DE10144436B4

DE10144436B4 - Testformulierung und ihre Verwendung zur gleichzeitigen Bestimmung von Gesamteiweiß und Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten

Info

Publication number: DE10144436B4
Application number: DE2001144436
Authority: DE
Inventors: Felix Levin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-09-05
Filing date: 2001-09-05
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2021-09-06
Also published as: DE10144436A1

Abstract

Testformulierung in fester Form zur gleichzeitigen Bestimmung von Gesamteiweß und erhöhtem Harnsäuregehalt in biologischen Flüssigkeiten, enthaltend Reagenzien, die das Gesamteiweiß fällen und eine visuelle Beurteilung des Resultates sicherstellen, wobei neben an sich üblichen Fällungsreagenzien, die das Gesamteiweiß fällen, als weiteres Fällungsreagenz Kupfersulfat und zusätzlich mindestens ein Polysaccharid, mindestens ein Monosaccharid und mindestens eine Di- oder Tricarbonsäure umfasst sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine Testformulierung und ihre Verwendung zur gleichzeitigen Bestimmung von Gesamteiweiß und Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten, vorzugsweise im Urin, wobei es die zur Bestimmung notwendige Reagenzmischung in einer trockenen, festen, wasserlöslichen Formulierung umfasst. Diese Reagenzmischung enthält neben an sich üblichen Reagenzien zur Gesamteiweißfällung Kupfersulfat, mindestens ein Polysaccharid; mindestens ein Monosaccharid und Zitronensäure. Die Reagenzmischung liegt in Form eines Granulates oder in einer anderen festen Formulierung, wie z.B. in Pulverform, vor.
Methoden zur Bestimmung von Proteinen (Gesamteiweiß) im Urin, im Serum und in anderen biologischen Flüssigkeiten sind zahlreich bekannt und diagnostisch relevant. Die Proteine können durch Fällungs- und Farbreaktionen nachgewiesen werden. Solche Methoden dienen dem Nachweis zahlreicher Krankheiten, so z.B. zum Nachweis einer Proteinurie (Eiweißausscheidung im Urin) und vor allem zur Diagnose verschiedener Nierenerkrankungen.

Aus GB 2 043 244 A ist z . B . ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung von zwei oder mehr Komponenten, wie z.B. von Glukose und Harnstoff oder γ-Glutamyltransferase und Harnsäure aus Körperflüssigkeiten, bekannt. US 5,900,376 A beschreibt. ein Verfahren zur Bestimmung der Proteinkonzenration unter Proteinfällung durch Mischen einer Proteinlösung mit einer Säurekomponente und Fällungsreagentien. US 5,300,440 A ist ein Verfahren zur Proteinbestimmung unter Verwendung einer hoch alkalischen Kupferlösung zu entnehmen. Weiterhin ist in US 3,950,133 A eine feste, wasserlösliche Reagenzmischung beschrieben, welche neben einem Testreagenz ein nichtionisches Stickstoff aufweisendes Polyoxyalkylen-Tensid umfasst zur Anwendung in klinischen diagnostischen Tests.

Der Eiweißnachweis kann qualitativ und halbquantitativ mit Teststreifen erfolgen, die in der Regel ein Reagenz enthalten, das mit dem Eiweiß eine Farbreaktion bildet. Diese Teststreifen haben den Nachteil, dass sie durch Licht, Feuchtigkeit und hohe Temperaturen empfindlich sind. Andere qualitative oder quantitative Methoden erfolgen z.B. durch Zugabe von Sulfosalicylsäure zu den Proben bzw. mit der Biuretreaktion nach Fällung mit Trichloressigsäure oder Perchlorsäure, ggf. unter Farbstoffzuzätzen. Bekannte Fällungsreagenzien sind neben Säuren u. a. auch Schwermetallsalze, Azeton, Alkohol und Ammoniumsalze.

Ein Testsystem zur Eiweißbestimmung im Urin ist in dem russischen Patent RU 2 077 060 C1 beschrieben. Dieses Testsystem, das zur Fällung des Eiweißes mit einem Reagenz, das ggf. mit einem in Wasser unlöslichen Bestandteil verbunden ist eingesetzt wird, enthält das Reagenz zur Eiweißfällung als. ein dichtes, festes Granulat mit einem spezifischen Gewicht größer 1.

