DE2153479A1

DE2153479A1 - Verfahren und Vorrichtung zum differentiellen Zählen von weißen Blutzellen

Info

Publication number: DE2153479A1
Application number: DE19712153479
Authority: DE
Inventors: Hudson R. Warwick; Ornstein Leonard White Plains; N.Y. Ansley (V.StA.). P
Original assignee: Mount Sinai Hospital Research Foundation Inc
Current assignee: Mount Sinai Hospital Research Foundation Inc
Priority date: 1970-10-30
Filing date: 1971-10-27
Publication date: 1972-05-04
Also published as: AU460469B2; CA960947A; NL7114995A; SU611598A3; JPS576932B1; US3741875A; SE372417B; BE774311A; AU3484771A; JPS56163455A; FR2113336A5; GB1331568A; IT961518B; DE2153479B2; NL172463C

Description

Pafenicmwälle

Pr.-Inj. Wülieliü ßeiciiel
Dipl-ing. WoMgang ßeiciiel

6 Frankfuii a. M. 1
Parkstraße 13

6862

MOUNT.SINAI RESEARCH FOUNDATION, New York, New York, VStA

Verfahren und Vorrichtung zum differentiellen Zählen von weißen Blutzelien ■ '

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum differentiellen Zählen von weißen Blutzellen.

Die weißen Blutzellen oder Leukozyten teilt man normalerweise in fünf Klassen ein, nämlich in Neutrophile, Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile und Basophile. Es ist bei der medizinischen Diagnose im allgemeinen üblich, getrocknete, gefärbte Blutausstriche unter einem Mikroskop zu untersuchen, um die prozentualen Anteile dieser fünf Leukozytenklassen als auch die prozentualen Anteile von abnormalen Zellen zu bestimmen. Dieser Vorgang wird im allgemeinen Leukozytendifferenzierung oder differentielles Zählen der weißen Blutzellen genannt. Hierzu wird verwiesen auf "Laboratory.Medicine - Hematology", 3. Ausgabe, J.B. Miale (The CV. Mosby Company, St. Louis, Mo. 1967), Seiten 822 bis 830, 1126, 1127 und 1130. Bei dieser Art der Blutzellen-

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zählung wird ein gefärbter Blutausstrich hergestellt, der dann unter dem Mikroskop untersucht wird, wobei 100 bis 200 weiße Blutzellen bestimmt werden. Aufgrund dieser Prüfung erhält man eine grobe prozentuale Aufteilung der vorhandenen verschiedenen Zellenarten, Dieses bekannte Verfahren ist Jedoch äußerst ermüdend und zeitraubend und zum anderen ungenau, da nur eine verhältnismäßig geringe Anzahl von Zellen je Probe ausgezählt wird·. Es besteht daher ein dringendes Bedürfnis nach einem automatischen Verfahren, das eine differenzierte Leukozytenzählung schneller vornimmt . und dabei eine wesentlich größere Anzahl von Zellen auswertet. Bei einem solchen selbsttätigen Zählvorgang sollten für jeden Patienten in ein bis zwei Minuten etwa 10000 weiße Blutzellen ausgezählt werden. Darüberhinaus sollte dieses Verfahren wesentlich genauere Ergebnisse liefern und billiger durchführbar sein als die herkömmlichen Verfahren.

Die klassische Leukozytendifferenzierung beruht auf den verschiedenen Färbeeigenschaften der Nucleinsäuren und Proteine von den einzelnen Teilen der verschiedenartigen Zellarten und auf der Fähigkeit des Menschen bestimmte Farb- und Strukturmuster, die für die einzelnen unter dem Mikroskop zu beobachtenden Zellen charakteristisch sind, mit dem Auge zu erkennen, zu unterscheiden und zu behalten. Jede der verschiedenen Leukozytenarten enthält unterschiedliche Anteile von verschiedenartigen katalytischen Enzymarten, die die Zellen befähigen, ihre speziellen Funktionen auszufüh-.ren. Die Umstände, unter denen enzymhaltige Zellen gefärbt werden können, sind Gegenstand der enzymhistochemischen oder enzymcytochemischen Methodolog ie .Hierzu wird verwiesen auf: Histochemistry: Theoretical and Applied, A.G.E. Pearse, (Little & Brown, Boston, 1968)j Enzyme Cytology, D.B. Roodyn (Academic Press, London, New York, 1967); und Laboratory Medicine - Hematology, John B. Miale, Seiten 184 bis 185 und 212 bis 217.

