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Die Erfindung betrifft einen Testkit
zur Eiweißbestimmung
in biologischen Flüssigkeiten,
insbesondere im Urin, der ein Granulat mit einem spezifischen Gewicht
größer 1 und
ggf. einen saugfähigen festen
Träger
umfaßt.
Das Granulat enthält
neben an sich üblichen
Reagentien zur Eiweißfällung mindestens
einen Farbstoff und ein Polysaccharid.
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Methoden zur qualitativen und quantitativen Bestimmung
von Proteinen (Gesamteiweiß)
im Urin, in Plasma, Serum, Liquor und in anderen biologischen Flüssigkeiten
sind zahlreich bekannt und diagnostisch relevant. Die Proteine können durch
Fällungs- und Farbreaktionen
nachgewiesen werden. Solche Methoden dienen dem Nachweis zahlreicher Krankheiten.
So gelten z.B. Ausscheidungen im Harn mit Werten von 150 mg Eiweiß/24 Std.
als krankhaft. Diese Proteinurie kommt beispielsweise im Rahmen verschiedener
Nierenerkrankungen vor.
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Der Eiweißnachweis kann qualitativ mit
Teststreifen erfolgen, die in der Regel ein Reagenz enthalten, das
mit dem Eiweiß eine
Farbreaktion bildet. Diese Teststreifen haben jedoch den Nachteil,
daß sie
durch Licht, Feuchtigkeit und hohe Temperaturen empfindlich und
unbeständig,
also nicht lagerfähig sind,
wodurch eine Auswertung nach längeren
Zeiträumen
nicht mehr möglich
ist.
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Andere qualitative, halbquantitative
oder quantitative Nachweise erfolgen z.B. durch Zugabe von Sulfosalicylsäure zum
Urin bzw. mit der Biuretreaktion nach Fällung mit Trichloressigsäure oder
Perchlorsäure,
ggf. unter Farbstoffzusätzen.
Bekannte Fällungsreagentien
sind neben Säuren
u.a. auch Schwermetallsalze, Aceton, Alkohol, Ammoniumsalze und
dergleichen. Ferner können
die nachgewiesenen Proteine mittels Elektrophorese nach ihrem Molekulargewicht
aufgetrennt werden, was weitere diagnostische Hinweise ergibt.
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DE-AS
1 246 281 beschreibt einen imprägnierten Teststreifen zur Eiweißbestimmung,
der aus einem saugfähigen
Träger
besteht und neben bekannten Eiweißfällungsreagentien, einen Farbindikator
aufweist, welcher mit einem Puffer zur pH-Werteinstellung imprägniert ist.
DE 42 01 179 A1 beschreibt
Wirkstoff-haltige Granula, die als Gel- bzw Gerüstbildner u.a. Polysaccharide
aufweisen können.
Weitere Verfahren zum Nachweis von Protein im Urin können z.B.
EP 0 770 873 A2 ,
US 5,326,707 A und
JP 5172821 A entnommen
werden.
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Ein Testsystem zur Eiweißbestimmung
im Urin ist in dem russischen Patent
RU 2 077 060 C1 beschrieben. Dieses Testsystem,
das zur Fällung
des Eiweisses mit einem Reagenz, das ggf. mit einem in Wasser unlöslichen
Bestandteil verbunden ist, eingesetzt wird, enthält das Reagenz zur Eiweißfällung als ein
dichtes, festes Granulat mit einem spezifischen Gewicht größer 1.
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Die bekannten Testsysteme haben jedoch sämtlich den
Nachteil, daß der
Test spätestens
ca. 1 Stunde nach der Analysendurchführung ausgewertet sein muß, da die
Aufbewahrung der Ergebnisse über einen
längeren
Zeitraum nicht möglich
ist, wodurch auch eine spätere
Auswertung oder Diskussion mit Fachleuten somit nicht mehr durchführbar ist.
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Aufgabe der Erfindung war es deshalb,
einen einfach anwendbaren Testkit zur Eiweißbestimmung zu finden und bereitzustellen,
der zu einem Ergebnis führt,
dessen Auswertung auch nach einem längeren Lagerzeitraum, mindestens
nach einem Monat, noch erfolgen kann.
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Erfindungsgmäß wird die Aufgabe durch einen
Testkit gelöst,
der ein Granulat und einen saugfähigen
festen Träger
aufweist. Das Granulat umfaßt bekanntermaßen Reagentien,
die das Eiweiß quantitativ
fällen,
eine visuelle Beurteilung des Resultates des Fällungsreaktion sicherstellen
und ein dichtes, festes Granulat mit einem spezifischen Gewicht
größer 1 bilden,
wobei es erfindungsgemäß neben
den an sich üblichen
Fällungsreagentien
mindestens einen Farbstoff und ein Polysaccharid enthält.
