wasserbad erwärmt.
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Ein 100 µl-Serumaliquet wird dem "Test"-Reagensglas zugesetzt, während
eine 100 µl-Standardlösung dem "Standard"-Reagensglas zugegeben wird. Es wird gründlich
vermischt und während genau 30 Minuten bei 40°C inkubiert. 0,45 ml einer 0,666n
Schwefelsäure werden dann jedem der Reagensgläser zugesetzt. 2,1 ml Strkesubstrat
werden dem "Blindprobe"-Reagensglas zugesetzt. Ein 0,15 ml-Aliquet der 10 % Natrium-Wolframat-Lösung
wird jedem Reagensglas zugegeben, werauf beimischt wird. Nach ungefähr 10 Minuten
werden die Inhalte der Reagensgläser erneut vermischt. Dann wird wiiend einer Zeitspanne
von 10 Minuten bei 5000 - 7000 Upm zur Entferung von etwa vorhandenen Niederschlägen
zentrifugiert (Bemerkung: Die Standardlösung liefet keinen Niederschlag und braucht
nicht zentrifugiert werden). 1,0 ml der klaren überstebenden Flüssigkeit werden
aus jedem Reagensglas in ein entsprechend bezeichnetes Reagensglas überführt. 1,0
ml einer alkalischen Kupferlösung werden jedem Reagensglas zugesetzt. Die Inhalte
der Reagensgläser werden dann während einer Zeitspanne von 20 Minuten in einem 100°C-Wassenbad
inßnibiert.
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Nach dem Abkühlen in einem Wasserbad auf Zimmertemperatur werden 1,0
ml Arsenomolybdat-Farbreagens zugesetzt. Die Reaktionamischung wird gr2ndlich gemischt,
mit destilliertem Wasser auf 10 ml verdünnt und durch Umkippen vermischt* Dann erfolgt
eine Ablesung in einem Spektrophotometer bei 540 mp, und zwar gegenüber einer Wasserblindprobe.
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Bin Vergleich der erhaltenen Analysewerte mit diesen zwei Methoden
ist graphisch in der beigefügten Figur a,ufgezeicMlet.
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Dabei sind die Analysewerte, die bei dem erfindungsgemässen Verfahren
erhalten werden, in Somogyi-Einheiten auf der Ordinate aufgetragen, während die
entsprechenden Bezugsmethoden werte (Somogyi-Nelson) ebenfalls in Somogyi-Einbeiten
auf der Abszisse aufgezeichnet sind. Wie aus der Figur hervorgeht, liefert die vorliegende
Erfindung eine lineare Beziehung zwisuchen der Amylasekonzentration und der beobachteten
optischen Dichte, wobei diese Beziehung durch die Vergleichsmethode, und zwar der
derzeit anerkannten Standardmsthode, bestätigt wird. Die Neigung der Linie in der
Figur beträgt 1,4. Dies bedeutet einen kenstanten Faktor, um welchen die erfindungsgemäss
erhaltenen Werte die entsprechenden Werte übersteigen die bei Anwendung der Bezugsmethode
erhalten werden. Die erfindungsgemäss erhaltenen Analysewerte können daher durch
1,4 dividiert werden. Dabei erhält man einen entsprechenden Wert, der von den Ersten
sowohl für die normalen als auch für die abnormalen Bereiche anerkannt wird.
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Die graphische Darstellung zeigt ferner die lineare Beziebung der
erfindungsgemässen Methode bis zu ungefähr 1600 Somogyi-Einheiten. Dieser Wert bedeutet
ungefähr das Dreifache der oberen Linearitätsgrenze der bisher bekannten Methoden
(Bemerkung: Bei höheren Amylas ekonzentrat ionen musste das Serumaliquet bei der
Durchführung der Bezugsmethode entsprechend verdünnt wcrderi, um die Bestimmung
durchzuführen. Das Endergchnis werde dann mit einem entsprachenden Fakto zur Gewinnung
des
Endanalysewertes multipliziert). Man kann derzeit annelimen, obwohl dies noch nicht
durch Experimente infolge des Fehlens von entsprechenden Serumproben bestätigt ist,
dass die erfindungsgemässe Methode bei Verwendung von abnormalen Seren bis zu ungefähr
4000 Somogyi-Einheiten in Bezugsmethodeneinheiten linear ist, Dies entspricht ungefähr
6000 Somogyi-Einheiten in Bezug auf Rohwerte, die nach der erfindungege mässen Methode
vor der Division durch den konstanten Faktor von 1,4 erhalten werden. Diese obere
Grenze konnte unter Verwendung von Glukos es tandards nachgewiesen werden, jedoch
och nicht unter Verwendung von Serumproben, da Proben mit derartig hohen Amylasckonzentrationen
sehr selten sind.. Die erfindungsgemss beobachtete Linearität ist deshalb besonders
vorteilhaft, da sie im wesentlichen die Notwendigkeit beseitigt, eine jeweilige
Amylasebestimmung erneut durchzuführen, wenn man feststellty dass die Amylasekonzentration
abnormal hoch ist (d.h. wenn sie ausserhalb des linearen Bereiches der jeweils angewendeten
Methode liegt), Erfindungsgemäss ist es daher möglich, dem Arzt schneller Analysewerte
in solchen Fällen zur Verfügung zu stellen, in welchen diese Werte besonders kritisch
sind.