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Im Gegensatz zu den bekannten differentiellen Leukozytenzählverfahren handelt es sich bei der Erfindung um einen automatisch ablaufenden Vorgang. Nach der Erfindung wird einer Lösung, die weiße Blutzellen (beispielsweise Gesamtblut oder Vollblut) enthält, ein cytologisches Fixiermittel zugegeben, um die darin enthaltenen Blutzellen zu töten und die in den Zellen enthaltenen kataly ti sehen Enzyme zu immobilisieren. Proben aus Körperflüssigkeit, beispielsweise Gesamtblut oder Rückenmarksflüssigkeit, werden bevorzugt. Eine Suspension aus Knochenmark kann man ebenfalls gemäß der Erfindung analysieren. Das Fixiermittel bewirkt keine ernsthafte Beschädigung der katalytischen Eigenschaften der Enzyme, bewirkt keine Ausfällung der löslichen Be- f standteile, die normalerweise in einer die Zellen umgebenden Lösung vorhanden sind, und bewahrt die Morphologie der Zellen, so daß die katalytischen Enzyme innerhalb der Zellen bleiben und die klassischen. Identifiziereigenschaften der Zellen praktisch nicht verlorengehen. Nach der Zugabe des Fixiermittels wird die Lösung mit einem besonderen 2ytochemischen Substrat, einem Chromogene ausfällenden Kopplungsreagenz und einem pH-Püffer behandelt. Bei vorhandenem Kopplungsreagenz wirkt das Enzym auf das Substrat derart ein, daß innerhalb der besonderen zu zählenden weißen Blutzelle ein schwerer unlöslicher Farbstoff niedergeschlagen wird. Wenn Gesan&lut analysiert werden soll, ist g noch ein Hämolyseschritt vorhanden, um die roten Blutzellen zu zerbrechen und ihren Hämoglobingehalt in die Lösung zu entlassen. Den Hämolyseschritt kann man entweder vor oder nach der Zugabe des Substrats, des Kopplungsreagenzes und des pH-Puffers vornehmen. Nachdem die besondere Leukozytenart gefärbt ist, wird die Lösung mit den Leukozyten durch eine fotometrische Zähleinrichtung geschickt, die selbsttätig die Anzahl der vorhandenen gefärbten Zellen zählt. Die Bildung eines schweren Farbstoffniederschlags in der einen Zellenart ermöglicht es dem fotometrischen Zähler, diese Zellen von anderen in der Lösung befindlichen Zellen — zu unterscheiden.

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Bei dem Verfahren nach der Erfindung treten eine Reihe von bestimmten Forderungen auf, die eingehalten werden müssen. Da sehr viele Zellenzyme sehr leicht beschädigt oder bereits bei der geringsten Handhabung von den Zellen freigegeben werden, ist es notwendig, daß gleichzeitig die metabolischen Vorgänge, also die StoffWechselvorgänge, unterbrochen, d.h. die Zellen getötet, und die in den Zellen befindlichen interessierenden Enzyme immobilisiert werden, ohne daß dabei die katalytisch^ Wirksamkeit der Enzyme in hohem Maß nachteilig beeinträchtigt wird. Dies sind dieselben Anforderungen wie bei der cytologischen Fixierung in der klassischen Enzymcitochemie. Hierzu wird beispielsweise auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen: A. Wachtel et al, J. Histochem. and Cytochem., Band 7, Seite 291 (1959) und B.J. Davis et al, J. Histochem. and Cytochem., Band 7, Seiten 291 bis 292 (1959).

Es ist weiterhin erforderlich, daß die Fixierlösung irgendwelche der zuvor löslichen Bestandteile in der extra-zellulären Lösung nicht ausfällt. Bei dem vorliegenden Verfahren müssen die Zellen in einer Lösung suspendiert bleiben, die von anderen Partikeln frei ist, die sonst von der fotometrischen Zähleinrichtung fälschlicherweise als Zelle gezählt werden könnten. Weiterhin bestände die Gefahr, daß irgendwelche Niederschläge oder Ausfällungen den Kanal verstopfen könnten, durch den die Suspension mit den fixierten, gefärbten Zellen auf ihrem Weg zu der Zähleinrichtung strömt. Diese zusätzlichen Anforderungen bei dem vorliegenden Verfahren stehen im Gegensatz zu den Forderungen bei den klassischen histologischen Fixierverfahren, bei denen eine maximale Menge an intra- und extra-zellulären Substanzen unlöslich gemacht wird. Zahlreiche cytologische Fixiermittel, die bei den bekannten Verfahren benutzt werden, beispielsweise Aceton, kommen daher im vorliegenden Fall nicht in Frage.

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Eine bevorzugte cytologische Fixierlösung ist eine 0,2%ige bis 4O?6ige wässerige Lösung aus einem Monoaldehyd, beispielsweise Formaldehyd, Butyralaldehyd, Propionalaldehyd oder Acetaldehyd. Die Aldehyde sind nicht geeignet, da sie Querverbindungen eingehen und extra-zelluläre Niederschläge bilden. Acetone, Säuren und die meisten Alkohole sind aus ähnlichen Gründen ebenfalls nicht geeignet. Die Konzentration des Monoaldehyds muß hoch genug sein, um die Zellen zu töten, ohne jedoch die Wirksamkeit der Enzyme zu beeinträchtigen. Bei geringen Konzentrationen und tiefen Temperaturen benötigt man zusätzliche Zeit, um diese Funktion durchzuführen, im Vergleich zu hohen Konzentrationen und hohen Temperaturen. So benötigt beispielsweise eine 2#ige * Formaldehydkonzentration in der Lösung bei 4 ⁰C zwölf Stunden, während eine 4%ige Konzentration bei 50 ⁰C zwei Minuten benötigt. Da man im allgemeinen gleiche Volumen der Körperflüssigkeit und der Monoaldehydlösung mischt, beträgt die Stärke der Aldehydlösung das Doppelte der Konzentration beim Fixierzeitpunkt des Aldehyds in der Lösung. Die folgenden Formalinlösungen liefern gute Ergebnisse:

Lösung I

(20# Formalin)
(pH-Wert =7,2)

Na₂HPO₄ 6,5 g

NaH₂PO₄ 4,0 g

Formalin-

Stammlösung 200 ml

Diesen Mengen wird Wasser zugegeben, bis das endgültige Volumen 1000 ml beträgt. Dieses Reagenz wird gras Bestimmen des Gehalts an Eosinophilen und Neutrophilesa dasefärbung benutzt.

