DE60120257T2 - Verfahren zur Färbung, zum Nachweis und Zählen von Bakterien - Google Patents

Verfahren zur Färbung, zum Nachweis und Zählen von Bakterien Download PDF

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    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagens zum Färben von Bakterien in Urinproben und ein Verfahren zum Nachweis und Zählen von Bakterien in Urinproben unter Verwendung eines solchen Reagenzes.
  • Verwandter Stand der Technik
  • Die Zahl von Bakterien im Urin ist ein wichtige Parameter bei der klinischen Diagnose zur Bewertung der Gegenwart einer Infektion. Allgemein wird die Gegenwart von Bakterien mit 105 oder mehr/ml Urin als Kriterium für eine positive Harnleiterinfektion anerkannt. Wenn Urin Bakterien mit 103 oder mehr/ml enthält, wird er als kontaminierter Urin diagnostiziert (normale Bakterienflora), d.h. als negative Harnleiterinfektion. Wenn Bakterien mit ungefähr 104/ml beobachtet werden, wird die Diagnose umgekehrt, jedoch wird die Probe häufig nochmals untersucht.
  • Konventionell wurde die Beobachtung von Bakterien im Urin durch eine mikroskopische Überprüfung von Gram-gefärbten Bakterien, ungefärbten Bakterien ohne Gram-Färbungsbehandlung oder fluoreszenzgefärbten Bakterien durchgeführt.
  • Urin enthält häufig Kontaminanten wie z.B. Mukusfäden, Kristalle, amorphe Salze und Zellfragmente, die klinisch nicht signifikant sind. Diese Substanzen behindern die Messung von signifikanten Teilchen (insbesondere Bakterien), so daß es schwierig war, die Zahl der Bakterien akkurat zu zählen. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt gibt es kein Verfahren für eine genaue Auszählung von Bakterien mit ungefähr 104/ml.
  • Im Fall der Gram-Färbung werden Bakterien und Kontaminanten simultan gefärbt, so daß ein Zählverlust von Bakterien in geringer Zahl häufig in der mikroskopischen Überprüfung auftritt. Weiterhin beinhaltet die Gram-Färbung eine Anzahl von Färbeschritten und benötigt Zeit (ungefähr 15 Minuten), so daß die Arbeitseffizienz schlecht ist.
  • Die mikroskopische Überprüfung von Bakterien ohne eine Anfärbungsbehandlung kann schnell durchgeführt werden, kann jedoch nicht zwischen Bakterien unterscheiden, insbesondere wen Kokkenkontaminanten enthalten sind.
  • Die mikroskopische Überprüfung von fluoreszenzgefärbten Bakterien zeigt eine bessere Nachweisbarkeit als die oben erwähnten zwei Verfahren. Es wurde jedoch noch nicht etabliert, wie man andere Kontaminanten als Bakterien eliminieren und die Bakterien schnell anfärben kann.
  • Das Agarmediumverfahren, wobei es sich um ein Standardverfahren handelt, benötigt 16 Stunden oder mehr um die Bakterienzahl zu bestimmen, so daß es nicht als ein Schnellverfahren betrachtet werden kann.
  • US 4,622,298 und die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. Hei 9 (1997)-119926 schlagen jeweils ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien in fluoreszenzgefärbten Urinproben mit einem Flußzytometer vor. In den obigen Referenzen wird jedoch keine Überprüfung einer Probe einschließlich Kontaminanten durchgeführt.
  • Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. Hei 9 (1997)-329596 beschreibt eine Analyse von festen Komponenten im Urin, die schwierig voneinander zu unterscheiden sind. Bei diesem Verfahren wird eine Urinprobe mit einer wäßrigen Lösung behandelt, die ein Tensid enthält, und mit einem Flußzytometer überprüft. Es wird jedoch kein Verfahren einer Unterscheidung zwischen Bakterien und Kontaminanten beschrieben.
  • EP 0 841 403 offenbart ein Verfahren für eine Anfärbung und Messung der Zahl von Bakterien, wobei eine Probe mit einer Färbezusammensetzung vermischt wird, umfassend einen Farbstoff und ein Tensid, vorzugsweise ein nicht-ionisches Tensid. Diese Färbezusammensetzung muß auf einen pH von 4 bis 6 für Stabilitätszwecke eingestellt werden und wird auch in diesem Bereich eines pHs zur Anfärbung von Bakterien verwendet.
