DE1246281B - Trockene Indikatorzubereitung auf einem saugfaehigen Traeger zur Bestimmung von Protein in Fluessigkeiten - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

GOIn

Deutsche Kl.: 421 - 3/02

Nummer: 1 246 281

Aktenzeichen: E 13732IX b/421

Anmeldetag: 27. Februar 1957

Auslegetag: 3. August 1967

Die Bestimmung geringer Mengen an Protein in Flüssigkeiten, insbesondere Urin, spielt bei der ärztlichen Diagnose von Nierenerkrankungen usw. eine große Rolle. In der Praxis wurden bisher meist Fällungsreaktionen durchgeführt, wobei der Urin mit eiweißfällenden Reagenzien, wie Sulfosalicylsäure bzw. Pikrinsäure, oder mit Essigsäure in der Hitze behandelt wird. Eine Prüfung des Urins zeigt dann die Gegenwart von Proteinen an.

F e i g 1 und Anger (Microchim. Acta, II, 1937, S. 107 bis 110) haben eine Tüpfelreaktion beschrieben, bei der die Farbänderung eines pH-Indikators durch den sogenannten »Proteinfehler« in mit Essigsäure versetztem Urin ausgewertet wird. Nach E. Dannenberg, Analytica Chim. Acta, Bd. 8 (1953), S. 310, sind ferner schwammartige Glassintersteinchen bekannt, die mit Farbindikatoren imprägniert sind und für den Proteinnachweis in Urin verwendet werden sollen. Auf dem Prinzip des Proteinfehlers beruht auch die von K e t ο m a a et al. in Ann. Med. Exptl. et Biol. Fenniae, 30, 1952, S. 249 bis 253, beschriebene kolorimetrische Methode zur Bestimmung von Proteinen in Urin. Hierbei werden zu 10 ecm eines mit Wasser im Verhältnis 100:1 stark verdünnten Urins 1 ecm 0,ln-Acetat Pufferlösung pH 3,4 zugefügt und mit 1 ecm einer 0,05°/₀igen alkoholischen Lösung des Kaliumsalzes von Tetrabromphenolphthaleinäthylester versetzt. Die maximale Lichtäbsorption bei 610 ηιμ wurde nach mindestens 10 Minuten, maximal 30 Minuten langem Stehenlassen spektrophotometrisch bestimmt und der erhaltene Wert mit den Werten von Lösungen mit bekannten Proteinkonzentrationen verglichen. Diese Methode ist umständlich und benötigt kostspielige Apparaturen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine einfache Schnell methode zu schaffen, bei der ohne zusätzliche Vorrichtungen eine sichere Bestimmung von Proteinen in wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere Urin, auch durch Personen ohne Spezialkenntnisse möglich ist. Gelöst wird diese Aufgabe überraschenderweise durch eine trockene Indikatorzubereitung auf einem saugfähigen Träger, die einen Farbindikator enthält, der mit Protein einen wahrnehmbaren Farbumschlag zeigt, wobei der Träger mit einem auf den Farbindikator abzustimmenden Puffer imprägniert ist, der bei Berührung mit der Untersuchung'sflüssigkeit nahezu konstant einen pH-Wert einstellt, der in einem engen pH-Bereich liegt, und zwar innerhalb und dicht unterhalb des Umschlagsbereiches des Farbindikators, in dem dieser normalerweise als pH-Indikator verwendet wird.

Trockene Indikatorzubereitung auf einem saugfähigen Träger zur Bestimmung von Protein in Flüssigkeiten

Anmelder:
ίο Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Puls und Dr. E. Frhr. v. Pechmann, Patentanwälte, München 9, Schweigerstr. 2

Als Erfinder benannt:
Albert S. Keston, Englewood, N. J. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 29. Februar 1956 (568 437)

Es war auf Grund des Standes der Technik nicht zu erwarten, daß die Farbänderung, welche bei dem kolorimetrischen Verfahren erst nach einer Standzeit von 10 Minuten bestimmt werden durfte, bei der erfindungsgemäßen Indikatorzubereitung auf dem saugfähigen Träger praktisch unmittelbar eintritt und auch hier je nach Intensität der Farbänderung eine quantitative Aussage über den Proteingehalt der Lösung ermöglicht. Zwar kennt man schon seit längerer Zeit Papierstreifen, die mit einem pH-Indikator imprägniert sind, z.B. Lakmuspapier oder Papierstreifen, die verschiedene Farbindikatoren mit unterschiedlichem Farbumschlagsbereich aufweisen, um den pH-Wert von Lösungen genauer zu bestimmen. Bei diesen Indikatorpapieren liegen aber andere Aufgaben vor, auch dürfen diese Papiere gerade keine Puffersubstanzen aufweisen, da sie den pH-Wert der zu untersuchenden Lösungen ohne jede pH-Wert-Verschiebung anzeigen sollen.