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Lösung II

(2096 Formalin) (pH-Wert = 7,2)

KCl

1/15-molares
KH₂PO₄

1/15-molares K₀HPO/.

Formalin-Stammlösung

HoO

1,

5,0 UL

20,0 ml

45,0 si 100,0 El

Die folgenden Stammlösungen werden benutzt, um die obiger Formalin-Arbeitslösungen herzustellen:

1/15-molares KH₂PO₄ (einfachbasisch): etwa 9,07 g KH₂P% aufgelöst in 1 1 destilliertem Wasser.

1/15-molares K₂HPO₄ (zweifachbasisch): etwa 11_e6i g aufgelöst in 1 1 destilliertem Wasser..

Formalin-Stammlösung: Eins 37%ig® handelsübliche FormaMs hydlösung.

Wenn die Körperflüssigkeit, die dir· v^LBen

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zu hämolysieren, so daß die roten Blutzellen lediglich aufbrechen und ihren I halt, beispielsweise Hämoglobin, in die Lösung abgeben.

Das hämolysierende Reagenz darf die suspendierten Zellen nicht zur Klumpenbildung anregen und darf nachfolgende histochemische Reaktionen nicht stören, es darf also beispielsweise mit irgendeiner der Substanzen, die in späteren Schritten zum Färben der Zellen benutzt werden, nicht reagieren. Ferner darf das hämolysierende Reagenz nicht bewirken, daß die interessierenden Enzyme der weißen Blutzellen in die Lösung austreten und daß sich lösliche Substanzen in dem extra—zellulären Medium niederschlagen. ™

Der Hämolyseschritt wird entweder vor oder nach der Färbereaktion ausgeführt. Falls er nach dem Färben vorgenommen wird, darf er weder den Farbstoff, noch die gefärbten oder ungefärbten weißen Blutzellen ändern.

Bei dem vorliegenden Verfahren wird die Entfernung der roten Blutzellen durch Hämolyse gegenüber einer mechanischen Entfernung bevorzugt, da die Verwendung eines Hämolysereagenzes sicherstellt, daß sich der gesamte Vorgang einfach abspielt. Bei der Verwendung eines solchen Reagenzes ist es nämlich lediglich erforderlich, sowohl beim kontinuierli- ä chen Strömungsverfahren als auch beim diskontinuierlichen Einzelbearbeitungsverfahren dem ursprünglichen Blutvolumen ein zusätzliches Lösungsvolumen zuzugeben.

Der Hämolyseschritt kann dadurch ausgeführt werden, daß der Lösung, die die roten und weißen Blutzellen enthält, eine wässerige Lösung aus einer aliphatischen Säure mit einem pH -Wert von etwa 3,0 bis 5,5 zugegeben wird. Essig-, Propion-, Butter- oder Milchsäure in einer Konzentration von etwa 1# bis 10# reichen aus. Eine Essigsäurelösung mit einer Konzentration von etwa 7% wird bevorzugt. Die Lösung —

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kann man in einem Temperaturbereich von etwa 40 ⁰C für acht Minuten bis etwa 55 ⁰C für eine Minute erhitzen, um die Katalaseenzyme zu inaktivieren, die pseudoperoxidase Wirksamkeit des Hämoglobins zu vermindern und die Hämolyse zu beschleunigen. Bei niedrigen Temperaturen benötigt man eine längere Reaktionszeit. Höhere Temperaturen inaktivieren die Peroxidaseenzyme und fördern ein Verklumpen nach der Zugabe des Hämolysereagenzes.

Bei den Färbeschritten nach derErfindung handelt es sich um enzymatische Färbungen, bei denen die morphologisch α unzerstörte Zelle für die Erzeugung der Farbe direkt verantwortlich ist. Das Substrat und das Kopplungsreagenz werden innerhalb der Zelle durch eines der in der Zelle vorkommenden Enzyme in einen unlöslichen Farbstoff umgewandelt. Eine derartige Färbung erfordert eine schnelle Kopplung mit dem gespaltenen Substrat und bedingt auch ein unlösliches Erzeugnis innerhalb der Zelle. Bezüglich dieser Kriterien wird verwiesen auf: Lehrer, G.M., et al, J. Biophysic. and Biochem. Cytol., Band 6, Nr. 3_f Seiten 399 bis 404 (1959); Davis, B.J., et al, J. Histochem. and Cytochem., Band 7, Seiten 297 ff (1959); und Davis, B.J., Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., Band 101, Seiten 90 ff (1959).