  • US 2002/168630 betrifft Verfahren und Kits zum Nachweis und Quantifizieren lebensfähiger Zellen, wie z.B. Bakterien, in einer Probe unter Verwendung fluoreszierender Farbstoffe, die im wesentlichen durch lebensfähige Zellen internalisiert werden können und Eigenschaften aufweisen, die meßbar verändert werden, wenn sie an Zielverbindungen anbinden. Die zu überprüfende Probe kann eine Körperflüssigkeit oder ein Nahrungsmittelprodukt sein. Unter den offenbarten Verfahrensschritten wird die Probe mit einem Mittel behandelt, das ein Zellmembraneigenschaft beeinflußt, wie z.B. einem Detergens.
  • US 5,798,221 betrifft ein Verfahren zum Konditionieren von Proben wie Milch oder Fleisch, enthaltend Fettkugeln und somatische Zellen und/oder Proteinteilchen, bevor sie einer Fluoreszenzmessung unterzogen werden, um den Bakteriengehalt zu bestimmen und ein Verfahren zur Durchführung der Bestimmung des Bakteriengehalts in solchen Proben. Das Verfahren umfaßt die Behandlung der ursprünglichen Probe mit einem Ionen-chelatisierenden Mittel, einem proleolytischen Enzym, einem Detergens und einem bakteriologisch spezifischen Fluorochrom. Der pH der Probe, die behandelt wird, wird vorzugsweise durch einen Puffer in einem Bereich von 6 bis 11 gehalten.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Reagens für die Anfärbung von Bakterien in Urinproben bereitzustellen, das einen schnellen und effizienten Nachweis von Bakterien ohne Durchführung einer Kultivierung ermöglicht, selbst wenn eine Probe Kontaminanten enthält.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Reagens zum Färben von Bakterien in einer Urinprobe bereit, umfassend eine wäßrige Lösung, die mit der Probe zu vermischen ist, enthaltend ein kationisches Tensid, um die Farbstofftransmissivität von Bakterien zu beschleunigen, ein anorganisches Salz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfat und Nitrat mit einem pH von 2,0 bis 4,5, und eine Färbelösung enthaltend einen Farbstoff zum Anfärben der Bakterien.
  • Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis und Zählen von Bakterien bereit, umfassend die folgenden Schritte:
    • (1) Vermischen einer Urinprobe mit dem Reagens wie oben beschrieben;
    • (2) Einführen der so behandelten Probe in einen Nachweisteil eines Flußzytometers und Bestrahlung der Zellen der gefärbten Bakterien eine nach der anderen mit Licht, um gestreutes Licht zu messen und fluoreszierendes Licht, das von jeder der Zellen emittiert wird; und
    • (3) Unterscheiden der Bakterien von anderen Komponenten gemäß einer Intensität des gestreuten Lichtsignals und einer Intensität eines fluoreszierenden Lichtsignals oder einer Pulsbreite, die die Länge von Teilchen reflektiert, um die Zahl der Bakterien zu zählen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine Grafik der Streuung einer fluoreszierenden Lichtintensität – eine Vorwärtsstreu-Lichtintensität, erhalten in dem Fall, in dem kultivierte E. coli in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung überprüft wurden;
  • 2 ist eine Grafik der Streuung einer fluoreszierenden Lichtintensität – eine Vorwärtsstreu-Lichtintensität, erhalten in dem Fall, in dem verschiedene kultivierte Bakterien in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung überprüft wurden;
  • 3 ist eine Grafik, die die Ergebnisse eines Verdünnungslinearitätstests illustriert, der in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird;
  • 4 ist eine Grafik, die die Korrelation zwischen Meßergebnissen gemäß der vorliegenden Erfindung und denjenigen einer CLED-Mediumskultivierung darstellt, erhalten in Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung; und
  • 5 ist eine Ansicht, die das Schema des Verfahrens des Nachweises von Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung illustriert.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • In der vorliegenden Erfindung ist die Urinprobe die zu überprüfende Probe im Hinblick auf die Gegenwart oder Abwesenheit von Bakterien und zum Zählen einer Zahl von Bakterien, wenn die Probe Bakterien enthält. Die hier in Bezug genommenen Bakterien beinhalten Bakterien, die in einer Urinprobe beobachtet werden, wie z.B. E. coli, Klebsiella sp. wie auch Staphylococcus sp. Pseudomonas sp., Serratia sp., Enterobacter sp., Enterococcus sp., Streptococcus sp. und Citrobacter sp. Die Probe kann mit gereinigtem Wasser oder ähnlichem um das 2- oder mehrfache, vorzugsweise 4- bis 15-fache, noch bevorzugter 5- bis 10-fache verdünnt sein.
