DE2725961A1

DE2725961A1 - Reagens fuer untersuchung auf protein und verfahren zur untersuchung auf protein

Info

Publication number: DE2725961A1
Application number: DE19772725961
Authority: DE
Inventors: Marion M Bradford; William L Williams
Original assignee: University of Georgia
Current assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 1976-06-10
Filing date: 1977-06-08
Publication date: 1977-12-22
Also published as: JPS5325490A; CA1066176A; US4023933A; GB1577376A

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagens für Untersuchung auf Protein und Verfahren zur Untersuchung auf Protein, d.h. den Nachweis und die quantitative Messung von Proteinen.

Es sind bereits mehrere Methoden zum Nachweis der Anwesenheit von Protein in Proben bekannt. Diese umfassen die klassische Lowry-Methode (Lowry, Oh.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. und Randall R.J., J. Biol. Chem. Λ^Ι (1951) S. 265-275) und die Biuret-Methode (Mokrasch, L.G. und McGilvery, R.W., J. Biol. Chem. 221 (1956) S. 909-917), welche jedoch den Nachteil aufweisen, daß sie durch zahlreiche, üblicherweise in Protein enthaltenden Lösungen vorhandene Produkte gestört werden. Darüber hinaus sind modifizierte Arbeitsweisen zur Ausschaltung solcher Nachteile ebenfalls unvorteilhaft, da sie kompliziert und zeitraubend sind.

Eine weitere, allgemeine Technik zur Proteinanalyse umfaßt den Nachweis einer Farbänderung, die auftritt, wenn ein Farbstoff wie Orange G oder Bromcresolgrün oder Bromcresolpurpur an ein Protein gebunden wird. Diese Methoden basieren auf dem Proteinfehlerphänomen, wodurch eine geeignete Pufferung des Farbstoff enthaltenden Reagens das Auftreten der normalerweise pH-empfindlichen Farbänderung des Farbstoffes bei der Bindung an das Protein ohne pH-Änderung ermöglicht. Diese Methoden sind ziemlich unempfindlich, wobei Mengen von Milligramm bis Gramm an Proteinen nachgewiesen werden und sie sind nur bei einer beschränkten Anzahl von Proteinen anwendbar und typischerweise nur bei einem einzigen wie Albumin und sie sind nicht für die quantitative Proteinbestimmung in zahlreichen wichtigen, biologischen Flüssigkeiten wie Urin anwendbar. Darüber hinaus ist bei dieser Farbstoffbindungstechnik eine zufriedenstellende Empfindlichkeit nur durch Entfernung der Trübung aus dem Testgemisch erreichbar, z.B. durch Zugabe von grenzflächenaktiven Mitteln, siehe US-Patentschrift 3 884- 637t und/oder durch sequestrierende Mittel, siehe US-Patentschrift 3 872 272, um die Ausfällung des Komplexes

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aus Farbstoff/Protein zu verhindern. Es gibt zwar eine empfindlichere Farbstoffbindungstechnik, jedoch erfordert sie Ausfällung und Filtration und ist daher kompliziert und zeitraubend, siehe Schaffner, W. und Weissmann, C, Anal. Biochem. _5_6 (1973),

s. 502-514.

Die Bildung des Komplexes Farbstoff/Protein wird ebenfalls zum Färben von Proteinen in zur Elektrophorese verwendeten Gelen angewandt. Beispielsweise wurden hierfür der Farbstoff Coomassie Brilliant Blau G-250 in Perchlorsäurelösung verwendet, siehe Peisner, A.H. et al. Anal. Biochem. 64 (1975) S. 509-516. Jedoch umfassen diese Arbeitsweisen die Ausfällung des gefärbten Komplexes aus Protein/Farbstoff und sie sind bei der empfindlichen, quantitativen Analyse von Protein enthaltenden Lösungen, bei denen spektrophotometrische Einrichtungen im allgemeinen für die Messungen angewandt werden, nicht anwendbar. Es besteht daher die Notwendigkeit für eine empfindlichere und raschere Methode zur quantitativen Analyse von kleinen Mengen von Protein im «g-Bereich.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Reagens und eines Verfahrens zu seiner Anwendung bei der Untersuchung auf Protein, wobei das Verfahren π ehr empfindlich und rasch arbeiten soll und zur Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben eingesetzt werden kann. Weitere Aufgabe der Erfindung ist ein solches Reagens und ein Untersuchungsverfahren, welche bei zahlreichen unterschiedlichen Typen von Proteinen anwendbar sind, wobei das Reagens und das Verfahren nicht durch normalerweise in Protein enthaltenden Lösungen vorhandene Stoffe gestört wird.

Es wurde nun gefunden, daß die oben angegebene Aufgabe durch ein Reagens zur Verwendung bei einer Methode zur Proteinbestimmung gelöst werden kann, wobei dieses Reagens Coomassie Brilliant Blau und eine Säure mit einem pKa-Wert von 1 bis ?. enthält. Gemäß einer

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bevorzugten Ausführungsform enthält das Reagens weiterhin einen Alkohol, insbesondere Äthanol.

Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert; die einzelnen Figuren zeigen:

Fig. 1 die Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit einer Untersuchung auf Rinderserumalbumin durch die Protein-Farbstoff-Bindungsmethode gemäß der Erfindung;

Fig. 2 das Muster des Protein/Farbstoff-Bindungsansprechens gemäß der Erfindung für verschiedene Proteine;

Fig. 3 das Lowry-Ansprechmuster für verschiedene Proteine gemäß Stand der Technik;

Fig. 4 die Bildungsgeschwindigkeit und die Farbstabilität des Komplexes Protein-Farbstoff gemäß der Erfindung; und

Fig. 5 cLas Ansprechmuster für Rinderserumalbumin bei einer Mikrountersuchung gemäß der Erfindung.

Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.

Der aktive Bestandteil mit Farbänderung in dem erfindungsgemäßen Reagens ist der bekannte Farbstoff Coomassie Brilliant Blau G-250 mit der folgenden Formel:

CH₂-N —

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OC₀H.

Obwohl dieser Farbstoff in der Vergangenheit zum Färben von Proteinen bei der Elektrophorese durch Ausfällung des Komplexes Protein/Farbstoff, wie zuvor beschrieben, angewandt wurde, wurde er nicht für die quantitative Analyse von Proteinen in Lösung wegen des angenommenen Fehlens von Empfindlichkeit und wegen seiner Nichtgeeignetheit als Folge der Ausfällung des Komplexes Farbstoff/Protein verwendet. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Verwendung de3 zuvorgenannten Farbstoffes G-250 in dem geeigneten Säuremedium ein Reagens zur Untersuchung bzw. Bestimmung von Protein mit einer annähernd 100 mal größeren Empfindlichkeit als derjenigen der Biuret-Arbeitsweise und der konventionellen Farbstoffbindungsarbeitsweisen und mit einer etwa 3 bis 5 ^mal größeren als derjenigen der Lowry-Methode ergibt.

Der Säurebestandteil muß einen pKa-Wert von 0 bis 4- und vorzugsweise von 1 bis 2 aufweisen, und die entstandene, den Farbstoff enthaltende Lösung sollte einen pH-Wert von -1 bis 1 und vorzugsweise -0,5 bis 0,5 besitzen. Stark ionisierte Säuren wie Perchlorsäure, Chlorwasserstoffsäure und Schwefelsäure können in dem Reagens nicht verwendet werden. Geeignete Säuren umfassen Phosphorsäure oder andere Säuren mit einem pKa-Wert von 1 bis 2, welche keine Ausfällung von Protein ergeben. Typische Vertreter umfassen Perjodsäure, phosphorige Säure, Selensäure, schweflige Säure, Maleinsäure, Oxalsäure, die Dichloressigsäuren und dergleichen. Phosphorsäure ist besonders bevorzugt.

Der Farbstoff und die Säure können in einem beliebigen, wässrigen Medium, das keine grenzflächenaktiven Stoffe, Detergentien oder übermäßig starkes Alkali enthält, und vorzugnweise in Wasser aufgelöst werden. Die Endkonzentration des Farbstoffes G-250 in dem Reagens sollte von 0,001 bis 0,1 Gew./Vo1.-% und vorzugsweise von 0,005 bis 0,05 Gew./Vol.-% betragen, während diejenige der Säure von 4 bis 12 Vol./Vol.-% und vorzugsweise von 7,5 bis 9,5 Vol./Vol.-% betragen sollte. Die Reihenfolge der Zugabe des

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Farbstoffes und der Säure ist unerheblich, und beide können direkt zu dem wässrigen Medium zugesetzt werden oder sie können zu getrennten Portionen des Mediums zugesetzt und danach vermischt werden.

Wie bereits zuvor beschrieben, werden bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Reagens zur Untersuchung auf Protein Empfindlichkeiten bis zum 100-fachen derjenigen beobachtet, welche unter Verwendung von konventionellen Arbeitsweisen erhalten wurden. Obwohl dies einen großen Fortschritt selbst gegenüber der Lowry-Methode darstellt, isb eine schwache Trübung, wahrscheinlich als Folge der Bildung des Komplexes Farbstoff/Protein vorhanden. Es wurde jedoch überraschenderweise gefunden, daß die Zugabe eines Alkohols, eines an sich bekannten Denaturierungsmittels für Proteine, d.h. eines Mittels, das zur Insolubilisierung von Proteinen verwendet wird (siehe z.B. die zuvor angegebene Literaturstelle von Reisner), verwendet werden kann, um diese Trübung durch Solubilisierung des entstandenen Komplexes aus Farbstoff/Protein zu entfernen. Als Ergebnis hiervon wird eine annähernde Verdopplung der Empfindlichkeit des Reagens erreicht. Geeignete Alkohole umfassen Methanol, Äthanol und Propanol. Andere geeignete Alkohole sind solche mit guter Wasserlöslichkeit, welche kein Verhalten als Detergentien zeigen. Besonders bevorzugt ist Äthanol. Die Konzentration des Alkohols soll von 0,1 bis 10 Vol./Vol.-% und vorzugsweise von ¹V bis 5 Vol./Vol.-# für die angegebenen Konzentrationen von Farbstoff und Säure betragen.