Der Färbeschritt der vorliegenden Erfindung erfordert eine sorgfältige Auswahl der Reagenzien. Zwei klassische hystochemische Substrate für Peroxidaseenzyme sind beispielsweise Benzidin und Paraphenylendiamin. Hierzu wird verwiesen auf Pearse in Histochemistry: Theoretical and Applied sowie auf L. Ornstein in J. Histochem. and Cytochem., Band 16, Seite 504 (1968).

Im Gegensatz zu 4-Chlor-1-naphthol sind derartige Reagenzien für die vorliegende Erfindung nicht geeignet, da sie äußerst schnell mit dem als Fixiermittel dienenden Monoaldehyd reagieren und Verbindungen hervorrufen, die sich

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niederschlagen und die nicht als Peroxidasesubstrate für die Farberzeugung dienen können.

Nach der Erfindung wird eine Reihe von bekannten cytochemischen Substraten benutzt, jedoch in einer ganz besonderen Weise. So wird beispielsweise eine Mischung aus einem inorganischen oder organischen Peroxid und aus 4-Chlor-1-naphthol verwendet, um eine Perbxidase enthaltende Zelle zu färben, beispielsweise ein Eosinophil oder Neutrophil. Das Peroxid und 4-Chlor-1-naphthol dienen als Enzymsubstrate, und das 4-Chlor-1-naphthol wird darüberhinaus als Kopplungsreagenz verwendet. Ohne Zugabe eines getrennten Chromogene ausfällenden Kopplungsreagenzes erzeugt das 4-Chlor- " 1-naphthol innerhalb der Peroxidase enthaltenden Zelle einen blauschwarzen Farbstoffniederschlag. Eine Mischung aus o-Tolidin und 4-Chlor-1-naphthol kann man ebenfalls verwenden, um einen verschiedenartigen purpurroten Farbstoff zu erzeugen, wenn das beim Fixierschritt benutzte Formaldehyd inaktiviert wird.

Um einen wahren selektiven Färbevorgang zu erhalten, wird der pH-Wert der Lösung gesteuert. Wenn der pH-Wert der Lösung unter 3,0 liegt, werden schwere Farbstoffniederschlage nur in Eosinophilen gebildet. Wenn der pH-Wert in der Lösung innerhalb eines Bereichs von 3,0 bis 5,0 liegt, werden Λ schwere Farbstoffniederschläge nur in Eosinophilen und mittelmäßige Farbstoffniederschläge nur in Neutrophilen erzeugt. Wenn der pH-Wert auf einen Bereich zwischen.5,0 und 7,0 gepuffert ist, entstehen schwere Farbstoffniederschläge nur in Eosinophilen und Neutrophilen.

Wenn lipasehaltige Zellen, d.h. Monozyten, gefärbt werden sollen, wird nach der Erfindung vorzugsweise eine Kombination aus einem Naphtholester, beispielsweise 1-Naphthylacetat oder 1-Naphthylbutyrat, und aus einem Diazoniumsalz» beispielsweise Hexazoniumpararosanilin, verwendet, bei dem

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es sich um ein Chromogene ausfällendes Kupplungsreagenz handelt. Der optimale pH-Wert für diese Farbreaktion beträgt etwa 5,5 bis 6,5, vorzugsweise etwa 6,0. Bei einem solchen pH-Wert werden lediglich in Monozyten schwere Farbstoff niederschlage gebildet.

Die normalerweise bei der klassischen Esteraselipasehistochemie verwendeten Substrate sind" geringfügig unlöslich. Damit innerhalb einer kurzen Zeit, beispielsweise fünf Minuten, eine hinreichende Farbentwicklung auftritt, soll.die Konzentration des Substrats in der endgültigen Inkubationslösung etwa 0,5 mg/ml übersteigen. Naphthol-AS-Ester und ihre Derivate sowie 1-Naphthylbutyrate haben jedoch eine Löslichkeit von weniger als 0,5 mg/ml. Dieses Problem wird durch Zugabe bis zu einem Viertel des endgültigen Volumens von 2.2'-Oxydiäthanol (Diäthylenglycol) oder anderen wasserartigen Alkoholen oder Estern, beispielsweise Äthylenglycol, Propylenglycol, Dimethyläther von Diäthylenglycol und Diäthylcarbitol, überwunden. Wenn man in dieser Weise vorgeht, kann man 1-Naphthylbutyrat und 1-Naphthylacetat bis zu einer Konzentration von nahezu 1 mg/ml lösen. Auch andere Substrate können gelöst werden, beispielsweise «-Naphthylchloracetat, Indoxylester, beispielsweise Indoxylacetat, Indoxylpropionat und Indoxylbutyrat, 8-Hydrochinolinester, beispielsweise 8-Hydrochinolinacetat, 8-Hydrochinolinpropionat und 8-Hydrochinolinbutyrat. Unter denselben Bedingungen kann man nur 0,1 mg/ml Naphthol-AS-Acetat lösen, so daß sich eine wesentlich geringere Farbentwicklung ergibt. Die anderen Ester der Naphthol-AS-Derivate lösen sich in einem noch geringeren Haß. '

Die folgende Zusammenstellung bringt typische Reagenzien, die zum Färben von Monozyten, Eosinophllen und Neutrophilen bevorzugt verwendet werden:

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40	ml
20	ml
8	ml
3,4	ml

Reagenzien für Eosinophile und Neutrophile

Stammlösungen; 0,003% und 0,006# Gewichtsteile von

H₂O₂ in Wasser

0,5 g von 4-Chlor-1-naphthol in 25 ml von 2.2'-0xydiäthanol

0,1-Normalessigsäure

Arbeitslösungen: Färbelösung für Eosinophile;

(pH-Wert £ 2,5)

0,1-Normalessigsäure 2.2'-0xydiäthanol (10056)

4-Chlor-1-naphthol (Stammlösung)

konzentrierte Essigsäure

Färbelösung für Eosinophile und Neutrophile:

(pH-Wert £ 3,3)

0,1-Normalessigsäure 40 ml

2.2'-0xydiäthanol (100#) 20 ml 4-Chlor-1-naphthol

(Stammlösung) 13 ml

In Verbindung mit den oben erwähnten A-Chlor-1-naphthol-LÖ-sungen werden Wasserstoffperoxidlösungen verwendet. Zahlreiche andere organische und inorganische Peroxide können benutzt werden. Als Beispiele werden angeführt: Natriumperborattetrahydrat, Natriumcarbonatperoxid, Natriumpyrophosphatperoxid, Äthylhydroperoxid, tertiäres Butylhydroperoxid und Harnstoffperoxid. Alle diese Stoffe können mit einer endgültigen Konzentration von 0,1 bis 0,0001 Gew# verwendet werden.

Das 4-Chlor-1 -naphthol wird mit einer endgültigen Konzentration von 0,001 bis 0,06 Gew# benutzt.

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Reagenzien für Monozyten

Stammlösungen;

1. o-Naphthylbutyrat - 1 Gew% in 2.2^r-Oxydiäthanol

2. 1/15-molares KHpPO^ (zweifachbasisch) - etwa 9,07 g/l

3. 1/15-molares K₂HPO^ (zweifachbasisch) - etwa 11,61 g/l

4. Basisches Fuchsin (beispielsweise Matheson, Coleman
& Bell) 1 g in 25 ml von 2 n-HCl

5. 2.2»-Oxydiäthanol

6. 0,1-molares K₂^

7. 1g Natriumnitrit in 25 ml H₂O

Arbeitsreagenzien:
α-Naphthylbutyrat:

α-Naphthylbutyrat (Stammlösung) 2,0 ml

2.2'-Oxydiäthanol 6,0 ml

1/15-molares KH₂PO^ (einfachbasisch) 8,0 ml

Insgesamt 16,0 ml

Die obige Lösung sollte täglich neu aufbereitet werden.

Hexazoniumpararosanilin-Kuppler:

Basisches Fuchsin (Stammlösung) 0,8 ml

Natriumnitrit (Stammlösung) 0,8 ml

Die obigen Substanzen werden für etwa eine Minute gemischt und dann gegeben in

0,1-molares K₂HPO. (Stammlösung - um den
pH-Wert auf 5,8 bis 6,2 einzustellen) 17,0 ml

Insgesamt 18,6 ml

Die Menge des benutzten basischen Fuchsins hat eine endgültige Konzentration von 0,Q01?6 bis 0,01%.

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Beim Färben der Monozyten werden bei einem bevorzugten strömungstechnischen Ausführungsbeispiel etwa 0,32 ml/min formalinfixierte Probe, etwa 0,42 ml/min «-Naphthylbutyrat und etwa 0,42 ml/min Hexazoniumpararosanilin zugegeben. Beim Färben der Eosinophilen werden etwa 0,60 ml/min Eosinophilfärbelösung und etwa 0,10 ml/min 0,06%iges H₂O₂ zu etwa 0,42 ml/min der formalinfixierten, hämolysierten Probe zugegeben. Beim Färben der Eosinophilen und Neutrophilen werden etwa 0,32 ml/min Eosinophil-Neutrophil-Färbelösung, etwa 0,10 ml/min 0,03%iges Wasserstoffperoxid und etwa 0,23 ml/min der formalinfixierten, hämolysierten Probe zusammengebracht.

Eine Reihe von Komponenten in Gesamtblutproben stört sowohl das Peroxidase- als auch das Monozytenfärbeverfahren.

Wenn die Peroxidasereaktion durchgeführt wird, kann Serumkatalase die granulocytische Peroxidase überwältigen und dabei das Substrat aufbrauchen. Katalase ist wärmeunbeständig bei etwa 50 ⁰C, während Peroxidase bis zu etwa 80 ⁰C stabil ist. Demzufolge wird die Katalase durch Erhitzen auf eine Temperatur von 40 ⁰C für acht Minuten bzw. auf 55 ⁰C für eine Minute oder dazwischenliegende Temperatur- und Zeitwerte inaktiviert. Vorzugsweise wird eine Erwärmung auf 50 ⁰C für drei Minuten vorgenommen. Eine Verdünnung des μ Bluts verstärkt das Verhältnis der intrazellulären Peroxidasewirksamkeit in bezug auf die restliche Katalasekonzentration. Wenn die Katalasekonzentration auf einen Punkt vermindert ist, bei dem sie erfolgreich mit der Neutrophilperoxidase konkurriert, wird das aktivere Eosinophilperoxid immer noch stark gefärbt.