  • Dem kationischen Tensid ist keine besondere Begrenzung auferlegt, jedoch wird vorzugsweise ein quaternäres Ammoniumsalz verwendet, repräsentiert durch die folgende Formel:
    Figure 00060001
    worin R1 eine C8-18-Alkylgruppe ist; R2, R3 und R4 sind dieselben oder unterschiedlich und zwar eine C1-3-Alkylgruppe oder eine Benzylgruppe; Y– ist ein Halogenion.
  • Die C1-3-Alkylgruppe kann Methyl, Ethyl, Propyl oder ähnliches sein. Die C8-18-Alkylgruppe kann Octyl, Decyl, Dodecyl, Tetradecyl und ähnliches sein.
  • Es wird zum Beispiel in geeigneter Weise Decyltrimethylammoniumsalz, Dodecyltrimethylammoniumsalz, Tetradecyltrimethylammoniumsalz, Hexadecyltrimethylammoniumsalz, Octadecyltrimethylammoniumsalz und ähnliches verwendet. Eine geeignete Verwendungsmenge kann 10 bis 30.000 mg/l, vorzugsweise 100 bis 3.000 mg/l in der Probe (Endkonzentration) sein.
  • Die Addition des kationischen Tensids zu der bakterienhaltigen Probe beschädigt die Zellmembran der Bakterien, so daß ein Farbstoff einfach in die Zelle eintritt. Im Ergebnis werden Inhalt der Bakterienzelle und Farbstoff effizient miteinander verbunden, so daß Bakterien gut gefärbt werden, was die Unterscheidung von Bakterien von Kontaminanten erleichtert. Weiterhin werden Mukusfäden, Erythrozyten und Zellfragmente lysiert oder geschrumpft, was ihren Einfluß auf den Nachweis der Bakterien reduziert.
  • Der Farbstoff ist nicht besonders begrenzt, so lange er die Bakterien anfärben kann. Ein Farbstoff, der Bakterien unter sauren Bedingungen anfärben kann, wird vorzugsweise verwendet. Seine Konzentration kann in geeigneter Weise abhängig von der Art des Farbstoffs bestimmt werden, z.B. im Bereich von 0,1 bis 100 ppm (Endkonzentration). Im Hinblick auf die Bakteriennachweisbarkeit wird ein fluoreszierender Farbstoff, der mindestens an eine der Komponenten bindet, die die Bakterien bilden und fluoreszierendes Licht emittiert, vorteilhafterweise verwendet. Von diesem Standpunkt her betrachtet werden Polymethinfarbstoffe bevorzugt. Zum Beispiel werden die folgenden Farbstoffe (1) bis (11) verwendet:
    • (1) Thiazol-Orange
    • (2)
      Figure 00070001
    • (3)
      Figure 00070002
    • (4)
      Figure 00080001
    • (5)
      Figure 00080002
    • (6)
      Figure 00080003
    • (7)
      Figure 00080004
    • (8)
      Figure 00080005
    • (9)
      Figure 00090001
    • (10) einer Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel:
      Figure 00090002
      worin R1 ein Wasserstoffatom oder eine C1-3-Alkylgruppe ist; R2 und R3 sind ein Wasserstoffatom, eine C1-3-Alkylgruppe oder eine C1-3-Alkoxygruppe; R4 ist ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe oder eine C1-3-Alkylgruppe; R5 ist ein Wasserstoffatom oder eine C1-3-Alkylgruppe, die substituiert sein kann; Z ist ein Schwefelatom, ein Sauerstoffatom oder ein Kohlenstoffatom substituiert mit einer C1-3-Alkylgruppe; n ist 1 oder 2; X– ist ein Anion; und
    • (11) einer Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel:
      Figure 00090003
      worin R1 ein Wasserstoffatom oder eine C1-18-Alkylgruppe ist; R2 und R3 sind ein Wasserstoffatom, eine C1-3-Alkylgruppe oder eine C1-3-Alkoxygruppe; R4 ist ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe oder eine C1-18- Alkylgruppe; Z ist Schwefel, Sauerstoff oder Kohlenstoff mit einer C1-3-Alkylgruppe; n ist 0, 1 oder 2; X– ist ein Anion.