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Beispiel 3 Aus Stabilitätsgründen, d.h. zur Erzielung einer langen
lagerungsfähigkeit unter Umgebungsbedingungen, können die erfindungsgemässen Zubereitungen
nach folgendem Rezept tablettiert werden: (a) Puffer-Substratzubereitung: Stärke
(Ztlkowsky) 6,0 mg Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 0,086 mg Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-
0,538 mg Hydrochlorid ' ifal i-unchl orid 3,23 mg PVP-15 0,1 mg PEG-4000 0,05 mg
(b)
Basezubereitung: Lithiumhydroxyd 3,5 mg Kaliumchlorid 5,5 mg PEG-4000 1,0 mg (c)
Puffer-Indikatorzubereitung: Diäthylamin-Hydrochlorid 7,77 mg Neotetrazoliumchlorid
0,268 mg Kaliumchlorid 1,86 mg Tergitol NP-44 0,1 mg Die als, Tablette (a) identifizierte
Puffersubstratzubereitung wird 1/2 ml Wasser zugesetzt und mit 10 ul eines nicht
verdünnten Serums vermischt. Nach einer entsprechenden Inkubatio-n während einer
Zeitspanne von ungefähr 20 Minuten werden die Gabletten (b) und (c) der Reaktionsmischung
zugesetzt. Nach einer weiteren Inkubation zur Erzielung einer entsprechenden Entwicklung
wird die optische Dichte periodisch abgelesen (beispielsweise alle 40 Sekunden),
und zwar bei 560 mp. Eine lineare Beziehung zwischen der optischen Dichte und der
Amylasekonzentration wird beobachtet. Gleichzeitig wird eine Blindprobenbestimmung
durchgeführt. Die Blindprobenuntersuc ilung unters che idet sich von der Testmethode
dadurch, dass die Puffersubatrat-Tablette gleichzeitig mit den Tabletten (b) und
(c) nach Beendigung der 20 Minuten dauernden Testinkubation zugesetzt wird.
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Der alkalische pH, der durch das Lithiumhydroxyd sowie das Diäthylamin-Hydrochlorid
erzeugt wird, verhindert eine ÄflWlaseinduzierte hydrolytische Wirkung auf das Stärkesubstrat.
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Beispiel 4 Andere tablettierte Formulierungen, die sich zur Durchführung
des Verfahrene gemäss Beispiel 3 eignen, sind folgende:
(a) Puffersubstratzubereitung:
Stärke (mit Borhydrid reduzierte Zulkowoky-stärke) 8,00 mg ris-(hydroxymethyl)-aminomethan
0,086 mg Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Hydrochlorid 0,538 mg Kaliumchlorid 2,976
mg PVP-K15 0,200 mg PEG-6000 0,200 mg (b) Dasezubereitung: Lithiumhydroxyd 3,50
mg Kaliumchlorid 9,50 mg Gelatine 0,20 mg PEG-6000 0,20 rilg (c) Puffer-Indikatorzubereitung:
Diäthylamin Hydrochlorid 7,77 mg Neotetrazoliumchlorid 0,268 mg Tergitol-NP-44 0,15
ing Gummieum arabicum 0,20 mg PEG-6000 0,20 mg Kaliumchlorid 5,41 mg Die zur Durchführung
dieses Beispiels verwendete Stärke besteht aus Zulkowsky-Stärke (E. Merck, Darmstadt),
die durch eine Behandlung mit Natriumborhydrid modifiziert worden ist, und zwar
gemäss den Anweisungen von Strumeyer ("Analytical Biochemistry" 19, 61-71 (1967)).
Die mit Borhydrid behandelte Stärke weist im wesentlichen keine reduzierenden Enden
auf, welche die Ablesungen der optischen Dichte erhöhen, und zwar sowohl bei der
Durchführung des Testversuches als auch des Blindprobenversuches. Daher ist diese
Stärke in idealer Weise ftir die erfindungsgemässe Amylasebestimmung geeignet.