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Gemäß der Erfindung enthält der Testkit
die Reagentien im Granulat mit folgenden Gew.%:
Fällungsreagenz
87,80–95,99
Gew.%,
Polysaccharid 4,00–12,0
Gew.% und
Farbstoffanteil 0,01–0,2 Gew.%.
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Das Granulat wird nach an sich bekannten Verfahren
für das
Granulieren oder Tablettieren chemischer Mischungen hergestellt.
So wird z.B. eine gesättigte
Lösung
eines Fällungsreagenzes,
die auch das Polysaccharid und den Farbstoff enthält, auf
eine glatte Plastoberfläche
getropft und bei 10 bis 20°C
ausgetrocknet. Das so hergestellte Granulat kann in einem geschlossenen
Glas- oder Plastikflakon bis zu 3 Jahren aufbewahrt werden.
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Als bevorzugtes Fällungsreagenz dient eine Mischung
aus einer festen organischen Säure
und einem anorganischen Salz, besonders bevorzugt ist eine Mischung
aus Sulfosalizylsäure
und Natriumchlorid, die in dem Gemisch mit 75–95 : 5–25 Gew.% vorliegen.
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Als Polysaccharid ist bevorzugt ein
lösliches Dextran
enthalten. Als bevorzugtes Farbstoffreagenz wird eine Mischung von
Bromthymolblau und Methylrot im Verhältnis 1:1, der Tintenfarbstoff
Methylviolett oder Coomassie-Brillantblau eingesetzt.
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Zur qualitativen Eiweißbestimmung
wird in einer Ausführungsvariante
der Erfindung das Granulat zu einer biologischen Flüssigkeit – 1 ml in
einem Reagenzglas – gegeben.
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Wenn Eiweiß in der biologischen Flüssigkeit vorhanden
ist, wird es aus der Flüssigkeit
gefällt
und es bildet sich über
dem Granulat ein Niederschlag in Form eines weißen Ringes, der durch den vorhandenen
Farbstoff verstärkt
sichtbar ist.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante
der Erfindung enthält
der Testkit zur quantitativen, halbqualitativen und/oder qualitativen Eiweißbestimmung
neben dem Granulat einen saugfähigen
festen Filterträger.
Im Sinne der Erfindung sind diese Filterträger aus Cellulosematerialien
oder Kunstoff, vorzugsweise sind es Papierträger.
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Nachdem das erfindungsgemäße Granulat einer
biologischen Flüssigkeitsprobe
zugegeben und das gegebenenfalls vorhandene Eiweiß ausgefällt wurde,
welches sich dann als weißer
bzw. gefärbter Ring über der
Oberfläche
des Granulates niederschlägt,
schüttelt
man kurz das Reagenzglas mit der Flüssigkeit und dem Granulat und
gießt
dann die Mischung auf einen saugfähigen festen Filterträger, vorzugsweise
auf einen Papierträger,
wodurch auf der Oberfläche
des Trägers
gefärbte
Regionen entstehen, die lagerstabil erhalten bleiben und den Eiweißnachweis
sicherstellen.
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Da die Farbintensität der gefärbten Zonen gerade
proportional der Eiweißmenge
ist, kann das Eiweiß nicht
nur qualitativ, sondern unter Verwendung von Standardproben, auch
quantitativ bestimmt werden.
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Der erfindungsgemäße Testkit ist insbesondere
zur in vitro Diagnostik in medizinischen, tiermedizinischen Einrichtungen
und Laboratorien einsetzbar und zur Früherkennung, z.B. von Nierenkrankheiten
geeignet. Er ist einfach handhabbar, da das Granulat mit den Reagentien
einfach zu einer biologischen Probe zugegeben werden kann und außerdem hoch
empfindlich. So können
bereits geringe Konzentrationen von 0,02 g/l (also Eiweißspuren)
sicher visuell nachgewiesen werden. Darüber hinaus kann das Analysenergebnis
auf dem saugfähigen
festen Filterträger
mindestens 30 Tage und mehr aufbewahrt werden, ohne daß eine Auflösung erfolgt,
was auch die spätere
Auswertung ermöglicht.
Ein weiterer Vorteil besteht noch darin, daß die Testergebnisse postalisch
oder per Telefax bzw. Computernetz weitergeleitet werden und ausgewertet
können.
Damit werden teleanalytische Bestimmungen möglich, z.B. wenn mit Fachleuten
an verschiedenen Orten diskutiert werden soll. Außerdem kann
der Test auch einfach vom Anwender selbst zu Hause durchgeführt und
ausgewertet werden, was den erfindungsgemäßen Testkit für eine diagnostische
Breitenuntersuchung empfiehlt.