Die bei Anwesenheit von Proteinen mit der erfindungsgemäßen Indikatorzubereitung auftretende Färbung beruht auf einem anderen Effekt als die bekannte, zum Nachweis von Proteinen bei der Papierchromatographie oder -elektrophorese (vgl. F. Cra-

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mer, »Papierchromatographie«, 1952, S. 34) durch- Der günstigste pH-Wert hängt nicht nur von der

geführte Anfärbung von Proteinen, bei der sich der Art des Farbindikators, sondern in geringerem Maße

Farbstoff mit den am Papier in begrenzten Flecken auch von der Art des verwendeten Puffers und seiner

oder Streifen adsorbierten Proteinen verbindet. Wie Ionenstärke ab und ist durch eine Versuchsreihe sehr

bei der bekannten Tüpfelreaktion und der spektral 5 einfach festzustellen. Beste Ergebnisse mit Brom-

kolorimetrischen Methode beruht beim erfindungs- phenolblau wurden mit vielen Puffern bei pH-Werten

gemäßen Indikator die Farbänderung auf den von zwischen 2 und 3 erhalten. Diese pH-Werte liegen

Kolthoffin »Säure-Basen-Indikatoren« schon 1932, also zweckmäßig außerhalb des pH-Bereichs, in dem

S. 357, beschriebenen Proteinfehler. Wenn auch die die Farbindikatoren normalerweise als pH-Indikatoren

einzelnen Merkmale der Indikatorzubereitung bekannt io verwendet werden, d.h. die vom pH-Wert abhängige

waren, so ist ihre Kombination neu und ermöglicht deutliche Farbänderungen zeigen. Ein geeignetes Ver-

überraschenderweise die Lösung der der Erfindung fahren zur Bestimmung des genauen pH-Wertes bei

zugrunde liegenden Aufgabe der einfachen Schnell- einer Zusammensetzung, die Bromphenolblau als

bestimmung von Protein in Flüssigkeiten wie Urin. . Farbindikator und einen Malonsäure-Malonat-Puffer

Die erfindungsgemäße trockene Indikatorzubereitung 15 enthält, ist wie folgt: Um die günstigsten Bedingungen ist unbegrenzt stabil und zeigt bei Berührung mit einer für den Malonsäure-Malonat-Puffer zu ermitteln, wird proteinhaltigen Flüssigkeit sogleich einen Färb- 1 g Malonsäure in 10 ecm einer 0,04%igen Bromumschlag, der genau die Konzentration an Protein _# phenolblaulösung unter Bildung einer zunächst gelben in der Flüssigkeit wiedergibt, weil die Farbverände- Lösung aufgelöst. Dann wird ein geeignetes alkalisches rungen des Farbindikators, die auf pH-Änderungen 20 Mittel, wie Natriumhydroxyd oder Natriumbicarbonat, beruhen würden, durch den gleichzeitig vorhandenen zugegeben, bis die Lösung nach schwach Orange Puffer ausgeschaltet sind. Das Protein ist also nicht umschlägt. Aus dieser Lösung werden Reagenzwie bei den Anfärbeverfahren der Papierchromato- papierstreifen wie oben beschrieben hergestellt, und graphie und -elektrophorese auf dem Papier vor- diese werden in Urinproben, die kein Protein enthanden, sondern befindet sich gelöst in der Flüssigkeit. 25 halten, und solchen, die eine kleine bekannte Menge, Als saugfähiges Trägermaterial für die Zubereitung z.B. 0,5% Albumin enthalten, eingetaucht. Wenn der wird vorzugsweise poröses Papier verwendet. Durch eingetauchte Streifen bei der proteinfreien Probe Vergleich mit einer Farbtafel kann z.B. die Menge merklich dunkler wird, so ist dies ein Zeichen dafür, an pathologischem Albumin im menschlichen Urin daß ursprünglich zu viel Alkali zugefügt wurde und in einfacher Weise festgestellt werden. 30 der pH-Wert der Lösung durch Säurezusatz etwas

Mit dem Mittel nach der Erfindung ist somit eine erniedrigt werden muß. Kein Farbumschlag oder eine

sehr einfache Schnellbestimmung von Proteinen in nur geringe Farbänderung bei der proteinhaltigen