Eine besonders einzigartige Eigenschaft des erfindungsgemäßen Reagens ist seine Anwendbarkeit auf einen breiten Umfang von unterschiedlichen Arten von Proteinen. Während die meisten Proteinreagentien nur für ein Protein oder unter Umständen für wenige verschiedene Proteine verwendet werden können, zeigt das erfindungsgemäße Reagens seine überlegene Empfindlichkeit

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gegenüber allen untersuchten Seruraproteinen einschließlich Albumin, Globulin, Hämoglobin, Chymotrypsinogen A, Cytochrora C und dergleichen.

Ein weiteres vorragendes Merkmal des erfindungsgemäßen Reagens ist die kleine Menge, die für eine Untersuchung bzw. Bestimmung erforderlich ist. Im Gegensatz zu den annähernd 10 ml, die für eine konventionelle Untersuchung von 0 bis 0,2 ml Probe, welche von 0 bis 200 ng Protein bei der Lowry-Methode oder 0-10 mg für die Biuret-Methode enthalten, erfordert die Erfindung lediglich 1 bis 5 nl eines Reagens, das wie zuvor beschrieben angesetzt ist. Im allgemeinen sollten 0,1 bis 1 ml erfindungsgemäßes Reagens für Jeweils 0 bis 25 Aig Protein in der Probe verwendet werden. Vorzugsweise sollten von 3 his 5 ml des erfindungsgemäßen Reagens, die von 0,005 bis 0,05 Gew./Vol.-% Farbstoff enthalten, für Mengen von 0 bis 200 η Protein in der Probe verwendet werden, und von 0,5 bis 1,5 ^ml des Reagens, welche die gleiche Farbstoffkonzentration enthalten, sollten für 0 bis 10 ug Protein in einer Probe verwendet v/erden.

Weitere wesentliche Vorteile ergeben sich daraus, daß das Reagens stabil ist, und - wie in Beispiel 5 gezeigt -keiner Störung durch eine große Anzahl von üblicherweise in Protein enthaltenden Proben vorliegenden Stoffen ausgesetzt ist. Wie hieraus ersichtlich, besitzen nur Detergentien einen nennenswerten Effekt. Darüber hinaus ist der Zeitpunkt der Messungen nicht kritisch, da die Farbstabilität des KomDlexes aus Protein/ Farbstoff sehr hoch ist, wie ebenfalls in den Beispielen gezeigt.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Zugabe des Reagens zu einer Protein enthaltenden Probe oder umgekehrt. Der Nachweis des Proteins wird durch überwachung der Zunahme der Extinktion bei 595 nm als Folge der Bildung des Komplexes Farbstoff/Protein unter Anwendung einer üblichen Instrumentierung

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wie eines UV-Spektrophotometers (Bausch und Lomb, Modell Spectronic 200) oder eines beliebigen Kolorimeters, das zur Messung der Strahlung einer Wellenlänge im Bereich von 570 bis 620 nm in der lage ist, durchgeführt. Die Menge an Protein wird durch Vergleich mit vorher aufgestellten Standardkurven oder Eichkurven bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgezeichnet reproduzierbar und genau, wie in den Beispielen gezeigt. Die Temperatur ist nicht kritisch. Typischerweise wird die Untersuchung bzw. Bestimmung bei Zimmertemperatur durchgeführt.

Wegen der hohen Empfindlichkeit ist das Reagens in der Lage, so geringe Proteinmengen wie annähernd 0,5 bis 1 ns, in 0_t1 ml der Probe nachzuweisen. Darüber hinaus beträgt die für solche genaue und empfindliche Bestimmungen erforderliche Zeitspanne weniger als etwa 2 Minuten pro Probe im Gegensatz zu 30-40 Minuten, die im allgemeinen für konventionelle Untersuchungen erforderlich sind. Als Folge hiervon kann das erfindungsgeraäße Verfahren leicht bei einer Automatisierung und Analyse einer großen Anzahl von Proben eingesetzt werden. Das System wurde automatisiert, wobei 0,005 ml Probe und 0,250 ml Reagens pro Bestimmung verwendet wurden. Die Standardabweichung von 135 Proben wurde mit + 0,6 % des Mittelwertes bestimmt.

