CH625052A5 - - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-Vitro-Verfahren zur Bestimmung des Plasmahemmstoffs für den aktivierten Faktor X (Xal), der ein Alpha-2-globulin mit einem Molekulargewicht von 58 000-65 000 ist und der verschiedentlich als Antithrombin III, Heparin-kofaktor und Alpha-2-antitrypsin bezeichnet worden ist.
Es gab bisher keine zufriedenstellende biochemische Methode zur frühen Erkennung eines beginnenden oder offenkundigen thrombotischen Zustands bei Menschen oder Tieren. Thromboembolische Erkrankungen sind von zunehmender Bedeutung als Ursache von Arbeitsunfähigkeit und Tod, da die Fortschritte der chirurgischen Operationstechnik den Weg für ausgedehntere, chirurgische Eingriffe öffnen, sowie wegen der verbreiteten Anwendung von östrogenhaltigen Verbindungen als orale Kontrazeptiv^.
In den vergangenen Jahren sind in der Literatur viele Versuchsergebnisse veröffentlicht, sowohl in Vitro als auch in Vivo betreffend, die vorschlugen, dass die Wirksamkeit von Xal als natürlich vorkommendem Antikoagulans während der Blutgerinnung mehr von seiner Inaktivierung des ursprünglich gebildeten Faktors Xa - wobei die Thrombinbildung verhindert wird -abhängt, als davon, dass Thrombin daran gehindert wird, Fibrinogen anzugreifen. Diese Auffassung wird durch die Meldung, dass Spurenmengen von Heparin die Hemmung des Faktors Xa durch Xal deutlich erhöhen können, besonders verstärkt.
Gewisse Indizien sprechen stark dafür, dass bei einigen Patienten während und nach chirurgischen Eingriffen ein vorher nicht vorhandener Zustand der sogenannten «Hyperkoagulabi-lität» auftritt. Dieser «HyperkoagulabiIitäts»-Zustand bleibt nicht thrombotisch, solange die Geschwindigkeit der Beseitigung des Faktors Xa durch Xal, diejenige der Geschwindigkeit der Bildung des Faktors Xa übersteigt.
Es wurde ausserdem behauptet, dass Frauen, die orale Ovulationshemmer nehmen, häufiger zu einer traumatisch verursachten Thrombose neigen, da in ihrem Blut weniger Xal vorhanden ist.
Diese Erkenntnis hat die Möglichkeit eröffnet, dass niedrige Konzentrationen an Xal die Hyperkoagulabilität wiederspiegeln können. Es kann daher angenommen werden, dass die
Plasma-Xal-Aktivität ein praktisches Erkennungszeichen für den hyperkoagulierbaren Zustand sein kann. Diese Hypothese wird durch die folgenden Beobachtungen weiter untermauert:
(a) Patienten mit angeborenem Mangel an Antithrombin III 5 (Xal) sind thrombophil,
(b) Frauen, die orale Kontrazeptiva nehmen und die eine niedrige Xal-Aktivität in ihrem Plasma haben, zeigen statistisch ein häufigeres Auftreten postoperativer Thrombose der tiefen Beinvenen als solche, die nicht die «Pille» nehmen.
io Es besteht daher ein starker Bedarf an einer spezifischen Methode zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Xal im Blutplasma.
Es gibt einige Methoden, nach denen versucht wird, die Xal-Aktivität zu bestimmen. Die am häufigsten angewendeten 15 Methoden beruhen auf immunologischer Bestimmung der Hemmung von Thrombin. Diese Techniken haben jedoch verschiedene Nachteile. So zeigt die immunologische Methode -obwohl sie das Antigen Alpha-2-gIobuIin nachweist - nicht die biologische Aktivität dieses Hemmstoffs an. Es wurde berichtet, 2o dass das Blut bestimmter Patienten mit angeborenem Mangel an biologischer Aktivität dieses Hemmstoffs nach der immunologischen Bestimmung keinen Mangel erkennen liess. (Sas et al, Thromb. Diath. Haemorrh. 32 (1974) S. 105).
Die Thrombin-Methode für diesen Hemmstoff ist nicht spe-25 zifisch, da sie zur gleichen Zeit die Aktivität anderer Serumproteinasehemmstoffe misst. (Whigham et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34 (1975) S. 365). Darüberhinaus ist sie empfindlich gegenüber sehr kleinen Mengen von Heparin und heparinähnlichen Substanzen, sowie Fibrinogenzersetzungspro-30 dukten, die im Blutplasma vorhanden sind.