  • Die C1-3-Alkylgruppe kann Methyl, Ethyl, Propyl und ähnliches sein. Die C1-18-Alkylgruppe kann Methyl, Ethyl, Propyl, Octyl, Decyl, Dodecyl, Tetradecyl und ähnliches sein. Die C1-3-Alkoxygruppe kann Methoxy, Ethoxy, Propoxy und ähnliches sein. Substituenten für die C1-3-Alkylgruppe können eine Hydroxylgruppe, ein Halogenatom und ähnliches sein.
  • Unter den oben erwähnten Farbstoffen ist (1) kommerziell erhältlich. (2) und (3) werden von Nippon Photosensitive Dye Laboratory Ltd. zur Verfügung gestellt und (5) bis (9) von Molecular Probes, Inc. Herstellungsverfahren für (10) und (11) werden in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. Hei 9 (1997)-104683 bzw. Hei 10 (1998)-319010 beschrieben.
  • Unter den Farbstoffen (10) ist insbesondere ein Farbstoff, der durch die Formel
    Figure 00100001
    repräsentiert wird, besonders geeignet.
  • Weiterhin ist unter den Farbstoffen (11) insbesondere ein Farbstoff, der durch die Formel
    Figure 00100002
    repräsentiert wird, besonders geeignet.
  • In der vorliegenden Erfindung ist der pH im Färbeschritt nicht besonders begrenzt, so lange er es ermöglicht, daß die Bakterien sich färben. Die Urinprobe wird bei einem sauren pH, vorzugsweise pH 2 bis 4,5, noch bevorzugter pH 2 bis 3, gefärbt, (1) Bakterien werden besser als in einem neutralen oder alkalischen Zustand gefärbt und (2) eine nichtspezifische Färbung von Mukusfäden wird verhindert und die Mukusfäden werden in einem bestimmten Ausmaß lysiert. So ist der saure Zustand für die Bakterienanfärbung vorteilhaft.
  • Ein Puffer mit einem pKa von 1 bis 5,5 wird verwendet, um den sauren Zustand aufrechtzuerhalten. Der Puffer ist nicht besonders begrenzt, jedoch kann eine Säure oder eine Verbindung, die einen pH von 2,0 bis 3,0 aufrechterhalten kann, verwendet werden. Als Puffer können eine oder mehr Arten von Verbindungen verwendet werden, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Zitronensäure oder ihre Salze, Phosphorsäure oder ihre Salze, Phthalsäure oder ihre Salze, Bernsteinsäure oder ihre Salze, Milchsäure oder ihre Salze, ε-Aminocapronsäure oder ihre Salze, Fumarsäure oder ihre Salze, β-Alanin, Glycin und ähnliche. Die oben beschriebenen Salze beinhalten Alkali- oder Erdalkalisalze. Geeignete Beispiele hierfür sind mindestens solche, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zitronensäure-NaOH, Zitronensäurenatriumcitrat, Kaliumhydrogenphosphatdinatriumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat-NaOH, Zitronensäure-dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphthalat-NaOH, Bernsteinsäure-NaOH, Milchsäure-NaOH, ε-Aminocapronsäure-HCl, Fumarsäure-HCl, β-Alanin-NaOH, Glycin-NaOH und ähnliche. Geeignete Verwendungsmengen hierfür sind derartig gewählt, daß der oben erwähnte pH-Bereich aufrechterhalten bleibt, vorzugsweise bei ungefähr 10 bis 500 mM in der Probe.
  • Die Färbung wird durchgeführt, indem weiterhin ein anorganisches Salz von entweder Sulfat oder Nitrat verwendet wird, wodurch die fluoreszierende Farbstofftransmissivität der Bakterien erhöht und eine nicht-spezifische Färbung von Kontaminanten verhindert wird. Das anorganische Salz kann in einer Konzentration von ungefähr 10 bis 500 mM, vorzugsweise ungefähr 50 bis 200 mM, in der Probe verwendet werden.