Typische Anwendungen des erfindungsgemäßen Reagens und des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen den Nachweis von Protein in Urin, Serum, zerebrospinalen Flüssigkeiten, Lebensmitteln und beliebigen anderen, aus biologischen Stoffen stammenden Fluiden oder Extrakten. Von besonderer Wichtigkeit ist die Anwendbarkeit des Reagens auf den Nachweis von Protein in einer Urinumgebung. üblicherweise wird die quantitative Bestimmung von Protein in Urin sehr 3tark durch hierin enthaltene, biologische Stoffe gestört. Durch die Anwendung der Erfindung wird dieser Nachteil jedoch vermieden. Beispielsweise wurde die zuvor beschriebene, automatisierte Untersuchung unter Verwendung von Urin durchgeführt. 0,005 ml-Proben wurden bei der automatisierten Bestim-

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mung statt der bei einer konventionellen Bestimmung verwendeten 1,0 ml-Proben angewandt. Die Korrelationswerte der Ergebnisse der konventionellen Bestimmung mit der Farbsto.ffbindungsmethode gemäß der Erfindung waren unter Verwendung von Doppelproben gut. Darüber hinaus war die Reproduzierbarkeit der Farbstoffbindungsbestimmung wesentlich größer als diejenige der Standardmethoden. Da es derzeit keine zufriedenstellende Methode zur Bestimmung von Proteinen in Urin gibt (die Ergebnisse sind typischerweise nur auf + 5~5O % der wahren Werte genau), ist dies ein besonders hervorragendes Ergebnis. Weiterhin wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Verfahren für die Proteinbestimmung in Rückenmarksflüssigkeiten unter Verwendung von Proben von 2O-5O η der Rückenmarksflüssigkeit gut arbeitet, dies im Vergleich zu den Proben von 0,5 bis 1 ml Rückenraarksflüssigkeit, die bei konventionellen Bestimmungsmethoden erforderlich sind. Darüber hinaus war die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Bestimmung bei diesen Untersuchungen sehr hoch. Daher ist dies zusammen mit der Anwendbarkeit zur Urinanalyse ein beträchtlicher Vorteil, da konventionelle Proteinbestimmungen in Spinalfluiden den Nachteil eines Fehlens von Empfindlichkeit aufweisen. Hinsichtlich eines Vergleiches der Ergebnisse gemäß der Erfindung bei der Anwendung zur Proteinbestimmung in Urin und zerebrospinaler Flüssigkeit mit der konventionellen Bestimmung über Trübungsmessung wird auf Beispiel 6 verwiesen.

Als Mechanismus für die Reaktion des Proteinreagens mit Protein und der erhaltenen Farbänderung kann die folgende Theorie postuliert werden. Der Farbstoff, Coomassie Brilliant Blau G-25O existiert in zwei unterschiedlichen Farbformen, nämlich rot und blau. Die blaue Form des Farbstoffes ist in neutraler und alkalischer Lösung vorhanden, während die rote Form in einer merklich sauren Lösung (pH - 0-1) vorliegt. Eine ähnliche Art von Säure-Base-reaktion ergibt sich, wenn Benzilsäure einer stark sauren Lösung ausgesetzt wirdj die normalerweise farblose Benzil-

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säure wird brilliantrot. Dies wurde der Bildung eines Carbanions an der organischen Säure zugeschrieben. Vielleicht liegt der gleiche Typ von Mechanismus für das normalerweise blau gefärbte Coomassie Brilliant Blau G-250 vor. Unter dieser Annahme können die folgenden Angaben als Prinzip vorgeschlagen werden, auf welchen die Bestimmungsmethode beruht. Das Proteinreagens ist eine sorgfältig ausgeglichene Form des Farbstoffes, im wesentlichen in Gleichgewicht zwischen der roten und der blauen Form. Das Reagens ist etwas bräunlich im Aussehen. Wenn sich Protein an den Farbstoff bindet, wird der Farbstoff in eine unterschiedliche Mikrouragebung gebracht, so daß er vor dem sauren Medium, welches dem Farbstoff die rote Färbung erteilt, geschützt wird. Dies ist etwas gerechtfertigt, da ein wesentlicher Verlust an Empfindlichkeit der Bestimmung durch Steigerung der Stärke des Säureraediuras, in welchem das Reagens angesetzt wird, erfolgt. Der Komplex Protein/Farbstoff neigt zur Aggregation, wie dies in dem Beispiel hinsichtlich der Stabilität des Farbproduktes gezeigt wird. Die Anwesenheit der angegebenen Menge von Äthanol in dem Reagens besitzt die Neigung, den Komplex Protein/Farbstoff vor einer Aggregation für eine vernünftige Zeitspanne zu bewahren; Jedoch ergibt eine zu große Menge an Äthanol eine ausgeprägte Verschiebung zu der blauen Form, d.h. die Veränderung der Umgebung in eine weniger polare Umgebung. Daher kann postuliert werden, daß der Mechanismus der Untersuchung bzw. Bestimmung die Bindung einer Carbanionform des Farbstoffee an eine weniger polare Umgebung des Proteins ist. Dies erklärt ebenfalls vielleicht den Effekt von großen Mengen an Detergens und von Azeton auf die Untersuchung bzw. Bestimmung, da diese Verbindungen im allgemeinen nicht polar sind und die Neigung besitzen, die Umgebung des Farbstoffes zu verändern.