Die bekannten Testsysteme haben jedoch sämtlich den Nachteil, dass die Analysendauer zu lang ist. Des weiteren steht das Ergebnis (Konzentration des Eiweißgehaltes) nur für 10–15 Minuten zur Verfügung. Bei einigen Erkrankungen stört eventuell vorhandene Harnsäure die Eiweißbestimmung, da diese Säure mit dem Testgranulat auch einen Niederschlag bilden kann.

Dabei gibt es derzeit keine Möglichkeit mit bekannten Tests und Verfahren, Harnsäure zu bestimmen. Eine erhöhte Menge von Harnsäure ist jedoch ein wichtiger diagnostischer Marker und eine Möglichkeit zur Verlaufskontrolle z.B. bei Gicht, Leukämien, Harnsäuresteinen und einigen anderen schweren Erkrankungen.

Ein weiterer Nachteil von bekannten Testsystemen ist eine für Laboranten unbequeme und gefährliche Handarbeit, weil jeder Hautkontakt mit den Reagenzien vermieden werden sollte.

Aufgabe der Erfindung war es deshalb, eine gefahrlose und einfach anwendbare Testformulierung zu finden und bereitzustellen, die es ohne größeren technischen Aufwand gestattet, schnell und sicher neben dem Gesamteiweiß gleichzeitig erhöhte Konzentrationen von Harnsäure als weitere diagnostische Parameter auszuwerten.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine Testformulierung gelöst, die zur Bestimmung von Gesamteiweiß sowie zum gleichzeitigen Nachweis eines erhöhten Harnsäuregehaltes in biologischen Flüssigkeiten, vorzugsweise im Urin, dient, wobei die erfindungsgemäße Reagenzmischung in einer festen wasserlöslichen Formulierung vorliegt. Die Testformulierung umfaßt eine Reagenzmischung, die als feste, trockene Formulierung neben an sich üblichen Reagenzien zur Gesamteiweißfällung noch Kupfersulfat als weiteres Fällungsreagenz und zusätzlich mindestens ein Polysaccharid, mindestens ein Monosaccharid und weiterhin mindestens eine Di- oder Tricarbonsäure, vorzugsweise eine Tricarbonsäure, insbesondere Zitronensäure, aufweist.

Bekannte Fällungsreagenzien sind vorzugsweise feste organische Säuren, wie z.B. Sulfosalizylsäure, und anorganische Salze, wie z.B. Natriumchlorid bzw. Kombinationen dieser.

Die erfindungsgemäße Reagenzmischung bewirkt bei Auflösung in einer biologischen Flüssigkeitsprobe durch die unterschiedliche Geschwindigkeit der Fällung von Gesamteiweiß und einer Bodensatzbildung, die von einer eventuell vorhandenen erhöhten Harnsäuremenge ausgeht, die gleichzeitige Bestimmung beider Stoffe in einer Probe. Die Bestimmung des Gesamteiweißgehaltes kann sowohl visuell (halbquantitativ) als auch quantitativ (nephelometrisch) erfolgen.

Der Nachweis einer erhöhten Harnsäuremenge in der biologischen Flüssigkeit erfolgt qualitativ (visuell). Eine erhöhte Harnsäuremenge ist in der biologischen Flüssigkeit nachweisbar, wenn die Harnsäurewerte mindestens ca. doppelt so hoch sind wie die Normalwerte (d.h. die Harnsäuremenge muß > 1000 mg/l sein = ca. zweifaches des Normalwertes). Falls eine erhöhte Harnsäuremenge vorhanden ist, bildet die Harnsäure mit der Reagenzmischung, die bevorzugt Zitronensäure enthält, sehr schnell, in ca. 3–7 Minuten, einen Bodensatz und man kann sie qualitativ (visuell) bewerten.

Gleichzeitig bildet vorhandenes Eiweiß bereits nach ca. 50–60 Sekunden eine homogene Trübung, die (bei einer Eiweißkonzentrationen von etwa 30 bis 300 mg/l) zwei Stunden ohne Veränderung erhalten bleibt, ohne dass ein Bodensatz gebildet wird. Beträgt die Eiweißkonzentration mehr als 300 mg/l Eiweißgehalt (nephelometrisch gemessen oder im Vergleich mit Fotoskala), muss man die zu untersuchende Probe verdünnen.

Gemäß der Erfindung enthält die Testformulierung die Reagenzien mit folgenden Gew.%:

Fällungsreagenzien:	70–90 Gew.%
Polysaccharid:	5–15 Gew.%
Monosaccharid:	3–5 Gew.%
Di- oder Tricarbonsäure:	2–10 Gew.%.