  • Das Verfahren zum Nachweis und Zählen von Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Schritte durchgeführt:
    • (1) Vermischen einer Urinprobe mit dem Reagens wie oben beschrieben;
    • (2) Einführen der so behandelten Probe in einen Nachweisteil eines Flußzytometers und Bestrahlung der Zellen der gefärbten Bakterien eine nach der anderen mit Licht, um gestreutes Licht zu messen und fluoreszierendes Licht, das von jeder der Zellen emittiert wird; und
    • (3) Unterscheiden der Bakterien von anderen Komponenten gemäß einer Intensität des gestreuten Lichtsignals und einer Intensität eines fluoreszierenden Lichtsignals oder einer Pulsbreite, die die Länge von Teilchen reflektiert, um die Zahl der Bakterien zu zählen.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Arbeit eines Farbstoffs auf die Urinprobe (die Anfärbung) durch Vermischen der Probe mit, einer nach der anderen oder simultan, einer wäßrigen Lösung enthaltend das kationische Tensid und das anorganische Salz und einer Lösung enthaltend den Farbstoff durchgeführt werden. Der Farbstoff kann in der wäßrigen Lösung enthaltend das kationische Tensid und das anorganische Salz enthalten sein. Wenn jedoch der Farbstoff, der verwendet wird, in der wäßrigen Lösung instabil ist, kann er in einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie z.B. Methanol, Ethanol oder Ethylenglycol, gelöst und dann zur Verwendung mit der wäßrigen Lösung enthaltend die Substanz, die Nitritionen reduzieren kann und/oder das kationische Tensid, vermischt werden. Dies verbessert die Lagerstabilität des Farbstoffs.
  • Temperatur und Zeit für die Anfärbung sind nicht besonders begrenzt, jedoch kann die Färbung bei ungefähr 15 bis 50°C für ungefähr 20 Minuten oder weniger durchgeführt werden, vorzugsweise ungefähr 15 Minuten oder weniger, noch bevorzugter ungefähr 15 Minuten direkt vor dem Vermischen.
  • Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gefärbte Probe kann mit einem Mikroskop oder einem Abbildungsapparat zum Nachweis von Bakterien beobachtet werden. Alternativ können die Bakterien unter Verwendung eines Flußzytometers mit hoher Genauigkeit nachgewiesen und gezählt werden. Das hier verwendete Flußzytometer kann ein kommerziell erhältlicher Apparat sein, der allgemein auf dem Gebiet verwendet wird.
  • Die Unterscheidung von Bakterien von anderen Komponenten und das Zählen der Bakterien werden gemäß einer Kombination von Signalen durchgeführt, die bei der Verwendung eines Flußzytometers erhalten werden. Ein Beispiel für die Kombination beinhaltet z.B. eine Vorwärtsstreu-Lichtintensität und eine Vorwärtsstreu-Lichtpulsbreite, eine Vorwärtsstreu-Lichtintensität und eine fluoreszierende Lichtintensität, eine Vorwärtsstreu-Lichtpulsbreite und eine fluoreszierende Lichtintensität und ähnliches. In geeigneter Weise wird zunächst beispielsweise eine Grafik einer Streuung aus der Kombination der Vorwärtsstreu-Lichtintensität und der Vorwärtsstreu-Lichtpulsbreite gebildet und dann wird eine Austastung (gating) auf eine Masse durchgeführt, beinhaltend Bakterien, die auf der Grafik der Streuung spezifiziert sind, im wesentlichen zu Mukusfäden zu separieren. Weiterhin wird eine andere Grafik der Streuung aus der Vorwärtsstreu- Lichtintensität und der fluoreszierenden Lichtintensität der ausgetasteten Masse zum Separieren von Bakterien von anderen Komponenten (Kristalle, Zellfragmente und ähnliches) basierend auf dem Unterschied der fluoreszierenden Lichtintensität, gebildet. Das Schema des Verfahrens ist in 7 dargestellt. Wenn die Probe nur Bakterien enthält, wird eine Grafik einer Streuung aus der Vorwärtsstreu-Lichtintensität und der fluoreszierenden Lichtintensität für ihre Zählung gebildet.