Überraschenderweise wurde nun mehr gefunden, dass die biologische Aktivität von Xal im Blut ohne diese Nachteile in Vitro bestimmt werden kann, wenn man die erfindungsgemässe Methode anwendet.
35 Das erfindungsgemässe Verfahren zur in-Vitro-Bestim-mung der biologischen Aktivitäten des Faktors Xa-Hemmstoff (Xal) im Blut ist im Patentanspruch 1 charakterisiert.
Die Restmenge an Faktor Xa kann nach an sich bekannten Methoden bestimmt werden, wobei die Fibrinbildung zur End-40 punktbestimmung verwendet wird (Messung der Gerinnungszeit). Sie kann auch durch Bestimmung der Esterase-Aktivität t oder der amidolytischen Aktivität durch Verwendung anderer geeigneter Substrate bestimmt werden.
Das Polysaccharidpolysulfat kann 0,10 bis 3,0, vorzugsweise 45 0,45 bis 3,0, Sulfatgruppen pro Monosaccharid-Einheit enthalten.
Bei Verwendung von Dextransulfat als Polysaccharidpolysulfat ist der Substitutionsgrad der Sulfatgruppen 0,10 bis 3,0, vorzugsweise 0,90 bis 3,0, pro Monosaccharid-Einheit. Bei Ver-50 Wendung von Dermatansulfat oder Heparansulfat ist der Substitutionsgrad der Sulfatgruppen 0,45 bis ca. 2,0 pro Monosac-charid-Einheit.
Das mittlere Molekulargewicht des Polysaccharidpolysulfats ist nicht von ausschlaggebender Bedeutung. Daher können was-55 serlösliche Polysaccharidpolysulfate mit einem Molekulargewicht von etwa Tausend bis mindestens zehn Millionen angewendet werden. Es ist auch möglich, wasserlösliche und wasserunlösliche vernetzte Polysaccharidpolysulfate zu verwenden.
Falls gewünscht, kann das Polysaccharidpolysulfat an einen 60 wasserunlöslichen Trägerstoff gekoppelt werden, beispielsweise an ein vernetztes Dextran. Es ist auch möglich, das Polysaccharidpolysulfat an das entsprechende unsubstituierte Polysaccharid zu kuppeln. In diesem Fall wird der Substitutionsgrad der Sulfatgruppen auf den substituierten Teil eines solchen Produk-65 tes bezogen.
Bei der Ausführung der erfindungsgemässen Methode wird die Probe vorzugsweise mit Salz- oder Pufferlösung verdünnt.
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Eine Verdünnung von mehr als etwa 7n>, vorzugsweise mehr als '/»>, wird dann angewendet. Dadurch werden Störungen durch Stoffe, von denen bekannt ist, dass sie das Koagulationssystem ungünstig beeinflussen, weitgehend ausgeschaltet.
Die Inkubationszeit hängt von den Konzentrationen der Re-aktanten in der Inkubationslösung und auch von der Inkubationstemperatur ab. Für den Fachmann ist es leicht, in jedem bestimmten Fall die optimale Zeit zu bestimmen. Die Inkubationstemperatur kann in geeigneter Weise im Bereich von etwa 20 °C bis etwa 37 °C variiert werden.
Bei dieser Methode wird vorzugsweise ein pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,0 eingehalten. Die Mengen an Polysaccharidpolysulfat und aktiviertem Faktor X (Xa) sind nicht von entscheidender Bedeutung. So kann eine Menge von 1 bis 2000 |J.g/mI Polysaccharidpolysulfat und von 1 bis 10 Einheiten Xa/ml verwendet werden. Für den Fachmann ist es leicht, für jeden Fall die optimalen Konzentrationen zu bestimmen.
Während der Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass Polysaccharidsulfate bei der Blutcoagulation drei Haupteigenschaften zeigen können
(a) Fähigkeit die Hemmwirkung einer Komponente des menschlichen Plasmas zu überwinden gemäss Neutralisationsmechanismus von Xa durch Xa-Hemmstoff,
(b) eine schwache heparinähnliche Wirksamkeit,
(c) ein synergistischer Effekt auf die antikoagulierende Wirksamkeit von Spurenmengen Heparin.