Abschließend sei darauf hingewiesen, daß der Mechanismus der Protein/Farbstoff-Farbänderung nicht derjenige des konventionellen Proteinfehlertyps von Farbstoffreagentien ist, siehe US-Patentschrift 2 897 058. Die Funktionen der Säure und der anderen Bestandteile wie der Alkohole in diesen Reagenzien haben

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keine Beziehung zu denjenigen der Inhaltsstoffe in dienern Reagens, d.h. sowohl die Zwecke als auch die Ergebnisse sind vollständig unterschiedlich.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen naher erläutert.

Die in den Beispielen verwendeten Materialien und Präparationen waren die folgenden:
Reagenzien

Der Farbstoff, Cooraassie Brilliant Blau G-25O wurde im Handel (Firma Sigma) bezogen und in dieser Form verwendet. 2-MercaPtoäthanol wurde ebenfalls als Handels produkt (Firma Sigma) verwendet. Die grenzflächenaktiven Substanzen waren ebenfalls handelsübliche Produkte, z.B. Triton X-100 von Schwartz/ Mann und Natriumdodecylsulfat von BDII Chemicals Ltd., Poole, England.

Hemosol war ebenfalls ein handelsübliches Produkt von Scientific Products. Alle anderen Reagenzien waren analysenrein oder von größter, erhältlicher Reinheit.
Proteinpräparation

Rinderserumalbumin (2 χ kristallisiert) Chymotrypsinogen Λ und Cytochrora C (Pferdeherz) waren handelsübliche Produkte (Firma Schwärtz/Mann). Hämoglobin und menschliches Serumalbumin waren ebenfalls handelsübliche Produkte (Firma Nutritional Biochemicals Corporation). Die Proteinlösungen wurden in 0,15 M NaCl hergestellt. Die Konzentrationen wurden für Rinderserumalbumin, menschliches Serumalbumin, Chymotrypsinogen A und Cytochrom C spektrophotometrisch in einem UV Spektrophotometer (Bausch und Lomb Spectronic 200), basierend auf den Literaturwerten für die Extinktionskoeffizienten von

/in/

^PRO ^{= 6}'⁶' 5i3* 20 bzw. 17,1 bestimmt. Die Hämoglobinlösungen wurden gravimetrisch hergestellt.

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Herstellung des Proteinreagens

100 mg des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blau G-250 wurden in 5° ml 95 tigern Äthanol aufgelöst. Zu diener Lönung wurden 100 ml 85 Gew./Gew.-#ige Phosphorsäure hinzugegeben. Die erhaltene Lösung wurde auf ein Endvoluraen von 1 1 verdünnt. Die Endkonzentrationen im Reagens waren 0,01 Gew./Vol.-% des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blau G-250, 4,7 Vol./Vol.-% Äthanol und 8,5 Vol./Vo1.-^ Phosphorsäure.

Proteinbestimmunp; (Standardmethode)

Proteinlösung, die von 1Ö bis 100 /ug Protein in einem Volumen von bis zu 0,1 ml enthielt, wurde in 12 χ 100 mm Reagenzgläser pipettiert. Da3 Volumen im Reagenzglas wurde auf 0,1 ml mit einem geeigneten Puffer gebracht. 5 ml des Proteinreagens wurden in das Reagenzglas zugegeben, und der Inhalt wurde entweder durch Drehen oder Schleudern vermischt. Die Extinktion bei 595 nrn wurde nach 2 Minuten und vor 1 Stunde in 3 nil Küvetten gegenüber einer Reagensblindprobe, die aus 0,1 ml des geeigneten Puffers und 5 ml des Proteinreagens hergestellt worden war, gemessen. Das Gewicht des Proteins wurde gegenüber der entsprechenden Extinktion aufgetragen, was eine Standardkurve bzw. Eichkurve ergab, die zur Bestimmung des Proteins in nicht bekannten Proben verwendet wurde.

Mikropro te inbe s timmung

Proteinlösung, die von 1 bis 10 ug Protein in einem Volumen bis zu 0,1 ml enthielt, wurde in 12 χ 100 mm Reagenzgläser pipettiert. Das Volumen in den Reagenzgläsern wurde auf 0,1 ml mit dem geeigneten Puffer gebracht. 1 ml des Proteinreagens wurde in das Reagenzglas zugesetzt, und der Inhalt wurde wie bei der Standardmethode vermischt. Die Extinktion bei 595 nm wurde wie bei der Standardmethode, jedoch in 1 ml Küvetten gegenüber einer Reagensblindprobe, die aus 0,1 ml des geeigneten Puffers und 1 ml des Proteinreagens hergestellt worden war, gemessen. Die Standardkurven bzw. Eichkurven wurden angefertigt und wie bei der Standardmethode verwendet.