  • Beispiele
  • Hiernach werden bevorzugte Beispiele des Verfahrens zum Anfärben und zum Nachweis von Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht hierauf begrenzt. Beispiel 1 Reagenszusammensetzung
    (Verdünnungsmittel)
    Zitronensäure 100 mM
    NaOH bis zu pH 4,1
    Tetradecyltrimethylammoniumbromid 0,1 % (G/V)
    (Färbelösung)
    Farbstoff A (der oben erwähnten Formel) 40 ppm (in Ethylenglycol)
    Figure 00140001
  • Zu 100 μl einer Probe enthaltend kultivierte E. coli wurden 1.000 μl des oben erwähnten Verdünnungsmittels zugefügt und die Färbelösung wurde so zugefügt, daß die Endkonzentration des Farbstoffs A 1 ppm betrug. Die Färbung wurde bei 40°C für 30 Sekunden durchgeführt und dann wurde das gestreute Licht und fluoreszierendes Licht durch ein Flußzytometer gemessen, das mit einem Rot-Halbleiterlaser als Lichtquelle (Menge des überprüften Urins: 7,8 μl) versehen war. Als Kontrolle wurde eine Messung unter Verwendung eines Reagenzes durchgeführt, worin Tetradecyltrimethylammoniumbromid nicht enthalten war. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
  • In dem Fall, in dem das Reagens ohne Tetradecyltrimethylammoniumbromid verwendet wurde (linke Grafik der Streuung), betrug die fluoreszierende Lichtintensität 30 ch oder weniger, d.h. es waren nur wenige E. coli gefärbt. Demgegenüber war bei dem Reagens, das 0,1 (G/V) Tetradecyltrimethylammoniumbromid enthielt (rechte Grafik der Streuung), eine Masse von E. coli um die fluoreszierende Lichtintensität von 50 ch oder mehr verteilt. So wurde beobachtet, daß die Farbstofftransmissivität erhöht war. Beispiel 2 Reagenszusammensetzung
    (Verdünnungsmittel)
    Zitronensäure 100 mM (pH 2,5)
    Tetradecyltrimethylammoniumbromid 0,1 % (G/V)
    Natriumsulfat 90 mM
    (Färbelösung)
    wie in Beispiel 1
  • Mit dem oben erwähnten Reagens wurden Proben, die jeweils kultivierte Bakterien enthielten (E. coli, S. aureus, K. pneumoniae, C. freundii, E. faecalis) auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 untersucht. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
  • Wenn das Reagens ohne Tetradecyltrimethylammoniumbromid verwendet wurde, war die fluoreszierende Lichtintensität in den Proben schwach, d.h. es waren nur einige Bakterien gefärbt. Die Zugabe von Tetradecyltrimethylammoniumbromid führte jedoch zu einem Anstieg der fluoreszierenden Lichtintensität und es wurde so beobachtet, daß die Bakterien gut gefärbt waren. Im Vergleich der E. coli-Messungen zwischen dem gegenwärtigen Beispiel, worin weiterhin Natriumsulfat zugefügt wurde, und Beispiel 1, worin kein Natriumsulfat enthalten war, wurde gezeigt, daß die fluoreszierende Lichtintensität im gegenwärtigen Beispiel stärker erhöht war, d.h. daß die Zugabe von Natriumsulfat effektiv war.
  • Beispiel 3
  • Verdünnungslinearität
  • E. coli wurde kultiviert und verdünnte Proben, jeweils mit einem Verdünnungskoeffzienten von 1, 10, 100, 1.000, 10.000 und 100.000 verdünnt, wurden hergestellt, um eine Messung unter Verwendung des in Beispiel 2 verwendeten Reagenzes durchzuführen. 3 zeigt die Ergebnisse. Die Bakterienzahl wurde erhalten, indem eine Masse beinhaltend Bakterien, spezifiziert auf der Grafik der Lichtstreuung, gebildet aus der Vorwärtsstreu-Lichtintensität und der fluoreszierenden Lichtintensität, ausgetastet wurde.
  • Wie in 3 dargestellt, wurde eine günstige Linearität in einem Bakterienkonzentrationsbereich von 103 bis 107/ml erhalten.