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Beispiel 5 Zwei Puffersubstrat-Tabletten, und zwar die Tabletten (a)
gemäss Beispiel 4, werden zu 1,0 ml destilliertem Wasser zuzugesetzt
und
mit 10 ul eines nicht verdünsten Serums mit einer hohen Amylasekonzentration, d.h.
in der Grössenordnung von ungefähr 700 Somogyi-Nelson-Einheiten, vermischt. Nach
einer entsprechenden Inkubation in der Grössenoerdnung von ungefähr 20 Minuten wird
die Reaktionsmischung mit zwei Basezubereitungs-Tabletten, und zwar den Tabletten
(b) gemäss Beispiel 3, sowie 0,2 ml einer ge,sättigten Lösung von p-Nitrotetrazoliumblau
vermischt. Es wird eine Messung der optischen Dichte bei 560 mu durchgeführt, und
zwar unter Verwendung einer automatisch arbeitenden Vorrichtung, und zwar gleichzeitig
mit der Zugabe der Basezubereitungs-Tabletten sowie der Tetrazelium-Salzlösung.
Die Änderung der optischen Dichte wird kontinuierlich während der nächsten 250 Sekunden
aufgezeichnet.
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Unmittelbar nach Beendigung des Tests wird eine Blindprobenbestimmung
durchgeführt, wobei sich die Blindprobenbestimmung von dem Test nur dadurch unterscheidet,
dass die Puffersubstrat-2abletten gleichzeitig mit den Basezubereitungs-Tabletten
und dem Tetrazoliumsalz zugesetzt werden, d.h. im Gegensatz zu ihrer Zugabe vor
der Inkubationsperiode.
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Die Änderung der optischen Dichte pro 250 Sekunden bei der Durchführung
des Tests beträgt 1,170, während die entsprechende Änderung bei dem Blindprobenversuch
zu 0,715 ermittelt wird.
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Der Unterschied': der optischen Dichte ist unter diesen Bedingungen
einzig und allein dem Vorliegen von Amylase in der Testprobe zuzuschreiben.
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Beispiel 6 Die in Beispiel 5 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt,
wobei ein 0,2 mi-Aliq;uot von m-Nitrotetrazoliumblau verwendet wird. Die Änderung
der optischen Dichte pro 250 Sekunden bei der Durchfährung des Tests beträgt 0,879,
während die entsprechende
Änderung bei der Blindprobenbestimmung
zu 0,417 ermittelt wird. Der Unterschied der optischen Dichte ist unter diesen Arbeitsbedingungen
nur dem Vorliegen von Amylase in der Testprobe zuzuschreiben.
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Beispiel 7 Die in Beispiel 5 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt,
wobei ein 0,2 ml-Qliquot von Jodnitrotetrazoliumchlorid verwendet wird. Die Änderung
der optischen Dichte pro 250 Sekunden beträgt bei der Durchführung des Tests 5,310,
während die entsprechende Änderung bei der Blindprobenbestimmung su 3,060 ermittelt
wird. Der Unterschied in der optischen Dichte ist unter diesen Arbeitsbedingungen
nur dem Vorliegen von Amylase in der Testprobe zuzüschreiben.
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Beispiel 8 Die in Beispiel 4 mit (c) identifizierten Pufferindikator-Tabletten
werden während einer Zeitspanne von 4 Tagen bei 6000 unter dunklen und trockenen
Bedingungen gehalten. Die bei erhöhten Temperaturen gehaltenen Tabletten werden
gegffln Vergleichstabletten verglichen, und zwar gegen Tabletten aus der gleichen
Masse, die unter dunklen und trockenen Bedingungen bei Zimmertemperatur gehalten
werden. Im allgemeinen werden bei Tabletten, die bei erhöhten Temperaturen erhalten
werden, optische Dichteablesungen von ungefähr 7 bis ungefähr 8,5 o/o oberhalb der
entsprechenden Werte ermittelt, die dann erhalten werden, wenn die Tabletten gemessen
werden, die bei Zimmer temperatur gehalten werden Dieses Verhalten liegt innerhalb
der angestrebten und annehmbaren Grenzen für Materialien, die bei der angegebenen
Temperatur während der angegebenen Zeitspanne gehalten werden Ferner zeigen diese
I4'rgebuisse, das die tablettierten Zubereitungen bei Zimmertemperatur während längerer
Zeitspannen stabil sindl und zwar in der Grössenordnung von vielen Monaten