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Reinigung der Küvetten

Eine bei der Durchführung der Untersuchung bzw. Bestimmung beobachtete Schwierigkeit ist die Neigung des Komplexes aus Protein-Farbstoff in Lösung, an Quarzküvetten zu haften. Dies ergibt eine blau gefärbte Küvette. Bei Glasküvetten oder Kunststoffküvetten tritt dies nicht auf. Die Menge der Bindung ist insoweit vernachlässigbar, wie die Bestimmungsablesungen getroffen sind, d.h. weniger als 1 % Fehler, wie durch die Standardabweichung von Dreifachversuchen in dem Beispiel hinsichtlich der Reproduzierbarkeit angegeben ist. Das Ausmaß der Blaufärbung der Küvetten nach der Bestimmung ergibt jedoch Probiere bei anderen Verwendungen der Küvetten, so daß die folgenden Maßregeln zur Reinigung der Küvetten von dem blauen Komplex befolgt werden sollten;
Methode Λ'· Die Küvetten werden mit konzentriertem Detergens für Glaswaren gespült, anschließend mit Wasser und Azeton gespült, was eine sofortige Entfernung ergibt;

Methode 2: Die Küvetten werden in 0,1 M HGl eingeweicht, was den Komplex in wenigen Stunden entfernt.

Beispiel 1

Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit und Linearität der Bestimmung

Dreifachbestimraungen von Rinderserumalbumin als Standard ergaben die in der Fig. 1 dargestellte Kurve. Wie aus dem Diagramm ersichtlich, ist die Bestimmung vollständig reproduzierbar. Die statistische Analyse ergab eine Standardabweichung von 1,2 % des Mittelwertes für die Bestimmung. Das Diagramm zeigt ebenfalls, daß eine extreme Empfindlichkeit bei der Bestimmung gegeben ist, wobei eine 25 Jug Probe eine Extinktionsänderung von 0,275 OD-Einheiten ergibt. Die3 entspricht 5 lag Protein/ml in den endgültigen Bestimmungsvolumen. Das Bestimmungssystera hat ein nichtlineares Ansprechen, wie aus dem Diagramm ersichtlich ist. Die Ursache für die Nichtlinearität int das Reagens selbst,

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da es eine Überlappung im Spektrum der zwei unterschiedlichen Farbformen des Farbstoffes gibt. Der Untergrundwert für das Reagens nimmt kontinuierlich ab, ₍je mehr Farbstoff an das Protein gebunden ist. Dies stellt jedoch kein wirtliches Problem bei der Praxis dar, da das Ausmaß der Krümmung nur schwach ist. Falls die Untersuchung bzw. Bestimmung mit einem Satz von Eichpräparaten durchgeführt wird, und die nichtbekannten Proben gegen die Ansnrechkurve der Standardproben gemessen und nicht nach dem Beer'sehen Gesetz berechnet werden, ergibt sich keine Schwierigkeit bei der Erzielung von ausgezeichnet zufriedenstellenden Ergebnissen.

Beispiel 2

Genauigkeit der Bestimmung

Die Fig. 2 zeigt die einzelnen Ansprechwerte von verschiedenen Proteinen, die in dem System untersucht wurden. Es gibt eine Streuung von Punkten rings um die in dem Diagramm gezogene Linie. Ea wird angenommen, daß die Streuung eine vielfachfacettierte Funktion wegen der Schwierigkeiten bei der Bestimmung der exakten Menge an in einer vorgegebenen Probe vorliegenden Protein wegen der Änderungen der Extinktionskoeffizienten in der Literatur, der zur Bestimmung der exakten Menge des bei der Messung der Extinktionskoeffizienten verwendeten Proteins und in einem gewissen Ausmaß der Veränderung der Leistungsfähigkeit der Farbstoffbindung an verschiedene Proteine, erhalten aus Lowry-Bestimmungen des gleichen Proteins, ist. Fig. 3 zeigt das Muster. Das Muster der Streuung im Ansprechen des Proteins bei der Lowr.y-Bestimraung ist ähnlich wie das für die hier wiedergegebene Bestimmung der Farbstoffbindung. Die Empfindlichkeit der Lowry-Methode ist eine Extinktion von 0,110 OD-Einheiten für den 25 ug-Standard, dies entspricht 8 ug Protein/ml Endvolumen bei der Bestimmung. Durch Berechnung ergibt sich, daß die Farbstoffbindungsbestimmung gemäß der Erfindung annähernd viermal empfindlicher als die Lowry-Bestimmung ist. Das Ausmaß der Streuung um die Auftragung bei der Lowry-Bestimmung zeigt

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ebenfalls die Schwierigkeit bei der Aufstellung einen quantitativen Wertes für ein Protein in einer Standardlösung.

