DE2335350A1

DE2335350A1 - Bestimmung von calcium

Info

Publication number: DE2335350A1
Application number: DE19732335350
Authority: DE
Inventors: Robert Frederick Mack; William Spyros Stavropoulos; Bernard James Thiegs
Original assignee: Dow Chemical Co
Current assignee: Seragen Diagnostics Inc
Priority date: 1973-04-11
Filing date: 1973-07-11
Publication date: 1974-10-31
Also published as: JPS502991A; DE2335350C2; CA1007551A; JPS5629789B2; GB1424427A

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. R We ic km an ν, _;,

Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

H/KR _:

8 MÜNCHEN 86, DEN 2335350

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

THE DOW CHEMICAL COMPANY, Midland, Michigan 4864o/USA 2030 Abbott Road

Bestimmung von Calcium

Die Erfindung betrifft ein Reagenz bzw. ein Verfahren zur Bestimmung von Calcium.

Die Bestimmung von Calcium in biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung eines Orthokresolphthalein-Komplexon-Reagenz ist in vielen technischen und klinischen Γ Moratorien eine übliche Methode. Diese Methode baut sich' auf der Verwendung des Säure-Base-Indikators Orthokresolphthalein-Kom^lexon- auf. Dieser Indikator wird auch als 3^t,5"-Bis(fbis(carboxymethyl)-aminoJ-methyl)-5',5"-dimethylphenolphthalein bezeichnet und als "OCPC" abgekürzt. Dieser Indikator bildet bei alkalischen Bedingungen mit Calcium eine meßbare Färbung. Eine neutrale oder saure Lösung

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der Verbindung ist farblos. Alkalische Lösungen sind violett, wobei sich die Intensität der Farbe vertieft, wenn der pH zunimmt.

Diese Bestimmungsmethode wird gewöhnlich durchgeführt, indem ein Farbreagenz, das Orthokresolphthalein-Komplexon enthält, in verdünnter Salzsäurelösung und ein alkalisches Reagenz, das eine Aminbase und eine geringe Menge eines Alkalimetallcyanids enthält, mit einer biologischen Flüssigkeit vermischt werden. Die Säure und die Aminbase ergeben einen alkalischen Puffer, der dem Endgemisch einen geeigneten pH-Wert, gewöhnlich einen pH-Wert von 11 verleiht. Die Intensität der resultierenden Farbe wird nach einem vorgewählten Zeitintervall bei einer vorgewählten Temperatur photometrisch gemessen. Orthokresolphthalein-Komplexon-Methoden zur Bestimmung von Calcium werden z.B. in folgenden Literaturstellen beschrieben: Stern et al., Clin.Chem. 2, 576 (1957); Gitelman, Analytical Biochemistry, l8, 521 (1967) und Connerty et al., Am.J.Clin.Path. 4£, 29o (1966). Die Bestimmung kann in Gegenwart einer geringen Menge von 8-Chinolinol durchgeführt werden, um Störungen durch Magnesiumionen zu unterdrücken, wie es von Connerty et-..al. oben beschrieben wird. Zur Unterdrückung von Störungen durch Schwermetalle ist auch schon Kaliumcyanid verwendet worden.

Als Aminbase wird im allgemeinen Diäthylamin verwendet. Diathylamin hat aber einen störenden Geruch und einen niedrigen Flammpunkt. Weiterhin sind Diäthylamin-Reagenzien zu stark gegenüber sowohl dem pH-Wert als auch der Calciumkonzentration empfindlich. Es ist daher anzustreben, diese Substanz bei Calciumbestimmungen zu eliminieren. Von Connerty & Briggs wird ein Reagenz beschrieben, bei welchem ein 0,7^ molarer Aminoäthanolborat-Puffer (AEB) mit einem pH-Wert von 11 verwendet wird. Das AEB-System erfordert aber vor der Analyse eine Proteinausfällung oder eine Calciumoxalat-Ausfällung, so daß dieses System für direkte Analysen bei kleinen Serumproben ungeeignet ist. Auch ist das AEB-REagenz

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gegenüber Calcium überempfindlich, wobei Absorptionswerte von o,5 und mehr für Calciumwerte ' : d*er Nähe des oberen Endes des Normalbereiches erhalten werden, wodurch die genaue Ablesung der Ergebnisse erschwert wird.'