Lösungen möglich, bei der gleichzeitig qualitative und Probe zeigt an, daß zu wenig Alkali zugefügt wurde

quantitative Aussagen erhalten werden können. Gegen- und daß der pH-Wert des Puffers etwas höher gewählt

über den in der Klinik bisher benutzten Methoden 35 werden muß. Zur Vereinfachung wird das oben

zum qualitativen Proteinnachweis im Urin, wie der beschriebene Verfahren in den Beispielen als »pH-Ein-

Essigsäurekochprobe und der Sulfosalicylprobe, zeich- stellung« bezeichnet.

net sich das erfindungsgemäße Mittel, abgesehen von Bei der Herstellung des Mittels nach der Erfindung

dem Wegfall von Laboratoriumsgeräten, auch da- werden der Farbindikator und der Puffer in an-

durch aus, daß es gleichzeitig eine quantitative Ab- 40 gemessener Konzentration in Wasser oder anderen

Schätzung der Proteinmenge ermöglicht. Im Gegen- passenden Lösungsmitteln gelöst. Aus der wäßrigen

satz zu allen bisher angewendeten Eiweißbestimmungs- Lösung wird durch Sättigen von porösem Papier und

methoden werden keine Geräte und Chemikalien Trocknen desselben die trockene Indikatorzubereitung

außer dem Indikatorstreifen selbst benötigt, und die in Form eines Reagenzpapiers hergestellt. Zwecks

Prüfung kann innerhalb von wenigen Sekunden auch 45 besserer Anwendung wird das Papier in lange Streifen

von gänzlich ungeschulten Kräften durchgeführt oder Bänder geschnitten. Auch kleinere Abschnitte

werden. können in üblicher Weise auf einen anderen Träger-

Es wurde gefunden, daß außer mit den Färb- streifen befestigt werden.

Indikatoren Bromphenolblau und Bromkresolgrün Zur Proteinbestimmung wird das so hergestellte mit Tetrabromphenolblau besonders gute Ergebnisse 50 Indikatorpapier mit der proteinhaltigen Flüssigkeit erzielt werden können. Als Puffer lassen sich die durch kurzes Eintauchen gesättigt und nach 15 bis bekannten Puffersysteme verwenden. Die angewandte 60 Sekunden — um eine vollständige Farbentwicklung Menge an Puffer hängt teilweise von der zu unter- zu gestatten — das Ausmaß des Farbumschlags besuchenden Lösung ab. Für die Imprägnierung des stimmt. Eine quantitative Bestimmung wird ermöglicht saugfähigen Trägers wird gewöhnlich eine Lösung 55 durch Vergleich der entstandenen Farbtönung auf dem verwendet, die in bezug auf den Puffer zwischen 0,1- Reagenzpapier mit einer Reihe von Farbmustern, z.B. und 2- bis 3 molar ist. Die Art des benutzten Puffers einer Skala, deren Farbproben verschiedenen bekannhängt von der Art des benutzten Farbindikators ab. ten Proteinkonzentrationen entsprechen.
Wenn der Farbindikator gegenüber Proteinen inner- :
halb eines pH-Bereiches farbempfindlich ist, der 60 B e i s r> i e 1 1
durch einen basischen Puffer befriedigend aufrechterhalten werden kann, so können Borsäure-Natrium- 10 g Citronensäuremonohydrat und 800 g Natriumborat-Puffer verwendet werden. Wenn der verwendete citratdihydrat wurden in 100 ecm einer 0,04% igen wäß-Farbindikator bei einem niedrigeren bzw. sauren rigen Bromphenolblaulösung aufgelöst. Der UmschlagpH-Wert gegenüber dem Protein farbempfindlich ist, 65 bereich dieses Indikators liegt bei pH 3,0 bis 4,6. In kann ein saurer Puffer, z.B. Citronensäure-Natrium- diese Lösung mit pH-Wert 2,2 wurden Filtrierpapiercitrat- oder Weinsäure-Natriumtartrat-Puffer ver- streifen getaucht und an der Luft bei Raumtemperatur wendet werden. . getrocknet. Durch Auflösen verschiedener Mengen

Rinderplasmaalbumin in normalen Urinproben wurde eine Reihe von Probelösungen hergestellt. Stücke des wie oben hergestellten Reagenzpapiers wurden für einen Augenblick in die Ptobelösungen eingetaucht und die nach 15 bis 20 Sekunden entstandenen Farbtönungen visuell bestimmt, wobei die nachstehend aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden:

% Protein	Farbton des Papiers
0	Gelb
0,05	Grünlichgelb
0,15	Grün
0,3	Bläulichgrün
0,6	Grünlichblau
2,5	Blau

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß das beschriebene Indikatorpapier sehr empfindlich ist und genaue Angaben über das Vorliegen von Albumin in Urin liefert.