Beispiel 5

Stabilität der Farbe des Protein-Farbstoff-komplexes

Die Fig. 4 zeigt die Geschwindigkeit der Bildung des Protein-Farbstoff-komplexes in dem Untersuchungssyntem und die Stabilität des Farbkomplexes. Die Extinktion wurde in Zeitintervallen von 7,5 Sekunden während 2 Minuten und dann in Zeitintervallen von 1 Minute während einer Zeitcoanne von einer Stunde überwacht. Wie sich aus dem Diagramm ergibt, ist die Farbstoffentwicklung im wesentlichen nach 2 Minuten vollständig und bleibt innerhalb eines Werten von plus oder minus 4- % für eine Zeitspanne von 1 Stunde stabil. Da der Protein-Farbstoffkomplex die Neigung besitzt, mit der Zeit zu aggregieren, tritt eine Abnahme der Färbung nach dieser Zeitspanne lediglich durch physikalische Entfernung des Protein-Farbstoff-komplexes aus der Lösung auf. Falls sehr präzise Bestimmungen gefordert werden, können Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um die Extinktion der Proben während eines der flacheren Abschnitte der Kurve der Farbstabilität zwischen 5 und 20 Minuten nach der Reagenszugabe abzulesen. Dies ergibt immer noch ausreichend Zeit, um eine relativ große Anzahl von Proben auszumessen.

Beispiel 4

Empfindlichkeit eines Mikrobestimmungssystems

Die Fig. 5 zeigt die Ergebnisse bei der Durchführung einer Mikrobestimmung unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard. Das Ausmaß der Krümmung ist ähnlich, wie es bei der Standardbestimmung gefunden wurde. Es gibt einen Verlust beim Ansprechen des Protein-Farbstoff-komplexes im Vergleich zu der Standardbestimmung, d.h. 5 /ig Protein/ml ergeben eine Extinktionsänderung von 0,1 gegenüber 0,27 bei der Standardbestiramung. Vielleicht ist dies eine Folge der zunehmenden Verdünnung des Proteinreagens.

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Beispiel 5

Störung durch Nicht-Proteinkomponenten

Wie in der Einführung ausgeführt, gibt en eine gewinne Störung in dem Untersuchungssystem durch .stark alkalische Pufferraittel. Dies kann dadurch vermieden werden, daß geeignete Pufferkontrollen durchgeführt werden und der Wert für die Kontrolle entweder mathematisch oder spektrophotometrisch abgezogen wird. Ein großes Spektrum von Komponenten wurde hinsichtlich der Einflüsse auf die Protein-Farbstoff-Bindungsbestimmung durchgeführt, wie in der Tabelle I gezeigt. Die Ergebnisse wurden so durchgeführt, daß die Standardbestimmung einschließlich 0,1 ml ,-jeder Substanz durchgeführt wurde.

Tabelle I

Einfluß von verschiedenen Laborreagenzien auf die Bestimmung von Farbstoff-Protein-Komnlex Farbstoff: Coomassie Brilliant Blau G-250

Substanz	Änderung in OD-Einheiten bei 595 nm	Äquivalent yug RSA⁺
1 M KGl	0,000	0,00
5 M NaCl	0,000	0,00
1 M MgCl_?	0,000	0,00
2 M Tris	0,026	2,34
0,1 M EDTA	0,004	0,36
1 M (NH₄)₂S0^	0,000	0,00
99 # Glycerin	0,012	1,08
1 M 2-Mercaptoäthanol	0,004	0,36
1 M Saccharose	0,013	1,17
95 # Äthanol	0,000	0,00
Azeton	0,069	6,21
5 # Phenol	0,046	4,14
0,1 % grenzflächenaktives (Triton X-100) 1 % grenzflächenaktives	Mittel 0,013 Mittel 0,590	1,17 53,10

(Triton X-100)
0,1 % Natriumdodecylsulfat 0,011 0,99

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_ _?Λ _ 2 7 2 5 96

Fortsetzung von Tabelle I:	0,495	44,55
1 % Natriuradodecylsulfat	0,004	0,30
0,1 % Heraoso 1	0,108	9,7*
1 # Hemosol

/ RSA = Rinderserumalbumin

Weiterhin wurde ein Fehlen eines Einflusses auf die Bestimmung durch Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Äthanol und Ammoniumsulfat beobachtet. Die geringen Effekte als Folge von Tris, Essigsäure, 2-MercaDtoäthanol, Saccharose, Glycerin, EDTA und Spurenmengen der grenzflächenaktiven Stoffe bzw. Detergentien Triton X-100, Natriumdodecylsulfat und Hämo3ol können leicht durch Durchführung der geeigneten Pufferkontrolle zusammen mit der Bestimmung ausgeschaltet werden.

Weiterhin wurde festgestellt, daß Bilirubin, das die konventionellen Bestimmungen über Trübungsmessungen ausgenrägt stört, sowie Harnstoff, Ammoniak und Harnsäure, welche die konventionelle Biuret-Bestimmung und die Lowry-Bestimraung stark stören, nur einen geringen oder gar keinen Effekt auf die Farbstoffbindungsbestiraraung gemäß der Erfindung besitzen. Die Anwesenheit von großen Mengen an Detergentien oder grenzflächenaktiven Mitteln sollte ,jedoch vermieden werden.