Die Erfindung bezieht sich nun auf eine Verbesserung bei Orthokresolphthalein-Komplexon-Reagentien für die Bestimmung der Calciumr-Konzentration in biologischen Flüssigkeiten wie Blutserum, Plasma, Urin etc. Durch die Erfindung wird ein Reagenz zur Verfügung gestellt, bei welchem, die Aminbase in dem alkalischen Puffer ein Aminoniedrig-Alkanol ist. Die Erfindung gibt weiterhin eine Methode zur Verwendung dieses Reagenzes zur Bestimmung der Konzentration von Calcium in biologischen Flüssigkeiten.

Die Erfindung ist weiterhin dadurch charakterisiert, daß die Säure und die Aminbase in dem alkalischen Puffer in Verhältnismengen verwendet werden, die in der Reagenzmischung einen pH-Wert von etwa lo,l bis etwa 1ο,7 ergeben.

Die Aminbase ist ein Aminoniedrig-Alkanol mit J5 oder 4 Kohlenstoffatomen. Sie besitzt eine Dissoziationskonstante, pK, in Wasser von etwa 9*5 bis etwa Io. Das Aminoalkanol kann ein primäres Arnin wie 3-Amino-l-propanol sein, vorausgesetzt, daß es den richtigen pK-Wert besitzt. Eine bevorzugte Aminbase ist 2-Äthylaminoäthanol. Amine mit pK-Werten, die erheblich oberhalb oder unterhalb des oben angegebenen Bereiches liegen, z.B. Diäthylamin (pK lo,9) oder 2-D±iethylaminoäthanol (pK 9,2) ergeben Reagenzmischungen, die gegenüber geringfügigen Veränderungen der Aminkonzentration zu stark empfindlich sind und die gegenüber der Calciumkonzentration in unerwünschter Weise überempfindlich oder unterempfindlich sein können.

Die erfindungsgemäße Reagenzmischung und das erfindungsgemäße Verfahren eliminieren somit die Verwendung von Diäthylamin und die sich daraus ergebenden Probleme des störenden Geruches und

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BAD ORIGINAL

i.

die Gefahren, die mit dem niedrigen Flammpunkt des Diäthylamins verbunden sind. Darüberhinaus stellt die Erfindung ein Reagenz und eine Analysenmethode zur Verfügung, welche gegenüber geringfügigeren pH-Unterschieden, wie sie beispielsweise von Pipettierfehlern bei der Herstellung des Reagenzes herrühren, zur Verfügung. Schließlich ergibt die Erfindung eine verbesserte Empfindlichkeit gegenüber der Calciumkonzentration über den Bereich, der normalerweise bei Bestimmungen im menschlichen Serum vorliegt.

Bei der Herstellung des erfindungsgernäßen Reagenzes werden das Orthokresolphthalein-Komplexon, eine geeignete Säure, die Aminbase und gegebenenfalls Natrium- oder Kaliumcyanid, 8-Hydroxychinolin und ein wasserlösliches Netzmittel, z.B. ein äthoxylierter Fettalkohol oder ein Polysorbat in Wasser in ähnlichen Verhältnismengen und in ähnlicher Weise aufgelöst, wie sie bei der Herstellung der bekannten Orthokresolphthalein-Komplexon-Reagentien angewendet werden, mit der Ausnahme, daß als Aminbase ein Aminoniedrigalkanol verwendet wird und daß der pH-Wert des Endreagenzes sich in dem oben genannten Bereich befindet. Bei einer zweckmäßigen Ausführungsform wird die Reagenzmischung hergestellt, indem getrennt ein saures Farbreagenz, das das Orthokresolphthalein-Komplexon und die Säure enthält und ein alkalisches Reagenz, das das Aminoniedrigalkanol enthält, bereitet werden. Das saure Farbreagenz und das alkalische Reagenz werden zusammengemischt, wodurch die fertige Mischung mit dem erforderlichen pH-Wert erhalten wird.

In dem sauren Farbreagenz werden das Orthokresolphthalein-Komplexon und der Bestandteil im allgemeinen in Mengen von etwa o,ol bis etwa o,oj5 bis etwa o,o7 bis etwa o,l g/l und das 8-Chinolinol in einer Konzentration von O bis etwa 5 g/l verwendet. Ein Netzmittel (z.B. ein Polyoxyäthylen-Lauryläther, wie er unter dem Warenzeichen Brij vertrieben wird) wird in einer Konzentration von etwa o,5 bis etwa 5 g/l verwendet. Weiterhin wird eine Säure,