  • Beispiel 4
  • Überprüfung der Urinprobe
  • Mit dem in Beispiel 2 verwendeten Reagens wurden 62 Urinproben überprüft, und man betrachtete die Korrelation zwischen diesen Ergebnissen und denjenigen durch Kultivierung auf einem CLED-Medium, die als Kontrolle durchgeführt wurde.
  • Für die Messung der Bakterienzahl wurde eine Grafik einer Streuung aus einer Kombination der Vorwärtsstreu-Lichtintensität und der Vorwärtsstreu-Lichtpulsbreite gebildet und dann wurde eine Austastung auf einer Masse durchgeführt beinhaltend Bakterien, die in der Grafik der Lichtstreuung spezifiziert waren. Dann wurde eine andere Grafik der Lichtstreuung aus einer Kombination der Vorwärtsstreu-Lichtintensität und der fluoreszierenden Lichtintensität der ausgetasteten Masse gebildet. Eine Region von Bakterien wurde aus dem Unterschied der fluoreszierenden Lichtintensität spezifiziert, um Bakterien in der spezifizierten Region zu zählen. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
  • Es gab eine günstige Korrelation mit den Ergebnissen der Kultivierung auf dem CLED-Medium. In 4 werden etliche Punkte entlang der Vertikalachse beobachtet. Dies ist darauf zurückzuführen, daß Bakterien, die fast kaum auf Medium wachsen (statische Bakterien; Bakterien, deren Wachstum durch Mittel oder ähnliches behindert wird) und tote Bakterien in der vorliegenden Erfindung ebenfalls gemessen werden, obwohl die Kultivierung auf dem CLED-Medium nur lebende Bakterien nachweist.
  • Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Anfärben von Bakterien ist eine trockene Fixierung, wie z.B. eine Gram-Färbung, nicht notwendigerweise nötig, da die Bakterien im wäßrigen Zustand gefärbt werden. Dadurch kann die Färbezeitspanne deutlich reduziert werden, und so kann eine Probe zur Messung in kurzer Zeit einschließlich dem Färbeschritt bereitet werden.
  • Da die Färbung gemäß der vorliegenden Erfindung einfach durch einfaches Vermischen der Probe und des Reagenzes durchgeführt werden kann, ist das Fachwissen, das für die Gram-Färbung benötigt wird, nicht mehr nötig, Weiterhin kann der Färbeschritt einfach durchgeführt werden, was eine Automatisierung durch den Färbeschritt bis hin zum Meßschritt erleichtert (wie z.B. eine Flußzytometrie und eine Bildanalyse).
  • Gemäß dem Verfahren zum Nachweis von Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung können Bakterien mit hoher Genauigkeit ohne Beeinflussung durch Kontaminanten gezählt werden. Insbesondere können Bakterien mit 104/ml gezählt werden.
  • Weiterhin können Bakterien, deren Wachstum auf Medium schwierig ist (bakteriostatische Proben) zuverlässig ebenfalls gezählt werden.

Claims (13)

  1. Reagens zum Anfärben von Bakterien in einer Urinprobe, umfassend: eine wäßrige Lösung, die mit der Probe vermischt werden soll, enthaltend ein kationisches Tensid und ein anorganisches Salz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfat und Nitrat mit einem pH von 2,0 bis 4,5 und eine Färbelösung, enthaltend einen Farbstoff zur Anfärbung der Bakterien.
  2. Reagens gemäß Anspruch 1, wobei das anorganische Salz in einer Konzentration von 10 bis 500 mM verwendet wird.
  3. Reagens gemäß Anspruch 1, wobei der Farbstoff ein fluoreszierender Farbstoff ist, der mindestens an eine der Komponenten, die die Bakterien bilden, gebunden ist.