Beim Erhitzen der Blutlösung wird auch die Pseudoperoxidasewirksamkeit des Hämoglobins zerstört.

Die störende Komponente während der Monozytenfärbung ist der CM-Esteraseinhibitor, eine gut bekannte Komponente des

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Serums, die die CM-Esterase inaktiv hält. Die Wirkung des C'1-Esteraseinhibitors kann man in mannigfacher Weise blokkieren. Ein Weg besteht darin, eine Mischung aus Heparin (ein Antikoagulat) und C'1-Esterase der Probe zuzugeben, um den Inhibitor zu binden. Dies wird jedoch nicht bevorzugt, da C'1-Esterase sehr teuer ist. Stattdessen kann man eine Kombination von Heparin und Streptokinase zugeben. Eine wenig aufwendige Art besteht darin, die Probe mit einer Kaliumsalzlösung zu verdünnen. Normalerweise benötigt man eine 50-fache Verdünnung. Dadurch wird jedoch die Zählgeschwindigkeit erheblich herabgesetzt. Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, 2,2'-0xydiäthanol der fixierten Blutprobe in Konzentrationen von 10% bis 30% zuzusetzen. Dadurch wird der Inhibitor in einem höheren Maße geschädigt als die Monozytenlipase.

In den Figuren 1 und 2 ist eine Vorrichtung dargestellt» mit der man die verschiedenen Reagenzien der Probe zugeben kann. Die in der Fig. 1 dargestellte Anordnung dient zum Bestimmen und Zählen der Eosinophilen und Neutrophilen, während die in der Fig, 2 dargestellte Anordnung zum Bestimmen des Monozytgehalts in einer Probe verwendet wird. Diese Anordnungen sind einer von Skeggs, L.T., Am. J. Clinical Path., Band 28, Seite 311 (1957) beschriebenen Vorrichtung ähnlich, die früher zur klinisch chemischen Analyse verwendet wurde.

Bei der Darstellung nach der Fig. 1 wird eine Probe von einem Probennehmer 1 durch eine Leitung 2 geführt und mit einer Formalinlösung gemischt, die in einem Kühler 46 gekühlt wird, Es v/erden Luftblasen zugegeben, um den Flüssigkeitsstrom in Schübe zu unterteilen, um eine Durchmischung der aufeinanderfolgenden Proben zu verhindern. Das Proben-Formalin-Gemisch wird durch eine Mischschlange 3, eine geheizte Mischschlange 4 und eine weitere Mischschlange 5 geleitet, die in einem Kühler 6 mit Eiswasser gekühlt wird, über eine Leitung 7 wird der fixierten Probe für die

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Hämolyse Essigsäure zugeführt. Dieses Gemisch wird durch eine Mischschlange 8 und eine geheizte Mischschlange 9 geleitet und von dort einem Stromteiler 10 zugeführt, in dem Probenüberschüsse und Blasen über eine Leitung 11 abgegeben v/erden und der Probenstrom aufgeteilt wird. Die aufgeteilten Ströme werden von Leitungen 12 bzw. 13 geführt. Dem Strom in der Leitung 13 wird ein Gemisch aus einem Eosinophilfärbemittel und Wasserstoffperoxid über Leitungen 15 bzw. 16 zugegeben. Weiterhin wird der Strom durch über eine Leitung 14 zugeführte Luft erneut in Schübe unterteilt. Das Gemisch wird durch Mischschlangen 17 und 18 geleitet. Weiterhin strömt das Gemisch durch Mischschlangen 20, 21 und 22 und gelangt in einen Eosinophilzellen- i zähler 23, an den ein Schreiber 24 angeschlossen ist.

Der Strom in der Leitung 12 wird mit einem Färbemittel für Eosinophile und Neutrophile und mit V/asserstoffperoxid zusammengeführt. Diese Substanzen werden über Leitungen 26 bzw. 27 zugegeben..Die über eine Leitung 25 zugeführte Luft dient wiederum zur Unterteilung des Stroms in Schübe. Dieses Gemisch wird durch eine Mischschlange 28 und eine auf 37 ⁰C erhitzte Schlange 29 geschickt. Der die gefärbten Zellen enthaltende Strom wird durch eine Schlange 31 geleitet urd von dort einem Zähler 32 zugeführt, der die Gesamtanzahl der Eosinophilen und Neutrophilen zählt. An den Zähler 32 ist ein Schreiber 33 angeschlossen. %

Mit der beschriebenen Anordnung kann man die in einer Probe vorhandenen Eosinophilen und Neutrophilen zählen.

Mit der in der Fig. 2 gezeigten Anordnung kann man die Anzahl der Monocyten in einer Probe zählen. Die Probe wird von einem Probennehmer 34 zugeführt und in einen ummantelten Eisbad 35 mit einem luftunterteilten Formalinstrom vereinigt, der zuvor in einer Schlange 36 gekühlt wird. Diesem Gemisch wird ^a -Naphthylbutyrat, Oxydiäthanol und Hexazoni- . — umpararosanilin sowie Essigsäure zugeführt. Zum Herstellen

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dieses Gesamtgemischs wird der Strom durch Mischschlangen 37 bis 43 geleitet. Die die gefärbten weißen Blutzellen enthaltende Lösung wird einem Monozytenzellenzähler 44 zugeführt, an den ein Schreiber 45 angeschlossen ist.