In den folgenden Beispielen werden Lösungen gezeigt, die zum Imprägnieren der Filtrierpapierstreifen dienen.

Beispiel 2

Thymolblaulösung (0,04 %) (erster Umschlagsbereich pH 1,2 bis 2,8) 3 ecm

Sulfosalicylsäurelösung (41 g/100 ecm) 1 ecm

Kaliumcarbonatlösung (0,2 normal) 1 ecm

Die erhaltene Lösung zeigt einen pH-Wert von 2,3.

Beispiel 3

Thymolblaulösung(0,04 °/₀) (zweiter Umschlagsbereich pH 8,0 bis 9,6) 1 ecm

7 g Borax und 7 g Waschsoda in 130 ecm
Wasser gelöst (pH-Wert 9,2) 1 ecm

Beispiel4

Bromphenolblaulösung (0,04 °/₀) (Umschlagsbereich pH 3,0 bis 4,6) 6 ecm

Malonsäurelösung, enthaltend 1 g Malonsäure 6 ecm

3 n-Natriumhydroxydlösung wird zugesetzt, bis schwach orangerosa Farbe entsteht. Dann wpH-Einstellung«, um einen pH-Wert von 2,lzu erhalten.

Beispiel 5

Bromkresolgrünlösung (0,1% in 30°/₀igem
Alkohol) (Umschlagsbereich pH 3,8 bis

5,4) 10 ecm

Citronensäuremonohydrat 2,1 g

Natriumcitratdihydrat Ig

Wasser 16 ecm

Die erhaltene Lösung zeigte einen pH-Weit von 3,4.

Beispiel 6

Bromphenolblaulösung (0,05 %) (Umschlagsbereich pH 3,0 bis 4,6) 5 ecm

Weinsäurelösung (2molar) 9,8 ecm

Natriumtartratdihydratlösung (2molar).... 2,5 ecm

Diese Lösung mit pH-Wert von 2,3 wird vorzugsweise heiß auf das Papier aufgebracht, um eine Kristallisation zu vermeiden.

Beispiel 7

Alizarinnatriumsulfonat (0,1%) (Umschlagsbereich pH 3,7 bis 5,2) 4 ecm

g Citronensäuremonohydrat und 8 g Na-
*5 triumcitratdihydrat in 500 ecm Wasser gelöst 3 ecm

Natriumcitratlösung (lnormal) 6 ecm

Die erhaltene Lösung zeigte einen pH-Wert von 3,9.

Beispiel 8

Alizarinlösung (0,1% in Äthanol) (Umschlagsbereich pH 5,5 bis 6,8) 4 ecm

g Citronensäuremonohydrat und 8 g Natriumcitratdihydrat in 500 ecm Wasser gelöst 3 ecm Natriumcitratlösung (lmolar) 16 ecm

Die erhaltene Lösung zeigte einen pH-Wert von

5,3.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Trockene Indikatorzubereitung auf einem saugfähigen Träger zur Bestimmung von Protein in Flüssigkeiten, die einen Farbindikator enthält, der mit Protein einen wahrnehmbaren Farbumschlag zeigt, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einem auf den Farbindikator abzustimmenden Puffer imprägniert ist, der bei Berührung mit der Untersuchungsflüssigkeit nahezu konstant einen pH-Wert einstellt, der in einem engen pH-Bereich liegt, und zwar innerhalb und dicht unterhalb des Umschlagsbereichs des Farbindikators, in dem der Farbindikator normalerweise als pH-Indikator verwendet wird.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbindikator Bromphenolblau oder Bromkresolgrün enthält.

3. Mittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als Puffer einen Citronensäure-Citrat- oder einen Weinsäure-Tartrat-Puffer enthält.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Microchemica Acta, II, 1937, S. 107 bis 110;
Analytica chimica Acta, 8, 1953, S. 310 und 315;

F. Cramer, »Papierchromatographie«, 1952,
S. 34;

W i 11 a r d und F u r m a η η, »Grundlagen der qualitativen Analyse«, Wien, 1950, S. 104;
Holthoff, »Säure-Basen-Indikatoren«, 1932, S. 173, 174, 357, 376, 392;

Ann. Med. Exptl. et Biol. Fenniae, Bd. 30, 1952, S. 249 bis 253.

709 619/319 7. 67 Bundesdruckerei Berlin