Als Polysaccharid ist bevorzugt ein lösliches Dextran enthalten. Das verwendete Monosaccharid ist bevorzugt eine Glucose. Als bevorzugtes Fällungsreagenz dient eine Mischung aus einer festen organischen Säure, vorzugsweise Sulfosalicylsäure, und einem anorganischen Salz, vorzugsweise NaCl, in Kombination mit Kupfersulfat. Die bevorzugte Tricarbonsäure ist Zitronensäure.

Die Fällungsreagenzien liegen bevorzugt in einer Mischung aus den folgenden Bestandteilen vor:

Sulfosalicylsäure:	90–95 Gew.%
NaCl:	4–8 Gew.%
Kupfersulfat:	1–2 Gew.%

Die feste, trockene Formulierung der Reagenzmischung kann verschiedene geometrische Formen haben. So kann sie in Form eines Granulates, als Tablette oder in Pulverform vorliegen.

In Ausführungsformen der Erfindung befindet sich die Reagenzmischung bereits lose oder immobilisiert in einem durchsichtigen Testreagenzgefäß, z. B. in einem Reagenzglas oder Plastikflakon.

Ein solches Testsystem kann man auf verschiedene Weise herstellen, z.B. kann man zuerst ein Granulat aus o.g. Reagenzmischung produzieren und dann dieses Granulat in dem Reagenzgefäß unterbringen. Anderseits kann man die Reagenzmischung unmittelbar als ein Pulver in einem Reagenzglas unterbringen und lose lassen oder am Boden des Reagenzglases (nach Möglichkeit aus Plastik) befestigen.

Durchführung der Analyse

Das bevorzugte Verfahren zur Eiweißbestimmung unter Verwendung. der erfindungsgemäßen Testformulierung ist dadurch gekennzeichnet, dass man die zu untersuchende Probe, vorzugsweise eine Urinprobe, in ein Testreagenzglas, das die Reagenzmischung enthält, gießt und ca.10 Sekunden stark schüttelt, um die Reagenzmischung zu lösen. Bereits nach ca. 50–60 Sekunden wird ggf. ein erstes Ergebnis sichtbar. Spätestens nach 7 Minuten liegt das Endresultat vor. Parallel wird die gleiche Probenflüssigkeit in ein Testreagenzglas ohne Reagenzmischung gegeben.

Auswertung:

1. Bleibt die Lösung im Vergleich zu einer Probe in einem Reagenzglas ohne Reagenzmischung (auch nach ca. 7 Minuten noch) durchsichtig, ist das Analysenergebnis negativ. D.h. es liegen weder eine Mikroproteinurie vor, da der Eiweißgehalt unter 30 mg/l liegt, noch ist die Harnsäuremenge in dieser Probe erhöht (> 1000 mg/l).
2. Entsteht in der zu prüfenden Probe nach ca. 1 Minute eine Trübung, läßt man diese Probe noch ca. 3–6 Minuten in Ruhe stehen und beobachtet das weitere Geschehen: Bleibt eine ebene Trübung ohne Bodensatz in der Probe vorhanden, ist der Gesamteiweißgehalt in dieser Probe > 30 mg/l, aber es gibt keinen Hinweis auf eine erhöhte Harnsäuremenge. Man kann die Gesamteiweißkonzentration anhand der Trübung halbquantitativ mit der Fotoskala Nr.1 (1) oder quantitativ mit Nephelometer (ca. 30 Minuten später) ermitteln.
3. Wenn in einer zu untersuchenden Probe nach ca. 1 Minute keine Trübung sichtbar wird und nach weiteren ca. 3–6 Minuten ein Bodensatz entsteht und dabei die Flüssigkeit über dem Bodensatz durchsichtig bleibt – enthält diese Probe eine erhöhte Harnsäuremenge ohne dass die Gesamteiweißkonzentration > 30 mg/l ist (keine Mikroproteinurie)
4. Wenn in einer zu untersuchenden Probe nach ca. 1 Minute eine Trübung sichtbar wird und nach weiteren ca. 3–6 Minuten ein Bodensatz entsteht und die Trübung in der Probe über dem Bodensatz bestehen bleibt, enthält diese Probe vermehrt Harnsäure und weist auch einen Gesamteiweißgehalt von > 30 mg/l auf. Man kann das Ergebnis des Eiweißgehaltes anhand der Trübung halbquantitativ mit Fotoskala Nr.2 (1) oder quantitativ mit Nephelometer (ca. 30 Minuten später) anhand einer Grafik ermitteln.