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die mit den anderen Bestandteilen verträglich ist und die die Farbreaktion nicht stört, in einer genügenden Menge verwendet, daß eine Säurenormalität von etwa o,l bis etwa o,5 normal erzielt wird. Das äLkalische Reagenz wird getrennt zubereitet, daß es etwa Jo bis etwa 15o g Aminoniedrigalkanol pro Liter enthält. Es kann auch etwa Io bis etwa 1 g Alkalimetallcyanid pro Liter enthalten. Die 2 wässrigen Reagentien können als solche gelagert werden oder in Ampullen oder Cuvetten abgefüllt werden, um in Standardeinheiten vor der Verwendung gelagert zu werden. Beim Gebrauch werden das Farbreagenz und das alkalische Reagenz in solchen Verhältnismengen miteinander vermischt, daß ein alkalischer pH-Wert von etwa lo,l bis etwa lo,7 in dem Endgemisch mit der biologischen Flüssigkeit erhalten wird.

Die exakten relativen Verhältnismengen des Orthokresolphthalein-Komplexons, der Säure, des Aminoniedrigalkanols und des Netzmittels und der (wenn verwendet) anderen Bestandteile in der fertigen Reagenzmischung sowie die Parameter der Analysenmethode, z.B. die relativen Verhältnismengen des Parbreagenzes, des alkalischen Reagenzes und des Standards oder- der Probe, des pH-Wertes, der Wellenlänge des Lichtes, bei welcher die Farbintensität gemessen wird und dergleichen werden auf die übliche Weise ermittelt. Eine bevorzugte Farbreagenzmischung enthält etwa o,o25 bis o,l g Orthokresolphthalein-Komplexon, etwa 1 bis etwa 5 g 8-Chinolinol und etwa o,5 bis 2,5 g Netzmittel pro Liter der wässrigen Salzsäure, die etwa o.,2 bis o,3 normal ist. Ein bevorzugtes alkalisches Reagenz enthält etwa 4o bis etwa 12o g Aminoniedrigalkanol und etwa o,o5 bis etwa o,25 g Kaliumcyanid pro Liter Wasser. Diese beiden Mischungen werden in ungefähr gleichen Verhältnismengen vermischt, wodurch die fertige Reagenzmischung gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird.

Eine bevorzugte fertige bzw. Endmischung enthält etwa o,ol2 bis etwa o, 5 g Orthokresolphthalein-Komplexon^ etwa 2o bis etwa "*6o g Aminoniedrigalkanol pro Liter in wässriger Salzsäure mit einer

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Normalität von etwa o,l bis etwa o,2 normal. Die bevorzugte fertige bzw. Endmischung enthält auch etwa o,5 bis 2,5 g 8-Chinolinol und o,o25 bis o,125 g Kaliumcyanid pro Liter. Diese Mischung wird vorzugsweise bei der Calciumbestimmung in der Weise verwendet, daß man ein Volumenteil einer biologischen Flüssigkeitsprobe, einer Standardlösung oder eines Kontrollserums mit etwa 5o bis 3oo Volumenteilen der fertigen Reagenzmischung vermischt und daß man das Gemisch über eine genügende Zeitspanne stehenläßt, daß eine in geeigneter Weise meßbare Färbung entwickelt wird. Sehr gute Ergebnisse können bei Umgebungstemperatur in 2 bis Io Minuten erhalten werden.

Die resultierende rote Färbung wird sodann In einem Spektrophotometer oder einem Kolorimeter gemessen oder mit visuellen Standardproben verglichen, um eine Messung der Calciumkonzentration vorzunehmen. Die Farbintensität wird vorzugsweise in einem Spectrophotometer oder Kolorimeter mit Licht einer Wellenlänge

von 5^o bis 580 m /a (Nanometer) gemessen. · Die Erfindung wird In den Beispielen erläutert. Beispiel 1;

Es wird eine Calcium-Reagenzmisehung hergestellt, indem die folgenden Bestandteile in den angegebenen Verhältnismengen zusammengemischt werden:

Saures Farbreagenz - Orthokresolphthalein-Komplexon in

o,25 η Salzsäure

8-Kresolphthalein-Komplexon 50 mg

Salzsäure {yj% in Wasser) 21,ο ml

8-Hydroxychinolin 2,5 g

wässrige jjo#-ige Netzmittellösung

(Brij-35) l,o ml

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Destilliertes Wasser · * auf 1 1 Alkalisches Reagenz