Die bekannten Färbeverfahren verursachten lediglich geringfügige Unterschiede in den Farbstoffniederschlägen der verschiedenen Zellarten. Dadurch ist es nicht möglich, einfache Zähleinrichtungen zu verwenden, wie es im vorliegenden Fall geschieht, da diese nicht in der Lage sind, geringe Farbunterschiede innerhalb der Zellen zu unterscheiden. Daher mußte man bei den bekannten Verfahren zum Erkennen der gefärbten oder nichtgefärbten Strukturen teuere und komplizierte Einrichtungen verwenden.

Beschreibungen solcher Einrichtungen und Geräte findet man in den folgenden Literaturstellen: Ingram et al, Annais N.Y. Acad. Sei., Band 157, Abhandlung I, Seiten 275 ff (1969); Prewitt et'al, Annals N.Y. Acad. Sei., Band 128, Seiten 1035 ff (1966); Young, I.T., Quantitative Cytochemistry, Band 2, Wied et al, eds. (Academic Press, N.Y. 1970); Wied et al, Cytology Automation, D.M.D. Evans, ed. (E. & S. Livingstone, London, 1970); und US-PS 3 327 117, 3 413 464 und 3 497 690. Nach der vorliegenden Erfindung ist es aber möglich, den Farbniederschlag in einer besonderen Zellenart oder in besonderen Zellenarten derart vorzunehmen, daß ein verhältnismäßig einfach aufgebauter Zähler in der Lage ist, zwischen stark gefärbten, schwach gefärbten und nicht gefärbten Zellen zu unterscheiden. Derartige Einrichtungen sind beispielsweise in den folgenden Literaturstellen beschrieben: Kamensky, L.A., et al, Annais N.Y. Acad. Sei., Band 157, Abhandlung 0, Seiten 310 ff. (1969) und Kamensky, L.A., et al, Proc. I.E.E.E., Band 57, Seite 2007 (1969).

Der zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens benutzte Zähler beleuchtet die Eösung mit den suspendierten Zellen

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mit einem Lichtstrahl. Gefärbte Zellen entfernen eine gewisse Lichtmenge aus dem Strahl. Diese entfernte Menge unterscheidet sich meßbar von derjenigen Lichtmenge, die von nicht gefärbten Zellen oder von weniger stark gefärbten Zellen entfernt wird. Infolge dieser Differenz kann man zwischen zwei oder mehreren Arten von Zellen unterscheiden und diese Zellen genau zählen.

In einem derartigen Zähler kann man die Zellen mit hohen . Zählgeschwindigkeiten bestimmen, beispielsweise 1000 bis 30000 Zellen pro Minute und pro Kanal. Die Blutproben von verschiedenen Patienten werden aufeinanderfolgend zugeführt und sind durch kurze Waschflüssigkeitsschübe getrennt, die eine Verseuchung der nachfolgenden Blutproben durch die vorangegangenen Proben verhindern.

Nach der Erfindung wird somit zum differentiellen Zählen von weißen Blutzellen ein cytplogisches Fixiermittel einer Blutprobe zugegeben, um die Blutzellen zu täten und die katalytischen Enzyme in den Zellen zu immobilisieren. Die Wirksamkeit der Enzyme wird dabei kaum beeinträchtigt, und in der extra-zellulären Lösung werden keine löslichen Komponenten ausgefällt. Falls die Blutprobe auch rote Blutzellen enthält, wird nach dem Fixieren ein Hämolysierungsreagenz zugegeben, das veranlaßt, daß die roten Blutzellen ihren Hämoglobingehalt in die Lösung abgeben. Durch Zugabe eines besonderen cytochemischen Substrats, eines Chromogene ausfällenden Kupplungsreagenzes und eines pH-Puffers wird in einer besonderen Art von Zellen, die das immobilisierte Enzym enthalten, ein unlöslicher Farbstoff niedergeschlagen. Die Lösung, die die gefärbten Blutzellen enthält, wird dann durch einen fotometrischen Zähler geleitet, der sehr schnell und genau die Anzahl der gefärbten Zellen bestimmt. Wenn man für die verschiedenen in den besonderen Zellarten enthaltenen Enzyme verschiedene besondere Substrate verwendet, kann man für die verschiedenen Zellarten absolute und relative Zählwerte erhalten.