  4. Reagens gemäß Anspruch 1, wobei der Farbstoff mindestens einer ist ausgewählt aus der folgenden Gruppe bestehend aus: (1) Thiazol-Orange; (2)
    Figure 00190001
    (3)
    Figure 00200001
    (4)
    Figure 00200002
    (5)
    Figure 00200003
    (6)
    Figure 00200004
    (7)
    Figure 00200005
    (8)
    Figure 00210001
    (9)
    Figure 00210002
    (10) einer Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel:
    Figure 00210003
    worin R1 ein Wasserstoffatom oder eine C1-3-Alkylgruppe ist; R2 und R3 sind ein Wasserstoffatom, eine C1-3-Alkylgruppe oder eine C1-3-Alkoxygruppe; R4 ist ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe oder eine C1-3-Alkylgruppe; R5 ist ein Wasserstoffatom oder eine C1-3-Alkylgruppe, die substituiert sein kann; Z ist ein Schwefelatom, ein Sauerstoffatom oder ein Kohlenstoffatom substituiert mit einer C1-3-Alkylgruppe; n ist 1 oder 2; X– ist ein Anion; und (11) einer Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel:
    Figure 00220001
    worin R1 ein Wasserstoffatom oder eine C1-18-Alkylgruppe ist; R2 und R3 sind ein Wasserstoffatom, eine C1-3-Alkylgruppe oder eine C1-3-Alkoxygruppe; R4 ist ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe oder eine C1-18-Alkylgruppe; Z ist Schwefel, Sauerstoff oder Kohlenstoff mit einer C1-3-Alkylgruppe; n ist 0, 1 oder 2; X– ist ein Anion.
  5. Reagens gemäß Anspruch 1, wobei das kationische Tensid ein quaternäres Ammoniumsalz, repräsentiert durch die folgende Formel ist:
    Figure 00220002
    worin R1 eine C8-18-Alkylgruppe ist; R2, R3 und R4 sind dieselben oder unterschiedlich und zwar eine C1-3-Alkylgruppe oder eine C1-3-Benzylgruppe; Y– ist ein Halogenion.
  6. Reagens gemäß Anspruch 5, wobei das quaternäre Ammoniumsalz mindestens eines ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Decyltrimethylammoniumsalz, Dodecyltrimethylammoniumsalz, Tetradecyltrimethylammoniumsalz, Hexadecyltrimethylammoniumsalz und Octadecyltrimethylammoniumsalz.
  7. Reagens gemäß Anspruch 1, wobei die wäßrige Lösung einen Puffer mit einem pKa von 1 bis 5,5 umfaßt.
  8. Reagens gemäß Anspruch 7, wobei der Puffer mindestens einer ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zitronensäure-NaOH, Zitronensäure-natriumcitrat, Kaliumhydrogenphosphat-dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat-NaOH, Zitronensäuredinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphthalat-NaOH, Bernsteinsäure-NaOH, Milchsäure-NaOH, ε-Aminocapronsäure-HCl, Fumarsäure-HCl, β-Alanin-NaOH und Glycin-NaOH.
  9. Reagens gemäß Anspruch 1, wobei die Endkonzentration des Farbstoffs 0,1 bis 100 ppm beträgt.
  10. Reagens gemäß Anspruch 1, wobei die Endkonzentration des kationischen Tensids 10 bis 30.000 mg/l beträgt.
  11. Reagens gemäß Anspruch 7, wobei der Puffer bei 10 bis 500 mM in der Probe existiert.
  12. Verfahren zum Nachweis und Zählen von Bakterien, umfassend die folgenden Schritte: (1) Vermischen einer Urinprobe mit dem Reagens wie beschrieben in einem der Ansprüche 1 bis 11; (2) Einführen der so behandelten Probe in einen Nachweisteil eines Flußzytometers und Bestrahlung der Zellen der gefärbten Bakterien eine nach der anderen mit Licht, um gestreutes Licht zu messen und fluoreszierendes Licht, das von jeder der Zellen emittiert wird; und (3) Unterscheiden der Bakterien von anderen Komponenten gemäß einer Intensität des gestreuten Lichtsignals und einer Intensität eines fluoreszierenden Lichtsignals oder einer Pulsbreite, die die Länge von Teilchen reflektiert, um die Zahl der Bakterien zu zählen.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Schritt (3) der Unterscheidung und des Zählens der Bakterien gemäß mindestens einer der folgenden Kombinationen durchgeführt wird: (i) eine vorwärts gestreute Lichtintensität und eine vorwärts gestreute Lichtpulsbreite; (ii) eine vorwärts gestreute Lichtintensität und eine fluoreszierende Lichtintensität; und (iii) eine vorwärts gestreute Lichtpulsbreite und eine fluoreszierende Lichtintensität.
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