2-A'thylaminoäthanol ■ 6o,o g

Kaliumcyanid o,125 g

Destilliertes Wasser . auf 1 1

Von jeder Mischung werden 2 ml jeweils in Io Ampullen gegeben und gut durchgemischt. 7 Ampullen werden zur Bestimmung von Calcium in einem Kontrollserum mit einer angegebenen Calciumkonzentration von 4,5 bis 4,9 Milliäquivalenten (mSq) Calcium pro Liter verwendet. Zwei Ampullen werden als Standardwerte mit einer Standardlösung von Calciumcarbonat in wässrigerΌ,öl η Salzsäure, die 5 m&q Calcium pro Liter enthält,- verwendet. 5o Mikroliter der entsprechenden Flüssigkeit (des Kontrollserums oder der Standardlösung) werden sodann in jede Ampulle gegeben und die Bestandteile werden durchgemischt. Den Bestandteilen 1 Ampulle werden 5o Mikroliter destüLiertes Wasser zugesetzt, um als Leer-probe zu dienen. Nach einer 5-minütigen Farbentwicklung bei Raumtemperatur (etwa 25°C)" wird die Intensität der roten Färbung in jeder Ampulle sodann durch Messung der Absorption bei 565 nm unter Verwendung eines photoelektrischen Kolorimeters bestimmt, (das Instrument wird zuvor unter Verwendung von destilliertem Wasser auf eine Absorption von 0 eingestellt). Der.Calciumgehalt der Kontrollserumprobe wird für jede Ampulle errechnet, indem die Differenz zwischen der mit einer Kontrollserum-Ampulle (Probe) gemessenen Absorption und der Leerampulle durch die Differenz zwischen der mittleren Absorption, gemessen mit den zwei Standard-Lösungsampullen und der Leerampulle dividiert wird und der Quotient mit einem Faktor multipliziert wird (der Faktor wird durch den Calciumgehalt der verwendeten Standardlösung bestimmt. In diesem Fall ist der Faktor 5· Die erhaltenen Ergebnisse werden in Milliäquivalenten Calcium pro Liter Serum ausgedrückt).

Bei diesen Maßnahmen ist die Absorption mal loo (A χ loo), ge-

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messen mit der Leerprobe 12,7·· Die mittlere A χ loo mit der Standardlösung ist 46,75· Die bei den einzelnen sieben Kontrollserumbestimmungen erhaltenen Calciumkonzentrationen sind 4,6, 4,6, 4,7, 4,6, 4,6, 4,7 und 4,6.

Beispiel 2?

In ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 werden 2 Reihen von Reagenzmischungen hergestellt. Bei der ersten Reihe ist das verwendete alkalische Reagenz ähnlich dem des Beispiels 1, mit der Ausnahme, daß Diäthylamin (mit einem pK-Wert von etwa lo,9) als Aminbase verwendet wird.

Bei der zweiten Reihe wird bei verschiedenen Konzentrationen die Aminbase 2-Ä'thylaminoäthanol (mit einem pK-Wert von etwa 9,9) verwendet. Der pH-Wert der Reagenzmischungen wird bestimmt und die Mischungen werden sodann mit 5o Mikroliter einer Calciums tandard-Lösung des Beispiels 1 oder mit destilliertem Wasser (Leerprobe) vermischt. Sodann wird die Absorption wie im Beispiel 1 bestimmt.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Mischungen, die Diäthylamin als Aminbase enthalten, gegenüber der Aminbasen-Konzentration extrem empfindlich sind. Die Mischungen, die aus alkalischen Reagentien hergestellt sind, die J5,o bis 5* ο nil Diäthylamin pro loo ml enthalten (^,ο bis 5>o Vol.-$) haben pH-Werte von etwa 9*82 bis 9*92 bei einem Gehalt von J% bis zu Il,o3 bis 11,o4 bei einem Gehalt von 5$. Es zeigt sich auch, daß die Leerabsorption in unerwünschter Weise mit der Konzentration der Aminbase von A χ loo von etwa 8,4 bis 8,8 bei einem Gehalt von J>% bis auf 11,1 bis 11,6 bei einem Gehalt von 3,25 von Ij5,8 bei einem Gehalt von 3,75 und bis zu einem unerwünscht hohen Leerwert von 19,3 bis 2o,o bei einem Gehalt von 5# zunimmt. Die Standardabsorption und die korrigierte Absorption (Standard- ■ probe minus Leerprobe) nimmt ebenfalls ausgeprägt mit geringen

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Zunahmen der A'thylamin-Konzentratlon zu. Die Standardabsorption (A χ loo) steigt von 2J,o bis 29*1 auf j6,ο an. Die korrigierte Absorption steigt von 18,6 bis 2o,3 auf 56,0 bis 56,7 an, wenn der Diäthylamingehalt von ~5,o bis 5*0/» ansteigt.