Wie bereits ausgeführt, bildet vorhandenes Gesamteiweiß mit einer Konzentration von ca. 30 bis 300 mg/l eine homogene Trübung in der zu untersuchenden Flüssigkeit, die ca. zwei Stunden ohne wesentliche Änderung erhalten bleibt. In diesem Konzentrationsbereich kann man eine Linearität zwischen der optischen Dichte (OD) und der Eiweißkonzentration beobachten (2 – Grafik). Besonders bequem ist zur Auswertung die Verwendung eines einfachen Nephelometers, z.B. bioMerriux-Vitek. Mit diesem kann man eine Trübung unmittelbar im Reagenzglas messen. Bei einem Eiweißgehalt von mehr als 300 mg/l, muss man die Probe verdünnen.

Die Testformulierung ist zur in vitro Diagnostik in medizinischen, besonders in Notarzt-dienstlichen und tierärztlichen Einrichtungen sowie Laboratorien einsetzbar und zur Krankendiagnostik und zur Kontrolle des Krankheitsverlauf geeignet. Sie ist leicht handhabbar, da einem Testreagenzgefäß lediglich eine Flüssigkeitsprobe, vorzugsweise eine Urinprobe, zugegeben werden muß.

Die erfindungsgemäße Reagenzmischung ermöglicht bei Auflösung in einer biologischen Flüssigkeit durch die unterschiedliche Geschwindigkeit der Bildung einer Trübung durch Gesamteiweiß und durch Bodensatzbildung bei Anwesenheit einer erhöhten Harnsäuremenge deren gleichzeitige Bestimmung. Dabei wird der Test nur in kürzester Zeit (ca. 10 Sekunden) eigener Arbeitszeit durchgeführt und Analysenergebnisse für zwei wichtige medizindiagnostische Parameter stehen bereits nach maximal 7 Minuten zur Verfügung.

Ein weiterer Vorteil ist, dass man das Analysenergebnis als ein Sedimentbild fotografieren (z.B. mit normalen und digitalen Fotogeräten) und dann z.B. direkt vom Testreagenzglas per Computernetz weiteren Fachleuten zur kompetenten Beurteilung übermitteln kann.

Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1
Vergleichende Untersuchungen unter Verwendung von Urinproben von Gesunden (ohne Mikroprotein) und Proben, die einen erhöhten Gesamteiweißgehalt aufweisen und von einer Patientin mit Diabetes stammen:
Die Testformulierung enthält die folgende Reagenzmischung:

Sulfosalicylsäure: 75 Gew.%

NaCl: 4 Gew.%

Kupfersulfat: 1 Gew.%

Dextran: 12 Gew.%

D-Glucose: 3 Gew.%

Zitronensäure: 5 Gew.%
Es wurden 7 Urinproben von gesunden Menschen untersucht und 5 Urinproben mit einem bestimmten Eiweißgehalt, die von einer Patientin mit Diabetes an verschiedenen Tagen stammen.
Parallel wurden alle Proben mit einem bekannten Test (Micrall-Test) geprüft.
Ergebnis

1. In allen 7 Proben der gesunden Personen wurden die Lösungen nach einer Durchschüttelung und Auflösung der Reagenzmischung visuell bewertet. Sie waren zum einen ganz durchsichtig und haben bei der Messung mit dem Nephelometer der Fa. „bioMerieux" keine Angaben (0,00) gezeigt. Zum anderen war auch keine Bodensatzbildung zu beobachten. D. h. diese Proben wiesen weder einen erhöhten Gesamteiweißgehalt auf (die Konzentration lag unter 30 mg/l), noch konnte ein erhöhter Harnsäuregehalt festgestellt werden. Die negativen Eiweißergebnissen wurden mit dem Micrall-Test bestätigt.
2. In allen 5 Urinproben der Patientin mit Diabetes konnte nach ca. 1 Minute eine leichte Trübung beobachtet werden; nach ca. 5 Minuten blieb die Trübung bestehen, ohne dass sich ein Bodensatz bildete. D.h. diese Proben wiesen einen Gesamteiweißgehalt über 30 mg/l auf, jedoch keinen erhöhten Harnsäuregehalt. Mit der Fotoskala Nr.1 wurde der Gesamteiweißgehalt in diesen Proben halbquantitativ in Werten zwischen 30 und 100 mg/l ermittelt. Die quantitative Messung mit einem Nephelometer hat die folgenden Eiweißgehalte ergeben:

Probe-Nr. Eiweißgehalt

1 65 mg/l

2 41 mg/l

3 80 mg/l

4 91 mg/l

5 62 mg/l

Bei der Bewertung mit dem Micrall-Test wurde für diese Proben ein Eiweißgehalt zwischen 50 und 100 mg/l bestätigt.