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Anschließend wird die Erfindung an
Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
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Beispiel 1
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Vergleichende Eiweißbestimmung
im Urin eines Diabetikers, eines Gesunden und einer Kontrolle, die
per Fax am Analysentag, nach 15 Tagen und nach 34 Tagen zur Auswertung übermittelt
wurden
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In einem Mikroreagenzglas wurde zu
1 ml einer Urinprobe eines Diabetikers, genannt „Diabet" und zu 1 ml einer Urinprobe eines gesunden
Probanden, genannt „Normal" sowie zu 1 ml Wasser,
genannt „Kontrolle" jeweils ein Granulat
des erfindungsgemäßen Testkits
gegeben und für
5 Minuten stehengelassen.
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Das Granulat hatte folgende Zusammensetzung:
Sulfosalizylsäure: 81
Gew.%
NaCl: 9 Gew.%
Dextran: 9,98 Gew.%
Bromthymolblau/Methylrot:
0,02 Gew.%
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In der „Diabet"-Probe wurde ein weißer Ring über dem Granulat gebildet,
d.h. Eiweiß ist
vorhanden. Die beiden anderen Granulate wiesen keinen Ring auf,
d.h. die Proben enthielten kein Eiweiß.
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Anschließend wurden die Flüssigkeiten,
einschließlich
Granulat, auf einen dicken Filter gegossen (einen mehrschichtigen
Papierfilter). Die „Diabet"-Probe ergab einen
stark gefärbten
Fleck, die beiden Proben „Normal" und „Kontrolle" hinterließen gering
gefärbte
Flecke. Nach Trocknung der Flecke wurde der Papierfilter per schwarz-weiß Telefax
zur Auswertung übermittelt
und anschließend
an einem dunklen Platz aufbewahrt und nach 15 Tagen sowie nach 34
Tagen erneut zur Auswertung per Telefax verschickt.
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Bei Vorhandensein von Eiweiß kann in
der biologischen Probe dieses Eiweiß mit dem Testkit eindeutig
sichtbar gemacht werden. Darüber
hinaus kann die Auswertung auch nach mehr als 30 Tagen vorgenommen
werden, da sich die Farbintensität
der Flecke während
der Lagerung nicht merklich verändert
hat.
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Beispiel 2
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Halbquantitative Bestimmung
von Eiweiß im
Urin und Übertragung
der Analysenergebnisse per Computer
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Es wurde die Eiweißbestimmung
im Urin eines Diabetikers und eines gesunden Probanden (Nicht-Diabetikers)
gemäß Beispiel
1 durchgeführt und
entsprechende Filter erstellt. Ebenso wurden Standardlösungen mit
Eiweiß-Konzentrationen
von 0,02; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 und 1,0 g/l hergestellt und Filter
mit diesen Standardlösungen
gemäß Beispiel
1 präpariert.
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Diese Filter wurden ebenfalls sofort
ausgewertet und in einen Computer mit einem Farbscanner eingescannt
sowie mehr als 30 Tage im Dunkeln gelagert und dann erneut eingescannt,
per Computernetz verschickt und halbquantitativ bewertet.
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Anhand eines Computerbildes konnten
die Flecke der Probe des Diabetikers und der Probe des Gesunden
am Analysentag und nach über
einem Monat (34 Tagen) bewertet werden. Die Farbintensität der Flecke
hatte sich während
der Lagerung kaum verändert.
Im Urin des Nichtdiabetikers wurde kein Eiweiß beobachtet.
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Die Farbintensität des Fleckes der Diabetikerprobe
wurde mit der Farbintensität
der Flecke der Standardproben verglichen. Im Vergleich zu den Standardproben
zeigte der Fleck des Diabetikers eine Farbintensität; die sich
zwischen die Farbintensität
der Konzentrationen 0,05 und 0,1 g/l der Standardlösungen einordnen
ließ und
mit ca. 0,075 g/l bewertet wurde.
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Dieses Ergebnis konnte durch eine
Nephelometriemessung, die 0,08 g/l Eiweißkonzentration der Diabetikerprobe
ermittelte, bestätigt
werden.
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Die Eiweißbestimmung in anderen biologischen
Flüssigkeiten,
wie z.B. in Serum, Liquor oder Exudaten erfolgte in Analogie der
Bestimmung von Eiweiß im
Urin (Exudate muß man
im Verhältnis 1:100
in Wasser lösen).
Eine Aufbewahrung der Ergebnisse, ohne wesentliche Veränderungen
in der Farbintensität
in den Proben festzustellen, war ebenfalls nach mehr als 30 Tage
noch möglich.