Beispiel 6

Ergebnisse der Proteinbestimmung bei zerebrospinaler Flüssigkeit und Urin

Bei der Untersuchung von zerebrospinaler Flüssigkeit auf Protein nach der standardmäßigen Bestimmungsmethode über Trübungsmessung und nach der Farbstoffbindungsmethode gemäß der Erfindung wurden praktisch identische Ergebnisse erzielt. Die Bestimmung über Trübungsmessung erfordert 0,5 bis 1,0 ml der zerebrospinalen Flüssigkeit, während die erfindungsgemäße Farbstoffbindungsbestimmung nur °,05 ug erfordert.

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Bei der Untersuchung von Urin auf Protein nach der standardmäßigen Bestimmung über Trübungsmessung und nach der erfindungsgemäßen Farbntoff-Bindungsbestimmung wurden vergleichbare Ergebnisse erhalten. Die Reproduzierbarkeit der Farbstoff-Bindungsbestimmung lag innerhalb der Standardabweichung von 1,2 #, wie in Beispiel 1 angegeben. Die Schwankung bei der turbidometrischen Bestimmung betrug 5 bis 50 % des Mittelwertes in Abhängigkeit von dem Bereich, in welchem die Bestimmung durchgeführt wurde.

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Le e r s e i t e

Claims

R. SPLANEMANN

DIPL.-INQ.
MÖNCHEN

PATENTS N rfV Ä L T E dr. B. REITZNER J. RICHTER

DIPL.-CHEM. DIPL.-ING.

F. WERDERMANN

DIPL.-ING.

HAMBURG

University of Georgia
Athens, Ga.
V.St.A.

Patentanmeldung

MÜNCHEN 2 Tal 13

Tclrlon (089I 22 62 07 / 22 62 09 Tel'-tii nm-vr ■ Invcntius Munrhen

8. Juni 1977

Un,c-.AHr, 48 1 'j - I - 1 0008

Ihr Zeichen ■

Reagens für Untersuchung auf Protein und Verfahren zur Untersuchung auf Protein

Patentansprüche :

1. Reagens zur Verwendung bei der Untersuchung auf Protein, dadurch gekennzeichnet , daß es den folgenden Farbstoff:

CH, CH,

SO₃Na

OC₂H₅

sowie eine Säure mit einem pKa-Wert von 0 bis A- enthält.

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ORIGINAL INSPECTED

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure einen pKa-Wert von 1 bis 2 besitzt.

3· Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure Phosphorsäure ist.

4. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der erhaltenen Lösung von -1 bis beträgt.

5· Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Farbstoffes von 0,001 bis 0,1 Gew./Vol.-% und die Konzentration der Säure von 4- bis 12 Vol./Vol.-% betragen.

6. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin einen Alkohol enthält.

7· Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es von 0 bis 10 Vol./Vol.-% des Alkohols enthält.

8. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol Äthanol ist.

9· Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es von 0,005 bis 0,05 Gew./Vol.-% des Farbstoffes, von 7,5 bis 9,5 Vol./Vol.-% Phosohorsäure und von 4 bis 5 Vol./Vol.-# Äthanol enthält.

10. Verfahren zur Untersuchung auf Protein, dadurch g e k e η η zeichnet , daß es das Vermischen eines Reagens, welches den folgenden Farbstoff:

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2/2596

CH₅ CH₃

CH₂-N —

OC₂H₅

und eine Säure mit einem nKa-Wert von O bis 4 enthält, und einer proteinhaltigen Probe und die Beobachtung der entstandenen Farbänderung umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 570 bis 620 nm überwacht wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß von 0,1 bis 1 ml des Reagens für bis zu 25.W Protein in der Probe zugesetzt werden.

13· Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus der aus Albumin, Hämoglobin, Globulin, Chymotrypsinogen A und Cytochrom C bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

14. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die das Protein enthaltende Probe Urin ist.

15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die das Protein enthaltende Probe Rückenmarksflüssigkeit ist.

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16. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure Phosphorsäure ist.

17» Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der entstandenen Lösung von -1 bis 1 beträgt.

18. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Farbstoffes von 0,001 bis 0,1 Gew./Vol.-!*» und die Konzentration der Säure von 4- bis 12 Vol./Vol.-% betragen.

19· Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens weiterhin einen Alkohol enthält.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens von 0 bis 10 Vol./Vol.-# des Alkohols enthält.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol Äthanol ist.

22. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine automatische Analysenvorrichtung verwendet wird.

23· Verfahren zur Untersuchung auf Protein, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reagens, welches von 0,005 bis 0,05 Gew./Vol.-% des folgenden Farbstoffs:

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CH, CH

CH₂-N —

SO-

0C₀H

von 7,5 bis 9,5 Vol./Vol.-# Phosphorsäure und von 4 bis 5 Vol./Vol.-;? Äthanol enbhält, und eine Protein enthaltende Probe gemischt werden und die erhaltene Farbänderung beobachtet wird.

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