Beispiel 2
Es wurden drei Urinproben mit menschlichem Albumin (mit einer Konzentration von 30, 90 und 180 mg/l) und Harnsäure mit einer Konzentration von 1500 mg/l in jeder Probe vermischt. Dann wurde mit diesen Proben das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt, wobei eine Reagenzmischung gemäß Beispiel 1 eingesetzt wurde.
Ergebnisse:
Die visuelle Probenansicht ist analog der in Fotoskala Nr. 2 darstellten. So enthalten diese Proben sowohl einen Bodensatz unten und eine homogene Trübung über dem Bodensatz – d. h. sowohl eine erhöhte Menge an Harnsäure als auch ein erhöhter Eiweißgehalt (in entsprechende Menge) konnte nachgewiesen werden.
Mit nephelometrischer Messung nach 30 Minuten wurden folgende Ergebnisse für den Eiweißgehalt erhalten: 26, 100 und 194 mg/l, wodurch die eingesetzten Konzentrationen im Prinzip bestätigt werden konnten.
Beispiel 3
Untersuchung von 5 Urinproben eines Patientes mit Leukämie Es wurde wiederum eine Reagenzmischung gemäß Beispiel 1 eingesetzt und visuell anhand des typischen Präzipitätsbildes ein Eiweißgehalt von 120–260 mg/l ermittelt und eine erhöhte Harnsäuremenge > 1000 mg/l anhand einer Bodensatzbildung festgestellt. Der hohe Harnsäuregehalt lag im Bereich 2570–3620 mg/l und wurde nach dem Verfahren von E.Praetorius ermittelt.
Die Proben (mit der Eiweißkonzentration im Bereich 30–300 mg/l) waren ohne wesentliche Veränderung der Präzipitätbilder auch nach 2 Stunden noch auswertbar.

Claims

Testformulierung in fester Form zur gleichzeitigen Bestimmung von Gesamteiweß und erhöhtem Harnsäuregehalt in biologischen Flüssigkeiten, enthaltend Reagenzien, die das Gesamteiweiß fällen und eine visuelle Beurteilung des Resultates sicherstellen, wobei neben an sich üblichen Fällungsreagenzien, die das Gesamteiweiß fällen, als weiteres Fällungsreagenz Kupfersulfat und zusätzlich mindestens ein Polysaccharid, mindestens ein Monosaccharid und mindestens eine Di- oder Tricarbonsäure umfasst sind.
Testformulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fällungsreagenz eine Mischung aus einer festen organischen Säure, vorzugsweise Sulfosalizylsäure, einem anorganischen Salz, vorzugsweise Natriumchlorid, und Kupfersulfat ist.
Testformulierung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fällungsreagenzien mit den folgenden Gew.% im Gemisch vorliegen Sulfosalicylsäure: 90–95 Gew.% Natriumchlorid 4–8 Gew.% Kupfersulfat : 1–2 Gew.%.
Testformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der festen Formulierung die Fällungsreagentien: mit 70–90 Gew.% das Polysaccharid: mit 5–15 Gew. das Monosaccharid: mit 3–5 Gew.% und die Di- oder Tricarbonsäure: mit 2 – 10 Gew.% vorliegen.
Testformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid ein lösliches Dextran ist.
Testformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Monosaccharid eine Glucose ist.
Testformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Tricarbonsäure, vorzugsweise Zitronensäure, eingesetzt wird.
Testformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form eines Granulates, als Tablette oder in Pulverform vorliegt.
Testformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie sich in einem durchsichtigen Testreagenzgefäß immobilisiert oder lose befindet.
Verwendung einer Testformulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Nachweis von Gesamteiweiß und einer erhöhten Harnsäuremenge, die mindestens das Doppelte des Normalwertes darstellt, in biologischen Flüssigkeiten unmittelbar in einer Probe, wobei man die zu prüfende Flüssigkeit mit der Testformulierung in Kontakt bringt, stark schüttelt und nach einer Einwirkungszeit von maximal 7 Minuten das Ergebnis anhand vorhandener Trübungen und Bodensätze auswertet.
Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man den Gesamteiweißgehaltes halbquantitativ mit der Fotoskala Nr.1 oder quantitativ mit einem Nephelometer ermittelt.
Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man den Gesamteiweißgehaltes halbquantitativ mit der Fotoskala Nr. 2 oder quantitativ mit einem Nephelometer ermittelt.