Demgegenüber zeigt sich,' daß die erfindungsgemäßen Reagenzmischungen, die mit alkalischen Reagentien hergestellt werden, welche 5>o bis lo,o g 2-Ä'thylaminoäthanol je loo ml enthalten (5,0 bis lo,0% £Gew./Vol.] ) gegenüber Veränderungen des Amingehaltes erheblich weniger empfindlich sind. Der pH-Wert bei einem Gehalt von 5*o$ beträgt lo,17 bis Io,l8 und nimmt bei einem Gehalt von lo,o$ auf lo,62 bis 10,63 zu. Die Leer-, Standard- und korrigierte Absorption χ loo bei einem Amingehalt von 5ofo sind lo,o bis lo,2, 38,9 bis 39,0 und 28,8 bis 28,9. Bei Mischungen, die lo,oj£ (Gew./Vol.) 2-Ä'thylaminoäthanol enthalten, sind die entsprechenden Ergebnisse11,5 bis 12,o, 52,2 bis 52,5 und 4o,5 bis 4o,7.

Bei einer ähnlichen Verfahrensweise werden alkalische Reagentien, die entweder Diäthylamin in einer Konzentration von J52,5 ml pro Liter oder 2-A'thylaminoäthanol in einer Konzentration von βο g/l enthalten, hergestellt. Die alkalischen Reagenzmischungen werden mit einer Farbreagenzmischung gemäß Beispiel 1 eingesetzt, um die Variierungen der Leerabsorption zu ermitteln, die von Pipettierfehlern herrühren könnten. 50 ml destilliertes. Wasser werden als Leerprobe verwendet. Es werden 2 ml des Farbreagenzes eingesetzt. Verschiedene Menge des alkalischen Reagenzes werden in Teilmengen von o,l ml dazu verwendet, um Pipettierfehler zu simulieren. Nachstehend ist a±e mittlere Leerabsorption χ loo, die mit jedem Reagenz erhalten wird, angegeben;

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Io -

- Io -

Mililiter alkalisches Absorption χ loo

Reagenz Diäthylamin 2-Ä*thylaminoäthanol

11,25 11,05 11,15 lo,95 lo,9

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß geringe Pipettierfehler, die mit dem Diäthylamin-Reagens erhaltenen Ergebnisse erheblieh verändern können, während das 2-Äthylaminoäthanol-Reagenz gegenüber solchen geringfügigen Fehlern relativ unempfindlich ist.

Beispiel 3;

1,8	7,65
1,9	9,55
2,o	Ιο,8
2,1	11,7
2,2	1ο,ο5

Bei einer ähnlichen Verfahrensweise wird eine Reihe von Reagenzmischungen unter Verwendung von unterschiedlichen Mengen von unterschiedlichen Aminbasen in dem alkalischen Reagenz bereitet. 2 ml des alkalischen Reagenzes werden jeweils mit 2 ml eines Orthokresolphthalein-Komplexon-Reagenzes vermischt, um eine Reihe von Calciumreagenz-Mischlingen (nach der Arbeitsweise des Beispiels 1) herzustellen. Die fertigen Reagentien werden sodann mit 5o Mikroliter destilliertem Wasser oder einer Calciumstandardlösung, die 5 mÄq Calcium pro Liter enthält, vermischt. Die Farbe wird wie oben beschrieben entwickelt. Auch die Messung erfolgt wie oben beschrieben. In der nachfolgenden Zusammenstellung sind die verwendeten Aminbasen, die Konzentration der Basen in dem alkalischen Reagenz (ausgedrückt in g/l), die pH-Werte der resultierenden Mischungen und, die Leer- und korrigierten Standardabsorptionswerte zusammengestellt.

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Amin in pK-Wert Konzentration · Absorption χ loo'

dem alka- des Amins (g/1) pH Leerprobe korrigierter Iisehen · Standard

Reagenz

2-A'thyl- aminoäthanol	9,9	6o,o	lo,36	11,3	33,2
2-Me thy1- aminoäthanol	9,6	6o,o	lo,37	12,4	35,1
5-Amino-l- propanol	9,4	4o,o	lo,32	13,9	33,3
2-Amino- äthanol	9,4	loo	lo.U	12,9	35,1
2-Amino-2- methyl-1- propanol	9,3	loo	lo,42	11,7	32,3
2-Dimethyl- aminoäthanol	9,2	15o	lo,24	7,3	2o,7