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Claims

Patentansprüche

Λ J Verfahren zum Nachweisen einer weißen Blutzellenart, bei dem die betreffenden weißen Blutzellen gefärbt und anschließend gezählt werden,
dadurch gekennzeichnet, daß einer die weißen Blutzellen enthaltenden Lösung ein cytologisches Fixiermittel zugegeben wird, das die in der Lösung befindlichen weißen Blutzellen tötet und die in den Zellen enthaltenen katalytischen Enzyme immobilisiert, ohne dabei die katalytischen. Eigenschaften der Enzyme ernsthaft zu zerstören und die im allgemeinen in der Lösung befindlichen löslichen Bestandteile auszufällen, und daß anschließend ein cytochsmischSi* Substrat zugesetzt wird, das die eine weiße Blutzellenart enzymatisch färbt.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß ein getrenntes Chromogene ausfällendes Kupplungsreagenz mit dem cytophemischen Substrat zugegeben wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß ein pH-Puffer zugegeben wird, der während der Reaktion des Chromogene ausfällenden Kupplungsreagenzes mit einem Produkt des cytochemischen Substrats den pH-Wert aufrecht erhält.
4. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß, falls die Lösung rote Blutzellen enthält, der Lösung nach der Zugabe des Fixiermittels ein Hämolysiermittel zugesetzt wird, das die roten Blutzellen veranlaßt, ihren Inhalt in die Lösung freizugeben.

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5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungsreagenz Hexazoniumpararosanilin enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gek ennzeichnet , daß das Fixiermittel ein Monoaldehyd enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Monoaldehyd ein Formaldehyd, Butyraldehyd, Propionaldehyd oder Acetaldehyd ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Monoaldehyd eine 0,2#ige bis 40#ige wässerige Formaldehydlösung ist.
9. Verfahren nach' Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung zum Inaktivieren der Katalase behandelt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung auf eine Temperatur von etwa 37 ⁰C für zehn Minuten bis etwa 55 8c für eine Minute gebracht wird.
11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämolysierreagenz eine 1#ige bis 50#ige Lösung einer aliphatischen Säure mit einem pK_&-Wert von 3,0 bis 5,5 ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämolysierreagenz eine 7#ige Essigsäurelösung ist.
13· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das cytochemische Substrat ein Gemisch aus Peroxid und 4-Chlor-1-naphthol ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine schwache Säure zugegeben wird, die in der Lösung einen pH-Wert von weniger als 3,0 erzeugt, wobei nur in den Eosinophilen ein starker Farbniederschlag erfolgt.
15. Verfahren nach Anspruch 13,

w dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Puffer einen pH-Wert zwischen etwa 3,0 und 5,0 erzeugt, wobei nur in den Eosinophilen ein starker Farbniederschlag und nur in den Neutrophilen ein schwacher Farbniederschlag erfolgt.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Puffer in der Lösung einen pH-Wert von etwa 5,0 bis 7,0 erzeugt, wobei nur in den Eosinophilen und in den Neutrophilen ein starker Farbniederschlag erfolgt.
17. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das cytochemische Substrat ein Naphtholester, Indoxylester oder 8-Hydrochinolinester ist und es sich bei den gezählten Zellen um Monocyten handelt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert innerhalb eines Bereichs von 5,5 bis 6,5 gehalten wird.

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19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein 1-Naphthylacetat ist.
20. Verfahren nach Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein 1-Naphthylbutyrat ist.
21. Verfahren nach Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß als Inaktivator ein löslicher wärmeunbeständiger Plasmaesteraseinhibitor zugegeben wird. %
22. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch aus Heparin und Streptokinase oder ein Gemisch aus Heparin und komplimentärer C'1-Esterase zugegeben wird.
23. Verfahren nach Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß Formaldehyd und 2,2¹-Oxydiäthanol (Diäthylenglycol) zugegeben werden.
24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung nach Zugabe des Fixiermittels und vor Zugabe des cytochemischen Substrats und pH-Puffers ein Hämolysierreagenz zugesetzt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung nach Zugabe des Fixiermittels und vor Zugabe des cytochemischen Substrats, des Kupplungsreagenzes und des pH-Puffers ein Hämolysierreagenz zugesetzt wird.

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26. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung nach Zugabe des cytochemischen Substrats und des pH-Puffers ein Hämolysierreagenz zugesetzt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß nach Zugabe des cytochemischen Substrats, des Kupplungsreagenzes und des pH-Puffers ein Hämolysierreagenz zugesetzt wird.
28. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß eine Leitung zur Zugabe des cytologischen Fixiermittels zu der die weißen Blutzellen enthaltenden Lösung vorgesehen ist, daß eine weitere Leitung dazu dient, das cytochemische Substrat und einen pH-Puffer den in Lösung befindlichen fixierten Zellen zuzuführen, und daß eine Leitung die behandelte Lösung einem Zellenzähler zuleitet.
29. Vorrichtung nach Anspruch 28,
dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere Leitung vorgesehen ist, die der Lösung ein Chromogene ausfällendes Kupplungsreagenz zuführt.
30. Vorrichtung nach Anspruch 28,
dadurch gekennzeichnet, daß Mischschlangen vorgesehen sind, die dazu dienen, die verschiedenen Reagenzien und die Probe zu mischen.
31. Vorrichtung nach Anspruch 28,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Probennehmer vorhanden ist.

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32. Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere Leitung vorgesehen ist, die dazu dient, den Strom in Schübe zu unterteilen und eine Durchmischung aufeinanderfolgender Proben zu verhindern.

33· Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere Leitung vorgesehen ist, die dazu dient, der Lösung ein Hämolysierreagenz zuzugeben, das die roten Blutzellen veranlaßt, ihren Inhalt in die Lösung abzugeben.

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