Bei der Bestimmung des Xa-Hemmstoffs der vorliegenden Erfindung kann es von Vorteil sein, die heparinähnliche Wirksamkeit des Polysaccharidpolysulfats durch Zugabe eines Hepa-rinneutralisationsmittels, wie beispielsweise Hexadimethrinbro-mid («Polybrene»R der Abbot Laboratories, USA) oder Prot-aminsalzen, zu dem Plasmasubstrat zu neutralisieren. Sonst würden die Gerinnungszeiten für die praktische Durchführung in unzumutbarer Weise lang sein.
Unter Ausnutzung der synergistischen Wirkung des Poly-saccharidsulfats auf die antikoagulierende Wirksamkeit von Spurenmengen Heparin, kann die erfindungsgemässe Methode als ultra-empfindlicher Heparintest verwendet werden. Eine kleine, dem Testplasma zugesetzte Menge eines Polysaccharidpolysulfats, die selbst keine messbare heparinähnliche, antikoagulierende Wirksamkeit besitzt, verstärkt die antikoagulierende Wirksamkeit des Heparins auf ein Vielfaches.
Im folgenden werden anhand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Methode näher erläutert.
Beispiel 1
Zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Xal im Blutplasma wurden die folgenden Reagenzien hergestellt.
(a) Aktivierter Faktor X (Faktor Xa) aus Rinderplasma. Dieses Reagenz kann nach jeder beliebigen in der Literatur beschriebenen Methode hergestellt werden. Als Grundlage wird eine an Faktor X reiche Fraktion aus Rinderplasma hergestellt, die als BaS04-Eluat bekannt ist; diese wird dann entweder mit Russel's Vipergift oder mit Trypsin in Gegenwart von Cal-ciumchlorid behandelt. Faktor X ist dann zum Faktor Xa aktiviert. Dann wird die aktivierte Mischung an einer Anionenaus-tauschsäule (z.B. DEAE-Zellulose) nach der Methode von Yin et al., J. Biol. Chem. 243 (1968), S. 112, chromatografiert, um den Faktor Xa von anderen Substanzen, insbesondere dem Gift, frei zu isolieren. Der isolierte Faktor Xa wird dann nach der Methode von Yin et al., J. Lab. Clin. Med. 81 (1973), S. 298 (Ref. 1)., in kristalisiertem Rinderserumalbumin stabilisiert.
(b) Antikoagulantfreies Rinderplasma (AFBP), hergestellt nach Yin et al. (Ref. 1) und mit Kephalin (Säugetiergehirn oder Soyabohnenphosphatiden) vermischt. Diese Mischung wird im folgenden als AFBP-Kephalin bezeichnet.
(c) Puffer-Mono-tris-(hydroxymethyl)-aminomethanmaIe-at. Eine Konzentration von 0,02 m, pH-Wert, 7,5, wurde in dem Test angewendet.
0,5 ml verdünntes, mit Citrat versetztes menschliches Plas-5 ma (verdünnt mit Salzlösung, z.B. 0,9 prozentiger Kochsalzlösung, im Verhältnis 1 zu 50) wurde in ein Teströhrchen gegeben, das 0,4 ml einer Lösung des Natriumsalzes von Dextransulfat (Mw = 20 000; Substitutionsgrad 1,15 Sulfatgruppen pro Monosaccharid-Einheit) enthielt. Die Konzentration an Dex-lo transulfat betrug 50 (xg/ml dieser Inkubationsmischung. Diese Mischung wurde dann in einem 37 °C warmen Wasserbad eine Minute lang temperiert, dann wurden 0,1 ml Faktor Xa zugegeben, und eine erste Stoppuhr wurde in Gang gesetzt.
15 90 Sekunden nach der Zugabe von Xa wurden 0,1 ml der Inkubationsmischung in ein zweites sauberes Teströhrchen, das in dem 37 °C warmen Wasserbad temperiert worden war, übergeführt. Nach 110 Sekunden auf der ersten Stoppuhr, wurden 0,1 ml 0,03 m Calciumchloridlösung zu dem zweiten Teströhrchen gegeben. Genau nach 120 Sekunden nach der ersten Stoppuhr wurden 0,2 ml der AFBP-Kephalinmischung kräftig in das zweite Teströhrchen geblasen, und eine zweite Stoppuhr wurde gleichzeitig in Gang gesetzt. Die Zeit in Sekunden, die erforderlich war, einen festen Kuchen zu bilden, wurde ge-25 messen.
Es wurde dann eine Eichkurve für die Xal-Aktivität aufgestellt, indem eine Verdünnungsreihe der Plasmaprobe durch Verdopplung aufgestellt wurde, wobei die ursprüngliche 1:50 30 Verdünnung als «100% Aktivität» angenommen wurde (Tabelle 1).