Weiterhin werden die Reagenzmisehung und die Methode des Beispiels 1 in einer Standardreihenfolge von Tests zur Analyse des Calciums in menschlichem Serum verwendet. Es zeigt sich, daß das Reagenz und die Methode der vorliegenden Erfindung bei CaI-ciumkonzentrationen von bis zu Io mSq pro Liter (normale Werte beim Erwachsenen sind etwa 4,6 bis 5,6 mitq pro Liter) lineare Ergebnisse ergeben. Das Reagenz und die Methode sind durch Störungen durch Bilirubin bis zu 2o mg pro loo ml,durch Phosphat bis zu mindestens 4o mg pro loo ml,durch Magnesium bis zu der Io-fachen normalen Mengen und durch Hämoglobin (in hämolysiertem Serum) von bis zu 15ö mg pro loo ml frei.

Bei der Anwendung der Erfindung können naturgemäß Variierungen der Konzentration des Orthokresolöfchalein-Komplexons und der Mengen und der Natur der anderen Bestandteile erfolgen, um das erfindungsgemäße Reagenz bzw. die erfindungsgemäße Analysenmethode an besondere analytische Systeme anzupassen. Weiterhin kann im Rahmen der Erfindung die Reihenfolge der Vermischung der Bestandteile und der Proben variiert werden.

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Claims

Patentansprüche

Reagenzmischung zur Bestimmung von Calcium in biologischen Flüssigkeiten durch Messung der Farbintensität, die durch Orthokresolphthalein-Komplexon in einer wässrigen alkalischen Pufferlösung gebildet wird, aus einer Lösung von Orthokresolphthalein-Komplexon in einem wässrigen alkalischen Aminbasen-Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminbase ein Aminoniedrigalkanol mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen, welches einen pK-Wert von etwa 9,J> bis etwa Io aufweist, ist unc daß die Reagenzmischung einen pH-Wert von etwa lo,1 bis etwa lo,7 hat. , '
2. Reagenzmischung nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das Aminoniedrigalkanol 2-A'thylaminoäthc-]
J. Reagenzmischung nach Anspruch 2, dadurch g e k e η η zeichnet, daß der Puffer 2-A'thylaminoäthanol in einer Konzentration von etwa 2o bis etwa 6o g/l in wässriger Salzsäure mit einer Normalität von etwa o,l bis etwa o,2 η ist.
4. Reagenzmischung nach Anspruch 1, dadurch g e k e η r_; zeichnet, daß der pH-Wert etwa lo,;5 bis etwa lo,5 ist.
5. Verfahren zur Bestimmung von Calcium, bei welchem vorbestimmte Mengen einer biologischen Flüssigkeit, Orthokreso'¹ phthalein-Komplexon als wesentliches farbbildendes Reagenz und ein alkalischer Puffer, der eine Arninbase enthält, vermischt werden, das Gemisch über eine vorbestimmte Zeitspanne bei vor'; stimmten Bedingungen der Temperatur inkubiert wird und.die Ir.: si tat der resultierenden Farbe gemessen wird, dadurch g e -

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kennzeichnet , daß'man als Aminba.se einen Aminoniedrig-alkanol mit J5 oder 4 Kohlenstoffatomen, welche einen pK-Wert von etwa 9*3 bis etwa Io besitzt, verwendet und daß man die Bestandteile miteinander in solchen Verliältnismengen vermischt, die ausreichend sind, daß der fertigen Mischung bzw. der Endmischung ein pH-Wert von etwa. lo,l bis etwa lo,7 verliehen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, daß man als biologische Flüssigkeit menschliches Blutserum verwendet und daß man als Aminbase 2-Äthylaminoäthanol einsetzt.
7. Verfahren nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Viert der fertigen Mischung bzw. der Endmischung etwa lo,l bis etwa lo,7 beträgt.
8. · Verfahren nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, daß man das Vermischen vornimmt, indem man eine geringere Menge des menschlichen Blutserums direkt mit einer Reagenzmischung, die genügend Orthokresolphthalein-Komplexon, um mit dem Calcium in dem Serum eine meßbare Farbe zu bilden, enthält, in einer wässrigen Pufferlösung von 2-Ä'thylaminoäthanol in wässriger Salzsäure vermischt, xs'obei die Reagenzmischung einen alkalischen pH-Wert von etwa lo,l bis etwa lo,7 besitzt und wobei die Inkubierung bei Raumtemperatur etwa 2 bis etwa Io Minuten erfolgt.

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