In analoger Weise wurde eine weitere Eichkurve der Xal-Aktivität aufgestellt, indem eine unterschiedliche Ausgangsver-35 dünnung des Plasmas und eine andere Konzentration an Dextransulfat verwendet wurden (Tabelle 1).
20
Tabelle 1 40 Plasma-Verdünnung als 100% Xal-Aktivität angenommen
1
% Xal- Gerinnungszeit Aktivität in Sekunden
45 50
unter Verwendung von 50 |xg Dextransulfat pro Milliliter Inkubationsmischung
50
1
100%
79,5
50%
53,0
25%
38,5
12,5%
31,0
6,25%
27,0
0%
24,5
100%
58
50%
39
25%
32
12,5%
27,5
0%
24
100
unter Verwendung von 55 33 |xg Dextransulfat pro Milliliter Inkubationsmischung
Diese Tabelle zeigt klar, dass eine Enzym-Hemmstoff 60 (Xa-Xal) Wechselwirkung hoher Empfindlichkeit gemessen wird.
Beispiel 2
Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei 65 eine Lösung des Natriumsalzes eines Dermatansulfats (Mw = 30 000 bis 50 0000; Substitutionsgrad 1,0 Sulfatgruppen pro Disaccharid-Einheit) anstelle des Dextransulfats verwendet wurde. Es wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:
625 052
4
Tabelle 2
Plasma-Verdünnung als 100% Xal-Aktivität angenommen
1
100
unter Verwendung von 15 ng Dermatansulfat pro Milliliter Inkubationsmischung
% Xal-Aktivität
100%
50% 25% 12,5% 0%
Gerinnungszeit in Sekunden
57,5
40,0 27,5 23,0 17,4
Diese Tabelle zeigt klar, dass eine Enzym-Hemmstoff (Xa-Xal) Wechselwirkung mit hoher Empfindlichkeit gemessen wird.
Beispiel 3
Um die Möglichkeit der Bestimmung von niedrigen Hepa-
rin-Konzentrationen nach dem erfindungsgemässen Verfahren zu erläutern, wurde das Verfahren gemäss Beispiel 1 wiederholt, wobei folgende Änderungen vorgenommen wurden:
(a) In der Inkubationsmischung wurde unverdünntes Plasma 5 verwendet.
(b) Das Plasma enthielt Heparin in einer bekannten Konzentration von 0,006 Einheiten/ml.
Die Zugabe des Natriumsalzes von Dextransulfat (Mw = 20 000 ; Substitutionsgrad, 1,15 Sulfatgruppen pro Monosac-io charid-Einheit) bis zu einer Endkonzentration von 10 ng/ml in der Inkubationsmischung ergab einen Nachweis an heparinähn-licher Aktivität entsprechend 0,05 Einheiten pro ml. Dies beweist, dass die Empfindlichkeit eines Heparintests nach diesen Prinzipien etwa um einen Faktor von 10 verbessert werden 15 könnte. 10 Hg Dextransulfat hat in diesem Testsystem für sich selbst keine messbare heparinähnliche koagulationshemmende Wirksamkeit.
C
Claims (6)
1. Verfahren zur in-Vitro-Bestimmung der biologischen Aktivität des Faktors Xa-Hemmstoff (Xal) im Blut, dadurch gekennzeichnet, dass eine Plasmaprobe mit einem Polysaccha-ridpolysulfat und mit Faktor Xa eine bestimmte Zeitspanne inkubiert wird und dass dann die restliche Menge an Faktor-Xa-Aktivität bestimmt wird.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Restmenge an Faktor-Xa-Aktivität bestimmt wird, indem die Fibrinbildung zur Endpunktsbestimmung verwendet wird.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Restmenge an Faktor-Xa-Aktivität durch Messung der Esterase-Aktivität oder der amidolytischen Aktivität bestimmt wird.
4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polysaccharidpolysulfat, vorzugsweise ein Dextransulfat, das 0,10 bis 3,0 Sulfatgruppen pro Monosac-charid-Einheit aufweist, verwendet wird.
5. Verfahren gemäss Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharidpolysulfat ein Dermatansulfat oder ein Heparansulfat mit 0,45 bis 2,0 Sulfatgruppen pro Mo-nosaccharid-Einheit ist.
6. Verfahren gemäss Patentanspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharidpolysulfat an einen wasserunlöslichen Trägerstoff gekuppelt ist.
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